專利名稱：制備黃原膠生物聚合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制備生物聚合物的方法的領(lǐng)域，更具體地是屬于從來源于樹生黃單孢菌屬(Xanthomonas arboricola)和/或樹生黃單胞菌李屬(xanthomonas arboricola pruni)菌株的培養(yǎng)物中制備黃原膠(xantan)樣微生物的生物聚合物的方法。
背景技術(shù)：
微生物的生物聚合物是通過利用真菌、酵母或細(xì)菌并借助于生物技術(shù)方法而獲得的多糖。生物聚合物在廣泛的工業(yè)領(lǐng)域中的適宜和潛在的用途，屬于公知常識(shí)，例如在糧食、藥物產(chǎn)品、涂劑、殺蟲劑、石油工業(yè)等等中作為增稠劑、穩(wěn)定劑、膠凝劑以及乳化劑。目前，傳統(tǒng)的多糖逐漸地被微生物的相關(guān)產(chǎn)品所替代。在其它優(yōu)點(diǎn)中，這主要是由于可以通過控制除與氣候和批料質(zhì)量管理(batch quality control)無關(guān)之外的發(fā)酵參數(shù)來調(diào)節(jié)這些產(chǎn)物的流變學(xué)特征的可能性。
黃原膠是由五糖單元重復(fù)2,000至6,000次的形成的胞外陰離子多糖，具有2.106至12.106g.mol-1的高分子量。使用商品化野油菜patovar菌，通過野油菜黃單胞菌的好氧發(fā)酵可獲得黃原膠。它是由單糖D-甘露糖(mannose)、D-單糖和D-葡糖醛酸以及丙酮酸和乙酸基團(tuán)形成。
黃原膠的主要特征是它能調(diào)節(jié)溶液的流變學(xué)或流動(dòng)特性。它的性質(zhì)取決于其化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)和分子鍵。盡管作為進(jìn)口貨物，巴西跟隨著全球不斷增長的黃原膠消耗的趨勢(shì)。到目前為止，盡管巴西是世界上生產(chǎn)這些生物聚合物的原材料(蔗糖和酒精)的主要來源國，并且獲得各種生物聚合物生產(chǎn)菌，但巴西并不能制備黃原膠。
細(xì)菌多糖呈現(xiàn)出規(guī)則的化學(xué)結(jié)構(gòu)、可再現(xiàn)的化學(xué)和物理特性、以及恒定的供應(yīng)來源的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈儾⒉灰蕾囉谏a(chǎn)的氣候條件。
在50年代，在美國，出于對(duì)由微生物產(chǎn)生的水溶性膠體的關(guān)注，當(dāng)能觀察到野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv campestris)NRRL B 1459菌株可產(chǎn)生非常膠質(zhì)粘稠的菌落時(shí)，黃原膠生物聚合物被發(fā)現(xiàn)了。
與通過野油菜黃單胞菌野油菜致病變種產(chǎn)生黃原膠產(chǎn)物相關(guān)的第一件專利文件是美國專利3,000,790。隨后，美國農(nóng)業(yè)部和許多公司(例如Esso Research、Jersey ProductionResearch Co.、Kelco Co.、Rhone Poulec Industries、Pfizer Inc.、Standard Oil Co.、Sanofi-Societe Nationale EIf Aquitaine)在發(fā)酵方法上提交了的許多其它專利，例如US3,020,206、US3,251,749、US3,328,262、US3,391,060、US3,391,061、US3,485,719、FR2,342,339、FR2,414,555、US4,282,321、EP66,961、EP66,377、US4,352,882、US4,328,310、US4,400,467、US4,407,950、US4,407,951、FR2,671,097，它們都與野油菜黃單胞菌的用途相關(guān)；并且在所述方法中，溫度控制在25℃-30℃之間，在含有3gL-1酵母提取液、3gL-1麥芽提取液、5gL-1蛋白胨、10gL-1葡萄糖和20gL-1瓊脂的培養(yǎng)基中培育24h至72h，來產(chǎn)生接種物。
所涉及的發(fā)酵培養(yǎng)基使用含有0.01至0.5％質(zhì)量/體積比的無機(jī)鹽(例如K2HPO4和MgSO4)、和0.1至0.5％質(zhì)量/體積比的有機(jī)酸(例如丁二酸)以及0.01％至1％質(zhì)量/體積比的有機(jī)化合物(例如大豆糠、尿素和硝酸鹽)的培養(yǎng)基。
有用的碳源包括蔗糖、蔗糖蜜、咖啡和馬鈴薯農(nóng)產(chǎn)品、乳清以及其他等等。
其它專利，例如US3,119,812和US3,773,752，涉及在加入或不加入鹽時(shí)而通過乙醇來回收聚合物的方法。
所引用的專利文件指出黃原膠的制備基于野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)生產(chǎn)黃原膠的事實(shí)。得到的聚合物顯示下列組分除了丙酮酸和乙酸基團(tuán)之外，還有甘露糖、葡萄糖和葡糖醛酸。
商品化黃原膠所表現(xiàn)出的缺點(diǎn)是盡管它們具有優(yōu)良的特性，但單獨(dú)使用時(shí)它們不能生產(chǎn)真正的膠體，但只有當(dāng)這些產(chǎn)物被混合到半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖時(shí)才顯示出而所述的特性。令人驚訝地是，通過該方法獲得的生物聚合物具有這種性質(zhì)當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，它們可生產(chǎn)真正的膠。
另外，當(dāng)前技術(shù)水平生產(chǎn)的這些生物聚合物的粘性不隨溫度的升高而上升，這樣的特性可有所應(yīng)用。概括來說，所有由野油菜黃單胞菌生產(chǎn)的聚合物的粘度會(huì)隨著溫度升高而下降。相反，一些樹生黃單孢菌屬菌株會(huì)導(dǎo)致假塑性生物聚合物的生成，是一個(gè)最為相關(guān)的技術(shù)特征。
除此之外，商品化黃原膠生物聚合物對(duì)鹽的加入顯示出低耐受性(即使低至0.001至1％質(zhì)量/體積比(m/v)的低水平)，通常加入超過1m/v的鹽會(huì)使其粘度降低，這意味著如果黃原膠聚合物用于石油工業(yè)或用于糧食生產(chǎn)，收益會(huì)大大地減少。
因此，盡管技術(shù)已有所進(jìn)展，仍然需要通過使用來自稻米工業(yè)加工和蒸米(parboilizedrice)的剩余水和相關(guān)產(chǎn)物，來從樹生黃單胞菌和/或樹生黃單孢菌李屬菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中生產(chǎn)微生物的黃原膠類生物聚合物的加工方法。該方法中接種物在具有低濃度蔗糖或葡萄糖的培養(yǎng)基(更進(jìn)一步地指是含有常量營養(yǎng)元素和微量營養(yǎng)元素以及其它成分的液體發(fā)酵培養(yǎng)基)中，并在特殊加工條件下來實(shí)施發(fā)酵，之后，獲得的生物聚合物被沉淀和分離，這些方法所獲得的生物聚合物、培養(yǎng)基以及生物聚合物的用途在該申請(qǐng)中得以描述并要求予以保護(hù)。
發(fā)明概要概括地說，用于生產(chǎn)黃原膠類的生物聚合物的方法，包括步驟a)通過將在固體培養(yǎng)基上生長的樹生黃單孢菌和/或樹生黃單孢菌李屬致病變種的分離菌落或凍干的分離菌落，加入特殊細(xì)胞生長培養(yǎng)基中，來制備初始的預(yù)接種物；b)將所述的初始預(yù)接種物導(dǎo)入液體培養(yǎng)基并在20℃至35℃、pH4.5至9.0、以100至250rpm轉(zhuǎn)速的條件下攪拌溫育24或48小時(shí)，以便獲得最終的預(yù)接種物；凍干最終的預(yù)接種物以備另外的使用，或者將其立即轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中；c)將所得的最終預(yù)接種物輸送到含有液體培養(yǎng)基和占培養(yǎng)基直至10％質(zhì)量/體積比的蔗糖或葡萄糖的第一無菌發(fā)酵罐中，攪拌并通氣，并在20℃至35℃溫度和pH 4.5至9.0下、以50rpm和1,200rpm范圍中進(jìn)行攪拌溫育24或48小時(shí)，優(yōu)選以100至800rpm范圍中的轉(zhuǎn)速并以0.5和4體積/體積/分鐘(vvm)的通風(fēng)比加入氧氣、更優(yōu)選是0.5和3.0vvm的通風(fēng)比，以便獲得接種物；當(dāng)被凍干時(shí)，最終的預(yù)接種物應(yīng)當(dāng)通過重懸浮激活，并在被轉(zhuǎn)入所述的第一發(fā)酵罐之前的原來?xiàng)l件下進(jìn)行進(jìn)一步溫育，同時(shí)將最新制備的最終預(yù)接種物直接轉(zhuǎn)入所述的第一發(fā)酵罐中；a)d)根據(jù)50至1,200rpm的轉(zhuǎn)速、優(yōu)選100至800rpm的轉(zhuǎn)速和0.5至4體積/體積/分鐘(vvm)的通風(fēng)比、優(yōu)選0.5至3.0的vvm加入氧氣來進(jìn)行通風(fēng)，并在22℃至35℃之間的溫度和在pH4.5至9.0下，將接種物導(dǎo)入第二無菌發(fā)酵罐中，并進(jìn)行發(fā)酵24至120小時(shí)、優(yōu)選48至72小時(shí)，其中所述的第二無菌發(fā)酵罐含有用于通過深層發(fā)酵而生產(chǎn)生物聚合物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，或者將所述的無菌培養(yǎng)基加入含有接種物的發(fā)酵罐；除了纖維素、米糠和/或麥麩之外，和/或除了在0.1至4.2gL-1之間的氮、磷和鉀常量元素、和除了0.01至1.7gL-1的鎂和鐵微量元素之外，和除了復(fù)合維生素B、維生素E和直至25％質(zhì)量/體積比的蔗糖之外，以及除了50至200ppm的硅油或米糠油之外，發(fā)酵培養(yǎng)基由脫殼稻米(hull-bearing rice)浸泡液或煮飯水或來自蒸米水的水組成；e)發(fā)酵結(jié)束后，過濾發(fā)酵液以分離細(xì)胞；
f)通過加熱殺菌或用氯化化合物化學(xué)殺菌，直接在第二發(fā)酵罐中滅活發(fā)酵發(fā)酵液的細(xì)胞，以便獲得期望的生物聚合物；g)或者在離心之后，通過將極性有機(jī)溶劑(醇類優(yōu)選)加入到添加了或未添加0.2至10％m/v的一價(jià)鹽和/或二價(jià)鹽的、離心的或非離心的發(fā)酵液中，來沉淀所獲得的生物聚合物；h)通過蒸餾回收醇溶劑；i)通過在傳送帶上排干液體來分離生物聚合物產(chǎn)物，并將其轉(zhuǎn)入干燥器中；j)在普通碾磨機(jī)中碾磨和壓碎生物聚合物；和k)回收做好的黃原膠生物聚合物。
因此，本發(fā)明提供從樹生黃單孢菌和/或樹生黃單孢菌李屬致病變種培養(yǎng)物中生產(chǎn)黃原膠類生物聚合物的方法，該方法涉及使用與工業(yè)加工稻米和煮蒸稻米相關(guān)的剩余水和產(chǎn)物，來在營養(yǎng)培養(yǎng)基中制備接種物的過程。
本發(fā)明也提供由所述方法生產(chǎn)的黃原膠類生物聚合物的方法。
本發(fā)明提供所獲得的生物聚合物的另外一些用途。
本發(fā)明還提供用于實(shí)施所述方法的樹生黃單胞菌和/或樹生黃單孢菌李屬致病變種的發(fā)酵培養(yǎng)基。
本發(fā)明還提供用于實(shí)施該方法的樹生黃單胞菌和/或樹生黃單孢菌李屬致病變種培養(yǎng)物的用途。
附圖簡要說明

圖1和圖2是說明生物聚合物生產(chǎn)方法的流程圖，圖1顯示了在細(xì)胞存在下的發(fā)明模式，同時(shí)圖2顯示了生物聚合物生成過程中細(xì)胞已經(jīng)被提取的加工模式，然后干燥和碾磨生物聚合物。
圖3是舉例說明兩種樹生黃單胞菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的粘度值的曲線圖。
圖4和圖5是舉例說明在25℃下從生物聚合物水溶液獲得的粘度值的曲線圖，包括1％m/v的菌株在不同時(shí)間(24、48和72h)的粘度值，以及3％m/v濃度下的不同樹生黃單胞菌株的粘度值。這些圖也舉例說明這些生物聚合物溶液的假塑性特性。
圖6是顯示不同樹生黃單胞菌株的生物聚合物隨溫度上升粘性變化的曲線圖。
圖7是顯示72小時(shí)發(fā)酵后，不同菌株組生產(chǎn)生物聚合物的生產(chǎn)間隔(productioninterval)方框圖。
圖8顯示通氣條件對(duì)生物聚合物生產(chǎn)的影響或依賴。將樹生黃單胞李屬致病變種菌株06置于容積為3L的發(fā)酵罐中，條件分別以條件A(轉(zhuǎn)速250rpm，通氣比1.5體積/體積/分鐘-vvm)和條件B(轉(zhuǎn)速350rpm；通氣比2.0體積/體積/分鐘-vvm)加工黃原膠(g.L-1)。
圖9顯示發(fā)酵時(shí)期對(duì)生物聚合物的表觀粘度的影響，其中生物聚合物的生產(chǎn)條件是樹生黃單胞菌李屬致病變種06菌株濃度為1％m/v和2％m/v時(shí)，轉(zhuǎn)速為6rpm。
在圖10中的一組曲線顯示了與商品化黃原膠聚合物相比，由3％m/v的樹生黃單胞菌株101水溶液在加入或不加入1％m/v鹽的情況下，得到的黃原膠類生物聚合物的粘度和剪切速率的變化曲線圖。圖10的曲線舉例說明了根據(jù)本發(fā)明所得到的生物聚合物與所添加鹽的兼容性。
圖11中的一組曲線顯示了與不加入鹽的商品化黃原膠聚合物相比，106菌株的粘度和剪切速率中的變化，或者在由樹生黃單胞菌的1％m/v水溶液在不加入鹽和加入0.1％、1.0和3％m/v鹽的條件下，得到的黃原膠類生物聚合物的粘度和剪切速率中的變化。
圖12中的一組曲線顯示了，與已經(jīng)被加入1％m/v至3％m/v之間鹽量的商品化黃原膠聚合物相比，106菌株的粘度和剪切速率中的變化，或者由樹生黃單胞菌的水溶液在不加入鹽和加入0.1％、1.0和3％m/v鹽的條件下，得到的黃原膠類生物聚合物的粘度和剪切速率中的變化。
圖13中的一組曲線圖顯示了，與商品化黃原膠相比，在任意的和控制的pH下，由樹生黃單胞菌06、101和106菌株所生產(chǎn)的黃原膠的粘度和剪切速率的變化。
優(yōu)選方式的詳細(xì)說明因此，本發(fā)明涉及用于從樹生黃單胞菌(xanthomonas arboricola)和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種(xanthomonas arboricola pv pruni)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中生產(chǎn)微生物的黃原膠(xantan)樣的生物聚合物的方法，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有與稻米和蒸米的加工相關(guān)的剩余水和產(chǎn)物。
屬于Pseudomoniaceae家族的黃單孢菌屬細(xì)菌，為革蘭氏陰性菌、單鞭毛運(yùn)動(dòng)、嚴(yán)格好氧、耐鏈霉素，并且除了嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonas maltophilia)之外，黃單孢菌屬細(xì)菌基本上是植物致病菌。它們廣泛地分布于并能感染超過240種的單子葉和雙子葉植物種類(gender)。數(shù)量最多且含量豐富的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)，自身分為約125種patovar菌，它們可感染各種宿主并成為其病原菌。
樹生黃單孢菌李屬致病變種通常，黃原膠生產(chǎn)者使用野油菜(campestris)patovar菌，更具體地是NRRL B-1459及相關(guān)菌株。然而，考慮到這種生物聚合物的巨大工業(yè)用途，其它潛在的黃原膠生產(chǎn)微生物，以及細(xì)胞生長的優(yōu)化，和生產(chǎn)、回收以及純化所得到的EPS(胞外多糖，exopolysaccharide)的研究正在進(jìn)行。
李屬patovar菌按種類是李屬樹種(例如桃樹、扁桃樹和李樹)的細(xì)菌性斑點(diǎn)病(李屬細(xì)菌性斑點(diǎn)病，PBS)的病原菌。這種病害存在于各大洲，并且在炎熱潮濕氣候的區(qū)域更為嚴(yán)重。在辨別方法中，野油菜黃單胞菌顯示出對(duì)植物作用的全身性它的危害遍及植物全身，而黃單胞菌李屬致病變種(X pv pruni)具有局部危害。在位于巴西最南部的Rio Grande doSuI的州，這種細(xì)菌天生感染所有的李屬栽培種，并已成為巴西國家農(nóng)業(yè)研究公司(EMBRAPA-CPACT)進(jìn)行植物病理學(xué)研究的對(duì)象。出于這種目的，已經(jīng)分離并鑒定了超過一百種菌株。然而，只在最近才開始研究從這種patovar菌中制備黃原膠的研究。
目前，根據(jù)核糖體核糖核酸(rRNA)的寡核苷酸序列或相應(yīng)基因的序列的比較研究、以及在細(xì)胞總DNA的雜交水平中表達(dá)的同源定量DNA的同源表達(dá)定量的比較研究，對(duì)黃單胞菌種類進(jìn)行新的分類。根據(jù)這種新的分類法，將李屬黃單胞菌(xanthomonas pruni)重新分類為樹生黃單胞菌。
申請(qǐng)人指出本方法研究中使用的所有菌株，都屬于EMBRAPA收集的樹生黃單胞菌和樹生黃單胞菌李屬致病變種菌株。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面是從樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬菌株的凍干培養(yǎng)物中生產(chǎn)黃原膠類生物聚合物的方法是本發(fā)明的第一個(gè)方面。
根據(jù)本發(fā)明，從李屬樹種的壞死組織中、從具有高纖維素含量的宿主的壞死組織中、以及從桃樹和李樹的壞死果實(shí)和樹葉中分離樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬菌株的凍干培養(yǎng)物，并根據(jù)說明書中以下詳述的適宜操作條件，在深層發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。
術(shù)語“高纖維素含量”意指纖維素含量占總成分的38％至56％。
利用樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種的最顯著結(jié)果是，由本方法生產(chǎn)的黃原膠生物聚合物不同于目前市場上可得到的黃原膠生物聚合物，因?yàn)樯踔廉?dāng)它們單獨(dú)使用時(shí)，鼠李糖的存在可賦予所述的產(chǎn)物形成真正的膠體的能力。如上文所提到的那樣，這種特性是當(dāng)前黃原膠生物聚合物領(lǐng)域所缺少的。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是由于利用如上所述的稻谷加工的剩余水而降低了生產(chǎn)成本。
利用這種生物聚合物的主要優(yōu)點(diǎn)是可應(yīng)用于要求高粘度、耐熱聚合物的石油勘探中。
由于與常規(guī)黃原膠生物聚合物相比，減少了所需量，也可設(shè)想其用于食品中的好處，因?yàn)閮H僅已經(jīng)存在于產(chǎn)物配制劑中的鹽就足以提高粘度。
其它用途包括作為殺蟲劑中的涂劑增稠劑，它能有利于促進(jìn)殺蟲劑附著在植物葉片并避免產(chǎn)品流失到土壤中，以及在獸藥產(chǎn)品中作為疫苗穩(wěn)定劑。
為了更好地理解本方法，以下詳細(xì)描述了本方法的步驟。
根據(jù)在流程圖1例舉的本方法的方式中(通常由數(shù)字(100)表示的)，其中在糖濃度達(dá)到發(fā)酵培養(yǎng)基的25％質(zhì)量/體積比(或250g.L-1)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行第二次發(fā)酵，所述的方法包括下列步驟a)a)提供預(yù)先生長在固體培養(yǎng)基中或已凍干的樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種的或已凍干的分離菌落；b)通過將所述的菌落加入適宜的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基來制備初始的預(yù)接種物，并將菌落以100至250rpm的轉(zhuǎn)速并在20℃至30℃之間的溫度以及在pH 4.5至9.0的條件下溫育24h或48h(即步驟110)，其中所述的培養(yǎng)基含有13至55gL-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37gL-1的蛋白胨、10至20gL-1瓊脂、0.03至0.90g.L-1的K2HPO4以及0.001至2.5g.L-1的MgSO4和/或復(fù)合維生素B；優(yōu)選地，細(xì)胞生長培養(yǎng)基包含10至30g.L-1蔗糖或葡萄糖，3至15g.L-1蛋白胨、10至20g.L-1瓊脂、0.09至0.7g.L-1KH2PO4以及0.01至1.0g.L-1MgSO4和/或復(fù)合維生素B。優(yōu)選pH范圍在5.5到7.5之間。
c)將初始的預(yù)接種物導(dǎo)入含有下列成分的液體培養(yǎng)基13至55gL-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37gL-1的蛋白胨、0.03至0.90g.L-1的K2HPO4和0.001至2.5g.L-1的MgSO4和/或復(fù)合維生素B，然后將菌落以100至250rpm的轉(zhuǎn)速在20℃至35℃的溫度和pH 4.5至9.0的條件下溫育24h或48h，并在溫育期之后獲得最終液體預(yù)接種物(即步驟120)；優(yōu)選地，細(xì)胞生長培養(yǎng)基包含10至30g.L-1蔗糖或葡萄糖，3至15g.L-1蛋白胨、10至20g.L-1瓊脂、0.09至0.7g.L-1KH2PO4以及0.01至1.0g.L-1MgSO4和/或復(fù)合維生素B。優(yōu)選pH范圍在5.5到7.5之間。
最終預(yù)接種物可以凍干備用，或直接將其轉(zhuǎn)入第一發(fā)酵罐。
d)根據(jù)50至1,200rpm的轉(zhuǎn)速、優(yōu)選100至800rpm的轉(zhuǎn)速和0.5至4體積/體積/分鐘的通風(fēng)比、優(yōu)選0.5至3體積/體積/分鐘的通風(fēng)比加入氧氣，直接將最終預(yù)接種物導(dǎo)入第一無菌發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并在20℃至35℃之間的溫度和在pH4.5至9.0下培育24或48h來獲得發(fā)酵期結(jié)束的接種物(即步驟130)，其中所述的第一發(fā)酵罐含有由直至100gL-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37gL-1蛋白胨、0.03至0.90gL-1K2HPO4以及0.001至2.5gL-1MgSO4和/或復(fù)合維生素B組成的液體培養(yǎng)基；至于初始的和最終的預(yù)接種物，則使用優(yōu)選量。
當(dāng)被凍干時(shí)，在被轉(zhuǎn)入第一發(fā)酵罐之前，應(yīng)根據(jù)重懸浮并在先前的條件下進(jìn)行新鮮孵毓(fresh incubation)來活化凍干的最終預(yù)接種物。另一方面，直接將新近制備的預(yù)接種物轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。
e)根據(jù)50至1,200rpm的轉(zhuǎn)速、優(yōu)選100至800rpm的轉(zhuǎn)速和0.5至4體積/體積/分鐘的通風(fēng)比、優(yōu)選0.5至3體積/體積/分鐘的通風(fēng)比加入氧氣，并在22℃至35℃之間的溫度、優(yōu)選22℃至32℃之間的溫度和在pH4.5至9.0下，直接將接種物導(dǎo)入第二無菌發(fā)酵罐中，并根據(jù)生物聚合物的最終期望用途，進(jìn)行發(fā)酵24至120小時(shí)、優(yōu)選48至72小時(shí)(即步驟140)，其中所述的無菌發(fā)酵罐含有用于通過深層發(fā)酵而生產(chǎn)生物聚合物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，或者將所述的無菌培養(yǎng)基加入含有接種物的發(fā)酵罐；除了纖維素、米糠和/或麥麩之外，和/或除了0.1至7.2gL-1之間的氮、磷和鉀常量元素，和除了0.01至1.7gL-1的鎂、鐵微量元素之外，和除了復(fù)合維生素B和維生素E以及占液體培養(yǎng)基直至25％質(zhì)量/體積比(或250gL-1)的蔗糖之外，以及除了50至200ppm的硅酮和/或植物油之外，培養(yǎng)基由帶殼稻米的浸泡液或煮飯水或來自蒸米的水組成；除了米湯之外，培養(yǎng)基優(yōu)選包含常量元素(例如1.2至4.0gL-1的氮、磷、鉀)、微量元素(例如0.1t至1.0gL-1的鎂和鐵)、0.06mgL-1至2mgL-1的復(fù)合維生素B、10至30μgL-1的維生素E、直至25％質(zhì)量/體積比的蔗糖以及50至200ppm的硅酮或米糠油。
e)發(fā)酵結(jié)束后，過濾發(fā)酵液以分離細(xì)胞(即步驟150)；f)通過用121℃的流動(dòng)蒸汽(live steam)加熱殺菌或用氯化化合物進(jìn)行化學(xué)滅活的方法，滅活發(fā)酵罐中過濾發(fā)酵液中自帶的細(xì)胞(步驟160)；借助于溫度在121℃左右的流動(dòng)蒸汽，來實(shí)施加熱殺菌。
用于化學(xué)滅活培養(yǎng)基的氯化物，包含無機(jī)化合物，例如氯含量為100至200ppm次氯酸鈉和次氯酸。用于化學(xué)滅活的有機(jī)化合物包括0.01至0.1％m/v的雙氯苯雙胍己烷。
當(dāng)需要回收細(xì)胞時(shí)，將所得到的生物聚合物在離心之后進(jìn)行沉淀(參見圖2)。
當(dāng)不需要回收細(xì)胞時(shí)，在細(xì)胞滅活后進(jìn)行沉淀聚合物。
g)通過將極性有機(jī)溶劑加入滅活的培養(yǎng)液中，來進(jìn)行沉淀(步驟170)，其中培養(yǎng)液中加入或不加入濃度為0.2至10％質(zhì)量/體積比的NaCl、KCl和CaCO3其中的一價(jià)和/或二價(jià)鹽；當(dāng)溶劑濃度達(dá)到總體積的50％至80％時(shí)，發(fā)生聚合物沉淀。所需的溶劑體積取決于所加入鹽的百分比。
用于本發(fā)明目的的溶劑包括極性有機(jī)溶劑，主要是純的或以任意量混合的C2和C3醇。
h)通過蒸餾和再次投入生產(chǎn)過程的方法回收極性溶劑例如醇(步驟170a)；i)通過最初在傳送帶上排干聚合物液體的方法來干燥生物聚合物產(chǎn)物，然后將分離的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入表面干燥器或其它類似裝置中(步驟180)，隨后在任何適于碾碎的常規(guī)裝置中進(jìn)行碾磨或壓碎(步驟180a)；以及f)i)回收做好的黃原膠類生物聚合物以備使用(步驟190)。
或者，使用噴霧干燥器或表面干燥器來直接干燥發(fā)酵液，然后在球磨機(jī)或萬能磨粉機(jī)中將其粉碎成所要求的粒徑分布。
或者，通過降低初始pH約為中性的反應(yīng)系統(tǒng)的pH降低至下限值的不調(diào)節(jié)pH(或在任意pH條件下)的方法來實(shí)施該加工過程。
當(dāng)發(fā)酵液粘度在10s-1下超過250mPas時(shí)，用水或用水和極性有機(jī)溶劑(優(yōu)選C1至C3醇，例如乙醇和異丙醇)的混合液稀釋發(fā)酵液，直至粘度降至在10s-1下的250mPas。這是重要的加工特征，因?yàn)樘吵淼陌l(fā)酵液意味著本可避免的、回收步驟中的產(chǎn)物損失。
在流程圖2中描述了實(shí)施本發(fā)明方法的另一種方式，通常由數(shù)字(200)表示。根據(jù)這種方式，引入了用于細(xì)胞分離的離心步驟(250)和用于細(xì)胞回收或破碎步驟(260a)的其它步驟。
根據(jù)圖2，步驟(210)通過將固體培養(yǎng)基中的樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種菌落或凍干的菌落，加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，來制備初始的預(yù)接種物。步驟(220)和步驟(230)具有與圖1中對(duì)應(yīng)數(shù)字(120)和(130)的相同含義。
步驟(240)是在含有達(dá)直至500gL-1糖(蔗糖或葡萄糖)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的第二次發(fā)酵的步驟。
步驟(240a)是設(shè)計(jì)被用于細(xì)胞滅活的步驟。
緊跟第二次發(fā)酵步驟之后的是細(xì)胞破碎步驟(240b)。
步驟(250)涉及用于細(xì)胞分離的離心步驟。以10,000至15,000g的速度實(shí)施離心。
然后將離心過的培養(yǎng)液用醇(醇按體積比最大量為40％)進(jìn)行稀釋，并通過沉淀來回收生物聚合物，即步驟(260)。
步驟(260a)是蒸餾回收醇以作為再次利用的溶劑。
沉淀之后，將生物聚合物產(chǎn)物進(jìn)行干燥(270)、碾磨或壓碎(280)，并回收最終的生物聚合物(290)。
就所獲得的生物聚合物而言，本方法所用的菌株的生產(chǎn)力達(dá)到5.7至26.4gL-1，平均在15至22gL-1之間。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是用于實(shí)施可生產(chǎn)本發(fā)明的黃原膠類生物聚合物的方法中的第2次發(fā)酵步驟的發(fā)酵培養(yǎng)基。
如下所示優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括培養(yǎng)基A至J。
培養(yǎng)基A.
該發(fā)酵培養(yǎng)基包含a)帶殼稻米的煮飯水或浸泡水，以及稻谷蒸煮處理(蒸米)的剩余水(又稱淘米水)；所述煮飯水或浸泡水包含約20mgL-1至80mgL-1總氮量，主要是有機(jī)氮，這是用于樹生黃單胞菌李屬致病變種的優(yōu)良底物。此外，所述的水還包含10mgL-1至50mgL-1磷酸鹽離子以及2至20mgL-1硫酸根離子。
b)市場上可買到的、含量在0.2mgL-1至40gL-1中的米糠；c)市場上可買到的、含量在0.3gL-1至10gL-1中的麥麩；d)0.1至7.2gL-1的氮、磷、鉀常量元素，和0.01至1.7gL-1的鎂、鐵微量元素；e)濃度在0.02mgL-1至3mgL-1的純凈形態(tài)的復(fù)合維生素B，包括市場上可買到的維生素B1、維生素B2和煙酸(維生素B3)，或是富含復(fù)合維生素B的天然基質(zhì)。富含復(fù)合維生素B的基質(zhì)是那些維生素總含量超過10％質(zhì)量比的物質(zhì)，例如啤酒酵母、酵母提取物、脫水酵母以及麥芽；g)培養(yǎng)基中含量為10至30μg/L的維生素E，其在加工過程作為除泡劑，通常使用富含這種維生素的植物油(例如向日葵油、棉籽油或豆油)；h)濃度達(dá)250gL-1或者直至500gL-1的糖，例如蔗糖或葡萄糖。
或者，本發(fā)明的生產(chǎn)方法可使用其它培養(yǎng)基。有時(shí)候，使用所述備選的培養(yǎng)基可將產(chǎn)量提高至50％。
培養(yǎng)基B.
培養(yǎng)基B的成分包括0.15至5.0gL-1的KH2PO4、0.01至0.6gL-1的MgSO4·7H2O、10至250gL-1的蔗糖以及0.2至6gL-1的米糠。
培養(yǎng)基C.
培養(yǎng)基C的成分包括0.2至1.5gL-1的NH4H2PO4、1至5gL-1的K2HPO4、0.1至0.6gL-1的MgSO4·7H2O、0.2至2.0gL-1的檸檬酸、2至5.0gL-1的KH2PO4、0.006gL-1的H3BO3、2.0gL-1的(NH4)2SO4、0.0024gL-1的FeCl3、0.002gL-1的CaCl2·2H2O、0.002gL-1的ZnSO4、10至250gL-1的蔗糖以及0.2至6gL-1的米糠。
培養(yǎng)基D至J.
在以下表1中列出了其它有用的發(fā)酵培養(yǎng)基，用g.L-1表示不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的不用含鹽量。
表1

將在有關(guān)的附圖中進(jìn)一步描述本發(fā)明。
圖3是舉例說明兩種樹生黃單胞菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中的粘度值對(duì)比剪切速率的實(shí)施例的曲線圖。培養(yǎng)基1的曲線是關(guān)于菌株82的曲線，而培養(yǎng)基2的曲線是關(guān)于菌株87的曲線。
圖4是舉例說明25℃下，由單一菌株在不同時(shí)間(24、48和72小時(shí))所產(chǎn)生的1％m/v生物聚合物水溶液的粘度值。曲線1指24小時(shí)之后獲得的生物聚合物，而重疊的曲線2和曲線3分別指48小時(shí)和72小時(shí)之后獲得的生物聚合物。
圖5是舉例說明由不同的樹生黃單胞菌株所產(chǎn)生的3％m/v生物聚合物水溶液的粘度值的曲線圖。曲線1、2、3、4、5、6分別是由菌株101、108、113、30、25、83所產(chǎn)生的生物聚合物的幾個(gè)粘度值。
圖4和圖5還顯示了被測(cè)的生物聚合物溶液的假塑性特性。
圖6是舉例說明了由不同的樹生黃單胞菌株所產(chǎn)生的生物聚合物隨溫度上升而呈現(xiàn)粘性的柱形圖。在該圖中，實(shí)心框表示在25℃時(shí)的粘度值，而空心框表示在65℃時(shí)的粘度值。
附圖7是顯示72小時(shí)發(fā)酵后不同組菌株組生物聚合物的生產(chǎn)間隔(production interval)的柱形圖。白色方框表示由菌株06、106、46、101、37以及20所顯示的、在10至14gL-1之間的生產(chǎn)間隔。淺灰色方框表示由菌株18、07、39、36以及15所顯示的、在15至18gL-1之間的生產(chǎn)間隔。黑灰色方框表示由菌株24、58、40以及31分別在10L容積發(fā)酵罐中獲得的、在20至26gL-1之間的生產(chǎn)間隔。
圖8是方框圖，其顯示通氣條件對(duì)樹生黃單胞菌李屬致病變種菌株06在3L容積發(fā)酵罐中的黃原膠生物聚合物生產(chǎn)力(gL-1)的影響或依賴性的柱形圖。實(shí)心方框表示攪拌和通氣的條件A(250rpm和1.5vvm)，而空心方框表示條件B(350rpm和2.0vvm)。
圖9是曲線圖，其舉例說明了生物聚合物的發(fā)酵時(shí)間和濃度以及測(cè)試溫度對(duì)由樹生黃單胞菌李屬致病變種菌株06所產(chǎn)生的生物聚合物的表觀粘度的影響的曲線圖。曲線1、2、3涉及在不同時(shí)間所獲得的、并分別在65℃、45℃和25℃所測(cè)量的2％質(zhì)量/體積比生物聚合物水溶液的粘度值。曲線4、5和6涉及與曲線1、2、3所獲得相同的、并且在相同溫度下測(cè)量的1％質(zhì)量/體積比的生物聚合物水溶液的粘度值。
在附圖10中，舉例說明了1％m/v的樹生黃單胞菌株101水溶液所得到的黃原膠類生物聚合物中的粘度和剪切速率的變化。與商品化黃原膠聚合物相比，或者溶液中可選擇性的添加1％或3％m/v鹽。該曲線圖舉例說明了本發(fā)明生物聚合物與加入的鹽的相容性。曲線1是商品化的黃原膠生物聚合物加入1％m/v鹽的商品化黃原膠生物聚合物的粘度曲線。曲線2是相同的商品化生物聚合物加入3％m/v鹽的粘度曲線。曲線3是加入3％m/v鹽的菌株101中所產(chǎn)生的生物聚合物的粘度曲線，而曲線4涉及加入1％m/v鹽的菌株101中所產(chǎn)生的相同生物聚合物的粘度曲線。曲線5涉及沒有加入任何鹽的菌株101中所產(chǎn)生的生物聚合物的粘度曲線。應(yīng)當(dāng)注意與未加入鹽的并產(chǎn)生相同生物聚合物的曲線5相比，當(dāng)加入3％m/v鹽時(shí)，曲線3顯示菌株101的生物聚合物的粘度提高了十倍。
在圖11中，舉例說明了與未加入鹽的商品化黃原膠聚合物相比，通過和不通過加熱滅活以及加入或不加入鹽，在樹生黃單胞菌株106生產(chǎn)的1％m/v黃原膠類生物聚合物水溶液的粘度和剪切速率中的變化。曲線1涉及通過加熱滅活和加入1％m/v鹽而獲得的生物聚合物。曲線2、3和4涉及未加熱滅活和分別加入0.1、1和3％m/v鹽而獲得的聚合物。曲線5涉及未加入鹽的商品化黃原膠聚合物水溶液的粘度。
圖12是一組曲線圖，其舉例說明了與加入1％m/v和3％m/v鹽的兩種商品化黃原膠聚合物相比，106菌株中的粘度對(duì)剪切速率中的變化，或者由加入0.1％、1.0和3％m/v鹽的1％m/v樹生黃單胞菌水溶液所獲得的黃原膠類生物聚合物的粘度和剪切速率的變化的一組曲線圖。曲線1、2和3涉及菌株106的粘度，而曲線4和5涉及商品化黃原膠聚合物的粘度，曲線6和7涉及另一種商品化黃原膠聚合物的粘度。
圖13是一組曲線圖，其舉例說明了與商品化黃原聚合物相比，在任意的和控制的pH下，由樹生黃單胞菌06、101和106菌株所生產(chǎn)的黃原膠類聚合物的粘度對(duì)剪切速率的變化。曲線3是在10L容積的發(fā)酵罐中，pH7下的條件下，菌株106的1％m/v生物聚合物水溶液的粘度；曲線2是加入0.1％m/v鹽的、菌株06的1％m/v生物聚合物水溶液在pH 7下的粘度；曲線3是加入3％m/v鹽的、菌株101的1％m/v生物聚合物水溶液在pH 7下的粘度；而曲線4是加入1％m/v鹽的、1％m/v的商品化黃原膠生物聚合物的濃度的粘度。
本說明書中使用的術(shù)語“樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種”，表示在本發(fā)明原理中，菌株組合也是可行的。對(duì)于混合菌株僅有的限制是兩者都需要包括相似的加工pH范圍和通氣條件的發(fā)酵條件。例如，適宜的組合是相對(duì)低生產(chǎn)力和高粘度的一種菌株與相對(duì)高生產(chǎn)力和非高粘度的另一種菌株。與簡單的兩種菌株的平均參數(shù)相比，菌株組合可產(chǎn)生高產(chǎn)量和高粘度。
本發(fā)明的第三個(gè)方面是通過上述方法而獲得的生物聚合物。
根據(jù)本方法生產(chǎn)的樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種的生物聚合物，特征包括a)組分，主要由單糖(例如葡萄糖、甘露糖)、葡糖醛酸、丙酮酸、乙酸形成的異胞外多糖，并且涉及在鼠李糖存在下樹生黃單胞菌野油菜致病變種和manhiotis菌的辨別方法中；b)在4.106至12.106g.mol-1之間的高分子量；c)目前，生物聚合物最多的用途是制成粉末，不論加入或不加入鹽，都易溶于冷水、熱水或弱離子溶液?；蛘?，可將生物聚合物制成可用的濃縮水溶液(2至6％m/v生物聚合物)的利用形式，以備加入所需產(chǎn)品中；d)顏色粉末狀或在濃縮液中，其顏色都只會(huì)從淡灰色變化至淡黃色，很少呈暗褐色，并且所展現(xiàn)的顏色隨操作條件的改變而變。通過純化，生物聚合物為白色或淺黃色產(chǎn)品，可形成澄清溶液(即使?jié)舛雀哌_(dá)3％m/v或6％m/v)。
根據(jù)本申請(qǐng)所推薦的需氧發(fā)酵的條件，利用樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種聯(lián)合新發(fā)酵培養(yǎng)基的使用，可獲得新的黃原膠生物聚合物，其中所述的新發(fā)酵培養(yǎng)基的構(gòu)成除了上文提到的其它培養(yǎng)基成分之外，還有來自稻米產(chǎn)業(yè)(例如稻米蒸煮)的剩余水和除了以上其它培養(yǎng)基所引用之外的、所添加的相關(guān)產(chǎn)品和副產(chǎn)品(如米糠)。
由樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種所生產(chǎn)的生物聚合物的化學(xué)組分是含量比為3∶3∶1∶1的D-甘露糖、D-葡萄糖、D-葡糖醛酸和鼠李糖，另外，乙?；捅峄鶊F(tuán)的含量分別在1.1至5.5％和0.3至0.9％之間變化。
由于進(jìn)行了改進(jìn)，因此本發(fā)明的生物聚合物比商品化黃原膠更耐高溫。這種生物聚合物的粘度值高于類似的商品化聚合物的粘度值。
并且，新的生物聚合物的鹽相容性方面是非常高效的，因此可通過加入0.2至10％m/v鹽，來使1％m/v和3％m/v生物聚合物水溶液的粘度值加倍。
本發(fā)明的生物聚合物與商品化黃原膠聚合物的特性差別在下表中例舉。
因此，以下表2列舉了在6rpm、25℃以及65℃時(shí)，來自樹生黃單胞菌李屬致病變種的3％m/v生物聚合物水溶液的表觀粘度值與耐熱值的比較。將在相同條件下的商品化黃原膠聚合物作為對(duì)照。
表2


如上表2所示，根據(jù)對(duì)不同的樹生黃單胞菌株和樹生黃單胞菌李屬致病變種菌株所實(shí)施的拓展實(shí)驗(yàn)，可以證明所獲得生物聚合物的質(zhì)量和流變特性隨特定菌株而變。因此，從菌株24、87和46中獲得的生物聚合物水溶液隨溫度上升而粘度下降，這是生物聚合物溶液的普遍特征。
菌株20和菌株31的產(chǎn)物粘度值不會(huì)隨溫度上升而變化，而菌株15、82、06以及75的產(chǎn)物隨溫度上升而導(dǎo)致粘度值明顯增加。
下表3說明特定菌株對(duì)水溶液中的生物聚合物的流變特性的影響。從所列數(shù)據(jù)可觀察到，由菌株24產(chǎn)生的生物聚合物所顯示的假塑性，低于商品化黃原膠聚合物以及菌株06產(chǎn)生的生物聚合物所顯示的假塑性。粘度下降越劇烈，意味著假塑性越高。通常，高的假塑性產(chǎn)物在加工期間需要進(jìn)行泵水。
表2中所列出的測(cè)試實(shí)驗(yàn)條件是在25℃和不同的剪切速率下，商品化KelcoTM產(chǎn)品和樹生黃單胞菌李屬致病變種菌株06以及菌株24的3％m/v生物聚合物水溶液。
表3

以上表3的數(shù)據(jù)毫無疑義地說明根據(jù)本發(fā)明得到的生物聚合物的巨大多功能性。因此，菌株06表現(xiàn)出粘度和剪切速率明顯降低的性質(zhì)，使得它更適于石油用途，而粘度不隨剪切速率而明顯降低的菌株24，更適于食品和化妝品用途。
以下表4表明粘度和流變特性是隨著用于實(shí)施本方法的特定菌株而變化的?？蓞⒁姀臉渖S單胞菌李屬致病變種中獲得的生物聚合物與商品化黃原膠的粘度比較。使用條件是在25℃下，由樹生黃單胞菌李屬致病變種菌株15產(chǎn)生的3％m/v黃原膠生物聚合物水溶液的表觀粘度(mPas)，和由Kelko制造的dyalised黃原膠聚合物的表觀粘度(mPas)。
表4

對(duì)照由Kelko制造的dyalised商品化黃原膠樹膠體。
以下表5表明通過測(cè)量兩種剪切速率，培養(yǎng)基組分和發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間對(duì)所獲得生物聚合物的粘度的影響。含有培養(yǎng)基B+C的組分表示含有等量的兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。
表5

*剪切速率0.5s-1**剪切速率500s-1表5的數(shù)據(jù)表明組合培養(yǎng)基B+C，大大地提高了兩種發(fā)酵周期的產(chǎn)量。然而，如果僅僅研究粘度，則單獨(dú)使用培養(yǎng)基C效果更好。
以下表6列出通過不同的樹生黃單胞菌李屬致病變種菌株在根據(jù)表1所配制的培養(yǎng)基中而生產(chǎn)黃原膠聚合物，在25℃和剪切速率10s-1時(shí)，其1％m/v的水溶液的表觀粘度值(mPas)和pH值。
表6

表7


“任意pH”指的發(fā)酵反應(yīng)起始于中性以上的pH，并在沒有加入任何可維持高于7.0的pH值的堿性化合物的情況下，來任其pH值下降。
以下表8顯示菌株106產(chǎn)生的生物聚合物的粘度隨獲取過程中所用的攪拌條件的不同而變化。
表8

以下表9列出菌株106在滅活發(fā)酵液中的產(chǎn)量，并表明生物聚合物產(chǎn)量取決于攪拌和發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間。
表9

以下表10說明了發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值對(duì)菌株106產(chǎn)生的生物聚合物產(chǎn)物粘度的影響。
表10


任意pH*指如上述相同的含義。
下表11列出了菌株06在不同發(fā)酵時(shí)間和兩種不同的通氣條件下，在三種剪切速率測(cè)得的發(fā)酵培養(yǎng)基的反應(yīng)時(shí)間和通氣條件對(duì)生物聚合物的表觀粘度的影響，其中通過生產(chǎn)所述的生物聚合物。
表11

條件A 250rpm 1.5vvmB 350rpm 2.0vvm說明書中的一些表和附圖所提供的數(shù)據(jù)，證明了樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種建議用于生產(chǎn)高粘度的生物聚合物水溶液的優(yōu)點(diǎn)，生物聚合物可單獨(dú)使用，或與其他生物聚合物聯(lián)合使用，還可以加入鹽的形式使用生物聚合物。
另外，本發(fā)明的生物聚合物水溶液的粘度高于類似的商品化黃原膠聚合物的粘度。有利地是，如圖10、圖11和圖12的曲線所示，該生物聚合物隨濃度為0.2至10％m/v、優(yōu)選0.5至6％m/v的鹽(甚至一價(jià)鹽)的加入而粘度增加。
除可加入耐鹽產(chǎn)物之外，還可將抗菌劑例如疊氮化鈉、戊二醛和甲醛加入黃原膠生物聚合物中，以便提高生物聚合物溶液在貯存期間的穩(wěn)定性。
從某些菌株例如菌株82、15、06和75中獲得的生物聚合物中，具有隨溫度上升而粘度增加的異常特征。在圖4、圖5和圖6中舉例說明了這種特性。
而且，本發(fā)明的生物聚合物在單獨(dú)使用時(shí)或與其它聚合物聯(lián)合使用時(shí)，能形成真正的膠體，并且當(dāng)將二價(jià)鹽例如CaCl2或CaCO3加入生物聚合物時(shí)，可促進(jìn)凝膠強(qiáng)度。
10s-1、25℃時(shí)，1％m/v生物聚合物水溶液的粘度通常在1,000至5,000mPas之間變化。然而在10s-1、25℃時(shí)，粘度值可能在100mPas范圍中波動(dòng)是可能的，這并不意味著產(chǎn)生的是較低價(jià)值的產(chǎn)物，而是可用于非稠化劑用途的產(chǎn)物。
10s-1、25℃時(shí)，3％m/v生物聚合物水溶液的粘度值在4,000至28,000mPas之間波動(dòng)。
本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及所獲得的聚合物的用途。
從本發(fā)明得到的生物聚合物中所獲得的溶液的流變特性在測(cè)定其用途中具有最高的價(jià)值。如圖3和圖4中所示的高假塑性，是將生物聚合物應(yīng)用于石油勘探活動(dòng)中的必要參數(shù)。
因此，黃原膠或生物聚合物可用于石油生產(chǎn)的各個(gè)方面，包括通過配制含有或沒有其他固體的鉆井液而用于油井鉆探、水力壓裂、配制修井液(workover fluid)而用于油井維修、用于配制完井液(completion)、用于管道清潔和提高石油流體采收率。
該生物聚合物改變了水溶液的流變性質(zhì)。它具有期望的性質(zhì)例如穩(wěn)定、改進(jìn)活性組分的結(jié)構(gòu)并控釋活性組分，同時(shí)還能在冷凍時(shí)減少結(jié)冰以及消除鍛燒化合物的脫水收縮作用。生物聚合物膜可用于食品包裝用途。
同樣可用于需要泵輸液體步驟的糧食加工中，以及用于需要泵輸液體的其它工業(yè)作業(yè)中。
根據(jù)上述特征，生物聚合物在冷水或熱水中或在鹽溶液或弱酸性溶液中的快速增溶作用以及與鹽的相容性，同樣與它們?cè)谑称酚猛净蚱渌猛鞠嚓P(guān)。
除了涂劑、殺蟲劑組分以及獸藥組分之外，聚合物的其他用途包括可用作藥物組分和化妝品組分。
權(quán)利要求
1.一種制備黃原膠生物聚合物的方法，其中所述的方法包括下列步驟a)提供預(yù)先生長在固體培養(yǎng)基中的或已凍干的樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種的分離菌落；b)通過將所述的菌落加入適宜的細(xì)胞生長培養(yǎng)基來制備初始的預(yù)接種物，并將菌落以100至250rpm的轉(zhuǎn)速并在20℃至30℃之間的溫度以及在pH 4.5至9.0的條件下溫育24h或48h(即步驟110)，其中所述的培養(yǎng)基包含3至55g.L-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37g.L-1的蛋白胨、10至20g.L-1瓊脂、0.03至0.90g.L-1的K2HPO4以及0.001至2.5g.L-1的MgSO4和/或復(fù)合維生素B；c)將初始的預(yù)接種物導(dǎo)入含有下列成分的液體培養(yǎng)基3至55g.L-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37g.L-1的蛋白胨、0.03至0.90g.L-1的K2HPO4和0.001至2.5g.L-1的MgSO4和/或復(fù)合維生素B，然后將菌落以100至250rpm的轉(zhuǎn)速在20℃至35℃的溫度和pH 4.5至9.0的條件下溫育24h或48h，并在溫育期之后獲得最終液體預(yù)接種物(即步驟120)；d)根據(jù)50至1,200rpm的轉(zhuǎn)速、優(yōu)選100至800rpm的轉(zhuǎn)速和0.5至4體積/體積/分鐘的通風(fēng)比、優(yōu)選0.5至3體積/體積/分鐘的通風(fēng)比加入氧氣，直接將最終預(yù)接種物導(dǎo)入第一無菌發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并在20℃至35℃之間的溫度和在pH4.5至9.0下培育24或48h來獲得發(fā)酵期結(jié)束的接種物(即步驟130)，其中所述的第一發(fā)酵罐含有由維持在100gL-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37g.L-1蛋白胨、0.03至0.90g.L-1K2HPO4以及0.001至2.5g.L-1MgSO4和/或復(fù)合維生素B組成的液體培養(yǎng)基；e)根據(jù)50至1,200rpm的轉(zhuǎn)速、優(yōu)選100至800rpm的轉(zhuǎn)速和0.5至4體積/體積/分鐘的通風(fēng)比、優(yōu)選0.5至3體積/體積/分鐘的通風(fēng)比加入氧氣，并在22℃至35℃之間的溫度、優(yōu)選22℃至32℃之間的溫度和在pH4.5至9.0下，或在不控制pH(任意pH)下，直接將接種物導(dǎo)入第二無菌發(fā)酵罐中，并根據(jù)生物聚合物的最終期望用途，進(jìn)行發(fā)酵24至120小時(shí)、優(yōu)選48至72小時(shí)(即步驟140)，其中所述的無菌發(fā)酵罐含有用于通過深層發(fā)酵而生產(chǎn)生物聚合物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，或者將所述的無菌培養(yǎng)基加入含有接種物的發(fā)酵罐；除了纖維素、米糠和/或麥麩之外，和/或除了0.1至7.2g.L-1之間的氮、磷和鉀常量元素，和除了0.01至1.7g.L-1的鎂、鐵微量元素之外，和除了復(fù)合維生素B和維生素E以及直至250g.L-1的蔗糖之外，以及除了50至200ppm的硅酮和/或植物油之外，培養(yǎng)基由帶殼稻米的浸泡液或煮飯水或來自蒸米的水組成；e)發(fā)酵結(jié)束后，過濾發(fā)酵液以分離細(xì)胞(即步驟150)；f)發(fā)酵結(jié)束之后，通過用121℃的直接蒸汽加熱殺菌或用氯化物進(jìn)行化學(xué)滅活，致使發(fā)酵液直接在發(fā)酵罐中被滅活細(xì)胞(步驟160)；g)通過將極性有機(jī)溶劑加入滅活的發(fā)酵液中，來進(jìn)行沉淀(步驟170)，其中發(fā)酵液中加入或不加入選自濃度為0.2至10％質(zhì)量/體積比的NaCl、KCl和CaCO3的一價(jià)和/或二價(jià)鹽；h)通過蒸餾回收極性溶劑，并再次用于本方法(步驟170a，步驟260a)；i)通過最初在傳送帶上排干液體來干燥生物聚合物產(chǎn)物，然后將分離的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入表面干燥器或其它類似裝置中，隨后在任何適于碾碎的常規(guī)裝置中進(jìn)行碾磨或壓碎(步驟180a)；以及i)回收做好的黃原膠類生物聚合物以備使用(步驟190)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中在步驟b)、步驟c)和步驟d)中，細(xì)胞生長培養(yǎng)基優(yōu)選包含10至30g.L-1的蔗糖或葡萄糖，3至15g.L-1的蛋白胨、10至20g.L-1的瓊脂、0.09至0.7g.L-1的KH2PO4以及0.01至1.0g.L-1的MgSO4和/或復(fù)合維生素B，優(yōu)選pH范圍在5.5到7.5之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中將最終凍干的液體預(yù)接種物凍干以備另外使用，或者將其直接轉(zhuǎn)入第一發(fā)酵罐中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其中在被轉(zhuǎn)入第一發(fā)酵罐的使用之前，根據(jù)先前的條件重懸浮并進(jìn)行新近溫育來活化凍干的最終預(yù)接種物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中或者通過起始于約中性的pH值并使反應(yīng)系統(tǒng)降低pH值降低至下限值，并且不調(diào)節(jié)pH值(或在任意pH值條件下)來實(shí)施該方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中為了促進(jìn)產(chǎn)物回收，當(dāng)發(fā)酵液粘度在10s-1下超過250mPas時(shí)，用水或用水和極性有機(jī)溶劑的混合液稀釋發(fā)酵液，直至粘度降至在10s-1下的250mPas，其中極性有機(jī)溶劑選自C1至C3醇，例如乙醇和異丙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中在步驟f)中，用于化學(xué)滅活發(fā)酵液的氯化化合物包括無機(jī)化合物，例如使用氯濃度在100至200ppm之間的次氯酸鈉和鹽酸，而有機(jī)化合物包括0.01至0.1％m/v的雙氯苯雙胍己烷。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中在第二次發(fā)酵之后，或者以10,000至15,000g實(shí)施離心步驟(250)來進(jìn)行細(xì)胞分離，并實(shí)施另外的步驟來回收細(xì)胞，或者實(shí)施破碎步驟(240b)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中或者在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中實(shí)施第二次發(fā)酵步驟(240)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有總量占所述培養(yǎng)基達(dá)500gL-1的蔗糖或葡萄糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中就所獲得的生物聚合物而言，菌株的生產(chǎn)力達(dá)到5.7至26.4gL-1，平均在15至22gL-1之間。
11.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中經(jīng)受過所述處理的菌落包含了可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的菌株組合，并且所提供的菌株在pH范圍和通氣條件方面需要相似的發(fā)酵工藝條件。
12.一種旨在用于根據(jù)權(quán)利要求1的方法中的第二次發(fā)酵步驟的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的培養(yǎng)基包括a)帶殼稻米的煮飯水或浸泡水，以及稻谷蒸煮加工的剩余水；b)含量在0.2mgL-1至40gL-1中的米糠；c)含量在0.3gL-1至10gL-1的麥麩；d)0.1至7.2g.L-1的氮、磷、鉀常量元素，和0.01至1.7g.L-1的鎂、鐵微量元素；e)濃度在0.02mgL-1至3mgL-1之間的純凈形態(tài)的復(fù)合維生素B，包括維生素B1、維生素B2和煙酸(維生素B3)，或者是富含復(fù)合維生素B的天然基質(zhì)；f)來自植物油并且含量在10至30μg/L的維生素E；g)濃度直至250gL-1或直至500gL-1的糖，例如蔗糖或葡萄糖。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的培養(yǎng)基，其中所述的煮飯水或稻米浸泡水的組分包含約20mgL-1至80mgL-1的總氮量，主要是有機(jī)氮，這是適于黃單胞菌李屬致病變種細(xì)菌的優(yōu)良底物。此外，所述的水還包含10mgL-1至50mg.L-1的磷酸鹽離子以及2至20mgL-1的硫酸根離子。
14.一種旨在用于根據(jù)權(quán)利要求1的方法中的第二次發(fā)酵步驟的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基的組分包括0.15至5.0gL-1的KH2PO4、0.01至0.6gL-1的MgSO4·7H2O、10至250gL-1的蔗糖以及0.2至6gL-1的米糠。
15.根據(jù)權(quán)利要求14中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中或者所述的培養(yǎng)基不含米糠。
16.一種旨在用于根據(jù)權(quán)利要求1的方法中的第二次發(fā)酵步驟的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基的組分包括0.2至1.5gL-1的NH4H2PO4、1至5gL-1的K2HPO4、0.1至0.6gL-1的MgSO4·7H2O、0.2至2.0gL-1的檸檬酸、2至5.0gL-1的KH2PO4、0.006gL-1的H3BO3、2.0gL-1的(NH4)2SO4、0.0024gL-1的FeCl3、0.002gL-1的CaCl2·2H2O、0.002gL-1的ZnSO4、10至250gL-1的蔗糖、0.2至6gL-1的米糠。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中或者所述的培養(yǎng)基不含米糠。
18.由樹生黃單胞菌和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種所生產(chǎn)的黃原膠生物聚合物，其中化學(xué)組分除了含有含量分別為1.1至5.5％和0.3至0.9％的乙?；徒蛊咸阉峄?，還包括含量比為3∶3∶1∶1的D-甘露糖、D-葡萄糖、D-葡糖醛酸和鼠李糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中黃原膠生物聚合物的分子量在4.106gmol-1至12.106gmol-1之間。
20.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中所述的生物聚合物可用作粉末。
21.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中所述的生物聚合物可用作2％至6％質(zhì)量/體積比的澄清水溶液使用。
22.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中所述的生物聚合物具有耐鹽性，1％m/v和3％m/v的生物聚合物水溶液，其粘度值隨著加入0.2至10％m/v鹽的加入而增加。
23.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中當(dāng)來源于某些菌株時(shí)，所述的生物聚合物具有假塑性特性。
24.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中在10s-1和25℃時(shí)，1％m/v的生物聚合物水溶液的粘度在1,000至5,000mPas之間變化。
25.根據(jù)權(quán)利要求24中所述的黃原膠生物聚合物，其中在10s-1和25℃時(shí)，或者所述溶液的粘度在100mPas范圍之內(nèi)。
26.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中即使當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，所述的生物聚合物可形成真正的膠體。
27.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中所述的生物聚合物用于石油勘探作業(yè)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27中所述的黃原膠生物聚合物，其中通過配制具有或沒有額外固體的鉆井液，所述的用途包括油井鉆探、水力壓裂、油井維修、完井、清潔管道以及提高石油采收率。
29.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中所述的生物聚合物用于食品工業(yè)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29中所述的黃原膠生物聚合物，其中將所述的生物聚合物加入食品組合物中或用于食品包裝用途。
31.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中將所述的生物聚合物加入藥物組合物中。
32.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中將所述的生物聚合物加入化妝品組合物中。
33.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中將所述的生物聚合物加入涂劑組合物中。
34.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中將所述的生物聚合物加入殺蟲劑組合物中。
35.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的黃原膠生物聚合物，其中將所述的生物聚合物加入獸藥組合物，優(yōu)選獸用疫苗。
全文摘要
一種從加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的黃單胞菌株和/或樹生黃單胞菌李屬致病變種菌株中獲得黃原膠類生物聚合物的方法，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有與帶殼稻米和蒸米加工相關(guān)的剩余水和產(chǎn)物以及所述的其它營養(yǎng)物。該方法從初始的預(yù)接種物開始(步驟110)，生產(chǎn)最終的預(yù)接種物(步驟120，步驟220)，然后是接種物，根據(jù)操作條件將所述的接種物在第一發(fā)酵罐中發(fā)酵(步驟130和步驟230)，然后在第二發(fā)酵罐中發(fā)酵(步驟140，步驟250)，接著滅活發(fā)酵液并進(jìn)行沉淀以回收生物聚合物產(chǎn)物(步驟150)，干燥生物聚合物(步驟160)，將其碾磨或粉碎成期望的粒徑分布(步驟170)，并以粉末或水溶液的形式回收生物聚合物(步驟180)?；蛘咴诘诙伟l(fā)酵之后(步驟240)，離心發(fā)酵液以分離細(xì)胞(步驟250)，并且回收或破碎分離的細(xì)胞(步驟260a)。
文檔編號(hào)C12P19/06GK101061230SQ200580037785
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2005年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者克萊雷·特隆多·文德路斯科洛, 阿熱利塔·濟(jì)韋拉·莫雷拉, 喬·路易斯·席爾瓦·文德路斯科洛 申請(qǐng)人:佩洛塔斯聯(lián)邦大學(xué), 巴西農(nóng)牧研究企業(yè)