本發(fā)明涉及一種水凝膠及制備方法，更具體地說(shuō)，涉及一種2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸共聚物(PVDT-co-PAA)水凝膠及其制備方法，具有高強(qiáng)度、形狀記憶和無(wú)損脫細(xì)胞功能。

背景技術(shù)：

水凝膠是以水為分散介質(zhì)，親水性而又不溶于水的且能夠吸收大量水分(通常含水量大于總質(zhì)量的50％)具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子聚合物材料。形狀記憶高分子作為智能高分子的一種，能夠在外界刺激的作用下記憶形狀并在特定環(huán)境下恢復(fù)。因其獨(dú)特性質(zhì)形狀記憶高分子作為優(yōu)良的生物醫(yī)用材料得到廣泛應(yīng)用。形狀記憶水凝膠，作為形狀記憶高分子的一種，近幾年也吸引了很多研究人員的注意。但是目前關(guān)于誘發(fā)形狀記憶水凝膠形狀記憶的外界刺激多樣性的研究較少，同時(shí)其高含水量導(dǎo)致形狀水凝膠具有較差的機(jī)械性能及細(xì)胞粘附性。極大限制了形狀記憶水凝膠在生物軟組織替代，細(xì)胞脫附等領(lǐng)域的應(yīng)用。如果能提出新的誘發(fā)形狀記憶水凝膠形狀記憶的外界刺激刺激條件并制備出與人體軟組織力學(xué)性能接近且具有良好生物相容性和細(xì)胞粘附性的軟組織類(lèi)似物，將是一種更好的選擇。

為了解決誘發(fā)形狀記憶水凝膠形狀記憶的外界刺激較單一這一問(wèn)題，近期科學(xué)家們研制了以下幾種離子相應(yīng)的高強(qiáng)度水凝膠：鋅離子響應(yīng)的丙烯腈基形狀記憶水凝膠，三價(jià)鐵離子響應(yīng)的磷酸基形狀記憶水凝膠和鈣離子響應(yīng)的苯硼酸修飾的海藻酸鈉/聚乙烯醇超分子水凝膠。但是這些水凝膠所用的離子種類(lèi)或濃度都對(duì)細(xì)胞有一定毒性，限制了其在細(xì)胞醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種以2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪為主體的水凝膠，具體為2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸共聚物(PVDT-co-PAA)，該共聚物除表 現(xiàn)出水凝膠的固有特性，還具有很強(qiáng)的抗拉伸和抗壓縮能力，離子刺激形狀記憶功能和無(wú)損脫細(xì)胞功能。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

一種具有氫鍵增強(qiáng)離子驅(qū)動(dòng)的高強(qiáng)度形狀記憶水凝膠，由2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸和交聯(lián)劑通過(guò)自由基聚合共聚而成，將2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶解在溶劑中，通過(guò)引發(fā)劑引發(fā)2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸和交聯(lián)劑分子上的不飽和鍵，在絕氧的條件下通過(guò)自由基聚合反應(yīng)制備出具有氫鍵增強(qiáng)離子驅(qū)動(dòng)的高強(qiáng)度形狀記憶水凝膠，所述交聯(lián)劑分子的分子鏈兩端帶有碳碳雙鍵、分子鏈中間為聚乙二醇分子的主鏈結(jié)構(gòu)，單體2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪與丙烯酸的質(zhì)量比為(1-10)∶1，交聯(lián)劑質(zhì)量與2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸與引發(fā)劑質(zhì)量和的比為(1-3):1；引發(fā)劑的質(zhì)量為2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸與交聯(lián)劑總質(zhì)量的2-5％。

所述交聯(lián)劑為聚乙二醇二丙烯酸酯。

所述交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯的數(shù)均分子量為500-4000。

所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、過(guò)氧化苯甲酰、1-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2′，2′-二甲基乙酮、甲基乙烯基酮或者安息香中的一種。

優(yōu)選單體2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪與丙烯酸的質(zhì)量比為(1-2)∶1，或者(8—10)：1。

制備本發(fā)明水凝膠的方法，按照下述步驟進(jìn)行：

將2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶解在溶劑中，通過(guò)引發(fā)劑引發(fā)2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸和交聯(lián)劑分子上的不飽和鍵，在絕氧的條件下通過(guò)自由基聚合反應(yīng)制備出具有形狀記憶功能的高強(qiáng)度水凝膠。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，以2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和丙烯酸作為共聚單體，以交聯(lián)劑交聯(lián)共聚單體，交聯(lián)劑分子的分子鏈兩端帶有雙鍵、分子鏈中間為“氧-碳-碳-氧”單鍵相連的骨架結(jié)構(gòu)(即聚乙二醇分子的主鏈結(jié)構(gòu)，(CH₂CH₂O)_n，采用熱源或者光源使引發(fā)劑提供自由基，再由自由基引發(fā)2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸 和交聯(lián)劑(如不同數(shù)均分子量的聚乙二醇二丙烯酸酯，Mn為500-4000)中的雙鍵，使三者幾乎同時(shí)引發(fā)，發(fā)生聚合反應(yīng)，最終制備的水凝膠材料中，具有聚2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、聚丙烯酸和交聯(lián)劑三種物質(zhì)的鏈段，其中2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪提供骨架中的力學(xué)性能，丙烯酸提供骨架中的強(qiáng)吸水性，交聯(lián)劑中的聚乙二醇結(jié)構(gòu)提供柔性鏈段，上述三部分協(xié)同作用，使整個(gè)水凝膠材料體現(xiàn)出高強(qiáng)度、高壓縮和形狀記憶功能。

利用引發(fā)劑提供的自由基引發(fā)2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸和交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)。其中引發(fā)劑可以選擇高分子聚合領(lǐng)域中常用的熱引發(fā)劑，如偶氮二異丁腈(ABIN)、過(guò)氧化苯甲酰(BPO)，或者光引發(fā)劑，如1-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2′，2′-二甲基乙酮(Irgacure 2959)、甲基乙烯基酮、安息香。如果選擇熱引發(fā)劑，則需要首先利用惰性氣體(如氮?dú)狻鍤饣蛘吆?排除反應(yīng)體系中的氧，以避免其的阻聚作用，然后根據(jù)引發(fā)劑的活性和用量，將反應(yīng)體系加熱到所用引發(fā)劑的引發(fā)溫度之上并保持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，如1h以上或者更長(zhǎng)(1-5h)，以促使引發(fā)劑能夠長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生足夠多的自由基，引發(fā)反應(yīng)體系持續(xù)發(fā)生自由基聚合反應(yīng)，最終制備本發(fā)明的水凝膠。如果選擇光引發(fā)劑，則可以選用透明密閉的反應(yīng)容器，在紫外光照射的條件下引發(fā)自由基聚合，由于光引發(fā)效率高于熱引發(fā)，因根據(jù)所選引發(fā)劑的活性和用量調(diào)整照射時(shí)間時(shí)，照射時(shí)間可短于熱引發(fā)的加熱時(shí)間，如20分鐘或者更長(zhǎng)(30min-1h)。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸選擇使用的引發(fā)劑、交聯(lián)劑的溶解性，選擇能夠完全溶解上述四種物質(zhì)或者能夠與上述四種物質(zhì)完全互溶的溶劑，以混合均勻反應(yīng)體系。由于2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸有極性，引發(fā)劑和交聯(lián)劑也要能夠溶解在極性溶劑中，因此可選擇有機(jī)溶劑中的極性溶劑，如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋喃、二甲基亞砜。

在制備方案中，單體2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸的質(zhì)量比為(1-10)：1。交聯(lián)劑質(zhì)量與兩種單體(2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸)的質(zhì)量和的比為1：2。引發(fā)劑的質(zhì)量為單體與交聯(lián)劑總質(zhì)量的3％。在反應(yīng)結(jié)束后，從反應(yīng)容器中取出共聚物，去除未參加反應(yīng)的單體、引發(fā)劑、交聯(lián)劑和溶劑后，浸泡在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中直至達(dá)到溶脹平衡(如浸泡3天，每隔12h更換一次水，達(dá)到溶脹平衡)。

本發(fā)明提供的一種高強(qiáng)度PVDT-co-PAA水凝膠是以2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸為原料，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑存在下共聚制成，實(shí)現(xiàn)將2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪的分子間氫鍵和丙烯酸離子響應(yīng)性協(xié)同作用，同時(shí)綜合了聚乙二醇的性質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗拉伸和抗壓縮能力，同時(shí)能夠響應(yīng)離子刺激實(shí)現(xiàn)形狀記憶。并且在2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸的質(zhì)量比為(1-2)：1時(shí)，PVDT-co-PAA水凝膠能夠響應(yīng)離子刺激，發(fā)生劇烈的體積收縮。在2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸的質(zhì)量比為(1-2):1的PVDT-co-PAA水凝膠上培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞能很好的粘附在水凝膠上。當(dāng)加入離子溶液如鈣離子溶液時(shí)，細(xì)胞會(huì)從凝膠表面脫附，實(shí)現(xiàn)無(wú)損脫細(xì)胞。此凝膠制備方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)品易于長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸。

本發(fā)明提供的一種高強(qiáng)度PVDT-co-PAA水凝膠是以2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸為原料，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑存在下共聚制成，實(shí)現(xiàn)將2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪的分子間氫鍵和丙烯酸離子響應(yīng)性協(xié)同作用，同時(shí)綜合了聚乙二醇的性質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗拉伸和抗壓縮能力，同時(shí)能夠響應(yīng)離子刺激實(shí)現(xiàn)形狀記憶。并且在2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸的質(zhì)量比為(1-2)：1時(shí)，PVDT-co-PAA水凝膠能夠響應(yīng)離子刺激，發(fā)生劇烈的體積收縮。在2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸的質(zhì)量比為(1-2):1的PVDT-co-PAA水凝膠上培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞能很好的粘附在水凝膠上。當(dāng)加入離子溶液如鈣離子溶液時(shí)，細(xì)胞會(huì)從凝膠表面脫附，實(shí)現(xiàn)無(wú)損脫細(xì)胞。此凝膠制備方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)品易于長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的水凝膠在37℃,100mmol L^-1氯化鈣水溶液和50mmol L^-1EDTA^.2Na水溶液中實(shí)現(xiàn)形狀記憶的過(guò)程示意圖。

圖2是本發(fā)明的水凝膠在100mmol L^-1氯化鈣水溶液中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞脫附的顯微鏡圖，其中圖2(一)為細(xì)胞接種在PVDT-PAA-1凝膠上，圖2(二)為加入100mmol L^-1氯化鈣水溶液后，細(xì)胞從凝膠上脫附下來(lái)。圖2(三)為細(xì)胞接種在PVDT-PAA-2凝膠上，圖2(四)為加入100mmol L^-1氯化鈣水溶液后，細(xì)胞從凝膠上面脫附下來(lái)。

圖3是本發(fā)明水凝膠的傅里葉變換紅外吸收光譜圖，其中(一)為PVDT-AA-2水凝膠，(二)為PVDT-AA-6水凝膠。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1

將單體2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(91mg，Tokyo Kasei Kogyo)，丙烯酸(9mg，約9μl，sigma)，和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(50mg，數(shù)均分子量4000，sigma)加入到1.5ml離心管中，用800μl的二甲基亞砜(DMSO)溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(6mg，1-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2′，2′-二甲基乙酮，sigma)。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱(XL-1000UV，Spectronics Corporation)中照射40min，以充分引發(fā)自由基聚合。隨后打開(kāi)模具取出凝膠，用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗數(shù)次，并浸泡3天，每隔12h更換上述磷酸鹽緩沖溶液，得到實(shí)施例1制備的高強(qiáng)度形狀記憶水凝膠，記為PVDT-PAA-10。

實(shí)施例2

將單體2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(91mg，Tokyo Kasei Kogyo)，丙烯酸(9mg，約9μl，sigma)，和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(100mg，數(shù)均分子量4000，sigma)加入到1.5ml離心管中，用800μl的二甲基甲酰胺溶解單體和交聯(lián)劑后，加入偶氮二異丁腈(ABIN)4mg。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，將反應(yīng)體系加熱到所用引發(fā)劑的引發(fā)溫度之上并保持該引發(fā)溫度1h，以充分引發(fā)自由基聚合。隨后打開(kāi)模具取出凝膠，用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗數(shù)次，并浸泡3天，每隔12h更換上述磷酸鹽緩沖溶液，得到實(shí)施例2制備的高強(qiáng)度形狀記憶水凝膠，記為PVDT-PAA-1。

實(shí)施例3

將單體2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(91mg，Tokyo Kasei Kogyo)，丙烯酸(9mg，約9μl，sigma)，和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(34mg，數(shù)均分子量4000，sigma)加入到1.5ml離心管中，用800μl的二甲基乙酰胺溶解單體和交聯(lián)劑后，加入偶氮二異丁腈7mg。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，將反應(yīng)體系加熱到所用引發(fā)劑的引發(fā)溫度之上并保持該引發(fā)溫度5h，以充分引發(fā)自由基聚合。隨后打開(kāi)模具取出凝膠，用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗數(shù)次，并浸泡3天，每隔12h更換上述磷酸鹽緩沖溶液，得到實(shí)施例3制備的高強(qiáng)度形狀記憶水凝膠，記為PVDT-PAA-2。

實(shí)施例4

將單體2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(9mg，Tokyo Kasei Kogyo)，丙烯酸(9mg，約9μl，sigma)，和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(9mg，數(shù)均分子量500，sigma)加入到1.5ml離心管中，用800μl的四氫呋喃溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑安息香0.8mg，將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱(XL-1000UV，Spectronics Corporation)中照射1h，以充分引發(fā)自由基聚合。隨后打開(kāi)模具取出凝膠，用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗數(shù)次，并浸泡3天，每隔12h更換上述磷酸鹽緩沖溶液，得到實(shí)施例4制備的高強(qiáng)度形狀記憶水凝膠，記為PVDT-PAA-6。

對(duì)本發(fā)明制備的水凝膠進(jìn)行紅外測(cè)試，以PVDT-AA-2水凝膠和PVDT-AA-6水凝膠為例，說(shuō)明水凝膠的成功制備，2915，1070和1437cm^-1特征峰分別是交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯的C-H，C-O-C的伸縮振動(dòng)峰和-CH2-的彎曲振動(dòng)峰。2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪的特征峰是3200,1640,1544cm-1，分別屬于N-H，C＝N和C-N的伸縮振動(dòng)。3330cm-1處強(qiáng)烈的吸收峰是丙烯酸的羥基伸縮振動(dòng)峰。

按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能，形狀記憶和脫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mm×10mm，厚為500μm。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱，壓縮儀器：電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，廠商：濟(jì)南時(shí)代試金有限公司，型號(hào)：WDW-05。測(cè)量條件：常溫空氣環(huán)境，壓縮速率為每分鐘10mm。

利用如下方法檢測(cè)本發(fā)明的2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸(PVDT-PAA)水凝膠的形狀記憶功能：將片狀水凝膠切條，長(zhǎng)95mm，寬5mm，厚度0.5mm，折疊成U型放入100mmol L^-1氯化鈣溶液中，并浸泡十二小時(shí)，之后將凝膠取出，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)固定成U型，之后將U型凝膠放入50mmol L^-1EDTA2Na溶液中，凝膠在兩個(gè)半小時(shí)后恢復(fù)成直條，此過(guò)程可重復(fù)多次。同時(shí)還可將凝膠固定成金字塔形，立方體形，螺旋形。

利用如下方法檢測(cè)本發(fā)明的2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、丙烯酸(PVDT-PAA)的無(wú)損脫細(xì)胞功能。用消毒乙醇(75％)浸泡PVDT-PAA-1與PVDT-PAA-2水凝膠十二小時(shí)，之后將凝膠轉(zhuǎn)入96孔板中。用磷酸鹽緩沖液浸泡凝膠十二小時(shí)，達(dá)到溶脹平衡狀態(tài)。之后將大鼠成纖維細(xì)胞(L929)種植到凝膠表面，種植密度約1×10⁴/每孔。之后加入有10％牛血清的RPMI培養(yǎng)液，在37℃，5％二氧化碳濃度下培養(yǎng)二十四小時(shí)。之后將培養(yǎng)液換成磷酸鹽緩沖溶液，之后小心吸出磷酸鹽緩沖溶液，加入100mmol L^-1氯化鈣水溶液，然后靜置15分鐘。之后用吸管輕輕攪動(dòng)孔板中的氯化鈣溶液來(lái)幫助細(xì)胞脫落。之后檢測(cè)凝 膠的脫細(xì)胞率以及脫下的細(xì)胞活性，結(jié)果表明細(xì)胞繼續(xù)保持活性，即本發(fā)明的水凝膠作為支架培養(yǎng)大鼠成纖維細(xì)胞L929，使用100mmolL^-1氯化鈣水溶液進(jìn)行脫除細(xì)胞。

脫下的細(xì)胞活性檢測(cè)方法。將脫下的細(xì)胞重新培養(yǎng)在新的孔板上，并在之后加入有10％牛血清的RPMI培養(yǎng)液，在37℃，5％二氧化碳濃度下培養(yǎng)十二小時(shí)，之后檢測(cè)細(xì)胞活性。

將上述各個(gè)不同組分制備的水凝膠樣品性能參數(shù)詳見(jiàn)下表?？梢?jiàn)本發(fā)明的水凝膠具有很強(qiáng)的抗拉伸、抗壓縮能力，同時(shí)具有形狀記憶和無(wú)損脫細(xì)胞功能。

表1水凝膠樣品的各項(xiàng)力學(xué)性能參數(shù)

90％壓縮強(qiáng)度是指樣品應(yīng)變到90％時(shí)的壓縮強(qiáng)度。

依照本發(fā)明技術(shù)方案的工藝條件進(jìn)行調(diào)整，例如反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、引發(fā)劑用量、交聯(lián)劑用量、單體用量和比例等均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明水凝膠的制備，且表現(xiàn)與上述實(shí)施例出基本相同的性質(zhì)，表現(xiàn)出水凝膠的固有特性，還具有很強(qiáng)的抗拉伸和抗壓縮能力，離子刺激形狀記憶功能和無(wú)損脫細(xì)胞功能。

以上對(duì)本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說(shuō)明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡(jiǎn)單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)的等同替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。