本發(fā)明涉及多肽的提取和純化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種多肽提取純化方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

隨著功能多肽和多肽組學(xué)的研究和應(yīng)用快速發(fā)展，如何快速高效地從分析樣本中提取并純化符合檢測要求的多肽成分顯得越來越重要，成為多肽科學(xué)研究、多肽藥物開發(fā)和多肽臨床檢測等方向非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

多肽的廣義定位為兩個(gè)氨基酸以上組成的肽類物質(zhì)，但更多指的是狹義上的低分子量短肽，在10～100個(gè)氨基酸長度范圍內(nèi)，而且這些短肽是來自于生物體內(nèi)源性酶切產(chǎn)生的多肽，而非人為酶切或化學(xué)合成的，是生物體內(nèi)自然表現(xiàn)形式的一系列短肽。這些多肽廣泛存在于各種體液以及組織細(xì)胞中，有些具有高度特異性，有些甚至具有重要未知功能，含有豐富但并未被很好地認(rèn)識和開發(fā)的活性成分、免疫因子和效應(yīng)分子等，包括多肽生物標(biāo)志物。這些低分子量范圍的多肽分子可以作為腫瘤特異性診斷的豐富資源，因?yàn)樗鼈冇涗浟四[瘤組織微環(huán)境中胞內(nèi)胞外發(fā)生的一系列酶催化反應(yīng)事件，反映相關(guān)分子機(jī)制，因此具有非常重要的研究意義和應(yīng)用前景，高效研究多肽的工具和方法同時(shí)也顯得尤為重要，亟待開發(fā)。而多肽的分子量通常介于小分子化合物代謝物和大分子蛋白質(zhì)之間，因此需要有效的提取和純化方法將其與小分子代謝物以及大分子蛋白質(zhì)分離，以更好地提供后續(xù)檢測和分析研究。

多肽提取和純化方法原理上主要有酸提取法、有機(jī)溶液提取法、勻漿或研磨提取法、超聲法、沉淀法、超濾法、磁珠法、固相萃取法、免疫親和法、色譜分離法和納米孔材料法中一種或多種方法的組合。但是，目前還缺乏對這些方法進(jìn)行有效結(jié)合和優(yōu)化的方案，有待形成一套適用性廣、提取純化效率高的整合方法以及相應(yīng)試劑盒產(chǎn)品。

目前，國內(nèi)還沒有出現(xiàn)適用于大規(guī)模樣本高通量多肽組研究和功能多肽研究、多肽藥物開發(fā)的高效多肽提取純化方法和相應(yīng)試劑盒。DNA、RNA、蛋白質(zhì)的提取純化已有較多技術(shù)專利和試劑盒產(chǎn)品，但是多肽方面還存在空白。國外僅有一個(gè)多肽提取試劑盒產(chǎn)品“Stabilizor^TM Peptide Extraction Kit”，但這個(gè)試劑盒只適用于組織樣本類型的多肽提取，而且需要與Stabilizor system配套使用， 具有很大的使用局限性。另外其提取效果也存在較多與后續(xù)質(zhì)譜檢測鑒定不兼容的地方，只有提取，沒有純化，還需要再進(jìn)一步進(jìn)行還原烷基化處理和純化等步驟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種適用性廣、操作簡便、高效穩(wěn)定且成本較低的多肽提取純化方法和試劑盒。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種多肽提取純化方法，該方法包括以下步驟：

多肽提?。簩⒋崛颖九c含有蛋白質(zhì)多肽變性劑和蛋白酶抑制劑的緩沖液混合，反應(yīng)后分離上清液；

還原烷基化處理：取上述上清液與還原劑混合進(jìn)行還原反應(yīng)，然后加入烷基化試劑進(jìn)行烷基化反應(yīng)；

多肽富集純化：

a)使上述還原烷基化處理后的樣品通過能夠結(jié)合多肽的萃取器，該萃取器預(yù)先用洗脫緩沖液清洗并活化然后用清洗液清洗并平衡；任選地，重復(fù)該步驟至少一次；

b)使清洗液通過上述萃取器以去除不結(jié)合的非多肽物質(zhì)；任選地，重復(fù)該步驟至少一次；

c)依次使洗脫緩沖液和清洗液通過上述萃取器并收集穿透液；任選地，重復(fù)該步驟至少一次，并混合上述穿透液；

任選地，將上述穿透液離心抽干得到純化后的多肽。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述方法還包括：

多肽進(jìn)一步純化：

d)用超濾器超濾上述穿透液或上述純化后的多肽溶解后得到的溶液，上述超濾器預(yù)先用清洗液清洗并平衡、能夠截留分子量大于待純化多肽的蛋白成分；

e)用洗脫液洗脫上述超濾器并收集濾過液；任選地，重復(fù)該步驟至少一次，并混合上述濾過液；

任選地，將上述濾過液離心抽干得到進(jìn)一步純化后的多肽。

本發(fā)明中，上述待提取樣本可以選自組織類樣本、體液類樣本或細(xì)胞類樣本中的一種或多種的混合。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述組織類樣本是提前勻漿或液氮研磨 的，上述組織類樣本與上述緩沖液按質(zhì)量體積比(g/ml)或體積比(ml/ml)為1：1～1：10混合，混合后渦旋震蕩或冰浴超聲處理，然后離心取上清液。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述體液類樣本包括血清、血漿、腦脊液、精漿、唾液或尿液，上述體液類樣本與上述緩沖液按體積比(ml/ml)為1：1～1：10混合，優(yōu)選混合稀釋至樣品蛋白濃度為1～10mg/ml，混合后渦旋震蕩，然后離心取上清液。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述細(xì)胞類樣本與上述緩沖液按體積比(ml/ml)為1：3～1：10混合，優(yōu)選混合稀釋至樣品蛋白濃度為1～10mg/ml，混合后渦旋震蕩或冰浴超聲處理，然后離心取上清液。

本發(fā)明中，上述蛋白質(zhì)多肽變性劑可以選自尿素、鹽酸胍或硫脲中的一種或多種的混合。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述蛋白質(zhì)多肽變性劑在上述緩沖液中的濃度為6～10mol/L，上述蛋白酶抑制劑在上述緩沖液中的濃度為0.2～1mg/ml，上述緩沖液的pH緩沖范圍為7～10。

本發(fā)明中，上述還原劑可以選自二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巰基乙醇中的一種或多種的混合。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述還原劑的母液濃度為0.1～1.5mol/L，工作濃度為5～50mmol/L，上述還原反應(yīng)的溫度為50～65℃，時(shí)間為30～70min。

本發(fā)明中，上述烷基化試劑可以是碘代乙酰胺。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述烷基化試劑的母液濃度為0.1～1mol/L，工作濃度為20～100mmol/L，上述烷基化反應(yīng)的溫度為15～30℃，時(shí)間為30～60min。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述萃取器為萃取柱，優(yōu)選為C18固相萃取柱。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，采用配置的推氣筒推動上述樣品、洗脫緩沖液和清洗液通過上述萃取器。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述清洗液為可揮發(fā)性酸性水溶液，更優(yōu)選為甲酸水溶液、乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選地，上述可揮發(fā)性酸性水溶液中酸的含量為0.05～1wt％，pH值范圍為2～4。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述洗脫緩沖液選自可揮發(fā)可溶于水的有機(jī)溶液，更優(yōu)選為80～100體積％的乙腈水溶液或80～100體積％的甲醇水溶液。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述超濾器為超濾管。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述洗脫液為可揮發(fā)可溶于水的有機(jī)溶劑水溶液，更優(yōu)選為甲醇水溶液或乙腈水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選地，上述甲醇水溶液或乙腈水溶液的濃度為5～20％(體積)。

本發(fā)明的多肽提取純化方法的一個(gè)較優(yōu)選的技術(shù)方案，包括以下步驟：

多肽提?。簩⑦x自組織類樣本、體液類樣本或細(xì)胞類樣本的待提取樣本與含有蛋白質(zhì)多肽變性劑和蛋白酶抑制劑的緩沖液按體積比(ml/ml)為1：1～1：10混合，混合后渦旋震蕩或冰浴超聲處理，然后離心取上清液；

還原烷基化處理：取上述上清液與選自二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巰基乙醇的還原劑混合進(jìn)行還原反應(yīng)，然后加入碘代乙酰胺進(jìn)行烷基化反應(yīng)；

多肽富集純化：

a)使上述還原烷基化處理后的樣品通過能夠結(jié)合多肽的萃取柱，該萃取柱預(yù)先用洗脫緩沖液清洗并活化然后用清洗液清洗并平衡，上述清洗液為甲酸水溶液、乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液；任選地，重復(fù)該步驟至少一次；

b)使清洗液通過上述萃取柱以去除不結(jié)合的非多肽物質(zhì)；任選地，重復(fù)該步驟至少一次；

c)依次使洗脫緩沖液和清洗液通過上述萃取柱并收集穿透液；任選地，重復(fù)該步驟至少一次，并混合上述穿透液；

d)將上述穿透液離心抽干得到純化后的多肽；

多肽進(jìn)一步純化：

e)用超濾管超濾上述純化后的多肽溶解后得到的溶液，上述超濾管預(yù)先用清洗液清洗并平衡、能夠截留分子量大于待純化多肽的蛋白成分；

f)用洗脫液洗脫上述超濾器并收集濾過液，所述洗脫液為甲醇水溶液或乙腈水溶液；任選地，重復(fù)該步驟至少一次，并混合上述濾過液；

g)將上述濾過液離心抽干得到進(jìn)一步純化后的多肽。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種多肽提取純化試劑盒，上述試劑盒包括以下組成部分：

多肽提取緩沖液：含有蛋白質(zhì)多肽變性劑和蛋白酶抑制劑，用于從待提取樣本中提取多肽，以得到分離的上清液；

還原烷基化試劑：包含還原劑和烷基化試劑，上述還原劑用于與上述上清液進(jìn)行還原反應(yīng)，上述烷基化試劑用于與上述還原反應(yīng)之后的樣品進(jìn)行烷基化 反應(yīng)；

萃取器：能夠結(jié)合待純化的多肽，用于富集純化上述還原烷基化處理后的樣品中的多肽，該萃取器使用前預(yù)先用洗脫緩沖液清洗并活化然后用清洗液清洗并平衡，使用時(shí)使上述還原烷基化處理后的樣品通過該萃取器，然后使清洗液通過該萃取器以去除不結(jié)合的非多肽物質(zhì)，再依次使洗脫緩沖液和清洗液通過該萃取器并收集穿透液。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述試劑盒還包括以下組成部分：

超濾器：能夠截留分子量大于待純化多肽的蛋白成分，用于對上述萃取器富集純化后的樣品進(jìn)行超濾，該超濾器使用前預(yù)先用清洗液清洗并平衡，使用時(shí)使上述萃取器富集純化后的樣品通過該超濾器，然后用洗脫液洗脫該超濾器并收集濾過液。

本發(fā)明中，上述蛋白質(zhì)多肽變性劑可以選自尿素、鹽酸胍或硫脲，濃度優(yōu)選為6～10mol/L；上述蛋白酶抑制劑在上述緩沖液中的濃度優(yōu)選為0.2～1mg/ml，上述緩沖液的pH緩沖范圍優(yōu)選為7～10。

本發(fā)明中，上述還原劑可以選自二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巰基乙醇，濃度優(yōu)選為0.1～1.5mol/L。

本發(fā)明中，上述烷基化試劑可以為碘代乙酰胺，濃度優(yōu)選為0.1～1mol/L。

本發(fā)明中，上述萃取器優(yōu)選為萃取柱，更優(yōu)選為C18固相萃取柱；上述超濾器優(yōu)選為超濾管。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述試劑盒還包括：洗脫緩沖液、清洗液和洗脫液；進(jìn)一步優(yōu)選地，上述清洗液為可揮發(fā)性酸性水溶液，更優(yōu)選為甲酸水溶液、乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液，更進(jìn)一步優(yōu)選地，上述可揮發(fā)性酸性水溶液中酸的含量為0.05～1wt％，pH值范圍為2～4；進(jìn)一步優(yōu)選地，上述洗脫緩沖液選自可揮發(fā)可溶于水的有機(jī)溶液，更優(yōu)選為80～100體積％的乙腈水溶液或80～100體積％的甲醇水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選地，上述洗脫液為可揮發(fā)可溶于水的有機(jī)溶劑水溶液，更優(yōu)選為甲醇水溶液或乙腈水溶液，更進(jìn)一步優(yōu)選地，上述甲醇水溶液或乙腈水溶液的濃度為5～20％(體積)。

本發(fā)明的多肽提取純化方法和試劑盒適用于包括組織類樣本、體液類樣本或細(xì)胞類樣本在內(nèi)的所有類型樣本的多肽提取和純化，尤其適用于后續(xù)基于質(zhì)譜的多肽組定性和定量研究分析。本發(fā)明的方法和試劑盒操作簡便快速，適用于常規(guī)生物實(shí)驗(yàn)室，其多肽提取效率、富集純化效率以及回收率高，且與后續(xù) 實(shí)驗(yàn)步驟兼容性高，實(shí)驗(yàn)操作周期短，重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)成本低，有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模樣本的高通量處理和檢測，可應(yīng)用于各種多肽定性和定量研究、多肽藥物開發(fā)以及其它多肽產(chǎn)品開發(fā)，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織樣本富集后的多肽MALDI-TOF質(zhì)譜檢測圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)血漿樣本多肽富集純化后的多肽MALDI-TOF質(zhì)譜檢測圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2的兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)血漿樣本多肽富集純化后的多肽LC-MS/MS質(zhì)譜定量檢測結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3的兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞樣本多肽富集后的多肽MALDI-TOF質(zhì)譜檢測圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。除非特別說明，下面實(shí)施例中所使用的技術(shù)均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用的儀器設(shè)備和試劑等，均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以通過公共途徑如商購等獲得的。

本發(fā)明的關(guān)鍵構(gòu)思之一在于，對多肽提取和純化方法進(jìn)行優(yōu)化和整合，通過蛋白質(zhì)多肽變性、還原烷基化處理以及使用萃取器并配合洗脫緩沖液和清洗液的使用，以及對操作過程和溶液使用順序的優(yōu)化，使得洗脫效率最大化，實(shí)現(xiàn)增加多肽的回收率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)適用性廣、操作簡便、高效穩(wěn)定且成本較低的多肽提取純化。

本發(fā)明的進(jìn)一步構(gòu)思在于，在萃取器富集純化多肽以后，使用超濾器進(jìn)行超濾處理，實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步截留分子量偏大的蛋白成分，并且具有高回收率和高重復(fù)性的效果。

本發(fā)明的多肽提取純化方法基本上包括以下步驟：

多肽提?。簩⒋崛颖九c含有蛋白質(zhì)多肽變性劑和蛋白酶抑制劑的緩沖液混合，反應(yīng)后分離上清液；

還原烷基化處理：取上述上清液與還原劑混合進(jìn)行還原反應(yīng)，然后加入烷基化試劑進(jìn)行烷基化反應(yīng)；

多肽富集純化：

a)使上述還原烷基化處理后的樣品通過能夠結(jié)合多肽的萃取器，該萃取器預(yù)先用洗脫緩沖液清洗并活化然后用清洗液清洗并平衡；任選地，重復(fù)該步驟至少一次；

b)使清洗液通過上述萃取器以去除不結(jié)合的非多肽物質(zhì)；任選地，重復(fù)該步驟至少一次；

c)依次使洗脫緩沖液和清洗液通過上述萃取器并收集穿透液；任選地，重復(fù)該步驟至少一次，并混合上述穿透液；

任選地，將上述穿透液離心抽干得到純化后的多肽。

針對上述方案作以下說明：

“任選地”是指可以有該特征，也可以沒有該特征。權(quán)利要求書和說明書其它部分出現(xiàn)的“任選地”，如果沒有其它特別說明，也是該含義。

本發(fā)明的方法適用于組織類樣本、體液類樣本或細(xì)胞類樣本類型的待提取樣本，相比現(xiàn)有的只適用于組織樣本類型的多肽提取，具有明顯的適用性廣的優(yōu)勢。其中，組織類樣本比如腦組織、腎臟組織、神經(jīng)組織、結(jié)締組織、肌肉組織或上皮組織等；體液類樣本比如血清、血漿、腦脊液、精漿、唾液或尿液等；細(xì)胞類樣本比如人成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞或神經(jīng)元等，可以是從生物體內(nèi)分離的細(xì)胞，也可以是體外培養(yǎng)的細(xì)胞。

蛋白質(zhì)多肽變性劑是指使得蛋白質(zhì)和多肽以及多肽性物質(zhì)發(fā)生變性的物質(zhì)。這樣的變性劑比如可以是尿素、鹽酸胍或硫脲等，其濃度可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識和經(jīng)驗(yàn)確定。但是發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：蛋白質(zhì)多肽變性劑在上述緩沖液中的濃度在6～10mol/L范圍內(nèi)(例如6mol/L、7mol/L、8mol/L、9mol/L或10mol/L)能取得優(yōu)異效果，尤其是7mol/L的尿素；蛋白酶抑制劑的作用在于抑制蛋白質(zhì)受蛋白酶的作用而降解生成多肽，防止最終提取到的多肽物質(zhì)中混有蛋白質(zhì)體外降解的成分，不能真實(shí)反映生物體內(nèi)的多肽存在狀況。這樣的抑制劑比如ROCHE的蛋白酶抑制劑Cocktail(Protease Inhibitor Cocktail)或者SIGMA的蛋白酶抑制劑Cocktail，蛋白酶抑制劑在上述緩沖液中的濃度在0.2～1mg/ml范圍內(nèi)能取得優(yōu)異效果。上述緩沖液的pH緩沖范圍在7～10范圍內(nèi)(例如7、7.5、8、8.5、9、9.5或10)能取得優(yōu)異效果，尤其是pH為9效果更加優(yōu)異。本發(fā)明的緩沖液中的變性劑有利于增加多肽的溶解性，增加提取效率，且有利于后續(xù)還原烷基化效率，相比目前常報(bào)道的多肽提取方法——酸提取或有機(jī)溶劑提取，具有明顯優(yōu)勢；蛋白酶抑制劑有效防止蛋白質(zhì)在體外進(jìn)一步降 解，大大減小內(nèi)源性多肽的假陽性率。

針對組織類樣本、體液類樣本和細(xì)胞類樣本三類樣本，可以采用基本相同但有略有差異的操作方法實(shí)現(xiàn)多肽提取。例如本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的多肽提取及緩沖液(稱為Buffer A)如下。

多肽提取及緩沖液(Buffer A)：

該緩沖液中含有蛋白質(zhì)多肽變性劑(例如6M-10M、優(yōu)選7M的尿素、鹽酸胍或硫脲)和蛋白酶抑制劑(濃度0.2-1mg/ml)混合物，pH緩沖范圍7-10(優(yōu)選9)。

操作方法：

(1)組織類樣本提前勻漿或液氮研磨，得到勻漿液或粉末后按樣品：Buffer A＝1g:1ml至1g:10ml(質(zhì)量體積比)，或樣品：Buffer A＝1ml:1ml至1ml：10ml(體積比)與Buffer A混合，室溫(15-30℃)渦旋震蕩5-10min，或冰浴超聲處理1-3min；10000g離心5min，取上清。

(2)血清、血漿、腦脊液、精漿、唾液或尿液等體積較小、蛋白濃度較高的體液直接按照樣品:Buffer A＝1:1至1:10(體積比)與Buffer A混合，優(yōu)選混合稀釋至樣品蛋白濃度為1-10mg/ml，室溫(15-30℃)渦旋震蕩1-5min；10000g離心5min，取上清。如果尿液等體積較大，蛋白濃度較低的體液，提前抽干濃縮或先富集濃縮成較小體積液體后再按照上述步驟(2)操作。

(3)細(xì)胞類樣本直接按照樣品:Buffer A＝1:3至1:10(體積比)與Buffer A混合，優(yōu)選混合稀釋至樣品蛋白濃度為1-10mg/ml，室溫(15-30℃)渦旋震蕩5-10min，或冰浴超聲處理1-3min；10000g離心5min，取上清。

還原烷基化處理的目的在于通過還原劑還原多肽中的二硫鍵，通過烷基化試劑使二硫鍵還原生成的半胱氨酸發(fā)生烷基化，從而利于后續(xù)的多肽富集純化操作，并且純化出來的多肽不需要再進(jìn)一步進(jìn)行還原烷基化處理和其它純化操作就可以進(jìn)行后續(xù)應(yīng)用，如質(zhì)譜檢測等。

還原劑可以選用二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巰基乙醇等，一般還原劑配成0.1～1.5mol/L(例如0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L、1mol/L、1.3mol/L或1.5mol/L)的母液濃度，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)工作濃度在5～50mmol/L范圍內(nèi)(例如5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L或50mmol/L)能起到較好的還原效果，還原反應(yīng)的溫度在50～65℃范圍內(nèi)(例如50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、 64℃或65℃)較好，一般還原時(shí)間在30～70min(例如30min、40min、50min、60min或70min)。

典型的烷基化試劑可以選用碘代乙酰胺，從烷基化的目的考慮，任何具有烷基化作用的試劑均可用于本發(fā)明中。一般烷基化試劑配置成0.1～1mol/L(例如0.1mol/L、0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L、0.55mol/L、0.65mol/L、0.75mol/L、0.85mol/L、0.9mol/L或1mol/L)的母液濃度，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)工作濃度在20～100mmol/L范圍內(nèi)(20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L或100mmol/L)能起到較好的烷基化效果，烷基化反應(yīng)的溫度在15～30℃范圍內(nèi)(例如15℃、17℃、19℃、21℃、22℃、24℃、26℃、28℃或29℃)較好，一般烷基化時(shí)間在30～60min(例如30min、40min、50min或60min)。

本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的還原烷基化及試劑如下：

還原烷基化及試劑：試劑A(Reagent A)和試劑B(Reagent B)。

Reagent A含有還原劑(例如0.1M-1.5M、優(yōu)選0.5M的二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或β-巰基乙醇)，Reagent B含有烷基化試劑(例如0.1-1M、優(yōu)選0.85M的碘代乙酰胺)。

操作方法：

(1)樣品與Buffer A混合變性后，加入Reagent A使還原劑(如二硫蘇糖醇)終濃度為5-50mM(優(yōu)選20mM)，50-65℃(優(yōu)選60℃)水浴反應(yīng)30-70min(優(yōu)選50min)。

(2)待水浴反應(yīng)完，取出放置冷卻至室溫后加入Reagent B使烷基化試劑(如碘代乙酰胺)終濃度為20-100mM(優(yōu)選80mM)，室溫(15-30℃)暗室放置30-60min(優(yōu)選45min)。

多肽富集純化過程中使用的萃取器，用于富集純化多肽，可以是萃取柱或萃取塔等，優(yōu)選萃取柱，更優(yōu)選C18固相萃取柱，例如Phenomenex公司的Strata-X C18萃取柱。本發(fā)明中的萃取器可以稱作PepExtracter，其可以通過推氣筒例如手動推氣筒(可以稱作ManuPusher)來推動液體樣品及緩沖液經(jīng)過PepExtracter，可采用普通10ml注射器推筒。本發(fā)明的多肽富集所用的PepExtracter操作簡便，富集效率高，重復(fù)性好。

多肽富集純化過程中使用的清洗液(稱作Buffer B)的作用是清洗去除不與PepExtracter結(jié)合的非多肽物質(zhì)，同時(shí)也作為后續(xù)使用的超濾器(SpinFilter)的 清洗液；洗脫緩沖液(稱作Buffer C)的作用一是活化PepExtracter，作用二是洗脫與PepExtracter結(jié)合的多肽物質(zhì)。

Buffer B含有可揮發(fā)性酸性水溶液(例如0.05-1wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.15wt％或1.0wt％、優(yōu)選0.15wt％的甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液，pH值范圍一般為2～4)，Buffer C含有可揮發(fā)可溶于水的有機(jī)溶液(例如80～100體積％的乙腈水溶液或80～100體積％的甲醇水溶液)。

上述多肽富集純化過程的步驟a)的作用是將樣品中多肽物質(zhì)與PepExtracter結(jié)合，非多肽物質(zhì)不結(jié)合而流出，回收穿透液再重復(fù)一次的目的是增加多肽與PepExtracter的結(jié)合機(jī)會，增加回收率，其效果更佳。

上述多肽富集純化過程的步驟b)的作用是去除不與PepExtracter結(jié)合的非多肽物質(zhì)，起到凈化作用，重復(fù)操作1-2次凈化作用更加充分。

上述多肽富集純化過程的步驟c)的作用是洗脫與PepExtracter結(jié)合的多肽物質(zhì)，發(fā)明人深入研究發(fā)現(xiàn)，洗脫緩沖液和清洗液的交替使用能夠使洗脫效率大大提高；如果步驟c)重復(fù)1-2次，那么多次洗脫緩沖液和清洗液的切換使用能夠使洗脫效率最大化，這一點(diǎn)已經(jīng)經(jīng)過測試確證。步驟c)得到的穿透液在一些情況下可以直接用于后續(xù)分析或進(jìn)一步純化，在其它情況下可以將穿透液離心抽干得到純化后的多肽，再用于后續(xù)分析或進(jìn)一步純化。

為了進(jìn)一步提升純化效果，還可以采用超濾器對上述萃取器純化過的多肽進(jìn)一步純化，即上述方法還包括：

d)用超濾器超濾上述混合后的穿透液或上述純化后的多肽溶解后得到的溶液，上述超濾器預(yù)先用清洗液清洗并平衡、能夠截留分子量大于待純化多肽的蛋白成分；

e)用洗脫液洗脫上述超濾器并收集濾過液；任選地，重復(fù)該步驟至少一次，并混合上述濾過液；

任選地，將上述濾過液離心抽干得到進(jìn)一步純化后的多肽。

對上述進(jìn)一步純化過程說明如下：

上述超濾器(可稱為SpinFilter)可以是超濾管或超濾膜，優(yōu)選超濾管，如Sartorius公司的Vivacon500 10KD超濾管。

步驟d)中的清洗液可以與上述步驟a)至c)中的清洗液相同。

步驟e)中的洗脫液(可稱為Buffer D)選用可揮發(fā)可溶于水的有機(jī)溶劑水溶液，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)甲醇水溶液或乙腈水溶液效果較好，更優(yōu)選濃度為5～20％(體 積)的甲醇水溶液或乙腈水溶液的，洗脫液的作用是洗脫與SpinFilter結(jié)合殘留的多肽物質(zhì)，增加多肽回收率。

通過超濾能夠截留分子量偏大的蛋白成分，純化分子量偏小的多肽成分。要強(qiáng)調(diào)的是，在超濾器超濾完之后，再使用洗脫液(Buffer D)洗脫SpinFilter中吸附殘留的多肽成分，可以很大程度地提高純化回收率；另外，超濾與步驟c)的操作順序也是關(guān)鍵，即PepExtracter和SpinFilter的先后使用順序，本發(fā)明的操作順序可以很好地解決高蛋白濃度樣品在分子量截留超濾時(shí)常出現(xiàn)的堵塞所導(dǎo)致的回收率低和實(shí)驗(yàn)時(shí)間長等問題，可以達(dá)到高回收率和高重復(fù)性效果。

本發(fā)明的多肽進(jìn)一步純化所用的SpinFilter以及Buffer D提升了多肽純化效果并大大增加了多肽回收率，目前Buffer D的使用尚未見報(bào)道。另外，優(yōu)化的多肽富集純化操作順序解決了高蛋白濃度樣品離心難的問題，提高實(shí)驗(yàn)操作簡易度，同時(shí)提高了整體多肽富集純化效果。

本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的多肽富集純化及裝置、進(jìn)一步純化及裝置說明如下：

多肽富集純化及裝置：PepExtracter采用Phenomenex公司的Strata-X C18萃取柱；ManuPusher采用普通10ml注射器推筒；SpinFilter采用Sartorius公司的Vivacon500 10KD超濾管。這些裝置配合后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作步驟可達(dá)到良好的富集純化效果。

操作方法：

(1)移取1ml Buffer C至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer C以3滴/秒的速度推出PepExtracter。

(2)移取1ml Buffer B至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以3滴/秒的速度推出PepExtracter。

(3)移取步驟(2)還原烷基化之后的樣品至PepExtracter中，用ManuPusher將樣品以1滴/秒的速度推出PepExtracter；如樣品體積大于PepExtracter容積可分多次進(jìn)行。樣品從PepExtracter推出后的穿透液可放回PepExtracter中再重復(fù)一次操作效果更佳。

(4)移取1ml Buffer B至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以3滴/秒的速度推出PepExtracter；重復(fù)操作該步驟1-2次。

(5)移取0.2ml Buffer C至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer C以0.5滴/秒的速度推出PepExtracter，收集穿透液；移取0.1ml Buffer B至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以0.5滴/秒的速度推出PepExtracter， 收集穿透液。

(6)重復(fù)步驟(5)兩次，然后將所有收集到的穿透液混合，離心抽干，則得到富集后的多肽，該多肽一般可直接用于后續(xù)質(zhì)譜等檢測分析，若要求更進(jìn)一步的純化，則往下按步驟7操作。

(7)移取0.4ml Buffer B至SpinFilter中，然后14000g離心10-15min至全部Buffer B甩出，棄甩出液；將富集并抽干后的樣品用0.2-0.4ml Buffer B溶解，然后移取至Buffer B清洗后的SpinFilter中，更換新的收集套管，14000g離心10-15min至全部樣品甩出，收集甩出液；移取0.3ml Buffer D至SpinFilter中，14000g離心10-15min至全部Buffer D甩出，收集甩出液；再移取0.3ml Buffer D至SpinFilter中，14000g離心10-15min至全部Buffer D甩出，收集甩出液；將所有收集的甩出液混合，離心抽干，即得進(jìn)一步純化后的多肽。

下面通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明的特征、效果和優(yōu)勢，應(yīng)當(dāng)理解實(shí)施例僅是示例性的，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1

一、組織樣本多肽提取及還原烷基化

取小鼠腦組織樣本分成兩份，每份0.1g，液氮研磨，得到粉末后按樣品：Buffer A＝1g:5ml(質(zhì)量體積比)加入0.5ml Buffer A(含7M尿素和0.5mg/ml蛋白酶抑制劑(ROCHE的Protease Inhibitor Cocktail)混合物，pH值9)，室溫渦旋震蕩5min，然后冰浴超聲處理1min，10000g離心5min，取上清。

往上清液加入Reagent A(含0.5M二硫蘇糖醇)使二硫蘇糖醇終濃度為20mM，渦旋震蕩混勻，60℃水浴反應(yīng)50分鐘，待水浴反應(yīng)完，取出放置冷卻至室溫后加入Reagent B(含0.85M碘代乙酰胺)使碘代乙酰胺終濃度為80mM，室溫暗室放置45min。

二、組織樣本多肽富集

1、移取1ml Buffer C(乙腈溶液)至PepExtracter(Phenomenex公司的Strata-X C18萃取柱)中，用ManuPusher(普通10ml注射器推筒)將Buffer C以3滴/秒的速度推出PepExtracter。

2、移取1ml Buffer B(0.15wt％甲酸水溶液)至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以3滴/秒的速度推出PepExtracter。

3、移取提取并還原烷基化之后的樣品至PepExtracter中，用ManuPusher將樣品以1滴/秒的速度推出PepExtracter。樣品從PepExtracter推出后的穿透液 放回PepExtracter中再重復(fù)一次操作。

4、移取1ml Buffer B至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以3滴/秒的速度推出PepExtracter。重復(fù)操作該步驟2次。

5、移取0.2ml Buffer C至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer C以0.5滴/秒的速度推出PepExtracter，收集穿透液；移取0.1ml Buffer B至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以0.5滴/秒的速度推出PepExtracter，收集穿透液。

6、重復(fù)上述步驟5兩次，然后將所有收集到的穿透液混合，離心抽干，則得到富集后的多肽。

三、組織樣本富集多肽的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測

使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)選擇一級質(zhì)譜檢測方法，分子量檢測范圍為700-3500道爾頓，樣品板上點(diǎn)樣1μl富集后的組織樣本多肽，烘干后點(diǎn)加0.3μl基質(zhì)(飽和CHCA)，旁邊另外一個(gè)點(diǎn)點(diǎn)加0.2μl標(biāo)準(zhǔn)品，烘干后將樣品靶放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。

兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織樣本富集后的多肽MALDI-TOF質(zhì)譜檢測圖如圖1所示，示出了粒子流的強(qiáng)度(Intens)與質(zhì)荷比(m/z)的關(guān)系，具有很高的富集效率和重復(fù)性。

實(shí)施例2

一、血漿樣本的多肽提取及還原烷基化

取0.1ml人血漿樣本，直接按照樣品:Buffer A＝1:5(體積比)與BufferA(含6M尿素和1mg/ml蛋白酶抑制劑(ROCHE的Protease Inhibitor Cocktail)混合物，pH值9)混合，室溫渦旋震蕩1min，10000g離心5min，取上清。

往上清液加入Reagent A(含1Mβ-巰基乙醇)使β-巰基乙醇終濃度為20mM，渦旋震蕩混勻，60℃水浴反應(yīng)1小時(shí)，待水浴反應(yīng)完，取出放置冷卻至室溫后加入Reagent B(含1M碘代乙酰胺)使碘代乙酰胺終濃度為80mM，室溫暗室放置45min。

二、血漿樣本的多肽富集純化

1、移取1ml Buffer C(乙腈溶液)至PepExtracter(Phenomenex公司的Strata-X C18萃取柱)中，用ManuPusher(普通10ml注射器推筒)將Buffer C以3滴/秒的速度推出PepExtracter。

2、移取1ml Buffer B(1wt％甲酸水溶液)至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以3滴/秒的速度推出PepExtracter。

3、移取提取并還原烷基化之后的樣品至PepExtracter中，用ManuPusher將樣品以1滴/秒的速度推出PepExtracter。樣品從PepExtracter推出后的穿透液放回PepExtracter中再重復(fù)一次操作。

4、移取1ml Buffer B至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以3滴/秒的速度推出PepExtracter。重復(fù)操作該步驟2次。

5、移取0.2ml Buffer C至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer C以0.5滴/秒的速度推出PepExtracter，收集穿透液；移取0.1ml Buffer B至PepExtracter中，用ManuPusher將Buffer B以0.5滴/秒的速度推出PepExtracter，收集穿透液。

6、重復(fù)上述步驟5兩次，然后將所有收集到的穿透液混合，離心抽干，則得到富集后的多肽。

7、移取0.4ml Buffer B至SpinFilter(Sartorius公司的Vivacon500 10KD超濾管)中，然后14000g離心10min至全部Buffer B甩出，棄甩出液。將富集并抽干后的樣品用0.3ml Buffer B溶解，然后移取至Buffer B清洗后的SpinFilter中，更換新的收集套管，14000g離心15min至全部樣品甩出，收集甩出液。移取0.3ml Buffer D至SpinFilter中，14000g離心15min至全部Buffer D甩出，收集甩出液。再移取0.3ml Buffer D(10％乙腈水溶液)至SpinFilter中，14000g離心15min至全部Buffer D甩出，收集甩出液。將所有收集的甩出液混合，離心抽干，即得進(jìn)一步純化后的多肽。

三、血漿樣本富集純化多肽的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測

使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)選擇一級質(zhì)譜檢測方法，分子量檢測范圍為700-3500道爾頓，樣品板上點(diǎn)樣1μl富集后的血漿樣本多肽，烘干后點(diǎn)加0.3μl基質(zhì)(飽和CHCA)，旁邊另外一個(gè)點(diǎn)點(diǎn)加0.2μl標(biāo)準(zhǔn)品，烘干后將樣品靶放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。

四、血漿樣本富集純化多肽的LC-MS/MS質(zhì)譜檢測

液質(zhì)聯(lián)用儀采用的是島津的nano HPLC色譜儀系統(tǒng)和Thermo Scientific公司的Q-Exactive質(zhì)譜儀系統(tǒng)。每個(gè)預(yù)分離好的多肽組分分別經(jīng)過12cm長、75μm內(nèi)徑、填充了粒徑3μm孔徑120A的Welch Materials品牌XB-C18柱料的Ultimate毛細(xì)管分析柱分離，流速為300nl/min。檢測進(jìn)樣體積為25μl，洗脫梯度為B液 濃度從5％均勻上升到45％經(jīng)過40min。質(zhì)譜采集模式為DDA模式(數(shù)據(jù)依賴性采集)，可在一級和二級間切換，一級質(zhì)譜全掃描分子量范圍為350-1800m/z，軌道阱的分辨率達(dá)70000。二級質(zhì)譜的采集，離子強(qiáng)度排在前20的離子相繼分離后進(jìn)行高能碰撞碎裂(HCD)，選擇母離子價(jià)態(tài)在2電荷到5電荷的范圍，碎片離子通過高分辨率17500的軌道阱質(zhì)量器記錄，其中動態(tài)排除的設(shè)定是：重復(fù)次數(shù)為2，動態(tài)排除時(shí)間為8s。

兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)血漿樣本多肽富集純化后的多肽MALDI-TOF質(zhì)譜檢測圖如圖2所示，液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量檢測結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示具有很高的富集純化效率和重復(fù)性。

實(shí)施例3

一、細(xì)胞樣本的多肽提取及還原烷基化

取人成纖維細(xì)胞樣本10⁸細(xì)胞數(shù)(300μl體積)直接按照樣品:Buffer A＝1:5(體積比)與Buffer A(含7M鹽酸胍和0.5mg/ml蛋白酶抑制劑(ROCHE的Protease Inhibitor Cocktail)混合物，pH值9)混合，室溫(15-30℃)渦旋震蕩5min，冰浴超聲處理1min；10000g離心5min，取上清。

往上清液加入Reagent A(含1M三(2-羧乙基)膦)使三(2-羧乙基)膦終濃度為10mM，渦旋震蕩混勻，60℃水浴反應(yīng)50分鐘，待水浴反應(yīng)完，取出放置冷卻至室溫后加入Reagent B(含0.1M碘代乙酰胺)使碘代乙酰胺終濃度為80mM，室溫暗室放置45min。

二、細(xì)胞樣本的多肽富集純化及MALDI-TOF質(zhì)譜檢測

富集純化及質(zhì)譜檢測方法同實(shí)施例2。兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞樣本多肽富集后的多肽MALDI-TOF質(zhì)譜檢測圖如圖4所示，結(jié)果顯示很高的純化效率和重復(fù)性。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。