一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。其包括以下步驟：1）種細(xì)胞的培養(yǎng)；2）制苗用細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)；3）病毒的培養(yǎng)與收獲；4）豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗制備。采用本方法制備疫苗，其特點(diǎn)是可以縮短生產(chǎn)周期，降低人員配置，污染幾率低，占地面積小，所制備的病毒滴度高，所制備的疫苗批間差異小，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定高效，副反應(yīng)小，可全面提高疫苗質(zhì)量。
【專利說(shuō)明】一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome, PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以妊娠母豬發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔和木乃伊胎，仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道癥狀的疾病。PRRS難以有效的防制，首先是PRRSV以肺巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞，具有抗體依賴性增強(qiáng)作用(ADE)造成了一定的免疫抑制，其次是PRRSV不斷的發(fā)生著變異，并且PRRS沒(méi)有有效的治療藥物，當(dāng)前，疫苗免疫被認(rèn)為是預(yù)防和控制PRRS的重要手段。同時(shí)與其他控制手段相比，疫苗免疫也是各種規(guī)模豬場(chǎng)(大、中、小型豬場(chǎng))的最經(jīng)濟(jì)的選擇。自藍(lán)耳病疫苗廣泛應(yīng)用以來(lái)，該病的傳播和蔓延勢(shì)頭有所減緩。目前我國(guó)用于預(yù)防豬藍(lán)耳病的疫苗共有三種類型:豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(包括進(jìn)口美洲經(jīng)典毒株和國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗；與滅活疫苗相比，弱毒疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且更有效，能激活細(xì)胞免疫和體液免疫。弱毒疫苗可在豬體內(nèi)復(fù)制，能引發(fā)更好的免疫效果，可以持續(xù)刺激豬體的免疫應(yīng)答，以抵御病毒入侵，所以保護(hù)時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)弱毒疫苗的免疫量要比滅活疫苗低，在減少副反應(yīng)的同時(shí)也降低了生產(chǎn)成本。研究證明弱毒疫苗的交叉保護(hù)能力要優(yōu)于滅活疫苗，目前在暫時(shí)沒(méi)有更好替代方法防控PRRS的情況下，PRRS弱毒疫苗對(duì)于防控PRRS爆發(fā)有積極的作用。因此，國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)均在藍(lán)耳病弱毒疫苗上尋求積極的突破，試圖研制出更加優(yōu)質(zhì)的藍(lán)耳病活疫苗。
[0003]盡管如此，活疫苗的使用仍存在疑問(wèn)。目前大家主要關(guān)注的是活疫苗的安全性和疫苗株病毒因基因突變和或者與野毒株重組變異而使其毒力返強(qiáng)的可能性。實(shí)驗(yàn)室和田間研究均報(bào)道了作為活疫苗的疫苗株可導(dǎo)致病毒血癥、毒力返強(qiáng)、可垂直和水平傳播(可在本場(chǎng)和臨場(chǎng)中未免疫的豬體內(nèi)檢測(cè)到疫苗毒)。毒力返強(qiáng)的疫苗毒株可在妊娠后期經(jīng)胎盤(pán)進(jìn)行傳播，從而導(dǎo)致死胎和木乃伊胎數(shù)量增加。感染疫苗毒的母豬所產(chǎn)仔豬會(huì)攜帶PRRSV，排泄疫苗毒感染其他仔豬。此外，仔豬免疫活疫苗可導(dǎo)致臨床上的呼吸道癥狀以及對(duì)其生長(zhǎng)性能產(chǎn)生不良影響。這些免疫活疫苗的仔豬可導(dǎo)致病毒血癥，并至少在4周內(nèi)持續(xù)地傳染疫苗毒給其他仔豬。因此，養(yǎng)殖戶在首次使用活疫苗時(shí)有可能導(dǎo)致豬只生產(chǎn)性能下降，比如增加晚期流產(chǎn)率，死胎和木乃伊胎數(shù)量增加等。另外，最新研究表明，活疫苗的使用可干擾豬肺炎支原體疫苗的保護(hù)效力。
[0004]滅活疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)是安全，疫苗株不會(huì)傳染給其他豬只，同時(shí)其毒力也不會(huì)返強(qiáng)。田間試驗(yàn)研究表明，滅活疫苗的使用不會(huì)導(dǎo)致經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬的繁殖失敗。目前藍(lán)耳病滅活疫苗主要采用油包水劑型的油`乳劑疫苗。油包水型疫苗具有較好的緩釋作用，免疫后持續(xù)刺激機(jī)體達(dá)到免疫保護(hù)方面表現(xiàn)尤為突出。但油包水劑型的疫苗往往所需較高的抗原濃度來(lái)提高疫苗的效力。為提高PRRS滅活疫苗的效力，需要在確保疫苗病毒株免疫原性的前提下盡量提高疫苗在滅活前的病毒含量。研究表明，自1996年報(bào)道PRRS以來(lái)，國(guó)內(nèi)許多學(xué)者先后分離到PRRSV，但各地方分離株的滴度都呈現(xiàn)出較低的狀態(tài):(1)臺(tái)灣分離株，為美洲型毒株，毒價(jià)為106TCID5(l/0.1ml (臺(tái)灣養(yǎng)豬科學(xué)研究所)；(2)CH-la、CH-1b,CH-lc、CH-1d株，為美洲型毒株，毒價(jià)為106TCID5(i/0.1ml (哈爾濱獸醫(yī)研究所)。因此為了提高病毒含量，通常的做法是通過(guò)濃縮藍(lán)耳病抗原十幾倍甚至幾十倍，如此以來(lái)不僅增加了生產(chǎn)成本，同時(shí)在濃縮過(guò)程中藍(lán)耳病病毒的免疫原性會(huì)有所降低。
[0005]目前為止，藍(lán)耳病疫苗生產(chǎn)主要還是通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)單層細(xì)胞，接種藍(lán)耳病病毒后獲得病毒懸液，進(jìn)而制備成藍(lán)耳病疫苗。因轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度低，培養(yǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境條件受限制等很大程度上影響了藍(lán)耳病疫苗的產(chǎn)量，同時(shí)也導(dǎo)致了疫苗批次之間的不穩(wěn)定性。為了克服現(xiàn)有PRRS弱毒疫苗生產(chǎn)技術(shù)所存在的缺陷，尋找簡(jiǎn)便、高效的病毒株以及其合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)條件對(duì)提高疫苗質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本具有重大意義。
[0006]近年來(lái)，生物反應(yīng)器和微載體技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞、繁殖病毒在生物制藥行業(yè)應(yīng)用廣泛。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝相比，懸浮培養(yǎng)技術(shù)有著巨大的優(yōu)勢(shì):首先單位體積內(nèi)有效工作細(xì)胞數(shù)量增加；其次全密閉、管道化系統(tǒng)生產(chǎn)流程及過(guò)程自動(dòng)化監(jiān)控、控制技術(shù)，不僅減少了污染細(xì)胞的機(jī)會(huì)，而且在減輕勞動(dòng)強(qiáng)度的同時(shí)減少人為操作因素影響；再者生物反應(yīng)器容積的擴(kuò)大，提高了產(chǎn)品的均一性，也提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量；最后生產(chǎn)疫苗所用的成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，綜合成本大大降低。我國(guó)的生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)起步較晚，但近幾年該技術(shù)的在國(guó)內(nèi)的發(fā)展非常快。目前國(guó)內(nèi)已有部分發(fā)明專利采用不同生物反應(yīng)器系統(tǒng)和不同類型微載體進(jìn)行藍(lán)耳病疫苗的研制，但應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器-聚酯纖維紙片載體生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(CH-1a株)，尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0007]水包油包水乳化佐劑具有鋁膠佐劑、水包油佐劑和油包水佐劑的特點(diǎn)，與油包水乳化佐劑相比，其制備疫苗所需要的抗原濃度大大降低，另外因其具有水包油佐劑的特性，使得其可以添加水溶性的免疫增強(qiáng)劑、中藥多糖和鎮(zhèn)痛劑(維生素)，在疫苗免疫機(jī)體時(shí)可以緩解疼痛，減少動(dòng)物應(yīng)激，同`時(shí)免疫增強(qiáng)劑、中藥多糖還具有提高免疫效果，預(yù)防疾病等功能。
[0008]多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。
[0009]維生素是機(jī)體代謝中必不可少的有機(jī)化合物。機(jī)體猶如一座極為復(fù)雜的化工廠，不斷地進(jìn)行著各種生化反應(yīng)。其反應(yīng)與酶的催化作用有密切關(guān)系。酶要產(chǎn)生活性，必須有輔酶參加。已知許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子。因此，維生素是維持和調(diào)節(jié)機(jī)體正常代謝的重要物質(zhì)。
[0010]黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類物質(zhì)，也是自然界藥用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15個(gè)碳原子并以C6-C3-C6的方式構(gòu)成的三環(huán)天然有機(jī)物，是植物在長(zhǎng)期自然選擇中產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物，現(xiàn)在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于果蔬、中草藥中，無(wú)毒副作用，它具有顯著的清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂降血壓等藥理保健功能，是一類極具開(kāi)發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑，這些抗氧化活性物質(zhì)可以減少和清除機(jī)體內(nèi)自由基，具有預(yù)防疾病的作用。
[0011]法氏囊素(bursin,BS)是從禽類特有的體液免疫中樞淋巴器官法氏囊(Bursa offabricius)中分離出來(lái)的一種活性三肽物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促進(jìn)禽類和哺乳動(dòng)物B淋巴細(xì)胞前體的分化、增殖，能提高B細(xì)胞系Daudi細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP水平，加快B細(xì)胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的速度，促進(jìn)B細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成，從而使B細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體能力加強(qiáng)。
[0012]本發(fā)明基于上述技術(shù)背景，提出一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗(CH-1a株)的制備方法，該疫苗主要由豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活抗原，加適量含免疫增強(qiáng)劑制成，劑型為水包油包水型。通過(guò)該方法制備的復(fù)合滅活疫苗，因其擁有水包油，油包水兩種特性，使得水溶性的維生素、中藥多糖、法氏囊素、中藥黃酮等免疫增強(qiáng)劑與鎮(zhèn)痛劑易于溶解，利于動(dòng)物機(jī)體吸收，免疫時(shí)可降低動(dòng)物應(yīng)激，減少動(dòng)物痛苦，可提高動(dòng)物福利；同時(shí)免疫增強(qiáng)劑可大大提聞活疫苗的體液免疫，廣生較聞的中和抗體，大幅提聞保護(hù)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法的技術(shù)方案，采用本方法制備疫苗，其特點(diǎn)是可以縮短生產(chǎn)周期，降低人員配置，污染幾率低，占地面積小，所制備的病毒滴度高，所制備的疫苗批間差異小，廣品質(zhì)量穩(wěn)定聞效，副反應(yīng)小，可全面提聞疫苗質(zhì)量。
[0014]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
1)種細(xì)胞的培養(yǎng):用細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)種子細(xì)胞；
2)制苗用細(xì)胞的懸浮培養(yǎng):將步驟I)中培養(yǎng)好的種子細(xì)胞懸液接種至已驗(yàn)證的灌注袋中，吸附后在激流灌注式生物反`應(yīng)器中加入細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；
3)病毒的培養(yǎng)與收獲:當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)4~6天，將藍(lán)耳病病毒CH-1a株懸液接種于激流灌注式生物反應(yīng)器中，換用維持液進(jìn)行培養(yǎng)，接毒后實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)糖耗情況，當(dāng)糖耗接近O時(shí)，即開(kāi)始收獲病毒，收獲病毒后，反復(fù)凍融灌注袋，收獲全懸病毒液，測(cè)定毒價(jià)；
4)豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗制備:將步驟3)中得到的病毒液進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、病毒含量測(cè)定，檢驗(yàn)合格后進(jìn)行甲醛滅活，滅活檢驗(yàn)合格后，在每1000ml滅活檢驗(yàn)合格的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原液中加入I~2份免疫增強(qiáng)劑混合均勻，然后與桑米特家畜水包油包水佐劑按3:2 (V:V)進(jìn)行乳化分裝制成豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗。
[0015]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中種細(xì)胞為細(xì)胞MA104或細(xì)胞Marcl45。
[0016]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中培養(yǎng)條件為溫度36~37°C，pH7.2~7.4，DO 30%~60%，循環(huán)轉(zhuǎn)速按40rpm、60rpm、90rpm、120rpm、150rpm梯度提高，種子細(xì)胞接種量為3 X IO9個(gè)細(xì)胞。
[0017]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟3)培養(yǎng)條件為溫度36~37°C，pH7.5~7.6，DO 30%~50%，循環(huán)速度100~150rpm，藍(lán)耳病病毒CH-1R株接種量為0.5~1.0MOI。[0018]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH為7.2~7.4、DO為30%~60%,含糖4.0g/L,維持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH為7.4~7.6、DO為30%~50%,含糖4.0g/L。
[0019]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟4)中每份免疫增強(qiáng)劑含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、維生素組合6~IOg和法氏囊素2~16mg。
[0020]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過(guò)以下步驟制得:
a、按桑白皮10~30份，生地10~30份，黃芪20~40份，車前子10~20份，茯苓10~30份，穿心蓮20~30份，蘆根10~30份，生地10~30份，生甘草10~20份，貝母10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過(guò)夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過(guò)程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即得粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過(guò)夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；` f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后，最后經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
[0021]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的法氏囊素通過(guò)以下步驟制得:將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈，按
I:1比例加入PH7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行高速勻漿，勻漿液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反復(fù)凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀,上清用1000da截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，膜下液經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，濾過(guò)液即為法氏囊素粗提液，粗提液經(jīng)冷凍真空干燥得到法氏囊素。
[0022]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的維生素組合中含有維生BI 15~35%、維生素C 40~70%和維生素E 10~30%。
[0023]本發(fā)明中桑米特家畜水包油包水佐劑由珠海國(guó)年生物科技有限公司生產(chǎn)銷售。
[0024]本發(fā)明具有以下有益效果:
1.本發(fā)明中種細(xì)胞培養(yǎng)采用微型反應(yīng)器，減少操作程序，縮短了種細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。
[0025]2.本發(fā)明在接種細(xì)胞時(shí)采用梯度升高循環(huán)轉(zhuǎn)速法，提高了細(xì)胞在微載體上的貼壁率。
[0026]3.本發(fā)明在培養(yǎng)細(xì)胞和病毒時(shí)根據(jù)糖耗情況隨時(shí)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)，確保細(xì)胞的密度和病毒的滴度。
[0027]4.本發(fā)明采用了先進(jìn)的懸浮培養(yǎng)設(shè)備與技術(shù):(1)激流灌注式生物反應(yīng)器，聚酯纖維紙片為微載體；(2)以糖耗為技術(shù)指標(biāo)以及先進(jìn)的控制系統(tǒng)；(3)在細(xì)胞培養(yǎng)方面增加了細(xì)胞密度；(4)在培養(yǎng)病毒時(shí)提高了病毒滴度；(5)使疫苗的效價(jià)大大提高，同時(shí)降低了疫苗的副反應(yīng)。(6)采用了連續(xù)、完全封閉的細(xì)胞與病毒培養(yǎng)方式，完善了生產(chǎn)過(guò)程中的可控性，確保疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性，同時(shí)降低了疫苗生產(chǎn)的安全隱患。
[0028]5.本發(fā)明采用了新的疫苗佐劑，所制備的疫苗具有油包水、水包油雙重特性，兼具了疫苗的緩釋作用以及水溶性免疫增強(qiáng)劑、中藥多糖、鎮(zhèn)痛劑等共同作用的優(yōu)點(diǎn)。
[0029]6.本發(fā)明采用了有效的免疫增強(qiáng)劑，大幅度提高了機(jī)體的免疫力，提高體液免疫能力，刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的中和抗體，提高了機(jī)體預(yù)防疾病的能力。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限止本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。[0031]實(shí)施例1用激流灌注式反應(yīng)器AP20C型生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病病毒(CH-1a株)，包括如下步驟:
Cl)生物反應(yīng)器的選擇:激流式反應(yīng)器AP-20C型，體積為10L。
[0032](2)疫苗毒株的選擇:選用豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-1a株。
[0033](3)種細(xì)胞的培養(yǎng):利用T175方瓶繁殖Marc-145細(xì)胞或MA104細(xì)胞，一般按1:3~I: 5傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后消化、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液接種至轉(zhuǎn)管中，每管接種細(xì)胞約3 X IO7個(gè)細(xì)胞，置微型反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，反應(yīng)器溫度設(shè)置為37°C，轉(zhuǎn)速設(shè)置為42rpm。
[0034](4)制苗用細(xì)胞的懸浮培養(yǎng):首先準(zhǔn)備生物反應(yīng)器:檢漏激流袋和灌注袋；采用滅菌PBS浸泡微載體過(guò)夜；校正溫度電極、pH電極和溶氧電極并進(jìn)行高壓滅菌；組裝生物反應(yīng)器，注入培養(yǎng)液，循環(huán)24小時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的無(wú)菌檢驗(yàn)。驗(yàn)證合格后，將步驟(3)中培養(yǎng)好的種子細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，無(wú)菌條件下接種至灌注袋中，以40rpm、60rpm、90rpm、120rpm各循環(huán)30min，使細(xì)胞貼壁，然后開(kāi)始150rpm循環(huán)，培養(yǎng)條件為溫度36~37°C，pH7.2~7.4，DO30%~60%。培養(yǎng)過(guò)程中適時(shí)測(cè)定糖耗，當(dāng)殘?zhí)橇恐?g/L時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)糖或補(bǔ)加培養(yǎng)液。
[0035](5)所述步驟(3)和步驟(4)細(xì)胞生長(zhǎng)液含90%DMEM、10%胎牛血清，細(xì)胞生長(zhǎng)液的pH 為 7.2 ~7.4，DO 為 30% ~60%,含糖約 4.0g/L。
[0036](6)病毒的培養(yǎng)與收獲:當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)4~6天，當(dāng)糖耗達(dá)到最大時(shí)，將藍(lán)耳病病毒CH-1a株懸液按0.5~1.0MOI的接種量接種于激流灌注式生物反應(yīng)器中，換用維持液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度36~37°C，pH7.5~7.6，D030%~50%，循環(huán)速度100~150rpm。接毒后實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)糖耗情況，當(dāng)糖耗接近O時(shí)，即開(kāi)始收獲病毒。收獲病毒后，反復(fù)凍融灌注袋內(nèi)細(xì)胞，收獲全懸病毒液。
[0037](7)所述步驟(6)中的細(xì)胞維持液含98%DMEM、2%胎牛血清，維持液的pH為7.4~
7.6，DO 為 30% ~50%,含糖約 4.0g/L。
[0038](8)病毒液的檢測(cè)
無(wú)菌檢驗(yàn):按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。
[0039]病毒含量測(cè)定:用2%胎牛血清的DMEM維持液將病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品做10倍系列稀釋，取10' I O—8、10_9三個(gè)滴度，每個(gè)滴度接種96孔細(xì)胞板上生長(zhǎng)良好的Marc-145細(xì)胞單層8孔，每孔0.1ml。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照孔，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，觀察7日，記錄細(xì)胞病變情況，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID5tl，病毒含量應(yīng)≥108 °TCID50/0.1ml。
[0040]實(shí)施例2中藥多糖的制備，包括以下步驟:
a、按桑白皮10~30份，生地10~30份，黃芪20~40份，車前子10~20份，茯苓10~30份，穿心蓮20~30份，蘆根10~30份，生地10~30份，生甘草10~20份，貝母10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過(guò)夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過(guò)程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過(guò)夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥多糖。
[0041]實(shí)施例3中藥黃酮的制備，包括以下步驟:
a、按桑白皮10~30份，生地10~30份，黃芪20~40份，車前子10~20份，茯苓10~30份，穿心蓮20~30份，蘆根10~30份，生地10~30份，生甘草10~20份，貝母10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過(guò)夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過(guò)程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，上清即得粗制中藥黃酮；
d、將c中上清進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后，最后經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
[0042]實(shí)施例4法氏囊素的制備，包括以下步驟:
a、取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，pH7.2滅菌冷PBS洗凈。
[0043]b、稱量法氏囊重量，按1:1 (W:V)比例加入pH 7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行聞速勻衆(zhòng)。
[0044]C、勻衆(zhòng)液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復(fù)凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀。
[0045]d、上清用1000da截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，膜下液即為法氏囊素粗提液。
[0046]e、將d中粗提液通過(guò)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到法氏囊素。
[0047]實(shí)施例5免疫增強(qiáng)劑制備，包含以下組分:稱取中藥多糖60g、中藥黃酮50g、維生素組合IOg(其中維生素BI 2.2 g，維生素C 5.2g，維生素E 2.6g)、法氏囊素16mg ;將上述各組分混合均勻作為一份計(jì)量使用。其中中藥多糖由按照實(shí)施例2的步驟制得，中藥黃酮按照實(shí)施例3的步驟制得，法氏囊素按照實(shí)施例4的步驟制得。
[0048]實(shí)施例6免疫增強(qiáng)劑制備，包含以下組分:稱取中藥多糖100g、中藥黃酮60g、維生素組合6g (其中維生素BI 2.lg，維生素C 2.4g，維生素E 1.5g)、法氏囊素2mg ;將上述各組分混合均勻作為一份計(jì)量使用。其中中藥多糖由按照實(shí)施例2的步驟制得，中藥黃酮按照實(shí)施例3的步驟制得，法氏囊素按照實(shí)施例4的步驟制得。
[0049]實(shí)施例7免疫增強(qiáng)劑制備，包含以下組分:稱取中藥多糖30g、中藥黃酮20g、維生素組合Sg(其中維生素BI 2g，維生素C 4g，維生素E 2g)、法氏囊素IOmg;將上述各組分混合均勻作為一份計(jì)量使用。其中中藥多糖由按照實(shí)施例2的步驟制得，中藥黃酮按照實(shí)施例3的步驟制得，法氏囊素按照實(shí)施例4的步驟制得。
[0050]實(shí)施例8 一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗(CH-1a株)的制備方法，包括以下步驟:
a、無(wú)菌條件下，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活后抗原液按每1000ml加入實(shí)施例5、6或7中制備的免疫增強(qiáng)劑I或2份，混合均勻，使免疫增強(qiáng)劑完全溶解。
[0051]b、將3份量的含免疫增強(qiáng)劑的豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活抗原液加入乳化器中，調(diào)節(jié)乳化器轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為1500rpm，將2份量的桑米特水油水佐劑緩緩加入攪拌中的抗原液。
[0052]C、當(dāng)油相加完時(shí)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為3000rpm，繼續(xù)攪拌3_5分鐘。
[0053]d、乳化完全后，將乳化后疫苗無(wú)菌分裝制成豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗。
[0054]f、成品檢驗(yàn) Cl)檢驗(yàn)結(jié)果
按照“豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅`活疫苗(CH-1a株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程”和《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010版)相關(guān)要求對(duì)成品進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1:
表1成品檢驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟: 1)種細(xì)胞的培養(yǎng):用細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)種子細(xì)胞； 2)制苗用細(xì)胞的懸浮培養(yǎng):將步驟I)中培養(yǎng)好的種子細(xì)胞懸液接種至已驗(yàn)證的灌注袋中，吸附后在激流灌注式生物反應(yīng)器中加入細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)； 3)病毒的培養(yǎng)與收獲:當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)4~6天，將藍(lán)耳病病毒CH-1a株懸液接種于激流灌注式生物反應(yīng)器中，換用維持液進(jìn)行培養(yǎng)，接毒后實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)糖耗情況，當(dāng)糖耗接近O時(shí)，即開(kāi)始收獲病毒，收獲病毒后，反復(fù)凍融灌注袋，收獲全懸病毒液，測(cè)定毒價(jià)； 4)豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗制備:將步驟3)中得到的病毒液進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、病毒含量測(cè)定，檢驗(yàn)合格后進(jìn)行甲醛滅活，滅活檢驗(yàn)合格后，在每1000ml滅活檢驗(yàn)合格的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原液中加入I~2份免疫增強(qiáng)劑混合均勻，然后與桑米特家畜水包油包水佐劑按3:2 (V:V)進(jìn)行乳化分裝制成豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中種細(xì)胞為細(xì)胞MA104或細(xì)胞Marcl45。
3.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中培養(yǎng)條件為溫度36~37°C，pH7.2~7.4，DO 30%~60%，循環(huán)轉(zhuǎn)速按40rpm、60rpm、90rpm、120rpm、150rpm梯度提高,種子細(xì)胞接種量為3 X IO9個(gè)細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟3)培養(yǎng)條件為溫度36~37°C，pH7.5~7.6，DO 30%~50%，循環(huán)速度100~150rpm,藍(lán)耳病病毒CH-1R株接 種量為0.5~1.0MOI。
5.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH為7.2~7.4,DO為30%~60%，含糖4.0g/L,維持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH為7.4~7.6、DO為30%~50%,含糖4.0g/L0
6.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟4)中每份免疫增強(qiáng)劑含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、維生素組合6~IOg和法氏囊素2~16mg。
7.如權(quán)利要求6所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過(guò)以下步驟制得: a、按桑白皮10~30份，生地10~30份，黃芪20~40份，車前子10~20份，茯苓10~30份，穿心蓮20~30份，蘆根10~30份，生地10~30份，生甘草10~20份，貝母10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過(guò)夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過(guò)程中每10分鐘攪拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即得粗制中藥黃酮； d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過(guò)夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥多糖； g、將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后，最后經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
8.如權(quán)利要求6所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的法氏囊素通過(guò)以下步驟制得:將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈，按1:1比例加入pH7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行高速勻漿，勻漿液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反復(fù)凍融3次，12000rpm離心20min，棄沉淀，上清用1000da截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，膜下液經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，濾過(guò)液即為法氏囊素粗提液，粗提液經(jīng)冷凍真空干燥得到法氏囊素。
9.如權(quán)利要求6所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的維生素組合中含有 維生BI 15~35%、維生素C 40~70%和維生素E 10~30%。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK103495162SQ201310426537
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】李陽(yáng), 閆艷麗, 劉雪, 王二先, 徐曉艷, 盛璐絲 申請(qǐng)人:浙江美保龍生物技術(shù)有限公司