專利名稱：豬生殖與呼吸綜合征分離株及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于新的野生型PRRS病毒分離株及其相應(yīng)的改良型減毒PRRS病毒，該減毒病毒在疫苗及免疫組合物中的用途，以及檢測(cè)該病毒分離株病毒血癥水平，生長(zhǎng)速度，抗體反應(yīng)，或其組合的方法。更具體的，本發(fā)明提供一種預(yù)測(cè)新的或先前未表征的PRRS分離株的致病性的方法，減毒該分離株的方法，以及該病毒分離株在疫苗與免疫組合物中的用途。
背景技術(shù)：
豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是一種具包膜的單鏈RNA病毒，是屬于披衣病毒科(Arteriviridae)(Cavanaugh，1997年)。該病毒會(huì)造成一種普遍性的豬疾病，此癥在1987年首先出現(xiàn)于美國(guó)(Hill，1990年)并被稱為神秘豬病(mystery swine disease)。其臨床病征在于造成各年齡層豬的呼吸道疾病，而導(dǎo)致某些較年輕豬的死亡，以及對(duì)處于生殖年齡的母豬造成嚴(yán)重的生殖問(wèn)題。
PRRSV的動(dòng)態(tài)特性使其在疾病中持續(xù)地改變，為新的病毒分離株的出現(xiàn)充分提供了的機(jī)會(huì)(Andreyev等人，1997年；Murtaugh等人，1998年；Meng，2000年)。由于PRRSV不斷地演變，加上對(duì)豬農(nóng)造成破壞性難題的能力，使其成為一個(gè)重要的主題而得到研究(Mengeling等人，1998年；Pejsak等人，1997年)、開發(fā)疫苗以及尋找其它降低傳染力的方法。病毒分離株致病性標(biāo)準(zhǔn)的差異，已在豬的肺部損傷及死亡情形中得以證明(Halbur等人，1996年)，但將這些生物學(xué)及免疫學(xué)上的差異與特定基因變異的相關(guān)的嘗試則多半失敗(Albina等人，1998年；Key等人，2001年；Yuan等人，2001年；Murtaugh等人，2002年；Grebennikova等人，2004年)。Labarque等人(2003年)，Mengeling等人(2003年a)及Nodelijik等人(2001年)的研究中，測(cè)試了PRRS疫苗的安全性及效率。這些研究證明，在實(shí)驗(yàn)情況下，改良的PRRS活疫苗可降低病毒血癥的量和持續(xù)性，以及減輕病毒侵襲后造成的熱病和肺部損傷。
Opriessing等人(2002年)證明，當(dāng)病毒分離株在開放讀框5(open readingframe 5，簡(jiǎn)稱ORF5)具有高度氨基酸序列相似時(shí)，會(huì)造成豬有顯著不同程度的肺炎(pneumonia)產(chǎn)生。宿主差異也會(huì)影響豬對(duì)于PRRSV有不同反應(yīng)(Mengeling等人，2003b)。研究已證明，致病性與PRRSV在豬中的復(fù)制速率和分布(Hayne等人，1997年)、巨噬細(xì)胞的銅離子清除能力(Thanawongnuwech等人，1998年)、以及宿主動(dòng)物的貧血程度(Halbur等人，2002年)有關(guān)。然而，這些方法并無(wú)法提供有效預(yù)測(cè)新的或先前未表征的PRRS病毒分離株的致病性的方法。
根據(jù)前述，本領(lǐng)域需要一種預(yù)測(cè)PRRS病毒分離株致病性的方法。本領(lǐng)域進(jìn)一步需要將病毒分離株給予或暴露或至既往無(wú)PRRS的豬后，根據(jù)豬體內(nèi)PRRS病毒的生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平，來(lái)預(yù)測(cè)病毒分離株的致病性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服上述問(wèn)題，并且提供新的野生型PRRS病毒分離株，和該病毒分離株的減毒型，及其對(duì)應(yīng)疫苗，該疫苗是含有減毒型PRRS病毒的藥物組合物。具體而言，本發(fā)明的野生型病毒分離株名稱為SDSU73、17198-6、MN 184，及其混合株。這些病毒分離株的減毒型，及包含減毒型分離株的完整疫苗，都能提供豬體內(nèi)對(duì)抗PRRS的免疫力，而不會(huì)產(chǎn)生明顯的PRRSV臨床病征。
本發(fā)明的減毒型PRRS病毒分離株的另一特征為，它們大部分保留了野生型或未減毒病毒分離株產(chǎn)生病毒血癥的情況。因此，減毒型病毒產(chǎn)生的病毒血癥是野生型未減毒病毒所產(chǎn)生病毒血癥的至少50％，優(yōu)選至少約75％。以這種方式，減毒型病毒能夠賦予豬較快速且完全的PRRS免疫力。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是實(shí)施例1中的豬測(cè)試的圖，其為平均血清病毒效價(jià)對(duì)時(shí)間的變化，所述病毒效價(jià)以log10 TCID50/ml表示；圖2是實(shí)施例1中的豬測(cè)試的圖，其為利用實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定的平均血清PRRSV病毒濃度；圖3為使用商用ELISA測(cè)定法測(cè)定的平均S/P比值相對(duì)于對(duì)時(shí)間的圖；圖4圖示實(shí)施例1中商用ELISA化驗(yàn)與log10 TCID50/ml數(shù)據(jù)的重復(fù)測(cè)量分析，其中用ELISA S/P比值曲線下的組平均值對(duì)log10 TCID50/ml下的組平均面積作圖；圖5圖示實(shí)施例1中商用ELISA化驗(yàn)與RT-PCR濃度數(shù)據(jù)的重復(fù)測(cè)量分析，其中用ELISA S/P比值曲線下的組平均面積對(duì)RT-PCR濃度曲線下的組平均面積作圖；圖6a是實(shí)施例1中吸收值對(duì)時(shí)間作圖的圖；圖6b是用吸收值對(duì)時(shí)間作圖的圖，說(shuō)明PRRSV分離株對(duì)nsp-4 IgG反應(yīng)的影響，其中數(shù)據(jù)是十只動(dòng)物的平均數(shù)值，但如動(dòng)物死亡則不列入計(jì)算；圖7圖示了利用實(shí)施例1中的nsp-4與log10 TCID50/ml數(shù)據(jù)的重復(fù)測(cè)量分析，其中用nsp-4曲線下的組平均面積系對(duì)log10 TCID50/ml曲線下的組平均面積作圖；圖8是利用實(shí)施例1的臨床評(píng)分與log10 TCID50/ml數(shù)據(jù)的重復(fù)測(cè)量分析的圖，其中用臨床評(píng)分曲線下的組平均值對(duì)log10 TCID50/ml曲線下的組平均面積作圖；以及圖9是本申請(qǐng)中每個(gè)分離株的IHC評(píng)分的圖。
實(shí)施方式野生型病毒可以通過(guò)許多方法來(lái)進(jìn)行減毒，例如使病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中重復(fù)連續(xù)繼代、基因插入、基因轉(zhuǎn)換(gene switching)、基因缺失、堿基對(duì)置換與溫度敏感突變等。使用在本領(lǐng)域中所熟知的方法，所述減毒型病毒可以用于各種免疫組合物中，包括疫苗。在某些情況下，這些減毒型病毒可以利用本領(lǐng)域中所熟知的方法進(jìn)一步被殺死或滅活，然后摻入或包含在根據(jù)本發(fā)明的致免疫組合物中?？捎糜诜乐筆RRS感染或降低PRRS感染后臨床病征的嚴(yán)重程度的致免疫組合物的例子包括利用Abst-1或JA-142所制備而成的疫苗。
也發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的疫苗可以以冷凍狀態(tài)進(jìn)行儲(chǔ)存?zhèn)溆?，而不?huì)減損疫苗的所欲特征。這解決此技術(shù)中長(zhǎng)久以來(lái)的問(wèn)題，因?yàn)橄惹暗腜RRS疫苗并不適合冷凍儲(chǔ)存。
本發(fā)明進(jìn)一步提供預(yù)測(cè)新的或未表征的PRRS病毒分離株致病性等級(jí)的方法。該方法通常涉及對(duì)新的或先前未表征的PRRS病毒分離株進(jìn)行以下幾項(xiàng)參數(shù)中至少一項(xiàng)的評(píng)估病毒生長(zhǎng)速率、病毒血癥水平、抗體反應(yīng)、或其組合。然后利用評(píng)估得到的結(jié)果，來(lái)預(yù)測(cè)新的或先前未表征的病毒分離株的致病性等級(jí)。該方法通常涉及給予或?qū)⑽词躊RRS病毒感染的豬暴露于一定量的新的或先前未表征的PRRS病毒分離株，使病毒復(fù)制達(dá)約15天的一段時(shí)間，優(yōu)選從約2到12天，更優(yōu)選從約3到10天，更優(yōu)選從約3到7天。給予病毒的方式可以用常規(guī)方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括口服、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、或其組合，但是最佳的方式則是透過(guò)鼻內(nèi)投藥。鼻腔投藥所使用劑量?jī)?yōu)選達(dá)約5毫升，更優(yōu)選約在0.5到4毫升之間，更優(yōu)選約1到3毫升之間，更優(yōu)選則是約2毫升。每劑的病毒濃度應(yīng)達(dá)約5.0 Log10 TCID50/ml，更優(yōu)選約在1.0到4.0 Log10 TCID50/ml之間，更優(yōu)選約在2.5到3.5 Log10 TCID50/ml之間，最優(yōu)選是約3.0 Log10TCID50/ml。在此病毒復(fù)制期間選定的時(shí)間點(diǎn)，從豬獲取生物樣品，測(cè)量所給予病毒的生長(zhǎng)速率、病毒血癥水平、抗體反應(yīng)、和/或其組合。隨后將從這些分析收集的數(shù)據(jù)與其它已知或已確認(rèn)的病毒分離株的病毒生長(zhǎng)速率、病毒血癥水平、抗體反應(yīng)、或其組合進(jìn)行比較，作為預(yù)測(cè)新的或未表征的病毒分離株的致病性的標(biāo)準(zhǔn)。
利用本發(fā)明的方法，測(cè)量對(duì)其施予了八種不同PRRSV分離株中的一種的豬中的PRRS病毒生長(zhǎng)、病毒血癥水平、抗體反應(yīng)、和/或其組合。這些病毒分離株中的每一種都有已知的致病性水平與臨床病征。也測(cè)量對(duì)其給予了所有八種分離株的組合的豬中的上述特性。
更具體來(lái)說(shuō)，將100只2到3周大的豬，根據(jù)其體重隨機(jī)分成10組，每組10只。所有豬皆利用HerdChekPRRS ELISA 2XR(IDEXX LaboratoriesInc.，Westbrook，ME)測(cè)試PRRS感染。其中對(duì)八組給予八種病毒分離株中的一種，一組給予所有八種病毒株的組合，最后一組則給予Eagle’s極限必需培養(yǎng)基(EMEM)當(dāng)作對(duì)照組。對(duì)每種病毒接種進(jìn)行取樣重新進(jìn)行定量，以確定病毒效價(jià)。優(yōu)選，設(shè)計(jì)給予的病毒效價(jià)使其與病毒的自然暴露水平相似。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的不同階段，收集血液形式的生物樣品。通過(guò)病毒分離，定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，HerdChekPRRS ELISA 2XR，以及PRRSV蛋白特異性ELISA分析每個(gè)樣品。
病毒分離是通過(guò)連續(xù)稀釋血清并將其與EMEM、遺傳霉素(gentamicin)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)及兩性霉B(Fungizone)(Invitrogen Corp.，Grand Island，NY)混合在CL2621(一種MA 104細(xì)胞株)細(xì)胞上進(jìn)行的。隨后保溫稀釋液，檢驗(yàn)其致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect)(CPE)。利用Reed-Muench法計(jì)算病毒效價(jià)。
RT-PCR是利用QIAamp Viral RNA Mini-Kit(購(gòu)自Qiagen，Inc.，Valencia，CA)進(jìn)行的，而PRRSV則是利用Tetracore公司(Gaithersburg，MD)的單管分析(single-tube assay)來(lái)檢測(cè)的。為了確定病毒量，首先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)將對(duì)已知濃度的3’UTR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作圖的循環(huán)閾值進(jìn)行線性外推求得未知樣品的濃度。
使用ELISA S/P比值的抗體檢測(cè)是利用HerdChekPRRS ELISA 2XR根據(jù)制造商說(shuō)明書而產(chǎn)生的。PRRSV蛋白特異性ELISA是利用在BL21(DE3)-RP細(xì)胞(購(gòu)自Stratagene，La Jolla，CA)的重組病毒分離株VR2332表達(dá)的核衣殼蛋白(N)以及非結(jié)構(gòu)性蛋白4(nsp4)來(lái)進(jìn)行的。
在研究的開始與終點(diǎn)對(duì)所有豬進(jìn)行體重測(cè)量。此外，在研究過(guò)程中的每一天，由獸醫(yī)對(duì)每只豬的PRRS病的臨床病征進(jìn)行評(píng)估與評(píng)分。所有所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，并基于群組進(jìn)行比較。
十組中的九組隨后再次用高致病性病毒分離株攻擊，來(lái)進(jìn)一步評(píng)估同源保護(hù)作用以及疫苗相對(duì)野生型異源保護(hù)作用(活病毒暴露的概念)。經(jīng)過(guò)此次攻擊，評(píng)估豬并驗(yàn)尸以使用病毒分離與免疫組織化學(xué)法而進(jìn)行分析。
因此，本發(fā)明也提供包含減毒型PRRS病毒分離株的致免疫組合物。在優(yōu)選的形式中，該組合物也可包括藥學(xué)上相容的載體和/或佐劑。該組合物其中一個(gè)例子包括Abst-1和/或利用上述方法所預(yù)測(cè)為具致病性PRRS病毒的減毒型。
本發(fā)明也提供一種改良的方法，來(lái)挑選用來(lái)減毒并包含入致免疫組合物的PRRS病毒分離株。該方法通常包括以下步驟a)取得致病性未知的PRRS病毒分離株；b)給予一定量的該P(yáng)RRS病毒分離株到未感染PRRS的豬；c)使該病毒分離株在豬中復(fù)制約3到15天的時(shí)間；d)測(cè)量該期間內(nèi)病毒生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平；e)將該生長(zhǎng)速率或病毒血癥水平與致病性已知的PRRS病毒分離株的生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平作比較；f)根據(jù)與致病性已知的病毒分離株相比較的生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平，選擇病毒分離株，用以減毒并包含入致免疫組合物。盡管有時(shí)會(huì)采用預(yù)測(cè)為致病性較低(包括那些無(wú)致病性)的病毒分離株，但是優(yōu)選挑選預(yù)測(cè)為具高致病性的病毒分離株用以包含入致免疫組合物。這是因?yàn)轭A(yù)測(cè)為具高致病性的病毒分離株有較高生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平，如此通常造成較旺盛且保護(hù)作用較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。利用本發(fā)明的方法，簡(jiǎn)化了挑選用以包含入致免疫組合物的病毒分離株的過(guò)程，并且增加了得到有效疫苗來(lái)對(duì)抗致病型PRRS病毒分離株的可能性。
此處所用“生長(zhǎng)速率”意指測(cè)量病毒在豬中的復(fù)制隨時(shí)間的變化，實(shí)施例1提供優(yōu)選實(shí)例。此處所用“病毒血癥水平”意指豬血液的病毒循環(huán)濃度，實(shí)施例1也提供優(yōu)選實(shí)例。
參考實(shí)施方案的簡(jiǎn)要說(shuō)明以下實(shí)施例說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選病毒分離株及步驟。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅為例示性，其不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明范疇的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1材料與方法一百頭2到3周大的健康豬獲自未受PRRS病毒感染的購(gòu)得的豬群，并在獸醫(yī)師的管理下，飼養(yǎng)在愛荷華州安姆斯獸醫(yī)資源公司(VeterinaryResouces Inc.，Ames，Iowa)。豬的飲水與食物任意提供。參與本研究的所有動(dòng)物照料人員及實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)于各組動(dòng)物的處理方式均不知情。利用HerdChehPRRS ELISA 2XR(IDEXX Laboratories Inc.，Westbrook，ME)對(duì)豬進(jìn)行檢測(cè)，確定豬是否受到PRRSV感染。本實(shí)施例中所有的豬經(jīng)測(cè)試均呈陰性。然后根據(jù)體重將豬隨機(jī)分成10組，每組有10頭豬。
本實(shí)施例所用PRRSV分離株總共有八種，這些病毒分離株已被命名為VR-2332、IngelvacPRRS MLV、JA 142、IngelvacPRRS ATP、SDSU 73、Abst-1、MN 184、與17198-6。這八種病毒分離株橫跨整個(gè)PRRS病的病史，表現(xiàn)出各種不同程度的致病性等級(jí)，并呈現(xiàn)相關(guān)的臨床病征。所有病毒分離株均生長(zhǎng)在ATCC細(xì)胞系CL2621細(xì)胞上(CL2621是來(lái)自NVSL，Ames，IA的私有細(xì)胞株)(一種MA-104猴腎臟細(xì)胞系)。三株原始野生型病毒分離株VR-2332、JA-142與SDSU 73，也具有其對(duì)應(yīng)減毒型，分別稱作IngelvacPRRS MLV(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.，St.Joseph，MO)、IngelvacPRRS ATP(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.，St.Joseph，MO)、以及Abst-1。這些減毒型病毒分離株均顯示較低或不可檢出的致病性，其通過(guò)在活體外傳代來(lái)減毒而衍生的。PRRSV分離株ATCC VR-2332是1991年在明尼蘇達(dá)州(Minnesota)分離出來(lái)，使用的是第三代細(xì)胞傳代培養(yǎng)物。此病毒的減毒型可商業(yè)購(gòu)得，商品名稱為IngelvacPRRS MLV。PRRSV分離株JA142(ATCC編號(hào)為PTA-6504)由愛荷華州安姆斯國(guó)家動(dòng)物疾病中心(NationalAnimal Disease Center)的William Mengeling所提供，是1997年在愛荷華州，從造成繁殖障礙的嚴(yán)重“流產(chǎn)風(fēng)暴(abortion-storm)”病例中分離，使用第5代細(xì)胞傳代培養(yǎng)物。JA 142的減毒型可商業(yè)購(gòu)得，其商品名稱為IngelvacPRRS ATP，且ATCC編號(hào)為VR-2638。PRRSV SDSU 73(ATCC編號(hào)為PTA-6322)是1996年在愛荷華州，從嚴(yán)重的繁殖疾病病例中發(fā)現(xiàn)，使用第一代細(xì)胞傳代培養(yǎng)物。SDSU 73的減毒型，稱為Abst-1(ATCC編號(hào)為PTA-6320)，通過(guò)52次傳代獲得。PRRSV分離株17198-6(ATCC編號(hào)為PTA-6321)，是1997年在俄克拉荷馬(Oklahoma)從一群患有嚴(yán)重繁殖疾病的豬中獲得的，使用第四代細(xì)胞傳代培養(yǎng)物。PRRSV MN184(ATCC編號(hào)為PTA-6319)是在2001年在南明尼蘇達(dá)從遭遇嚴(yán)重繁殖疾病與母豬死亡的養(yǎng)豬場(chǎng)中取得，由圣保羅明尼蘇達(dá)大學(xué)(University of Minnesota，St.Paul)的KurtRossow所提供，使用病毒分離株的第一代細(xì)胞傳代培養(yǎng)物。此外，我們也制備了包含所有病毒分離株的組合的混合株。
在第零天，將八種PRRSV分離株中的每一種及PRRSV混合株在含有4％胎牛血清(FBS)(JRH Bioscience，Lenexa，KS)的Eagle’s極限必需培養(yǎng)基(EMEM)(JRH Bioscience，Lenexa，KS)中稀釋至大約3.0 log10 TCID50/ml，然后經(jīng)鼻內(nèi)投藥至豬，劑量為一劑2毫升(每鼻孔1毫升)。給予未處理的對(duì)照組2毫升的培養(yǎng)液。在含有3日齡CL2621細(xì)胞的96孔板上滴定接種物以利用Reed-Muench法(Reed等，1938)確定效價(jià)。所觀察到施用至豬的效價(jià)，以及致病性水平的描述和分離信息列在表1中。
表1分離株的致病性和接種效價(jià)

*代表減毒型RRSV病毒**含有八種病毒分離株的混合物***發(fā)表在Symposium on Emerging Diseases(羅馬，2003年)中關(guān)于肺部損傷的摘要然后通過(guò)分析百分比序列同一性比較分離株以確定其基因相似度。序列同一性是將病毒樣品委托明尼蘇達(dá)大學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室(Diagnostic Laboratory)進(jìn)行序列分析來(lái)確定的。提供ORF 5-6的結(jié)果，然后將其與PRRS病毒的共有序列進(jìn)行比較。個(gè)別堿基對(duì)的差異被注明，然后比較各病毒分離株的％序列同一性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，blast搜尋也能在不同的網(wǎng)站上進(jìn)行。例如，明尼蘇達(dá)大學(xué)提供一個(gè)PRRSV數(shù)據(jù)庫(kù)(ccgb.umn.edu/cgi-bin/common/web_blast.cgi)，其中列出從1989到2003年病毒分離株的序列。另一個(gè)常被使用的網(wǎng)站是NCBI BLAST，網(wǎng)址為ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。
根據(jù)表2顯示的百分比序列同一性與系統(tǒng)樹圖，致病性野生型病毒分離株的基因差異非常明顯，且代表多個(gè)組的PRRSV分離株。相反地，親代與疫苗PRRSV對(duì)在基因上相同。表2的成對(duì)比較(pairwise comparison)與系統(tǒng)樹圖是用序列分析工具中的Lasergene軟件套件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)所產(chǎn)生。
表2，本研究所用的致病型與減毒型PRRSV分離株的ORF5核苷酸序列的成對(duì)比較。相似百分比顯示在表格右上角，差異百分比顯示在表格左下角。系統(tǒng)樹圖顯示病毒分離株的遺傳相關(guān)度。條帶代表每一百殘基有一個(gè)核苷酸改變。VR2332是Ingelvac PRRS MLV的親代病毒分離株，JA 142是Ingelvac PRRS ATP的親代病毒分離株，SDSU 73是Abst-1的親代病毒分離株。
相似百分比


差異百分比在第49天，將2毫升致病型分離株P(guān)RRS MN 184經(jīng)鼻內(nèi)投藥至第1到9組。MN 184分離株系稀釋于MEM+4％FCS中，使其濃度等于log3.0+/-0.5每毫升。經(jīng)稀釋的攻擊病毒(challenge virus)于內(nèi)含用于測(cè)試的三日齡CL2621細(xì)胞的96孔板內(nèi)滴定。動(dòng)物被評(píng)估14天，然后進(jìn)行驗(yàn)尸。
病毒血癥的評(píng)估在第0、1、3、7、15、21、28、35、42、與49天，利用真空采血管(vacutainer)從各組的每只豬中采集血液樣品。以6000RPM離心20分鐘從凝集的全血中分離血清。然后將血清樣品分裝以用于通過(guò)病毒分離、TCID50分析、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、HerdChekPRRS ELISA 2XR、和PRRSV蛋白特異性ELISA進(jìn)行分析。本研究的血清樣品在收集后立即處理，并且在取得后三小時(shí)內(nèi)放置冰上降溫。樣品儲(chǔ)存在4℃最久不超過(guò)24小時(shí)，之后儲(chǔ)存在-70℃。以RT-PCR檢測(cè)的血清樣品在收集當(dāng)天凍在-70℃，并儲(chǔ)存直到樣品數(shù)目足以在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)試，再將樣品解凍，提取，以及測(cè)試。
對(duì)于TCID50分析，將100微升來(lái)自每只豬的血清加到含有900微升EMEMm+2％FBS+50微克每毫升遺傳霉素(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)+2.5微克每毫升兩性霉素B(Invitrogen Corporation，Grand Island，NY)的稀釋管中。將稀釋管渦旋震蕩，取100微升到另一含有900微升EMEMm+2％FBS+50微克每毫升遺傳霉素+2.5微克每毫升兩性霉素B的稀釋管中。重復(fù)此步驟直到達(dá)到最終的稀釋度10-6。將每次稀釋的4種重復(fù)體鋪于內(nèi)含每孔100微升CL2621(MA 104細(xì)胞)的96孔盤中，置于37℃與4％CO2的條件下培養(yǎng)八天。接著檢驗(yàn)每個(gè)孔的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，并利用Reed-Muench計(jì)算法測(cè)定效價(jià)。對(duì)于病毒分離，將100微升血清加到含有MA 104細(xì)胞的一式兩份的測(cè)試孔的每一個(gè)中。然后將板置于37℃、4％CO2下保溫1小時(shí)。接下將500微升EMEM+2％FBS+50微克每毫升遺傳霉素+2.5微克每毫升兩性霉素B加入每個(gè)孔。將板置于37℃、4％CO2下保溫八天，然后檢驗(yàn)CPE。
為了從血清中提取病毒的RNA以用于定量RT-PCR，如試劑盒中的指示所述使用QIAamp Viral RNA Mini-kit(購(gòu)自Qiagen Inc.，Valencia，CA)。對(duì)于實(shí)時(shí)PCR，商業(yè)可購(gòu)得的實(shí)時(shí)單管RT-PCR試驗(yàn)(其用于檢測(cè)美國(guó)PRRSV)系由Tetracore公司(Gaithersburg，MD)提供，并被用于檢測(cè)PRRSVRNA。通過(guò)比對(duì)GenBank PRRSV分離株并基于3’UTR引物與探針區(qū)的保守區(qū)域，從3’非翻譯區(qū)(UTR)PRRSV基因組區(qū)域設(shè)計(jì)小溝結(jié)合型(minorgroove binding，MGB)5’核酸酶探針與引物。使用由Tetracore U.S.PRRSVMaster Mix(18.9微升Master mix、2微升Enzyme mix 1、與0.1微升Enzymemix 2)與4微升提取的PRRSV RNA所組成的25微升反應(yīng)體積，在單個(gè)管中轉(zhuǎn)錄PRRSV RNA。將反應(yīng)管置入Smart Cycler IIblock(Cepheid，Sunnyvale，CA)中，將熒光檢測(cè)的軟件工具設(shè)定為用于基線的自動(dòng)計(jì)算，并開啟背景扣除。溫度循環(huán)程序由以下組成52℃1800秒，95℃900秒，與以94℃30秒，61℃60秒和72℃60秒進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。假如循環(huán)閾值(Ct)水平在小于或等于45個(gè)循環(huán)獲得，PCR反應(yīng)被認(rèn)為是陽(yáng)性。為定量，使用已知量的連續(xù)稀釋的體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物(1×10-1到1×108拷貝每微升)來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的拷貝/ml濃度通過(guò)將對(duì)濃度已知的3’UTR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作圖的Ct值進(jìn)行線性外推來(lái)測(cè)定。
抗體檢測(cè)ELISA S/P比值通過(guò)由根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行HerdChekPRRS ELISA2XR(INDEXX Laboratories，Westbrook，MA)而產(chǎn)生。用于HerdChek的PRRSV蛋白特異性ELISA利用重組病毒分離株VR2332的核衣殼蛋白(N)以及非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)4(nsp4)來(lái)進(jìn)行，其在BL21(DE3)-RP細(xì)胞(購(gòu)自stratagene)中自質(zhì)粒pET 24b表達(dá)為含有氨基末端myc標(biāo)簽與羧端6x組氨酸標(biāo)簽(6x histidine tag)的融合蛋白。變性蛋白質(zhì)在0.1M Tris HCl，pH8.0，6M胍-HCl，2mM EDTA中透析，并調(diào)整濃度到3毫克每毫升。將DTT加至300mM，以0.45微米膜過(guò)濾溶液。經(jīng)還原的蛋白質(zhì)被加到重折疊緩沖液(100mM Tris HCl，pH8.0，0.5ML-精胺酸，8mM氧化型谷胱甘肽，2mM EDTA，10μM pepstatin A，10μM leupeptin，1mM PMSF)中，過(guò)濾(0.22μm)并攪拌過(guò)夜。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)通過(guò)切向流式過(guò)濾(tangential flow filtration)(Pellicon XLUltracel PLC 5kd，Millpore)濃縮，再用20mM Tris HCl(pH8.0)透析。將蛋白質(zhì)在具有Protein LabChip的Agilent 2100 Bioanalyzer上分析。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)存在-80℃。
蛋白特異性ELISA是通過(guò)用在pH9.6碳酸緩沖液中的100ng重組蛋白質(zhì)或用單獨(dú)的緩沖液包被微量滴定板來(lái)進(jìn)行。該板用含有0.1％Tween20(PBST)的磷酸鹽緩沖鹽水中的2.5％脫脂牛奶封閉(block)。將100微升稀釋度1∶2000的血清加入一式二份的孔中2小時(shí)，然后以PBST清洗盤，抗體的結(jié)合通過(guò)以下方法檢測(cè)與1∶5000稀釋的辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的山羊-抗豬IgG(重+輕鏈(購(gòu)自KPL，Gaithersburg MD))保溫1小時(shí)，接著洗滌，并用100微升TMB底物(購(gòu)自KPL)呈色。反應(yīng)利用1M磷酸終止，在波長(zhǎng)450nm讀板值。
體重在第0天(研究第1天)及第49天(研究最后一天)對(duì)所有豬進(jìn)行稱重。豬在可攜式電子重量-橫杠天平系統(tǒng)Weigh-TronixTM模式615XL(Wight-Tronix，Inc.，F(xiàn)airmont，MN)上秤重。天平在每次使用前后以合格檢驗(yàn)砝碼進(jìn)行校正。
臨床評(píng)分在研究中每一天，每一豬由獸醫(yī)師對(duì)呼吸癥狀、行為、以及咳嗽進(jìn)行評(píng)分，每一種臨床癥狀的評(píng)分為1到4分。正常動(dòng)物給3分，最嚴(yán)重的臨床疾病給予9分，而死亡動(dòng)物得到12分。研究中死亡的所有豬的樣品，被送至愛荷華州立大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病理檢驗(yàn)。
肺部免疫組織評(píng)估在驗(yàn)尸當(dāng)天，將來(lái)自每只豬的肺部樣品用福爾馬林固定，以用于通過(guò)免疫組織化學(xué)及顯微鏡檢查符合PRRSV的損傷。此檢驗(yàn)由愛荷華州立大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均輸入SAS(版本8.02)進(jìn)行數(shù)據(jù)管理與分析。對(duì)所有適合的目標(biāo)變量(out come variable)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)摘要，包括平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、標(biāo)準(zhǔn)誤差、中位數(shù)、及頻率分布。對(duì)于體重、RT-PCR、及Log10 TCID50/ml的數(shù)據(jù)，通過(guò)單向ANOVA分析處理群組間的整體差異，并通過(guò)最低顯著差異t測(cè)定法(Least Significant Difference t test)對(duì)處理組間的差異進(jìn)行成對(duì)檢測(cè)。組間差異的所有測(cè)試設(shè)計(jì)為雙向檢測(cè)(two-sided test)。差異在p值小于或等于0.05時(shí)被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的。
數(shù)據(jù)會(huì)進(jìn)行一些變動(dòng)以利于相關(guān)性分析。Log10 TCID50/ml的數(shù)值小于2.00時(shí)，會(huì)被設(shè)定為1.0。RT-PCR數(shù)值為陰性時(shí)，設(shè)定為1.0，而所有RT-PCR數(shù)值在分析前通過(guò)轉(zhuǎn)換為以10為底的對(duì)數(shù)(log base 10)進(jìn)行常態(tài)化(normalize)。對(duì)照組的結(jié)果不包含在相關(guān)性分析中。每只豬的結(jié)果利用梯形法則(Trapezoidal Rule)轉(zhuǎn)換為曲線下近似面積。計(jì)算整個(gè)研究周期、從第一次觀察到第15天與從第15天到最后一次觀察的曲線下面積，但在圖中只顯示整個(gè)研究周期。
結(jié)果病毒分離與Log10 TCID50/ml的定量在感染當(dāng)天的暴露以前，沒(méi)有動(dòng)物對(duì)PRRSV測(cè)試陽(yáng)性。透過(guò)鼻內(nèi)感染的后第1天，五組中只有13只動(dòng)物的病毒測(cè)試為陽(yáng)性。然而，在感染后第3天，除了感染17198-6病毒分離株的動(dòng)物以外，其它感染野生型(field)病毒分離株的所有動(dòng)物皆呈為病毒陽(yáng)性，平均Log10 TCID50/ml值為從2.1(SDSU-73)到3.9(MN 184)。相反地，接種減毒型病毒分離株的豬的細(xì)胞培養(yǎng)一律呈現(xiàn)陰性。這些結(jié)果在圖1顯示。對(duì)于5株致病性病毒分離株中的4株，在第7天達(dá)到病毒血癥峰值水平，其為從3.6到4.6 Log10 TCID50/ml。17198-6病毒分離株在第15天達(dá)到最高。所有致病性病毒組中的效價(jià)維持在接近或高于2 Log10 TCID50/ml 21天，但除了JA 142感染組具有低于該水平之外。
在接種了減毒型PRRSV分離株的豬中，病毒血癥程度比在接種致病型野生型病毒分離株的豬中低。減毒型病毒分離株的效價(jià)的組平均最高值比最低的致病型組效價(jià)的最高值低一個(gè)log值。除了在接種后第3天外，Abst-1分離株不曾被重新分離。從第7到28天，IngelvacPRRS MLV的病毒血癥在0.5到1.0 Log10 TCID50/ml之間變動(dòng)，而從第7到28天，IngelvacPRRSATP的病毒血癥在0.4到1.2 Log10 TCID50/ml之間變動(dòng)。減毒型病毒分離株的病毒在第28天后，無(wú)法從血清中回收，而到第35天，病毒僅可從二個(gè)致病型野生型病毒分離株組(分離株混合物-感染的與MN 184感染的豬)回收(結(jié)果也表示在圖1)。在第42及49天，病毒分離的結(jié)果顯示，幾乎所有豬均無(wú)病毒血癥發(fā)生。
整體來(lái)說(shuō)，觀察到致病性越高的病毒分離株比減毒型病毒分離株在豬中復(fù)制速度更快，效價(jià)更高。具體地，MN 184病毒分離株感染的豬表現(xiàn)出非常迅速增加的病毒復(fù)制(其在第三天前開始)，在第7天達(dá)到超過(guò)4.5 Log10TCID50/ml的峰值。在達(dá)到峰值以后，MN 184病毒血癥不斷下降，但是在第28與35天，比起其它病毒分離株，仍然維持在顯著較高的效價(jià)(t檢驗(yàn)，p值小于或等于0.05)。在所有其它致病型組(VR2332、JA 142、SDSU 73、與分離株混合物)中，均觀察到相似的趨勢(shì)(見圖1)。感染17198-6的豬，與MN 184感染組的趨勢(shì)相同，但是并不很接近。
施予減毒型病毒分離株(IngelvacPRRS MLV，IngelvacPRRS ATP與Abst-1)的豬的組的趨勢(shì)不同。在第3天后，它們開始顯示出適中的病毒當(dāng)量增加，在第7到15天的間達(dá)到最大值，其病毒當(dāng)量比任何致病型暴露組低一個(gè)對(duì)數(shù)值，并且比MN 184感染組低數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)。然后，在這些減毒型暴露組所觀察到的效價(jià)，在第35天或的前會(huì)下降到0(見圖1)。
當(dāng)比較第二次暴露后的群組平均值時(shí)，減毒型組的病毒效價(jià)有非常急劇的增加，而致病型組只顯現(xiàn)較小的增加或甚至完全無(wú)增加。舉例來(lái)說(shuō)，在第二次暴露后7天，Abst-1的效價(jià)為3.76logs，而MN 184的效價(jià)為0。其它減毒型組在第二次感染后第3天其效價(jià)達(dá)到最高。在第二次感染后對(duì)任何致病型組觀察到的最高效價(jià)為1.32logs，所述情況JA 142暴露后3天見到。
通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR定量病毒病毒血癥水平也可利用實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定，因?yàn)樵贑L2621細(xì)胞上的生長(zhǎng)對(duì)于所有病毒分離株可能不相同，而且因?yàn)閷?duì)于病毒血癥RT-PCR可比在細(xì)胞上生長(zhǎng)更為靈敏。如圖2所示，致病型暴露組在第1天顯現(xiàn)平均濃度急劇增加，且所有組在第7到15天間的最大值達(dá)到超過(guò)8logs每毫升。致病型暴露組濃度接著在下幾個(gè)星期逐漸變低，在第49天濃度低于4logs每毫升。
減毒型病毒分離株暴露組的濃度同樣在大約第1天開始顯示遠(yuǎn)較不明顯的增加，且其平均組效價(jià)從未到達(dá)或超過(guò)7logs每毫升(圖2)。對(duì)減毒型暴露組所觀察到的濃度，在暴露后數(shù)星期維持在顯現(xiàn)大范圍上下波動(dòng)的水平。此波動(dòng)主要是由于偶爾會(huì)在單個(gè)豬中檢測(cè)到高值。三種減毒型分離株暴露組都在研究的不同天數(shù)達(dá)到最大值。IngelvacPRRS MLV感染組在第28天達(dá)到最大濃度4.31logs每毫升，IngelvacPRRS ATP感染組在第3天達(dá)到最大值6.58logs每毫升，而Abst-1感染組在第35天達(dá)到最大值6.85logs每毫升，其是減毒型分離株達(dá)到的最高效價(jià)(圖2)。此外，在第3及15天，觀察到致病型分離株組的平均濃度明顯高于減毒型分離株組平均濃度(p值小于0.05)，但是在第49天，致病型分離株組的平均濃度明顯低于減毒型分離株組的平均濃度(p值小于0.05)。
HerdChekPRRS ELISA 2XR如圖3所示，由HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值所測(cè)得對(duì)PRRS病毒的體液性免疫反應(yīng)顯示，在第15天時(shí)，致病型分離株暴露組的陽(yáng)性結(jié)果平均提高超過(guò)0.4截點(diǎn)(cut off)。相反地，減毒型分離株暴露組平均值為陰性且所有三組均維持低于0.4直到第21天之后。IngelvacPRRS MLV與IngelvacPRRS ATP組在第28天顯示陽(yáng)性結(jié)果，但是直到第42天，Abst-1病毒感染組未顯示超過(guò)0.4的平均S/P比值。
在致病型病毒分離株或分離株混合物感染的組與接種了減毒型病毒分離株的組的體液性免疫反應(yīng)的比較中，很清楚抗體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)與量級(jí)與病毒血癥水平有相關(guān)性，特別是在感染后第14到35天之間。此觀察進(jìn)一步由HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值與病毒效價(jià)或RT-PCR的成對(duì)比較所確定的病毒血癥水平與體液性抗體反應(yīng)間的相關(guān)性所支持。圖4與圖5顯示體液性抗體反應(yīng)在整個(gè)研究期間與病毒負(fù)荷密切相關(guān)，病毒效價(jià)的相關(guān)系數(shù)γ＝0.858，RT-PCR的相關(guān)系數(shù)γ＝0.794。此相關(guān)性是高度顯著的(每種情況中p值小于0.0001)，此外，減毒型病毒分離株表現(xiàn)出低抗體反應(yīng)與低病毒負(fù)荷，而致病型病毒分離株顯示高反應(yīng)。
PRRSV蛋白特異性ELISA為了獲得對(duì)PRRSV接種物與體液性免疫反應(yīng)的差異間的相關(guān)性的進(jìn)一步了解，測(cè)定針對(duì)N(主要結(jié)構(gòu)蛋白)與nsp4(重要但次要的非結(jié)構(gòu)蛋白酶)的抗體效價(jià)。圖6a顯示核衣殼蛋白抗NIgG抗體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)對(duì)所有組幾乎相同，在第28天達(dá)到最大效價(jià)，隨即在的后7到14天后急速減小，之后在第42到49天間維持不變或輕微增加。
每個(gè)分離株的反應(yīng)程度與HerdChekPRRS ELISA 2XR結(jié)果所得相似，并且與病毒血癥水平一致。在第28天，最低的峰效價(jià)值在接種了減毒型病毒分離株的組中觀測(cè)到，而最高效價(jià)值在感染了高度致病型MN 184病毒分離株的豬中觀測(cè)到。到第49天，除MN 184與分離株混合物組之外，各組中抗N抗體的效價(jià)均相同，顯示對(duì)MN 184的體液反應(yīng)可能在性質(zhì)上不同。此外，到第49天，這兩組中每組只有5只豬存活，反映出第49天時(shí)，在MN 184組中的標(biāo)準(zhǔn)誤差增加。
如圖6b所示，對(duì)nsp4的IgG反應(yīng)實(shí)質(zhì)上與對(duì)N的不同。在第21天之前并沒(méi)有檢測(cè)到抗nsp4抗體，總體反應(yīng)低得多，而且在接受IngelvacPRRS MLV與Abst-1的組中沒(méi)有檢測(cè)到明顯反應(yīng)。此外，抗nsp4反應(yīng)程度與病毒血癥水平?jīng)]有相關(guān)性。對(duì)于VR 2332、JA 142、MN 184及分離株混合物的反應(yīng)均相同，在第28天到達(dá)最高值，隨后在第35天下降，然后在第42天再度上升，而在此四組中，病毒血癥的量級(jí)，時(shí)程與持續(xù)時(shí)間皆有不同變化。圖7表示當(dāng)檢查重復(fù)測(cè)定分析(repeated measures analysis)時(shí)，nsp4 ELISA的數(shù)據(jù)與Log10 TCID50/ml數(shù)據(jù)相比，可發(fā)現(xiàn)病毒血癥水平與nsp4體液性抗體反應(yīng)并無(wú)相關(guān)性。在第49天對(duì)MN 184病毒分離株的第二次暴露后，第二次反應(yīng)也非常低。
體重在實(shí)驗(yàn)第0天時(shí)，任一組的平均體重并無(wú)明顯差異(p值為0.099)。在第49天時(shí)，接種了減毒分離株Abst-1病毒的豬具有最高平均體重，除對(duì)照組外，明顯高于其它所有組(表3)。此外，在第49天時(shí)，除17198-6組外，所有致病型分離株暴露組的平均體重明顯低于對(duì)照組(表3)。減毒型分離株暴露組IngelvacPRRS MLV與IngelvacPRRS ATP以及對(duì)照組的平均體重在統(tǒng)計(jì)上相等(表3)。
表3平均體重病毒分離株第0天 第49天
VR23326.381 33.5bIngelvacPRRS MLV6.5634.6*JA 1426.4232.7bIngelvacPRRS ATP6.2435.0*SDSU-73 6.5932.9bAbst-16.6939.4aMN 1846.7323.7c17198-6 6.3634.5*混合物**6.5123.0c控制組6.4838.4*1體重以公斤為單位。第0天時(shí)的平均體重并無(wú)顯著差異。
*表示第49天時(shí)，這幾組的體重在統(tǒng)計(jì)上相同。
**混合物代表含有所有八分離株的混合物。
a除對(duì)照組外，顯著高于所有組(p值小于或等于0.05)。
b代表顯著低于對(duì)照組。
c代表顯著低于所有組。
臨床評(píng)分僅有在致病型暴露組中的四組觀察到平均臨床評(píng)分增加JA 142、SDSU 73、MN 184、與混合物組。在整個(gè)研究中，一直維持較高的評(píng)分，而剩下的組(包括致病型與減毒型暴露組)在研究期間基本上具有正常臨床評(píng)分。在本研究中所觀察到平均臨床評(píng)分改變唯一主要的因素是，一或多只動(dòng)物在相關(guān)的處理組中死亡(表4)。
表4感染后豬死亡率組別病毒分離株 死亡率 死亡天數(shù)1 VR 2332 0/10 無(wú)2 IngelvacPRRS MLV 0/10 無(wú)3 JA 142 1/10(10％) 174 IngelvacPRRS ATP 0/10 無(wú)5 SDSU-73 2/10(20％) 9，23
6Abst-10/10 無(wú)7MN 1845/10(50％)14，14，17，23，41817198-6 0/10 無(wú)9混合組**5/10(50％)12，16，17，21，2110 對(duì)照組2/10*41，48減毒型PRRSV0/30(0％)致病型PRRSV13/60(22％)在處理組中所有死亡均是由于PRRS病毒與第二次細(xì)菌感染所造成的中度或嚴(yán)重非化膿性間質(zhì)性肺炎(non-suppurative interstitial pneumonia)。
*由細(xì)菌性肺炎造成死亡，與PRRS病毒無(wú)關(guān)。
**混合物是含有所有八分離株的混合物。
臨床疾病的嚴(yán)重性與病毒負(fù)荷高度相關(guān)(病毒效價(jià)的p值小于0.001)。如圖8所示，MN 184與混合物感染的組的最高臨床評(píng)分。每組有百分之五十的豬死亡，病毒效價(jià)顯示，感染水平實(shí)質(zhì)上比所有其它組高。根據(jù)RT-PCR所測(cè)定的病毒負(fù)荷的差異較不明顯(數(shù)據(jù)未顯示)，而臨床病征與由RT-PCR所測(cè)定的病毒負(fù)載的相關(guān)性比與病毒效價(jià)的相關(guān)性低(分別為γ＝0.556相對(duì)于γ＝0.803)。第10組(控制組)的臨床評(píng)分在兩只豬死于細(xì)菌性肺炎后增加。通過(guò)肺組織的免疫組織染色、陰性病毒分離與實(shí)時(shí)RT-PCR分析，顯示兩只豬皆呈PRRSV陰性，并且HerdChekPRRS ELISA 2XR或蛋白特異性ELISA顯示完全沒(méi)有血清轉(zhuǎn)化(seroconversion)。之后的發(fā)現(xiàn)顯示，在研究中意外死亡的豬，存在許多細(xì)菌性病原，因此可能由于受到第二次細(xì)菌感染而導(dǎo)致死亡(表5)。
表5暴露后死亡的原因豬編號(hào) 組別 死亡原因 死亡天數(shù)993 JA 142PRRS與豬鏈球菌(Streptococcus suis)17948 陰性對(duì)照組化膿性隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)與敗血41性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)983 陰性對(duì)照組化膿性隱秘桿菌與敗血性巴氏桿菌48922 SDSU 73 PRRS與細(xì)菌性肺炎*9
918SDSU 73 PRRS與埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)23973MN 184 PRRS與豬放射桿菌(Actinobacillus suis) 14992MN 184 PRRS與豬放射桿菌 14980MN 184 PRRS與埃希氏大腸桿菌 17971MN 184 PRRS與埃希氏大腸桿菌 23958MN 184 PRRS與埃希氏大腸桿菌 41976混合物 PRRS與豬放射桿菌 12970混合物 PRRS與豬鏈球菌16972混合物 PRRS與豬鏈球菌17995混合物 PRRS與豬鏈球菌21969混合物 PRRS與化膿性隱秘桿菌 21*診斷報(bào)告表示無(wú)所列特定因子的“細(xì)菌性肺炎”。
肺部免疫組織學(xué)評(píng)估雖然各組的平均IHC評(píng)分與所觀察到PRRSV損傷之間無(wú)明顯差異，但當(dāng)根據(jù)致病性來(lái)比較IHC評(píng)分時(shí)，有明顯的差異存在。平均IHC評(píng)分與PRRSV損傷，如圖9與表6所示。
表6根據(jù)致病性的平均IHC評(píng)分

*＝p≤0.05時(shí)顯著。
討論本實(shí)施例的一個(gè)目的在于檢驗(yàn)致病性水平已知的不同PRRSV分離株，來(lái)測(cè)定是否與其體內(nèi)復(fù)制有關(guān)系，其可用于預(yù)測(cè)PRRSV分離株的致病性，而不需進(jìn)行受控制的攻擊實(shí)驗(yàn)。此外，興趣在于測(cè)定病毒分離株的致病性、病毒血癥水平、與體液性抗體反應(yīng)之間的關(guān)系。最后，興趣在于利用本發(fā)明的方法，開發(fā)對(duì)抗被發(fā)現(xiàn)具有致病性的PRRSV分離株的疫苗。目標(biāo)是獲得對(duì)其它致病性病毒分離株提供某種程度上的保護(hù)的疫苗；然而，此種交叉效用可能不是普遍地針對(duì)所有PRRSV分離株，且需要再進(jìn)一步試驗(yàn)。無(wú)論如何，明顯地本發(fā)明提供一種有效的工具，來(lái)鑒定疫苗開發(fā)的主要候選物。
為了在相同狀況下測(cè)試PRRSV分離株，所使用的經(jīng)許可的疫苗(licensed vaccine)的劑量，必須低于美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)所確定的最小免疫劑量，并且必須不是典型的商用劑量。此外，本研究所使用的MLV疫苗的經(jīng)鼻內(nèi)投藥途徑不是符合USDA標(biāo)示，而僅是模仿較自然的暴露。經(jīng)改良的活PRRS疫苗(Ingelvac PRRS MLV與Ingelvac PRRS ATP)的典型商用劑量要比本試驗(yàn)使用的高得多。這些經(jīng)改良活PRRS疫苗在實(shí)驗(yàn)中所使用的低劑量，不代表此領(lǐng)域中所使用的實(shí)際產(chǎn)品劑量與型式，并且很容易解釋所報(bào)告的血清效應(yīng)。使用疫苗的商用劑量時(shí)，利用IDEXX測(cè)定可在第14天測(cè)得血清學(xué)效價(jià)。在使用效價(jià)約為3logs的本試驗(yàn)中，此血清反應(yīng)會(huì)延遲且較低。這種現(xiàn)象本來(lái)是預(yù)期的，但進(jìn)行它以確保在組間效價(jià)投與的一致性，并促進(jìn)致病型與減毒型病毒分離株之間的分析與比較。雖然沒(méi)有在本實(shí)施例中特別指出，但是劑量所造成的影響對(duì)于減毒型或致病性較低的病毒比其對(duì)于致病性野生型病毒分離株很可能明顯得多，所述致病性野生型病毒在豬血清中可以快速生長(zhǎng)，在暴露后3到7天內(nèi)就可以收獲超過(guò)4logs每毫升的病毒量。較高的推薦的商用肌肉內(nèi)劑量，在接種后14天(觀察本研究所用劑量的時(shí)間的二分之一)得到的HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值高于0.4截點(diǎn)(cutoff)(Roof等人，2003年)。本研究中的例行劑量(每只豬2×103TCID50)，在接受MN 184病毒分離株的組中造成50％致死率，并在所有組別造成抗核衣殼蛋白反應(yīng)。較高的劑量并未進(jìn)行測(cè)試，因?yàn)樵谟酶咧虏⌒圆《痉蛛x株攻擊的組中的過(guò)多死亡會(huì)妨礙到本研究的目的。此外，先前的研究已經(jīng)證明，在接種PRRSV分離株VR2332的年輕豬，在劑量為每只動(dòng)物102.2，103.2與104.2TCID50時(shí)，臨床病征與病毒血癥并無(wú)差異。
Log10 TCID50/ml與實(shí)時(shí)RT-PCR的結(jié)果都顯示，在PRRSV暴露后組間的病毒血癥水平有明顯變化。這代表豬中PRRSV生長(zhǎng)速率是病毒的一種表型特征，且其與豬對(duì)于病毒感染的耐受性的可能差異無(wú)關(guān)。此外，通過(guò)適應(yīng)在CL2621細(xì)胞株中生長(zhǎng)來(lái)使PRRSV減毒，不僅降低病毒在豬中生長(zhǎng)，并且改變病毒復(fù)制的動(dòng)力學(xué)，使病毒血癥峰值較晚出現(xiàn)。Chang等人(2002年)也有類似的觀察，他們證明即使在細(xì)胞傳代培養(yǎng)一段有限的時(shí)間，中度致病型PRRSV分離株VR 2332在豬中的病毒生長(zhǎng)也會(huì)減慢，并且達(dá)到病毒血癥峰值的時(shí)間明顯延遲。然而，延遲病毒血癥峰值時(shí)間，對(duì)于體外細(xì)胞傳代培養(yǎng)或減毒并無(wú)診斷意義，因?yàn)楦叨戎虏⌒筒《痉蛛x株17198-6也表現(xiàn)出病毒血癥峰值時(shí)間延遲。
總而言之，當(dāng)接種同樣劑量時(shí)，致病型病毒分離株與減毒型病毒分離株相比表現(xiàn)實(shí)質(zhì)上更高的血清病毒血癥水平。舉例來(lái)說(shuō)，在第15天對(duì)于給予IngelvacPRRS ATP的豬，任一減毒型病毒分離株暴露組中所觀察到最大的病毒效價(jià)為1.22logs，然而，在第15天任何致病性組的最低效價(jià)則是SDSU 73組中的2.40logs。在致病型PRRSV分離株中，病毒血癥在最大值出現(xiàn)在3到7天，及其所檢測(cè)到的病毒水平(全部大于3.5logs每毫升)有高度一致性，雖然其中MN 184在程度及持續(xù)時(shí)間上明顯較高，在第28和35天仍存在病毒效價(jià)。這支持以下概念高度致病型PRRSV分離株與減毒型或低致病型病毒分離株相比，在體內(nèi)復(fù)制到較高的效價(jià)，但在野生型PRRSV中并無(wú)法建立致病性水平與體內(nèi)生長(zhǎng)速度之間的直接的量化關(guān)系(Haynes等人，1997年)。所述的組顯示對(duì)MN 184分離株的二次暴露的廣范的防護(hù)作用。例如，在MN 184及混合株組并沒(méi)有檢出病毒，兩者在最初均接受MN184病毒分離株?？梢姷紸bst-1在暴露至MN894后賦予極小的保護(hù)。這些觀察進(jìn)一步鞏固以下概念同源暴露比異源暴露提供更多的保護(hù)作用。同源致病型暴露系較防護(hù)性，而異源致病型暴露則較低保護(hù)性，但仍比異源減毒型暴露高。
實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果在統(tǒng)計(jì)上與Log10 TCID50/ml結(jié)果非常類似，說(shuō)明兩種方法都測(cè)量組與組間感染性病毒的相對(duì)水平。在第7天所測(cè)得數(shù)據(jù)中，RT-PCR與Log10 TCID50/ml值的皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlationcoeffcient)為0.89，而平均實(shí)時(shí)RT-PCR與Log10 TCID50/ml值結(jié)果的皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.88。實(shí)時(shí)RT-PCR所測(cè)定的濃度值比Log10 TCID50/ml值高幾個(gè)量級(jí)，原因包括含有目標(biāo)擴(kuò)增子(amplicon)的病毒顆粒與完全感染CL2621細(xì)胞的病毒顆粒的頻率的差異，以及能降低感染力的中和型抗體的存在(Dianzani等人，2002年)。然而，中和型抗體不太可能解釋其差異，因?yàn)樵谒袝r(shí)間點(diǎn)(包括抗PRRSV抗體反應(yīng)產(chǎn)生的前的時(shí)間)都可觀察到所述差異。
實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)得的拷貝每毫升值，比在細(xì)胞培養(yǎng)中由TCID50/ml所測(cè)得的感染效價(jià)值還高。這是因?yàn)榛诓《净蝮w拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線例行使用在定量RT-PCR中，其直接擴(kuò)增病毒基因組序列而非已知的感染性病毒顆粒。生物分析例如細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)量感染力的存在，然而其無(wú)法計(jì)數(shù)制備物中存在的所有感染性顆粒。影響感染性效價(jià)的因子(例如細(xì)胞培養(yǎng)條件與體內(nèi)抗體(該抗體可以中和病毒)在其它研究中已經(jīng)被觀察到，導(dǎo)致低估在血清中以TCID50/ml所測(cè)得的感染性病毒的量?；蛘?，某些非感染性或復(fù)制缺陷型病毒可能存在，其可由較高拷貝數(shù)反映。
普遍來(lái)說(shuō)，ELISA觀察結(jié)果支持以下想法體液性免疫反應(yīng)規(guī)模與急性感染期間的病毒復(fù)制量相關(guān)。圖4與圖5所示的趨勢(shì)說(shuō)明此相關(guān)性。利用細(xì)胞培養(yǎng)的減毒型病毒分離株引發(fā)較慢、較低的體液性免疫反應(yīng)，而致病型病毒分離株則引發(fā)較快、較強(qiáng)的體液性免疫反應(yīng)。此外，這些觀察也證明，至少有兩個(gè)因子(病毒分離株種類與感染劑量)影響在HerdChekPRRS ELISA 2XR中的相對(duì)S/P比值。雖然圖3所示的ELISA結(jié)果顯示明顯的陽(yáng)性或陰性平均群組反應(yīng)，但重要的是應(yīng)注意個(gè)體動(dòng)物間的差異。有些在減毒型病毒組中的豬在直到第21天一直呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，而有些致病型病毒組中的豬直到第21天仍為陰性反應(yīng)。
分析對(duì)N及nsp4蛋白特異性抗體反應(yīng)顯示，對(duì)PRRSV的免疫反應(yīng)在程度上的變化與所接種的病毒分離株無(wú)關(guān)。在接種高度致病性病毒分離株MN 184與JA 142的動(dòng)物中，對(duì)于N蛋白的抗體反應(yīng)，顯示了與其它所有病毒分離株相似的趨勢(shì)，但在程度上較高。如圖1與2顯示，接種MN 184與JA 142的豬也具有最高病毒效價(jià)。這表明體液性免疫反應(yīng)的程度在急性感染中可能與病毒負(fù)荷(如病毒效價(jià)所測(cè)定的)有關(guān)。有趣的是，所有組的反應(yīng)的時(shí)間過(guò)程(time course)相同，雖然在高度致病性病毒分離株17198-6及減毒型病毒分離株中，最高效價(jià)到達(dá)時(shí)間延遲。反之，nsp4抗體反應(yīng)在所有時(shí)間點(diǎn)且對(duì)于所有病毒分離株(減毒型及致病型)都很低。抗nsp4反應(yīng)的時(shí)間流程在所有組中均相同，盡管與抗N蛋白抗體反應(yīng)的觀察結(jié)果相同，每組到達(dá)最高病毒負(fù)荷的時(shí)間有所差異。圖7顯示所有豬的抗nsp4反應(yīng)都很低。
這些觀察表明，某些PRRSV蛋白引起宿主免疫系統(tǒng)較強(qiáng)的反應(yīng)，并且與所暴露的病毒分離株的致病性無(wú)關(guān)。然而，觀察也顯示，對(duì)于致免疫性較強(qiáng)的蛋白，其引發(fā)免疫反應(yīng)的規(guī)模，可能與所暴露的病毒分離株的致病性，或病毒分離株在體內(nèi)復(fù)制能力有關(guān)。另一可能性為，抗體反應(yīng)的差異可能只是由于病毒分離株的基因差異，因而導(dǎo)致抗原反應(yīng)性的差異，所以抗其它病毒分離株的N與nsp4的抗體不與VR2332病毒分離株表達(dá)的重組蛋白(其用于包被ELISA板)反應(yīng)，或反應(yīng)較差。然而，許多證據(jù)顯示，所觀察到抗體水平上的差異，反映出免疫相關(guān)性反應(yīng)。根據(jù)ORF5比較測(cè)定，MN 184與VR2322病毒分離株基因差異最大，但是卻表現(xiàn)出最高抗N抗體反應(yīng)。先前Kapuer等人(1996年)顯示，PRRSV分離株間在一開放讀框中的相對(duì)差異，在其它開放讀框中也同樣存在。此外，單一蛋白含有保守及非保守區(qū)域(例如Kapur等人，1996年)，而強(qiáng)烈的成免疫反應(yīng)性可能針對(duì)保守性抗原決定區(qū)(Ostrowski等人，2002年)。雖然如此，根據(jù)對(duì)經(jīng)純化PRRSV蛋白的抗體反應(yīng)的ELISA結(jié)果可能受到基因及抗原差異影響，而這些效應(yīng)需被考慮進(jìn)去。對(duì)重組蛋白進(jìn)行重折疊，但在包被了未經(jīng)重折疊或經(jīng)重折疊的蛋白的ELISA板之間未觀察到差異。
需要注意的是，大約在接種后4到5周，發(fā)生對(duì)N及nsp4的抗體反應(yīng)相對(duì)上較大的降低。Foss等人(2002年)先前對(duì)GP5(主要的膜醣蛋白)也觀察到相似的1到2周的抗體反應(yīng)性高峰然后抗體反應(yīng)性降低?？傊?，這些觀察結(jié)果提示，對(duì)于單一病毒蛋白的反應(yīng)可能無(wú)法代表豬對(duì)PRRS病毒的免疫反應(yīng)的全貌，因?yàn)橛蒆erdChekPRRS ELISA 2XR所測(cè)定的體液性免疫反應(yīng)并未顯現(xiàn)抗體反應(yīng)性的相似的短暫峰值。
生長(zhǎng)減慢和死亡是使致病性及病毒的體內(nèi)生長(zhǎng)速率相互關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵。在致病性病毒暴露組中觀察到的較低平均重量最可能反映PRRSV分離株在豬體內(nèi)復(fù)制并誘導(dǎo)較嚴(yán)重疾病的能力的差異。這些觀察與先前報(bào)導(dǎo)數(shù)據(jù)一致(Thacker，2003年)PRRS感染可能造成食欲不振，而日增重(daily weightgain)降低25到40百分比。暴露于致病型病毒的豬的臨床評(píng)分在接種后不久顯現(xiàn)快速增加，但此時(shí)，減毒型病毒暴露組動(dòng)物的臨床評(píng)分實(shí)際上并無(wú)改變。臨床病征的增加在接受PRRS分離株MN 184、SDSU 73、與JA 142的致病型暴露組中表現(xiàn)為所觀察到的死亡率分別為50％、20％與10％。反之，減毒型暴露組并未造成豬死亡。當(dāng)比較暴露于MN 184與Abst-1的組時(shí)，在相同病毒感暴露況下，快速的病毒生長(zhǎng)與病毒致病性的間關(guān)系最明顯。接種效價(jià)實(shí)際上相同，分別為4.10logs每毫升及4.18logs每毫升，但是如圖8顯示，兩病毒分離株影響豬的方式存在顯著差異。Abst-1病毒分離株幾乎無(wú)活性，幾乎不在體內(nèi)復(fù)制，且不導(dǎo)致臨床病征出現(xiàn)。相反地，MN 184病毒分離株在活體內(nèi)復(fù)制至高效價(jià)，并造成嚴(yán)重臨床病征，使50％暴露的動(dòng)物死亡。另外需注意的是，暴露至所有病毒分離株的混合物的豬，表現(xiàn)出與暴露至MN 184的豬的相同的病毒學(xué)、臨床及免疫學(xué)反應(yīng)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明，在混合感染中，復(fù)制最快速的病毒可能勝過(guò)它種病毒分離株，導(dǎo)致最終結(jié)果與感染生長(zhǎng)潛力最高的單一病毒分離株的情況相同。
致病型與減毒型PRRSV分離株在體內(nèi)引人注意的差異，使我們明白病毒的致病性與其體內(nèi)生長(zhǎng)及復(fù)制的間的相關(guān)性。當(dāng)給予豬相等劑量時(shí)，致病性越高的病毒分離株顯示的Log10 TCID50/ml當(dāng)量值及RT-PCR濃度值與減毒型病毒分離株相比呈指數(shù)式升高。致病型病毒分離株誘發(fā)較快速、較強(qiáng)的體液性免疫反應(yīng)。致病型病毒分離株與減毒型病毒分離株相比，負(fù)面地影響獲重并且造成較高死亡率與較嚴(yán)重的臨床病征。
總結(jié)來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)案的實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)表示，減毒型及致病型PRRSV分離株造成顯著不同的臨床病征，以及不同規(guī)模的免疫反應(yīng)。這些差異的原因是病毒在體內(nèi)復(fù)制能力，其為可在血清樣本中定量檢測(cè)，并可以建立以預(yù)測(cè)PRRSV分離株致病性的表型特征。
實(shí)施例2本實(shí)施例提供幾種對(duì)PRRS病毒分離株的減毒及將其包含入致免疫組合物的方法。
材料與方法配制疫苗制備物，其中摻入了經(jīng)修飾或減毒的活病毒，以用于使豬通過(guò)感染PRRS病毒而獲得免疫。用于疫苗制備物的PRRSV病毒是在MA-104持續(xù)性細(xì)胞株中繁殖，優(yōu)選ATCC No.CL2621。細(xì)胞系生長(zhǎng)在含有加入10％胎牛血清的MEM的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至大約7.2，并培養(yǎng)在大約37℃。之后通過(guò)加入大約1毫升冷凍接種物到液態(tài)培養(yǎng)液基而用病毒接種細(xì)胞。使病毒吸附到細(xì)胞上，保持24小時(shí)。此時(shí)，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換為維持培養(yǎng)基(由加入4％胎牛血清的MEM，pH7.6所組成)。環(huán)境優(yōu)選為35到37℃。使病毒生長(zhǎng)，直到50％MA-104細(xì)胞薄層被病毒破壞。將樣本冷凍，并準(zhǔn)備傳代至另一燒瓶的MA-104細(xì)胞。持續(xù)此過(guò)程，使病毒在細(xì)胞系中傳代25代。之后在31℃，而非35到37℃，用上述相同技術(shù)，讓病毒繼續(xù)繁殖12代。將第12代進(jìn)行分裝，冷凍，稱為種原病毒株(Master SeedVirus)。
以下詳細(xì)說(shuō)明較佳的方法。
I.培養(yǎng)基a.Eagles極限必需培養(yǎng)基(MEM)，購(gòu)自JRH Biosciences，貨號(hào)為#200-2041。
b.胎牛血清(FCS)，購(gòu)自JRH Biosciences。
c.細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基-MEM+10％胎牛血清d.維持培養(yǎng)基-MEM 4％胎牛血清e(cuò).胰蛋白酶-Versene IXf.5％或飽和的碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate)。
II.組織培養(yǎng)所使用細(xì)胞系MA-104(非洲綠猴(African Green Monkey)腎細(xì)胞，維持在20傳代數(shù)水平內(nèi)(繼代數(shù)約58到78代)。
III.設(shè)備75cm組織培養(yǎng)瓶設(shè)定在35到37℃的培養(yǎng)箱設(shè)定在31℃的培養(yǎng)箱離心機(jī)IV.用于生長(zhǎng)在25到37℃的減毒PRRS病毒的方法。
A.制備組織培養(yǎng)的母液(stock)將5到7天的MA-10475cm儲(chǔ)存瓶，依下列方式以1比4方式分裝a.倒掉所有培養(yǎng)基(每個(gè)培養(yǎng)瓶50毫升)。
b.使用10毫升胰蛋白酶-Versene，在37℃保溫5到10分鐘，以移出細(xì)胞薄層。
c.將細(xì)胞從瓶中取出，以270xg離心5到10分鐘。
d.倒掉上清液，并將細(xì)胞再懸浮在5到10毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM10％FCS)中。
e.將所有細(xì)胞加到200毫升MEM 10％FCS中，然后分配到四個(gè)75cm培養(yǎng)瓶中，每瓶50毫升以1比4分裝。之后將培養(yǎng)瓶置于35到37℃，直到實(shí)驗(yàn)所需(可在無(wú)二氧化碳環(huán)境下進(jìn)行)。
f.已形成細(xì)胞薄層的3到4天的培養(yǎng)瓶可立即使用。
g.調(diào)整培養(yǎng)瓶中的50毫升培養(yǎng)液的pH值到7.2，然后加入1毫升病毒到培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶置于35到37℃(可在無(wú)二氧化碳環(huán)境下進(jìn)行)。
h.24小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，重新加入50毫升MEM 4％FCS(pH7.6)到培養(yǎng)瓶中，再置于35到37℃。
i.此次液體更換24小時(shí)后，CPE應(yīng)出現(xiàn)，而當(dāng)50到60％孔洞出現(xiàn)在細(xì)胞薄層中時(shí)，將其冷凍。
j.將上述培養(yǎng)瓶解凍，取1毫升其中液體并將其移到新的75cm培養(yǎng)瓶，如上述，以制造下個(gè)病毒繼代。
進(jìn)行此以上步驟總共25次，生長(zhǎng)在35到37℃。
V.用于減毒生長(zhǎng)在31℃的PRRS病毒的方法。使用在35到37℃繼代25次的病毒來(lái)制備生長(zhǎng)在31℃病毒的第1繼代。
A.準(zhǔn)備組織培養(yǎng)的母液5到7天的MA-104細(xì)胞75cm儲(chǔ)存瓶，依下列方式以1比4方式分裝a.倒掉所有培養(yǎng)基(每個(gè)培養(yǎng)瓶50毫升)。
b.使用10毫升胰蛋白酶-Versene在37℃保溫5到10分鐘，以移出細(xì)胞薄層。
c.將細(xì)胞從瓶中取出，以270xg離心5到10分鐘。
d.倒掉上清液，并將細(xì)胞再懸浮在5到10毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM10％FCS)中。
e.將所有細(xì)胞加到200毫升MEM 10％FCS中，然后分配到四個(gè)75cm培養(yǎng)瓶中，每瓶50毫升，1比4分裝。之后將培養(yǎng)瓶置于35到37℃，直到實(shí)驗(yàn)所需(可在無(wú)二氧化碳環(huán)境下進(jìn)行)。
f.已形成細(xì)胞薄層的3到4天的培養(yǎng)瓶可立即使用。
g.調(diào)整培養(yǎng)瓶中的50毫升培養(yǎng)基pH值到7.2，然后加入1毫升病毒到培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶置于31℃(可在無(wú)二氧化碳環(huán)境下進(jìn)行)。
h.24小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，重新加入50毫升MEM 4％FCS(pH7.6)到培養(yǎng)瓶中，置于31℃。
i.此次液體更換24小時(shí)后，CPE應(yīng)出現(xiàn)，而當(dāng)50到60％孔洞出現(xiàn)在細(xì)胞薄層中時(shí)，將其冷凍。
j.將上述培養(yǎng)瓶解凍，并取出1毫升此液體以制備下個(gè)SIRSVR-2332病毒繼代。
在31℃執(zhí)行以上步驟總共12次。將生長(zhǎng)在31℃病毒的第12繼代稱為種原病毒株(Master Seed Virus)，用來(lái)生產(chǎn)疫苗。
利用基因缺失使PRRS病毒減毒熟習(xí)此技術(shù)者可以利用傳統(tǒng)基因缺失方式使PRRSV減毒。一般來(lái)說(shuō)，該方法包括使編碼病毒的致病表型的相關(guān)基因缺失。該方法可以改編自如Elbers等人(U.S.Pat.App.No.20020012670)或Schall等人(U.S.Pat.No.6,740,324)的參考文獻(xiàn)，其教示與內(nèi)容系以引用方式包含入本文中。
利用溫敏型突變使PRRS病毒減毒熟習(xí)此技術(shù)者也可以利用傳統(tǒng)溫敏型突變方法使PRRSV減毒。一般來(lái)說(shuō)，此方法包括造成突變，其限制病毒活化的溫度范圍。例如，可以改編Skiadopoulos等人(”Identification of Mutations Contributing to theTemperature-Sensitive，Cold-Adapted，and Attenuation Phenotypes of the Live-減毒的Cold-Passage 45(cp45)Human Parainfluenza Virus 3 CandidateVaccine”，73 No.2 Journal of Virology 1374，(February 1999))的方法以用于PRRSV。Skiadopoulos等人的教示及內(nèi)容系以引用方式包含入本文中。
利用建立感染性殖系使PRRS病毒減毒熟習(xí)此技術(shù)者也可以利用傳統(tǒng)建立感染性殖系的方法使PRRSV減毒。一般來(lái)說(shuō)，該方法包括建立含有所需病毒基因型的全長(zhǎng)cDNA克隆，該克隆也對(duì)目標(biāo)動(dòng)物具有致病性。例如，可以改編Nielson等人(”Generation of anInfections Clone of VR-2332，a高ly Virulent North American-type Isolate ofProcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus”，77 Journal of Virology3702(Mar.2003))的方法以用于PRRSV的減毒型。Nielson等人的教示及內(nèi)容系以引用方式包含入本文中。
利用基因插入使PRRS病毒減毒熟習(xí)此技術(shù)者也可以利用傳統(tǒng)基因插入方法使PRRSV減毒。一般來(lái)說(shuō)，該方法包括將一段基因插入到病毒中，該基因抑制病毒的致病性表型。例如，可以改編Schall等人(U.S.Pat.No.6,740,324)的方法以用于此等PRRS病毒的減毒型。Schall等人的教示及內(nèi)容系以引用方式包含入本文中。
利用堿基對(duì)置換使PRRS病毒減毒熟習(xí)此技術(shù)者也可以利用傳統(tǒng)密碼子與堿基對(duì)置換方法使PRRSV減毒。一般來(lái)說(shuō)，密碼子或堿基對(duì)置換包含用不同的密碼子或堿基對(duì)置換密碼子與堿基使病毒基因編碼限制病毒病原性的蛋白質(zhì)。例如，可以改編McAuliffe等人(”Codon Substitution Mutations at Two Positions in the LPolymerase Protein of Human Parainfluenza Virus Type 1 Yield Viruses with aSpectrum of Attenuation In Vivo and Increased Phenotypic Stability In vitro”，78Journal of Virology 2029(February 2004))的密碼子置換方法，來(lái)建立用于減毒PRRS病毒的基因置換方法。此外，Hurrelbrink與McMinn(”Attenuationof Murray Valley Encephalitis Virus By Site-Directed Mutagenesis of the Hingeand Putative Receptor-Binding Regions of the Envelope Protein”，75 Journal ofVirology 7692(Auguest 2001))以及Elbers等人(U.S.Pat.App.No.20020012670)提供堿基對(duì)置換方法，其可被改編來(lái)建立經(jīng)減毒PRRS病毒分離株。McAuliffe等人、Hurrelbrink與McMinn、以及Elbers等人的教示及內(nèi)容系以引用方式包含入本文中。
利用嵌合型PRRS構(gòu)建體使PRRS病毒減毒熟習(xí)此技術(shù)者也可以利用傳統(tǒng)嵌合型構(gòu)建體的方法使PRRS病毒減毒。一般來(lái)說(shuō)，嵌合型構(gòu)建體系帶有不同種的基因以在宿主細(xì)胞中誘發(fā)產(chǎn)生抗原性反應(yīng)。例如，可以改編Harris等人(U.S.Pat.App.No.20040157307)的方法，來(lái)建立具有PRRS基因的嵌合型構(gòu)建體。
將減毒型PRRS病毒分離株摻入致免疫組合物在對(duì)新的病毒分離株進(jìn)行減毒后(優(yōu)選以上述方法之一)，將該減毒型分離株摻入可有效提供對(duì)抗PRRS致病性分離株的免疫反應(yīng)的組合物。優(yōu)選方式是，對(duì)于接受有效量組合物的動(dòng)物，該組合物可以提供對(duì)抗PRRS病毒感染的防護(hù)性免疫。在以后暴露或受到致病型病毒分離株感染的接種后的動(dòng)物中，此種防護(hù)性免疫可以降低PRRS病毒感染的臨床病征的嚴(yán)重度。優(yōu)選，所述臨床病征會(huì)通過(guò)投藥有效量的致免疫組合物或疫苗而得以防止。在某些形式中，減毒型PRRS分離株會(huì)被用來(lái)制備經(jīng)改良的活病毒疫苗，其中在致免疫組合物中，減毒分離株以其存活狀態(tài)使用。在其它形式中，減毒分離株會(huì)在包含入致免疫組合物前被殺滅或滅活。
參考文獻(xiàn)以下每個(gè)參考文獻(xiàn)的教示與內(nèi)容系以引用方式包含入本文中。
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權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)致病性未知的PRRS病毒分離株的致病性的方法，其步驟包括將一定量的該P(yáng)RRS病毒分離株給予到未受PRRS病毒感染的豬，使病毒在所述豬中復(fù)制大約3到15天的一段期間，測(cè)量該期間內(nèi)病毒生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平，并比較該生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平與致病性已知的PRRS病毒分離株的生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平，以其作為致病性未知的PRRS分離株的致病性預(yù)測(cè)指標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述期間大約在3到7天之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包括在所述期間測(cè)量病毒血癥水平，以及比較該水平與所述已知PRRS病毒分離株的病毒血癥水平的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該給予的病毒的量類似于動(dòng)物自然暴露所接受的量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該P(yáng)RRS病毒通過(guò)選自口服，鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、或其組合所組成的組的方法而給予。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該生長(zhǎng)速率或病毒血癥水平在來(lái)自所述豬的生物樣品中測(cè)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該病毒血癥的測(cè)量通過(guò)Log10TCID50/ml、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)、PRRS特異性ELISA、PRRS蛋白-特異性ELISA、或其組合來(lái)進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在給予所述PRRS病毒分離株后觀察該豬PRRS感染的臨床病征的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，該臨床病征包括呼吸癥狀、行為、咳嗽，或其組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括當(dāng)該P(yáng)RRS分離株的生長(zhǎng)速率或病毒血癥水平與具有高致病性的病毒分離株相似時(shí)預(yù)測(cè)該P(yáng)RRS病毒分離株具有高致病性的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括當(dāng)該P(yáng)RRS分離株的生長(zhǎng)速率或病毒血癥水平與具有低致病性的病毒分離株相似時(shí)預(yù)測(cè)該P(yáng)RRS病毒分離株具有低致病性的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該P(yáng)RRS病毒的給予量可達(dá)大約5毫升接種物，其病毒濃度可達(dá)5.0 Log10TCID50/ml。
13.一種致免疫組合物，其包括減毒型PRRS病毒分離株與藥理學(xué)上相容的載體，該減毒型PRRS病毒分離株選自由Abst-1以及根據(jù)權(quán)利要求1的方法被預(yù)測(cè)為具致病性的PRRS病毒的減毒形式所組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，該減毒型病毒分離株為Abst-1。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，所述根據(jù)權(quán)利要求1的方法被預(yù)測(cè)為具致病性的PRRS病毒分離株選自由ATCC VR-2332、ATCC PTA-6504、ATCC PTA-6319、ATCC PTA-6321、與ATCC PTA-6322所組成的組。
16.一種挑選用于減毒并包含入致免疫組合物中的PRRS病毒分離株的方法，其包括以下步驟a)獲得致病性未知的PRRS分離株；b)將一定量的該P(yáng)RRS病毒分離株給予未受PRRS病毒感染的豬；c)使該分離株在該豬中復(fù)制從大約3到15天的一段期間；d)在該期間測(cè)量病毒生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平；e)將該生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平與致病性已知的PRRS病毒分離株的生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平比較；以及f)根據(jù)分離株的生長(zhǎng)速率和/或其病毒血癥水平與致病性已知的分離株的比較，挑選用于減毒并包含入致免疫組合物的分離株。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，步驟(f)進(jìn)一步包括挑選與高致病性分離株具有相似的生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平的分離株。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括使所選病毒減毒的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，該病毒選自通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物中重復(fù)連續(xù)傳代、基因插入、基因轉(zhuǎn)換、基因缺失、堿基對(duì)置換、與溫度敏感突變所組成的組的方法來(lái)減毒。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括將該所選病毒包含入致免疫組合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種預(yù)測(cè)新的或未表征的PRRS病毒分離株的致病性的方法，其中，將病毒分離株注射到豬，使其復(fù)制一段時(shí)間(大約3到15天)。在該期間，測(cè)量病毒生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平，并將此數(shù)據(jù)與致病性已知的PRRS病毒分離株的生長(zhǎng)速率和/或病毒血癥水平作比較，以此當(dāng)作新的或未表征的PRRS病毒分離株的致病性的標(biāo)準(zhǔn)。此外，本發(fā)明也提供一種根據(jù)所預(yù)測(cè)的致病性來(lái)挑選用以包含在致免疫組合物中的病毒分離株的方法，以及包含預(yù)測(cè)為致病型病毒的減毒型的組合物。
文檔編號(hào)C12N7/04GK101090981SQ200580038053
公開日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月21日
發(fā)明者邁克爾·魯夫, 埃里克·沃恩, 韋斯利·約翰遜 申請(qǐng)人:貝林格爾·英格海姆維特梅迪卡有限公司