專利名稱：設(shè)計(jì)用于在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行抗腫瘤或抗病毒治療的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含編碼通透酶的核酸序列和含有一個(gè)核堿基(nucleobase)部分的藥物或其前體的試劑盒。本發(fā)明還涉及一種包含藥物前體的試劑盒，所述藥物前體包含一個(gè)核堿基部分、包含編碼通透酶的基因的核酸序列和包含自殺基因的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含編碼通透酶的基因和自殺基因的載體。本發(fā)明在進(jìn)行增生性或感染性疾病的基因治療處理方面尤其有用。
包含一個(gè)核堿基部分的藥物是用于癌癥或者病毒感染的治療的最廣泛使用的藥物。其中，核苷類似物(例如阿糖胞苷、吉西他濱、氟達(dá)拉濱、克拉屈濱、曲沙他濱和克羅拉濱(clofarabine))目前被用于癌癥化學(xué)療法中。核苷類似物是阻礙核酸合成的抗代謝物。這些制劑通常是S階段特異性的，并可以通過被摻入和改變DNA和RNA大分子本身，和/或通過抑制參與核酸合成的各種酶，和/或通過修飾生理性核苷的代謝發(fā)揮細(xì)胞毒性活性。
核苷類似物也屬于被證明能有效地抗病毒感染的第一批化合物。例如，被批準(zhǔn)的第一批四種抗HIV藥物AZT、ddI、ddC和D4T都是核苷類似物。這全部四種藥物及其它核苷類似物被認(rèn)為在HIV抑制上具有相似的機(jī)制，其中核苷被逐漸磷酸化為5′-三磷酸酯，然后在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(yīng)中用作鏈終止劑。
核堿基類似物也被用于癌癥的治療。例如氟尿嘧啶(5-FU)是一種氟化嘧啶，其在細(xì)胞內(nèi)代謝為其活性形式氟脫氧尿苷單磷酸酯(FdUMP)。該活性形式通過抑制胸苷的正常產(chǎn)生從而抑制DNA的合成。氟尿嘧啶通過靜脈給藥治療結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌。氟尿嘧啶也可以乳劑和溶液的形式用于一些皮膚癌和生殖器疣的局部治療。
基因治療的發(fā)展為包含一個(gè)核堿基部分的藥物的應(yīng)用創(chuàng)造了新的可能。被稱作“自殺基因治療”的這一基因治療的特定領(lǐng)域利用了其表達(dá)產(chǎn)物能將非活性物質(zhì)(前體藥物)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，從而引起細(xì)胞死亡的基因。
編碼1型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-1 TK)的基因構(gòu)成了自殺基因的原型(Caruso et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，7024-7028；Culver et al.，1992，Science 256，1550-1552；Ram et al.，1997，Nat.Med.3，1354-1361)。雖然TK多肽本身沒有毒性，但其催化核苷類似物例如無環(huán)鳥苷或更昔洛韋(GCV)的轉(zhuǎn)化。經(jīng)修飾的核苷被摻入處于延伸過程的DNA鏈中，從而抑制細(xì)胞分裂。目前有大量可利用的自殺基因/前體藥物組合。其中特別可提及的是大腸桿菌(E.Coli)嘌呤核苷磷酸化酶和6-甲基嘌呤脫氧核糖核苷(Sorscher et al.，1994，Gene Therapy 1，223-238)、大腸桿菌鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和6-硫代黃嘌呤(Mzoz and Moolten，1993，Human Gene Therapy 4，589-595)和胞嘧啶脫氨酶(CDase)和5-氟胞嘧啶(5FC)。
在人體中，將包含一個(gè)核堿基部分的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜是被動(dòng)的或是通過專門的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行的。例如，大多數(shù)核苷類似物是親水性分子，并且其轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜是通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)的。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，存在兩個(gè)主要的核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ENT)和富集型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CNT)。ENT是易化載體蛋白，CNT是Na(+)-依賴型次級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Kong et al.，2004，Curr Drug Metab，563-84)。核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與對抗癌核苷類似物的抗性有關(guān)。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能是造成個(gè)體間對核苷類似物發(fā)生不同反應(yīng)的原因(Damaraju et al.，Oncogene.2003，227524-36)。所以，需要一種可以克服核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的低表達(dá)或不表達(dá)的新的治療策略。此外，還需要提高包含一個(gè)核堿基部分的藥物的胞內(nèi)濃度，因其胞內(nèi)濃度與療效相關(guān)。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于改善包含一個(gè)核堿基部分的藥物進(jìn)入細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞)的胞內(nèi)濃度。該目的通過用包含編碼通透酶的基因的核酸序列轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的目的還在于通過聯(lián)合使用包含編碼通透酶的基因的核酸序列和包含自殺基因的核酸序列來改善自殺基因治療的效果。這一特定的應(yīng)用改善了前體藥物(即包含一個(gè)核堿基部分的藥物前體)的胞內(nèi)濃度，該前體藥物可被自殺基因編碼的蛋白所轉(zhuǎn)化。這一應(yīng)用也可通過增強(qiáng)藥物從自殺基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至表達(dá)通透酶的細(xì)胞而提高旁觀者效應(yīng)(bystander effect)。
就這方面而言，本發(fā)明也允許使用較小量的藥物或前體藥物，并減少由這種治療所引起導(dǎo)致的副作用。
為了這個(gè)目的，本發(fā)明提供了包含如下組分的試劑盒-包含一個(gè)核堿基部分的藥物或其前體，和-包含編碼通透酶基因的核酸序列。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明也提供了包含如下組分的試劑盒-包含一個(gè)核堿基部分的藥物前體，和-包含編碼通透酶基因的核酸序列，和-包含自殺基因的核酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒將被用于治療脊椎動(dòng)物尤其是人中的癌癥和/或病毒性疾病。
如本申請中所用，包含一個(gè)核堿基部分的藥物是在其結(jié)構(gòu)中僅包含一個(gè)核堿基部分的分子。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，包含一個(gè)核堿基部分的藥物能夠殺死細(xì)胞，更優(yōu)選能夠殺死腫瘤細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，包含一個(gè)核堿基部分的藥物能夠減少或防止病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。
根據(jù)本發(fā)明，核堿基部分選自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶及其類似物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，包含一個(gè)核堿基部分的藥物選自包含如下組分的組-核苷類似物，例如阿糖胞苷、吉西他濱、卡培他濱、氟達(dá)拉濱、克拉屈濱、曲沙他濱、克羅屈濱、疊氮胸苷(AZT)、2’，3’-雙脫氧肌苷(ddI)、扎西他濱(ddC)、司他伏定(d4T)、脫氧氟亞甲基胞苷(FMdC)和拉米夫定、氟尿苷(FUdR)，和-嘧啶類似物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)，和-嘌呤類似物，例如硫鳥嘌呤、巰嘌呤、無環(huán)鳥苷、伐昔洛韋(valacyclovir)、泛昔洛韋(famcyclovir)、更昔洛韋。
如本申請中所用，包含一個(gè)核堿基部分的藥物前體指能夠通過一或多個(gè)酶促反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為包含一個(gè)核堿基部分的藥物的分子。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，包含一個(gè)核堿基部分的藥物前體選自包含如下組分的組疊氮胸苷(AZT)、更昔洛韋(GCV)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-甲基嘌呤脫氧核糖核苷、更昔洛韋反油酸酯、噴昔洛韋、無環(huán)鳥苷、伐昔洛韋、(E)-5-(2-溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷、齊多夫定、2′-Exo-methanocarbathymidine。
如本申請中所用，通透酶指參與將包含一個(gè)核堿基部分的藥物或其前體轉(zhuǎn)移通過細(xì)胞膜的跨膜蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的通透酶特別地指嘌呤通透酶、胞嘧啶通透酶和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，通透酶是釀酒酵母(S.Cerevisiae)的嘌呤或胞嘧啶通透酶。釀酒酵母的核堿基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由嘌呤-胞嘧啶通透酶(被稱為“FCY2”)和尿嘧啶通透酶(被稱為“FUR4”)組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，所述通透酶具有選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的氨基酸序列。
嘌呤-胞嘧啶通透酶(FCY2)介導(dǎo)質(zhì)子以及腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和胞嘧啶同向轉(zhuǎn)運(yùn)通過酵母質(zhì)膜(Grenson 1969，Jund and Lacroute 1970，Polak and Grenson 1973，Chevallier et al.，1975，Hopkins et al.1988)。FCY2蛋白也介導(dǎo)5-氟胞嘧啶(一種胞嘧啶類似物)的轉(zhuǎn)運(yùn)(Grenson 1969，Jund and Lacroute 1970)。FCY2基因編碼一種533個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(58kDa)，其最初被預(yù)測具有10-12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(Weber et al.1990)，目前證實(shí)了9個(gè)(Ferreira et al.1999)。FCY2對嘌呤核堿基和胞嘧啶顯示出相似的親合力(Brethes et al.1992)。尿嘧啶進(jìn)入釀酒酵母由尿嘧啶通透酶FUR4介導(dǎo)(Jund and Lacroute 1970，Jund et al.1977)。FUR4是一種尿嘧啶-質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Hopkins et al.1988)，其被預(yù)測為是一種633個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(71.7kDa)，具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和長胞質(zhì)親水性N末端及C末端尾部(Jund et al.1988，Garnier et al.1996)。FUR4蛋白還可以介導(dǎo)5-氟尿嘧啶(一種尿嘧啶類似物)的轉(zhuǎn)運(yùn)(Jund and Lacroute 1970)。
就這一方面，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述通透酶選自FCY2、Fur4及其類似物。特別地，F(xiàn)CY2和Fur4的氨基酸序列可在swissprot數(shù)據(jù)庫中獲得(登錄號(hào)分別為P17064和P05316)。Fur4和FCY2的類似物指具有與母本蛋白(parent protein)的氨基酸序列的相同性至少大于70％，優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，最優(yōu)選大于95％的氨基酸序列，并保留將包含一個(gè)核堿基部分的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜的能力的多肽。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述通透酶選自hENT1、hENT2、hCNT1、hCNT2和hCNT3及其類似物。這些通透酶的氨基酸序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可以獲得的，特別是可在swissprot數(shù)據(jù)庫中獲得。這些多肽的類似物指具有與母本多肽的氨基酸序列的相同性至少大于70％，優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，最優(yōu)選大于95％的氨基酸序列，并保留將包含一個(gè)核堿基部分的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜的能力的多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇與包含一個(gè)核堿基部分的藥物或該藥物前體相關(guān)的通透酶。例如，F(xiàn)CY2和Fur4優(yōu)選與5-FC有關(guān)。
自殺基因指編碼能夠?qū)粋€(gè)核堿基部分的藥物前體轉(zhuǎn)化為包含一個(gè)核堿基部分的藥物的基因。
自殺基因包含但不限于編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性、胸苷激酶活性、尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶活性、嘌呤核苷磷酸化酶活性和/或胸苷酸激酶活性的蛋白質(zhì)的基因。
優(yōu)選地，包含在本發(fā)明的試劑盒中的自殺基因編碼能夠轉(zhuǎn)化包含在相同的試劑盒中的包含一個(gè)核堿基部分的藥物前體的蛋白質(zhì)。自殺基因和相應(yīng)的包含一個(gè)核堿基部分的藥物前體的例子如下表中所示
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的自殺基因編碼至少具有CDase活性的蛋白質(zhì)。CDase參與嘧啶代謝途徑，其通過水解脫氨作用將外源胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。盡管已經(jīng)在原核生物和低等真核生物中證實(shí)了CDase活性(Jund and Lacroute，1970，J.Bacterid.102，607-615；Beck etal.，1972，J.Bacteriol.110，219-228；De Haan et al.，1972，Antonie vanLeeuwenhoek 38，257-263；Hoeprich et al.，1974，J.Inf.Dis.130，112-118；Esders and Lynn，1985，J.Biol.Chem.260，3915-3922)，但在哺乳動(dòng)物中不存在CDase活性(Koechlin et al.，1966，Biochem Pharmacol.15，435-446；Polak et al.，1976，Chemotherapy 22，137-153)。釀酒酵母FCY1和大腸桿菌codA基因(分別編碼這兩種生物的CDase)是已知的，且它們的序列已被公開(EP 402 108；Erbs et al.，1997，Curr.Genet.31，1-6；WO93/01281)。
CDase也使胞嘧啶類似物，即5-氟胞嘧啶(5-FC)脫去氨基，從而形成5-氟尿嘧啶(5-FU)，當(dāng)其被轉(zhuǎn)化為5-氟-尿苷酸(5-FUMP)時(shí)是一種具有很高的細(xì)胞毒性的化合物。缺乏CDase活性的細(xì)胞(或因?yàn)橥蛔兪咕幋a該酶的基因失活或因?yàn)樘烊蝗狈υ撁?，例如如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，對5-FC具有抗性(Jund and Lacroute，1970，J.Bacteriol，102，607-615；Kilstrup et al.，1989，J.Bacteriol.1989 171，2124-2127)。相反，其中轉(zhuǎn)移進(jìn)了編碼Cdase活性的序列的哺乳動(dòng)物細(xì)胞變得對5-FC敏感(Huber et al.，1993，Cancer Res.53，4619-4626；Mullen et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，33-37；WO 93/01281)。此外，鄰近的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞也變得對5-FC敏感(Huber et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，8302-8306)。這一現(xiàn)象，稱為旁觀者效應(yīng)，是由于表達(dá)CDase活性的細(xì)胞分泌5-FU，然后通過直接擴(kuò)散通過質(zhì)膜使鄰近的細(xì)胞中毒。5-FU的這一被動(dòng)擴(kuò)散特性與tk/GCV參比系統(tǒng)相比較表現(xiàn)出了優(yōu)點(diǎn)，在該參比系統(tǒng)中旁觀者效應(yīng)要求與表達(dá)tk的細(xì)胞相接觸(Mesnil et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，1831-1835)。因此，可以容易地了解CDase所提供的在基因治療，特別是抗癌基因治療范圍內(nèi)的所有優(yōu)點(diǎn)。
就這一方面，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，編碼具有CDase活性的蛋白質(zhì)的基因是FCY1或CodA或其類似物。這些基因的類似物指具有與母本基因(parent gene)的核酸序列的相同性至少大于70％，優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，最優(yōu)選大于95％的核酸序列的基因。專利申請F(tuán)R2004/001657公開了編碼具有增強(qiáng)的CDase活性的蛋白質(zhì)的基因。該多肽通過氨基酸序列的添加衍生自天然CDase。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，具有CDase活性的蛋白質(zhì)是FR2004/001657中公開的多肽，更優(yōu)選該多肽為FR2004/001657中的SEQ ID NO1所示的序列。
在原核生物和低等真核生物中，尿嘧啶在尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(UPRTase)的作用下被轉(zhuǎn)化成UMP。該酶將5-FU轉(zhuǎn)化為5-FUMP。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的自殺基因編碼具有UPRTase活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所述的UPRTase可以是任何來源的，尤其是原核生物、真菌或酵母來源的。舉例證來說，編碼來自大腸桿菌(Anderson et al.，1992，Eur.J.Biochem 204，51-56)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(Martinussen andHammer，1994，J.Bacteriol.176，6457-6463)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(Kim et al.，1997，Biochem Mol.Biol，Int 41，1117-1124)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(Martinussen et al.，1995，J.Bacteriol.177，271-274)的UPRTase的核酸序列可用于本發(fā)明。然而，最特別優(yōu)選使用酵母UPRTase；特別是由釀酒酵母FUR1基因編碼的UPRTase，該基因的序列在Kem et al(1990，Gene 88，149-157)中被公開，該文獻(xiàn)通過引用并入本申請。例如，所述基因的序列以及相應(yīng)的UPRTase的序列可從文獻(xiàn)中以及專業(yè)數(shù)據(jù)庫(SWISSPROT、EMBL、Genbank、Medline等)中找到。
此外，申請PCT/FR99/00904描述了一種在編碼區(qū)的5′端缺失105個(gè)核苷酸的FUR1基因，其能夠合成在N末端位置缺失35個(gè)最初的殘基并在天然蛋白質(zhì)的第36位以甲硫氨酸開始的UPRTase。突變基因的表達(dá)產(chǎn)物，命名為FUR1Δ 105，能夠與釀酒酵母的fur1突變株互補(bǔ)。此外，截短的突變株與天然酶相比呈現(xiàn)出更高的UPRTase活性。因此，根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的由自殺基因編碼的多肽是天然UPRTase的缺失突變體。缺失優(yōu)選位于天然UPRTase的N末端區(qū)域。其可以是完全缺失(影響所述N末端區(qū)域的所有殘基)或部分缺失(影響一級(jí)結(jié)構(gòu)中的一或多個(gè)連續(xù)或不連續(xù)的殘基)。通常，多肽由各自代表該分子大約三分之一的N末端部分、中間部分和C末端部分組成。例如，因?yàn)獒劸平湍傅腢PRTase具有251個(gè)氨基酸，其N末端部分由最初的83個(gè)殘基組成，其以位于天然形式的第一位的所謂的起始子甲硫氨酸開始。至于大腸桿菌的UPRTase，其N末端部分覆蓋了第1至69位。
優(yōu)選的具有UPRTase活性的蛋白質(zhì)包含基本上如PCT/FR99/00904的SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，其從第1位的Met殘基開始，以第216位的Val殘基結(jié)束。術(shù)語“基本上”指與PCT/FR99/00904的所述序列SEQ ID NO1的相同性程度大于70％，優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，最優(yōu)選大于95％。更優(yōu)選地，其包含PCT/FR99/00904的SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。如上所述，其可以包含額外的突變?？商貏e提及的是，第2位(天然UPRTase的第37位)的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基取代。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的自殺基因編碼具有至少一種Cdase和一種UPRTase活性的蛋白質(zhì)。專利申請WO96/16183和PCT/FR99/00904描述了編碼具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的酶的融合蛋白的應(yīng)用，所述結(jié)構(gòu)域具有CDase和UPRTase活性，并證明由表達(dá)質(zhì)粒攜帶的雜種基因codA∷upp或FCY1∷FUR1或FCY1∷FUR1Δ 105的轉(zhuǎn)移提高了被轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞對5-FC的敏感性。將這兩個(gè)申請中所描述的蛋白質(zhì)和核苷酸序列并入本申請的說明書中。
盡管融合可以發(fā)生在第一種多肽的任何位點(diǎn)，但是優(yōu)選N-末端或C-末端，特別是N-末端。優(yōu)選地，同相(in phase)融合使用具有胞嘧啶脫氨酶(CDase)活性并衍生自天然胞嘧啶脫氨酶的第二種多肽，以使根據(jù)本發(fā)明的融合多肽呈現(xiàn)CDase和UPRTase活性。優(yōu)選FCY1∷FUR1融合。這樣的雙功能多肽使得可以提高靶細(xì)胞對于5-FC和5-FU的敏感性。
使用原核或低等真核生物來源的CDase。更優(yōu)選地，其為酵母CDase，特別是由釀酒酵母FCY1基因編碼的CDase。在文獻(xiàn)和專業(yè)數(shù)據(jù)庫中提供了編碼各種來源的CDase的基因的克隆和測序。需要提到的是FCY1基因的序列在Erbs et al(1997，Curr.Genet.31，1-6)中被公開。當(dāng)然可使用具有相當(dāng)于或高于天然酶的轉(zhuǎn)化能力的CDase的突變體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)公開的資料克隆CDase或UPRTase序列、實(shí)施可能的突變、根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)或基于申請PCT/FR99/00904所述的方案檢測非細(xì)胞系統(tǒng)或細(xì)胞系統(tǒng)中的突變形式的酶活性、以及融合(特別是同相融合)具有CDase和UPRTase活性的多肽，從而融合相應(yīng)基因的全部或部分。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，自殺基因編碼包含基本上如PCT/FR99/00904的SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，其從第1位的Met殘基開始，并以第373位的Val殘基結(jié)束。術(shù)語“基本上”具有以上給出的定義。包含如PCT/FR99/00904的SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽尤其適于實(shí)施本發(fā)明。
在WO 96/16183中公開了另一個(gè)優(yōu)選的被編碼的多肽，更優(yōu)選由coda∷upp或FCY1∷FUR1編碼的多肽。
根據(jù)正在使用的傳統(tǒng)方法，通過克隆、PCR或化學(xué)合成可以容易地獲得核酸序列。它們可以是天然基因或來源于天然基因的經(jīng)一或多個(gè)核苷酸的突變、缺失、取代和/或添加的基因。此外，在本領(lǐng)域技術(shù)人員可以查閱的文獻(xiàn)中廣泛地記載了其序列。
本發(fā)明還涉及如上所述的試劑盒，其特征在于所述核酸序列被插入質(zhì)?；虿《緛碓吹囊换蚨鄠€(gè)重組載體中；以及攜帶位于其在寄主細(xì)胞中表達(dá)所必需的元件的控制下的所述核苷酸序列的重組載體。
更特別地，本發(fā)明的試劑盒可以包含所述包含編碼通透酶的基因的核酸序列和所述包含被插入相同的重組載體或不同的重組載體中的自殺基因的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述核酸序列包含在相同的重組載體中。
本發(fā)明還涉及攜帶至少一種根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的重組載體，所述核苷酸序列位于其在宿主細(xì)胞中表達(dá)所必需的元件的控制下。更特別地，本發(fā)明涉及包含編碼通透酶的核酸序列的重組載體。
所述重組載體可以是質(zhì)?；虿《緛碓吹模⒖膳c一或多種提高該載體的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)適當(dāng)?shù)亟M合在一起。這些物質(zhì)廣泛地記載于本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的文獻(xiàn)中(參見，例如，F(xiàn)eigner et al.，1987，Proc.West.Pharmacol.Soc.32，115-121；Hodgson and Solaiman，1996，Nature Biotechnology 14，339-342；Remy et al.，1994，BioconjugateChemistry，5，647-654)。作為非限制性舉例說明，所述物質(zhì)可以是聚合物、脂質(zhì)(特別是陽離子脂質(zhì))、脂質(zhì)體、核蛋白或中性脂脂。這些物質(zhì)可以單獨(dú)使用或組合使用?？梢灶A(yù)期的組合有與陽離子脂質(zhì)(DOGS、DC-CHOL、精胺-膽固醇、亞精胺-膽固醇等)、溶血磷脂(例如十六烷基磷酸膽堿)和中性脂質(zhì)(DOPE)組合的重組質(zhì)粒載體。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，可用于本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)是在EP901463B1中描述的陽離子脂質(zhì)，更優(yōu)選是pcTG90。
可用于本發(fā)明范圍內(nèi)的質(zhì)粒的選擇是巨大的。其可以是克隆載體和/或表達(dá)載體。一般而言，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，同時(shí)其中大部分可商購獲得，也可以利用遺傳操縱的技術(shù)對它們進(jìn)行構(gòu)建或修飾?？商岬降睦佑醒苌詐BR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、pREP4、pCEP4(Invitrogene)或pPoly(Lathe et al..1987，Gene 57，193-201)的質(zhì)粒。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的范圍的質(zhì)粒含有確保復(fù)制在生產(chǎn)細(xì)胞和/或宿主細(xì)胞中起始的復(fù)制原點(diǎn)(例如，將選擇ColEI起點(diǎn)用于欲在大腸桿菌中生產(chǎn)的質(zhì)粒；如果希望質(zhì)粒能在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中自我復(fù)制，則選擇oriP/EBNA1系統(tǒng)，Lupton and Levine，1985，Mol.Cell.Biol.5，2533-2542；Yates et al.，Nature 313，812-815)。所述質(zhì)?？梢灶~外地包含使轉(zhuǎn)染細(xì)胞被選擇或被識(shí)別的選擇基因(營養(yǎng)突變體的互補(bǔ)基因、編碼抗生素抗性的基因等)。當(dāng)然，所述質(zhì)?？砂纳破湓诮o定細(xì)胞中的維持和/或穩(wěn)定性的其它元件(促進(jìn)質(zhì)粒以單體形式維持的cer序列(Summers and Sherrat，1984，Cell 36，1097-1103，sequences forintegration into cell genome))。
對于病毒載體，可預(yù)期衍生自痘病毒(痘苗病毒，特別是MVA、金絲雀痘病毒等)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、甲病毒(aiphavirus)、泡沫病毒或腺病毒相關(guān)病毒的載體?？墒褂每蓮?fù)制或復(fù)制缺陷型病毒載體。優(yōu)選使用不完整的載體。在這方面，腺病毒載體和MVA尤其適于實(shí)施本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的病毒載體衍生自修飾的痘苗病毒安卡拉株(MVA)。歐洲專利EP83286和EP206920以及Mayr etal.(1975，Infection 3，6-14)和Sutter et Moss(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851)完整地描述了MVA載體和生產(chǎn)這種載體的方法。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方式，可以將本發(fā)明的核苷酸序列插入MVA載體的缺失體I、II、III、IV、V和VI中，更優(yōu)選插入缺失體III中(Meyer et al.，1991，J.Gen.Virol.72，1031-1038；Sutter et al.，1994，Vaccine 12，1032-1040)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染并在大多數(shù)情況下整合到分裂細(xì)胞中的特性，這方面對于癌癥尤其適用。根據(jù)本發(fā)明的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒通常含有LTR序列、殼體化區(qū)域(encapsidation region)和根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列，該核苷酸序列位于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR或內(nèi)部啟動(dòng)子例如以下所述的那些啟動(dòng)子的控制下。所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可衍生自任何來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒(鼠、靈長類、貓、人類等)，特別是衍生自MOMuLV(莫洛尼鼠類白血病毒)、MVS(鼠肉瘤病毒)或弗羅德鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒(Fb29)。其在殼體化細(xì)胞系(encapsidation cell line)中進(jìn)行增殖，所述細(xì)胞系能夠反式提供組成病毒顆粒所需的病毒多肽gag、pol和/或env。在文獻(xiàn)中描述了這樣的細(xì)胞系(PA317、Psi CRIP GP+Am-12等)。根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可含有修飾，特別是在LTR(用真核啟動(dòng)子置換啟動(dòng)子區(qū)域)或殼體化區(qū)域(用異源殼體化區(qū)域，例如VL3O型，進(jìn)行置換)(參見法國專利申請9408300和97 05203)。
也優(yōu)選使用缺失復(fù)制所必需的至少一個(gè)區(qū)域的全部或部分的腺病毒載體以避免所述載體在宿主生物體或環(huán)境中擴(kuò)增，所述區(qū)域選自E1、E2、E4和L1-L5區(qū)。優(yōu)選缺失E1區(qū)。但是，其可與(一或多種)其它的修飾/缺失相結(jié)合，特別是影響E2、E4和/或L1-L5區(qū)的全部或部分的修飾/缺失從而使有缺陷的必需功能通過互補(bǔ)細(xì)胞系和/或輔助病毒得以反式互補(bǔ)。在這方面，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中的第二代載體(參見，例如，國際申請WO-A-94/28152和WO-A-97/04119)。舉例來說，尤其優(yōu)選E1區(qū)和E4轉(zhuǎn)錄單元的主要部分的缺失。為了提高克隆能力，所述腺病毒載體可額外缺失全部或部分的非必需的E3區(qū)。根據(jù)另一個(gè)替代的實(shí)施方式，可以利用保留了殼體化所必需的序列(即5′和3′ITR(末端反向重復(fù)序列)和殼體化區(qū)域的最小腺病毒載體。已知各種腺病毒載體和它們的制備方法(參見，例如，Graham and Prevect，1991，in Methods in Molecular Biology，Vol 7，p109-128；EdE.J.Murey，The Human Press mc)。
此外，根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體的來源可根據(jù)物種和血清型改變。所述載體可衍生自人類或動(dòng)物(犬、禽、牛、鼠、羊、豬、猿等)來源的腺病毒的基因組，或衍生自包含至少兩種不同來源的腺病毒基因組片段的雜種。更特別提到的可以是由犬類來源的CAV-1或CAV-2腺病毒、禽類來源的DAV腺病毒或來源于牛的Bad 3型腺病毒構(gòu)成的腺病毒載體(Zakharchuk et al.，Arch.Virol.，1993，128171-176；Spibey and Cavanagh，J.Gen.Virol.1989，70165-172；Jouvenne et al.，Gene，1987，6021-28；Mittalet al.，J.Gen.Virol.，1995，7693-102)。但是，優(yōu)選人類來源的腺病毒載體，其優(yōu)選衍生自血清型C腺病毒，特別是2型或5型的血清型C腺病毒。
本申請中所用術(shù)語“可復(fù)制的”指在沒有任何反式互補(bǔ)的情況下能在宿主細(xì)胞中復(fù)制的病毒載體。在本發(fā)明中，該術(shù)語還包括選擇復(fù)制型或條件復(fù)制型腺病毒載體，其被加工以在癌癥或過度增殖的宿主細(xì)胞中更好地或選擇性地進(jìn)行復(fù)制。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述可復(fù)制的載體是可復(fù)制的腺病毒載體。這些可復(fù)制的腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。其中，特別優(yōu)選在編碼55kD P53抑制劑的E1b區(qū)有缺失的腺病毒載體，如在ONYX-015病毒中缺失E1b區(qū)(Bischoff et al.，1996；Heise et al.，2000；WO 94/18992)。因此，該病毒可用于選擇性地感染和殺死p53缺陷型新生細(xì)胞。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還可以根據(jù)已建立的技術(shù)對腺病毒5或其它病毒中的p53抑制基因進(jìn)行突變和破壞。在E1A Rb結(jié)合區(qū)有缺失的腺病毒載體也可以用于本發(fā)明，例如，在E1A區(qū)具有24個(gè)堿基對缺失的突變腺病毒Δ24病毒(Fueyo et al.，2000)。Δ24在Rb結(jié)合區(qū)具有缺失，且不與Rb結(jié)合。因此，在正常細(xì)胞中突變病毒的復(fù)制被Rb抑制。然而，如果Rb被失活且細(xì)胞發(fā)生腫瘤性轉(zhuǎn)化，則Δ24不再被抑制。相反，突變病毒高效地進(jìn)行復(fù)制，并裂解Rb缺陷型細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體可以在體外在大腸桿菌(E.coli)中通過連接或同源重組產(chǎn)生(參見，例如，國際申請WO-A-96/17070)，或在互補(bǔ)細(xì)胞系中通過重組產(chǎn)生。
表達(dá)所需的元件由使核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成RNA以及使mRNA被翻譯成多肽的全部元件組成。特別地，這些元件包括調(diào)控型或組成型啟動(dòng)子。當(dāng)然，該啟動(dòng)子要適于所選擇的載體和宿主細(xì)胞?？商峒暗膶?shí)例有PGK(磷酸甘油酸激酶)、MT(金屬硫蛋白；Mclvor et al.，1987，Mol.Cell Biol.7，838-848)、α-1抗胰蛋白酶、CFTR、表面活性劑、免疫球蛋白、β-肌動(dòng)蛋白(Tabin et al.，1982，Mol.Cell Biol.2，426-436)和Sra(Takebe et al.，1988，Mol.Cell Biol.8，466-472)等基因的真核啟動(dòng)子，SV40病毒(猿病毒)早期啟動(dòng)子，RSV(勞斯肉瘤病毒)的LTR，HSV-I TK啟動(dòng)子，CMV病毒(巨細(xì)胞病毒)早期啟動(dòng)子，痘苗病毒的p7.5K pH5R、pK1L、p28和p11啟動(dòng)子，以及E1A和MLP腺病毒啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子還可以是在腫瘤或癌細(xì)胞中刺激表達(dá)的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子還可以是刺激腫瘤或癌細(xì)胞中的表達(dá)的啟動(dòng)子?？商貏e提到以下基因的啟動(dòng)子MUC-I基因，其在乳腺癌和前列腺癌中過表達(dá)(Chen et al.，1995，J.Clin.Invest.96，2775-2782)；CEA(代表癌胚抗原)基因，其在結(jié)腸癌中過表達(dá)(Schrewe et al.，1990，Mol.Cell.Biol.10，2738-2748)；酪氨酸酶基因，其在黑素瘤中過表達(dá)(Vileet al.，1993，Cancer Res.53，3860-3864)；ERBB-2基因，其在乳腺癌和胰腺癌中過表達(dá)(Harris et al.，1994，Gene Therapy 1，170-175)和α-胎蛋白基因，其在肝癌中過表達(dá)(Kanai et al.，1997，Cancer Res.57，461-465)。尤其優(yōu)選巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子。
但是，當(dāng)使用衍生自痘苗病毒的載體(例如MVA載體)時(shí)，尤其優(yōu)選胸苷激酶7.5K基因的啟動(dòng)子。
必需的元件還可包括增加根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)或維持的額外元件?？商貏e提及的有內(nèi)含子序列、分泌信號(hào)序列、核定位序列、IRES型翻譯再起始的內(nèi)部位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止polyA序列、三聯(lián)前導(dǎo)序列和復(fù)制起點(diǎn)。這些元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
根據(jù)本發(fā)明的重組載體還可以包含一或多個(gè)感興趣的額外基因，這些基因可處于相同調(diào)控元件(多順反子盒)或獨(dú)立元件的控制下。可特別提及的基因有編碼白細(xì)胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-10和IL-12，干擾素，腫瘤壞死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)、特別是GM-CSF，以及影響血管發(fā)生的因子(例如PAI-1，代表纖溶酶原激活物抑制劑)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組載體包含編碼IL-2或編碼干擾素γ(INFγ)的感興趣的基因。也可以預(yù)期將根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列與其它自殺基因例如HSV-1 TK基因、蓖麻毒蛋白基因、霍亂毒素基因等結(jié)合起來。
本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的重組載體的病毒顆粒?？梢岳帽绢I(lǐng)域中的任何常規(guī)技術(shù)從病毒載體產(chǎn)生這樣的病毒顆粒。將病毒顆粒在互補(bǔ)細(xì)胞中增殖，所述互補(bǔ)細(xì)胞與載體的缺陷相適應(yīng)。對于腺病毒載體，將使用例如由293細(xì)胞系，其使用人胚腎細(xì)胞建立并有效地互補(bǔ)E1功能(Graham et al.，1977，J.Gen.Virol.36，59-72)；A549-E1細(xì)胞系(Imler et al.，1996，Gene Therapy 3，75-84)或允許雙重互補(bǔ)的細(xì)胞系(Yeh et al.，1996，J.Virol.70，559-565；Krougliak and Graham，1995，Human Gene Therapy 6，1575-1586；Wang et al.，1995 Gene Therapy 2，775-783；國際申請WO97/04119)組成的互補(bǔ)細(xì)胞。也可使用輔助病毒以至少部分互補(bǔ)有缺陷的功能。互補(bǔ)細(xì)胞被認(rèn)為是能夠反式提供早期和/或晚期因子的細(xì)胞，所述因子是使病毒基因組在病毒殼體中殼體化以產(chǎn)生含有所述重組載體的病毒顆粒所必需的。所述細(xì)胞自身不能互補(bǔ)載體全部有缺陷的功能，在這種情況下可用提供額外功能的載體/輔助病毒對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明還涉及制備病毒顆粒的方法，其中(i)將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入互補(bǔ)細(xì)胞，所述互補(bǔ)細(xì)胞能夠反式互補(bǔ)所述載體，以獲得轉(zhuǎn)染的互補(bǔ)細(xì)胞，(ii)將所述轉(zhuǎn)染的互補(bǔ)細(xì)胞在適于產(chǎn)生所述病毒顆粒的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以及(iii)從細(xì)胞培養(yǎng)物回收所述病毒顆粒。
病毒顆粒當(dāng)然可從培養(yǎng)物上清液回收，其還可以從細(xì)胞回收。一種通常使用的方法是通過連續(xù)的凍/融循環(huán)裂解細(xì)胞以便在裂解上清液中收集病毒體。然后可以對病毒體進(jìn)行擴(kuò)增和利用現(xiàn)有技術(shù)(層析法、超速離心法(特別是通過氯化銫梯度超速離心)等)進(jìn)行純化。
本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的試劑盒、重組載體或病毒顆粒以及藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。
更具體地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒是針對通過基因治療預(yù)防性地或治療性地治療疾病，更特別地是針對增殖性疾病(癌癥、腫瘤、再狹窄等)；以及感染性疾病，特別是病毒性疾病(由乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒、HIV、皰疹、逆轉(zhuǎn)錄病毒等引起的疾病)。
可以局部、腸胃外或通過消化道施用為目的常規(guī)制備根據(jù)本發(fā)明的試劑盒。特別地，將治療有效量的治療性或預(yù)防性制劑與藥學(xué)上可接受的賦形劑相組合?？深A(yù)期大量的施用途徑?？商峒暗膶?shí)例有胃內(nèi)、皮下、心內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和氣管內(nèi)施用的途徑。在后面的三個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選通過氣霧劑或通過滴注進(jìn)行施用?？梢砸詥蝿┝炕蛱囟〞r(shí)間間隔之后的一或多次重復(fù)的劑量的形式進(jìn)行施用。施用的適當(dāng)途徑和劑量根據(jù)多種參數(shù)(例如個(gè)體、待治療的疾病或待轉(zhuǎn)移的感興趣的基因)而不同?；诒景l(fā)明的病毒顆粒的制劑可以配制成介于104到1014pfu(空斑形成單位)之間的劑量形式，優(yōu)選105到1013pfu，優(yōu)選106到1012pfu，當(dāng)使用腺病毒顆粒時(shí)更優(yōu)選109到1010pfu，當(dāng)使用MVA顆粒時(shí)更優(yōu)選106到107pfu。就本發(fā)明的重組載體而言，可預(yù)期的劑量包含從0.01到100mg的DNA，優(yōu)選從0.05到10mg，尤其優(yōu)選從0.5到5mg。
該配制品還可以包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、輔劑或賦形劑，以及增溶劑、穩(wěn)定劑和保存劑。對于注射施用的情況，優(yōu)選用水性、非水性或等滲溶液形式的配制品。其可以以單劑量或多劑量、液體形式或可在使用時(shí)利用適當(dāng)?shù)南♂寗┲亟ǖ墓腆w(粉末、凍干物等)形式存在。所述配制品還可以包含適當(dāng)量的前體藥物。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的試劑盒、重組載體或病毒顆粒在制備用于通過基因治療治療人體或動(dòng)物體的藥物中的治療性或預(yù)防性應(yīng)用。根據(jù)第一個(gè)可能性，該藥物可直接進(jìn)行體內(nèi)施用(例如通過靜脈注射進(jìn)入的易接近的腫瘤內(nèi)、通過氣霧劑進(jìn)入肺、利用適當(dāng)?shù)膶?dǎo)管進(jìn)入血管系統(tǒng)等)。也可采用離體方法，包括將細(xì)胞從患者體內(nèi)移出(骨髓干細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、肌細(xì)胞等)，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)在體外對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染或感染，然后將其重新施用給所述患者。優(yōu)選的應(yīng)用是治療或預(yù)防癌癥、腫瘤和由不需要的細(xì)胞增殖所引起的疾病。可提及的可預(yù)期的應(yīng)用是治療或預(yù)防乳腺癌、子宮癌(特別是由乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的子宮癌)、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、喉癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)和血癌(淋巴瘤、白血病等)。它還可以用于心血管疾病范圍，例如為了抑制或延緩血管壁的平滑肌細(xì)胞的增殖(再狹窄)。最后，就感染性疾病而言，可預(yù)期到用于AIDS的藥物。
本發(fā)明還提供了通過基因治療用于治療疾病的方法，其特征在于將根據(jù)本發(fā)明的試劑盒、重組載體、病毒顆?；蛩拗骷?xì)胞施用給需要此類治療的宿主生物體或細(xì)胞。
包含一個(gè)核堿基部分的藥物或其前體可根據(jù)常規(guī)方法(例如經(jīng)口，全身性)施用。舉例來說，對于5-FU，可使用從50到500mg/kg/天的劑量，優(yōu)選使用200mg/kg/天的劑量。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在施用根據(jù)本發(fā)明的核酸序列之前、同時(shí)或之后，根據(jù)常規(guī)方法(例如經(jīng)口，全身性)施用所述前體藥物。優(yōu)選口服途徑?？梢允┯脝蝿┝康那绑w藥物，或者在一段足夠長以能夠在宿主生物體或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生毒性代謝物的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行重復(fù)施用的劑量。
此外，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒或方法可與一或多種加強(qiáng)包含一個(gè)核堿基部分的藥物的細(xì)胞毒性效應(yīng)的物質(zhì)聯(lián)合使用。可特別提及的是抑制嘧啶從頭生物合成途徑中的酶的藥物(例如在以下所提及的那些)，例如甲酰四氫葉酸(Waxman et al.，1982，Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18，685-692)，其在存在5-FU的代謝產(chǎn)物(5-FdUMP)的情況下增強(qiáng)對胸苷酸合酶的抑制，導(dǎo)致復(fù)制所需的dTMP池和最終藥物例如氨甲喋呤的下降(Cadmanet al.，1979，Science 250，1135-1137)，所述氨甲喋呤通過抑制二氫葉酸還原酶和增加PRPP(磷酸核糖焦磷酸)的集中增加5-FU摻入細(xì)胞RNA。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒或方法可與一或多種在抗癌治療中有效的物質(zhì)聯(lián)合使用。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒或方法還可以與放射治療聯(lián)合使用。


圖1腺病毒與125和50mg/kg/天的5-FC的組合對Swiss裸小鼠中LoVo結(jié)腸癌異種移植物的生長的抗癌活性。通過將5×106個(gè)細(xì)胞皮下植入到裸小鼠體內(nèi)建立腫瘤。當(dāng)腫瘤可觸知時(shí)，用空腺病毒(A)、Ad-FCU1(B)和Ad-FCY2FCU1(C)對動(dòng)物進(jìn)行瘤內(nèi)接種3次，并經(jīng)口施用5-FC處理3周。使用空腺病毒(A)時(shí)，存在或不存在5-FC之間的生長曲線無差異(P＞0.05)。使用Ad-FCU1(B)時(shí)，僅在存在或不存在125mg/kg/天的5-FC的生長曲線之間存在顯著差異(P＜0.05)。使用Ad-FCY2FCU1(C)時(shí)，在不存在5-FC與存在全身施用125和50mg/kg/天的5-FC的生長曲線之間存在顯著差異(P＜0.05)。
實(shí)施例表達(dá)來自E1區(qū)的FCY2的腺病毒的構(gòu)建利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，自作為模板的質(zhì)粒pAJ14(Bloch et al.1992)擴(kuò)增完整的酵母嘌呤-胞嘧啶通透酶基因(FCY2，1599bp)。將寡核苷酸SEQ ID NO.35′-TAACGATCTCGAGCCATGGTGGAAGAGGGAAATAATGTTTACG-3′(OTG14626，對應(yīng)于FCY2編碼序列的5′末端，但插入了在第2位由Val取代Leu的Kozak共有序列，并在起始密碼子的上游插入一個(gè)XhoI限制性位點(diǎn))和SEQ ID NO.45′-CCCTAATCACGCGTTCCTAACGACCGAAGTATTTTAAT-3′(OTG14627，對應(yīng)于3′末端，并在終止密碼子的下游插入一個(gè)MluI限制性位點(diǎn))用作引物。將PCR產(chǎn)物通過XhoI和MluI進(jìn)行消化，并亞克隆到形成質(zhì)粒pTG15829的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCIneo(Promega)的相應(yīng)位點(diǎn)中。來自pTG15829的序列揭示在FCY2基因的開放讀框中的核苷酸+1272的一個(gè)沉默突變(G到A)。將來自質(zhì)粒pTG15829的含有FCY2基因的XhoI-MluI片段插入由相同的酶切割的轉(zhuǎn)移載體pTG13387中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移載體pTG15857。通過BJ5183大腸桿菌菌株中pTG15857的片段PacI-BstEII與由ClaI線性化的載體pTG6624之間的同源重組產(chǎn)生腺病毒載體Ad-FCY2(pTG15895)。最終構(gòu)建的Ad-FCY2(pTG15895)含有E3(核苷酸第28592到30470位)的缺失，而E1區(qū)(核苷酸第459到3510位)被表達(dá)盒所取代，所述表達(dá)盒從5′到3′含有CMV即刻早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、嵌合人β-球蛋白/IgG內(nèi)含子、FCY2基因和bGH多腺苷酸化信號(hào)。在互補(bǔ)E1功能的細(xì)胞系(例如PERC6細(xì)胞系)中通過轉(zhuǎn)染產(chǎn)生表達(dá)FCY2的腺病毒顆粒(AdTG15895)。
表達(dá)來自E1區(qū)的雙順反子單位FCY2 IRES FCU1的腺病毒的構(gòu)建分離含有FCY2基因的質(zhì)粒pTG15829的NheI-NotI片段，并將其導(dǎo)入用NheI-NotI線性化的載體pTG14347(在p53FCU1的專利中描述的質(zhì)粒pTG4369p53FCU1)。如此獲得的質(zhì)粒pTG16055從5′到3′含有FCY2基因、ECMV(腦心肌炎病毒)的IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列和FCU1基因。將來自質(zhì)粒pTG16055的NheI-BamHI片段插入由相同的酶切割的轉(zhuǎn)移載體pTG14799(在FCU1-8專利中描述的質(zhì)粒)中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移載體pTG16066。通過BJ5183大腸桿菌菌株中pTG16066的片段PacI-BstEII與由ClaI線性化的載體pTG6624之間的同源重組產(chǎn)生腺病毒載體Ad-FCY2FCU1(pTG16079)。最終構(gòu)建的Ad-FCY2FCU1(pTG16079)包含E3(核苷酸第28592到30470位)的缺失，而E1區(qū)(核苷酸第459到3510位)被表達(dá)盒所取代，所述表達(dá)盒從5′到3′含有CMV即刻早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、嵌合人β-球蛋白/IgG內(nèi)含子、FCY2 IRES FCU1雙順反子單位和bGH多腺苷酸化信號(hào)。在互補(bǔ)E1功能的細(xì)胞系(例如細(xì)胞系PERC6)中通過轉(zhuǎn)染產(chǎn)生表達(dá)FCY2 IRES FCU1的腺病毒顆粒(AdTG16079)。
5-氟胞嘧啶攝取分析用Mock、空腺病毒(AdTG15149)、表達(dá)FCU1(FCU1-8專利中描述的AdTG14800)或FCY2(AdTG15895)或FCY2和FCU1(AdTG16079)的腺病毒感染人腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC CCL-185)。以MOI 20感染細(xì)胞(5×106)，并將其置于60-mm平板上。24小時(shí)之后，通過常規(guī)示蹤技術(shù)測量感染細(xì)胞對5-FC的攝取。利用1分鐘溫育期測量5-FC(10μM、室溫)最初的速率，并以0.15μCi/ml濃度的[3H]5-FC進(jìn)行追蹤。
簡而言之，在感染之后24小時(shí)，用轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液(100mM NaCl、2mMKCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2和10mM HEPES，pH7.5)洗滌細(xì)胞一次。攝取分析從添加2ml含有10μM 5-FC(0.15μCi/ml的[3H]5-FC)的轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液開始。溫育結(jié)束時(shí)，用冰冷的轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液三次快速洗滌去除胞外標(biāo)記。將細(xì)胞溶解在1ml的5％SDS中用于通過液體閃爍計(jì)數(shù)對放射性進(jìn)行定量。
表1轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞對5-FC的攝取利用含有10μM 5-FC的轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液測量5-FC的攝取。
每一數(shù)值代表三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±SD。
表1中所示的結(jié)果證明在被表達(dá)FCY2的腺病毒(AdFCY2和AdFCY2FCU1)感染的細(xì)胞中5-FC轉(zhuǎn)運(yùn)的增加。該結(jié)果表明在人細(xì)胞中表達(dá)的酵母FCY2編碼功能性的5-FC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
對5-FC的體外細(xì)胞敏感性比較用不同的腺病毒感染的腫瘤細(xì)胞對5-FC的敏感性。用Mock、空腺病毒(AdTG15149)、表達(dá)FCU1(FCU1-8專利中描述的AdTG14800)或FCY2(AdTG15895)或FCY2和FCU1(AdTG16079)的腺病毒感染人腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC CCL-185)。以MOI 1感染細(xì)胞，然后在存在不同濃度的5-FC的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)6天之后，利用臺(tái)盼藍(lán)測定細(xì)胞的成活力。列于表2中的5-FC的LD50值是四次計(jì)數(shù)的平均值。
體內(nèi)試驗(yàn)本研究的目的是比較在攜帶有LoVo人結(jié)腸腫瘤的裸鼠中，聯(lián)合經(jīng)口服施用的125或50mg/kg/天的5-氟胞嘧啶(5-FC)時(shí)，重組Ad-FCU1和Ad-FCY2FCU1的抗腫瘤活性。
將LoVo細(xì)胞皮下(s.c.)注射到Swiss裸小鼠的側(cè)腹。將懸浮于100mlPBS中的5×106個(gè)LoVo細(xì)胞植入每一動(dòng)物體內(nèi)。當(dāng)腫瘤達(dá)到30-50mm3時(shí)，以盲法對小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，并用1×108IU劑量的指示載體處理。在腫瘤植入后第12、15和18天將載體(懸浮于100ml的10mM Tris-HCl、pH7.5，1mM MgCl2中)直接注射到腫瘤中。從第12天開始，在三周內(nèi)每天兩次以經(jīng)口管飼法給予62.5mg/kg/天的5-FC(0.6ml 0.25％5-FC的水溶液)或25mg/kg/天的5-FC(0.6ml 0.1％5-FC的水溶液)。使用測徑器以二維測量腫瘤的大小。使用公式(p6)(長度×寬度2)計(jì)算腫瘤的體積(mm3)。
使用非參數(shù)的Mann-Whitney U檢驗(yàn)和Statistica 6.1軟件(StatSoft公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將p＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
施用125mg/kg/天的5-FC，注射Ad-FCU1和Ad-FCY2FCU1導(dǎo)致對腫瘤生長在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的抑制(圖1B，C)。這一抗腫瘤效應(yīng)是FCU1/5-FC特有的，因?yàn)楦腥静徽T導(dǎo)FCU1活性的空腺病毒在5-FC存在的條件下沒有明顯縮小腫瘤大小(圖1A)。在較低劑量的5-FC(50mg/kg/天)的條件下，在遞送Ad-FCY2FCU1之后觀察到對腫瘤生長的顯著抑制，而使用Ad-FCU1則沒有觀察到腫瘤生長的改變。該結(jié)果表明FCY2和FCU1的組合明顯比單獨(dú)的FCU1更有效，表明在癌癥基因治療方法中FCY2FCU1/5-FC系統(tǒng)比FCU1/5-FC系統(tǒng)更有效。
表2腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的A549細(xì)胞的5-FC的LD50值
這些結(jié)果證明與FCU1基因(AdTG14800)的表達(dá)相比，來自腺病毒載體(AdTG16079)的FCY2和FCU1基因的共表達(dá)使細(xì)胞對5-FC的敏感性更高。這一對5-FC的更高的敏感性是攝取由FCY2基因所編碼的5-FC的結(jié)果。利用Ad-FCY2(AdTG15895)感染的細(xì)胞，沒有觀察到抗增殖的效果，這表明在缺乏胞嘧啶脫氨酶活性的條件下，F(xiàn)CY2的單獨(dú)施用不足以用作有效的抗腫瘤治療方案。
序列表<110>特蘭斯吉恩股份有限公司<120>設(shè)計(jì)用于在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行抗腫瘤或抗病毒治療的試劑盒<130>D 22887<140>PCT/IB2005/003435<141>2005-10-26<150>EP 04360101.2<151>2004-11-08<150>US 60/646,595<151>2005-10-26<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>533<212>PRT<213>Saccharomyces cerevisiae<400>1Met Val Glu Glu Gly Asn Asn Val Tyr Glu Ile Gln Asp Leu Glu Lys1 5 10 15Arg Ser Pro Val Ile Gly Ser Ser Leu Glu Asn Glu Lys Lys Val Ala20 25 30Ala Ser Glu Thr Phe Thr Ala Thr Ser Glu Asp Asp Gln Gln Tyr Ile35 40 45Val Glu Ser Ser Glu Ala Thr Lys Leu Ser Trp Phe His Lys Phe Phe50 55 60Ala Ser Leu Asn Ala Glu Thr Lys Gly Val Glu Pro Val Thr Glu Asp65 70 75 80Glu Lys Thr Asp Asp Ser Ile Leu Asn Ala Ala Ser Met Trp Phe Ser85 90 95Ala Asn Met Val Ile Ala Ser Tyr Ala Leu Gly Ala Leu Gly Pro Met100 105 110Val Phe Gly Leu Asn Phe Gly Gln Ser Val Leu Val Ile Ile Phe Phe115 120 125Asn Ile Met Gly Leu Ile Phe Val Ala Phe Phe Ser Val Phe Gly Ala130 135 140Glu Leu Gly Leu Arg Gln Met Ile Leu Ser Arg Tyr Leu Val Gly Asn145 150 155 160
Val Thr Ala Arg Ile Phe Ser Leu Ile Asn Val Ile Ala Cys Val Gly165 170 175Trp Gly Ile Val Asn Thr Ser Val Ser Ala Gln Leu Leu Asn Met Met180 185 190Asn Glu Gly Ser Gly His Val Cys Pro Ile Trp Ala Gly Cys Leu Ile195 200 205Ile Ile Gly Gly Thr Val Leu Val Thr Phe Phe Gly Tyr Ser Val Ile210 215 220His Ala Tyr Glu Lys Trp Ser Trp Val Pro Asn Phe Ala Val Phe Leu225 230 235 240Val Ile Ile Ala Gln Leu Ser Arg Ser Gly Lys Phe Lys Gly Gly Glu245 250 255Trp Val Gly Gly Ala Thr Thr Ala Gly Ser Val Leu Ser Phe Gly Ser260 265 270Ser Ile Phe Gly Phe Ala Ala Gly Trp Thr Thr Tyr Ala Ala Asp Tyr275 280 285Thr Val Tyr Met Pro Lys Ser Thr Asn Lys Tyr Lys Ile Phe Phe Ser290 295 300Leu Val Ala Gly Leu Ala Phe Pro Leu Phe Phe Thr Met Ile Leu Gly305 310 315 320Ala Ala Ser Ala Met Ala Ala Leu Asn Asp Pro Thr Trp Lys Ala Tyr325 330 335Tyr Asp Lys Asn Ala Met Gly Gly Val Ile Tyr Ala Ile Leu Val Pro340 345 350Asn Ser Leu Asn Gly Phe Gly Gln Phe Cys Cys Val Leu Leu Ala Leu355 360 365Ser Thr Ile Ala Asn Asn Ile Pro Asn Met Tyr Thr Val Ala Leu Ser370 375 380Ala Gln Ala Leu Trp Ala Pro Leu Ala Lys Ile Pro Arg Val Val Trp385 390 395 400Thr Met Ala Gly Asn Ala Ala Thr Leu Gly Ile Ser Ile Pro Ala Thr405 410 415Tyr Tyr Phe Asp Gly Phe Met Glu Asn Phe Met Asp Ser Ile Gly Tyr420 425 430Tyr Leu Ala Ile Tyr Ile Ala Ile Ser Cys Ser Glu His Phe Phe Tyr435 440 445Arg Arg Ser Phe Ser Ala Tyr Asn Ile Asp Asp Trp Asp Asn Trp Glu450 455 460
His Leu Pro Ile Gly Ile Ala Gly Thr Ala Ala Leu Ile Val Gly Ala465 470 475 480Phe Gly Val Ala Leu Gly Met Cys Gln Thr Tyr Trp Val Gly Glu Ile485 490 495Gly Arg Leu Ile Gly Lys Tyr Gly Gly Asp Ile Gly Phe Glu Leu Gly500 505 510Ala Ser Trp Ala Phe Ile Ile Tyr Asn Ile Leu Arg Pro Leu Glu Leu515 520 525Lys Tyr Phe Gly Arg530<210>2<211>633<212>PRT<213>Saccharomyces cerevisiae<400>2Met Ala Asp Asn Leu Ser Leu His Leu Ser Gly Ser Ser Lys Arg Leu15 10 15Asn Ser Arg Gln Leu Met Glu Ser Ser Asn Glu Thr Phe Ala Pro Asn20 25 30Asn Val Asp Leu Glu Lys Glu Tyr Lys Ser Ser Gln Ser Asn Ile Thr35 40 45Thr Glu Val Tyr Glu Ala Ser Ser Phe Glu Glu Lys Val Ser Ser Glu50 55 60Lys Pro Gln Tyr Ser Ser Phe Trp Lys Lys Ile Tyr Tyr Glu Tyr Val65 70 75 80Val Val Asp Lys Ser Ile Leu Gly Val Ser Ile Leu Asp Ser Phe Met85 90 95Tyr Asn Gln Asp Leu Lys Pro Val Glu Lys Glu Arg Arg Val Trp Ser100 105 110Trp Tyr Asn Tyr Cys Tyr Phe Trp Leu Ala Glu Cys Phe Asn Ile Asn115 120 125Thr Trp Gln Ile Ala Ala Thr Gly Leu Gln Leu Gly Leu Asn Trp Trp130 135 140Gln Cys Trp Ile Thr Ile Trp Ile Gly Tyr Gly Phe Val Gly Ala Phe145 150 155 160Val Val Leu Ala Ser Arg Val Gly Ser Ala Tyr His Leu Ser Phe Pro165 170 175
Ile Ser Ser Arg Ala Ser Phe Gly Ile Phe Phe Ser Leu Trp Pro Val180 185 190Ile Asn Arg Val Val Met Ala Ile Val Trp Tyr Ser Val Gln Ala Tyr195 200 205Ile Ala Ala Thr Pro Val Ser Leu Met Leu Lys Ser Ile Phe Gly Lys210 215 220Asp Leu Gln Asp Arg Ile Pro Asp His Phe Gly Ser Pro Asn Ala Thr225 230 235 240Thr Tyr Glu Phe Met Cys Phe Phe Ile Phe Trp Ala Ala Ser Leu Pro245 250 255Phe Leu Leu Val Pro Pro His Lys Ile Arg His Leu Phe Thr Val Lys260 265 270Ala Val Leu Val Pro Phe Ala Ser Phe Gly Phe Leu Ile Trp Ala Ile275 280 285Arg Arg Ala His Gly Arg Ile Ala Leu Gly Ser Leu Thr Asp Val Gln290 295 300Pro His Gly Ser Ala Phe Ser Trp Ala Phe Leu Arg Ser Leu Met Gly305 310 315 320Cys Met Ala Asn Phe Ser Thr Met Val Ile Asn Ala Pro Asp Phe Ser325 330 335Arg Phe Ser Lys Asn Pro Asn Ser Ala Leu Trp Ser Gln Leu Val Cys340 345 350Ile Pro Phe Leu Phe Ser Ile Thr Cys Leu Ile Gly Ile Leu Val Thr355 360 365Ala Ala Gly Tyr Glu Ile Tyr Gly Ile Asn Tyr Trp Ser Pro Leu Asp370 375 380Val Leu Glu Lys Phe Leu Gln Thr Thr Tyr Asn Lys Gly Thr Arg Ala385 390 395 400Gly Val Phe Leu Ile Ser Phe Val Phe Ala Val Ala Gln Leu Gly Thr405 410 415Asn Ile Ser Ala Asn Ser Leu Ser Cys Gly Thr Asp Met Ser Ala Ile420 425 430Phe Pro Lys Phe Ile Asn Ile Lys Arg Gly Ser Leu Phe Cys Ala Ala435 440 445Met Ala Leu Cys Ile Cys Pro Trp Asn Leu Met Ala Thr Ser Ser Lys450 455 460Phe Thr Met Ala Leu Ser Ala Tyr Ala Ile Phe Leu Ser Ser Ile Ala465 470 475 480Gly Val Val Cys Ser Asp Tyr Phe Val Val Arg Arg Gly Tyr Ile Lys485 490 495
Leu Thr His Ile Tyr Ser His Gln Lys Gly Ser Phe Tyr Met Tyr Gly500 505 510Asn Arg Phe Gly Ile Asn Trp Arg Ala Leu Ala Ala Tyr Leu Cys Gly515 520 525Val Ala Pro Cys Leu Pro Gly Phe Ile Ala Glu Val Gly Ala Pro Ala530 535 540Ile Lys Val Ser Asp Gly Ala Met Lys Leu Tyr Tyr Leu Ser Tyr Trp545 550 555 560Val Gly Tyr Gly Leu Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Ala Leu Cys Tyr Phe565 570 575Phe Pro Val Pro Gly Cys Pro Val Asn Asn Ile Ile Lys Asp Lys Gly580 585 590Trp Phe Gln Arg Trp Ala Asn Val Asp Asp Phe Glu Glu Glu Trp Lys595 600 605Asp Thr Ile Glu Arg Asp Asp Leu Val Asp Asp Asn Ile Ser Val Tyr610 615 620Glu His Glu His Glu Lys Thr Phe Ile625 630<210>3<211>42<212>DNA<213>Saccharomyces cerevisiae<400>3taacgatctc gagccatggt ggaagaggga aataatgttt ac 42<210>4<211>38<212>DNA<213>Saccharomyces cerevisiae<400>4ccctaatcac gcgttcctaa cgaccgaagt attttaat 38
權(quán)利要求
1.一種用于治療脊椎動(dòng)物，尤其是人的癌癥和/或病毒性疾病的試劑盒，其包含-包含一個(gè)核堿基部分的藥物或其前體，和-包含編碼通透酶的基因的核酸序列。
2.一種用于治療脊椎動(dòng)物，尤其是人的癌癥和/或病毒性疾病的試劑盒，其包含-包含一個(gè)核堿基部分的藥物的前體，和-包含編碼通透酶的基因的核酸序列，和-包含自殺基因的核酸序列。
3.權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述包含一個(gè)核堿基部分的藥物選自包含如下組分的組阿糖胞苷、吉西他濱、卡培他濱、氟達(dá)拉濱、克拉屈濱、曲沙他濱、克羅屈濱、疊氮胸苷(AZT)、2’，3’-雙脫氧肌苷(ddI)、扎西他濱(ddC)、司他伏定(d4T)、脫氧氟亞甲基胞苷(FMdC)、拉米夫定、氟尿苷(FUdR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫鳥嘌呤、巰嘌呤、無環(huán)鳥苷、伐昔洛韋、泛昔洛韋和更昔洛韋。
4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述通透酶是釀酒酵母(S.Cerevisiae)的嘌呤或胞嘧啶通透酶。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述通透酶選自FCY2和Fur4及其類似物。
6.權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的試劑盒，其中自殺基因選自編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性、胸苷激酶活性、尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶活性、嘌呤核苷磷酸化酶活性和/或胸苷酸激酶活性的蛋白質(zhì)的基因。
7.權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的試劑盒，其中自殺基因編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的試劑盒，其中自殺基因編碼至少具有胞嘧啶脫氨酶活性和尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求7的試劑盒，其中自殺基因選自CodA、upp、FUR1、FCY1和FUR1Δ105。
10.權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述蛋白質(zhì)是一種融合蛋白，其中呈現(xiàn)尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶或胞嘧啶脫氨酶活性的第一種多肽至少與第二種多肽同相融合，所述第二種多肽相應(yīng)地呈現(xiàn)胞嘧啶脫氨酶或尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
11.權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述自殺基因包含選自upp、FUR1和FUR1Δ105的第一種核酸序列和選自CodA和FCY1的第二種核酸序列。
12.權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述包含一個(gè)核堿基部分的藥物的前體選自包含如下組分的組疊氮胸苷(AZT)、更昔洛韋(GCV)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-甲基嘌呤脫氧核糖核苷、更昔洛韋反油酸酯、噴昔洛韋、無環(huán)鳥苷、伐昔洛韋、(E)-5-(2-溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷、齊多夫定、2′-Exo-methanocarbathymidine。
13.權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述核酸序列被插入質(zhì)?；虿《緛碓吹闹亟M載體中。
14.權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述核酸序列被插入相同的重組載體中。
15.權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述核酸序列被插入不同的重組載體中。
16.包含編碼通透酶的基因和自殺基因的重組載體。
17.權(quán)利要求16的重組載體，其特征在于所述載體選自質(zhì)粒和病毒載體，其與一或多種提高所述載體的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)適當(dāng)?shù)亟M合在一起。
18.權(quán)利要求17的重組載體，其中所述提高所述載體的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)選自陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物、溶血磷脂和多肽。
19.權(quán)利要求17的重組載體，其中所述載體是衍生自痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、甲病毒、泡沫病毒或腺病毒相關(guān)病毒的病毒載體。
20.權(quán)利要求19的重組載體，其中所述載體衍生自修飾的痘苗病毒安卡拉株(MVA)。
21.權(quán)利要求20的重組載體，其中所述編碼通透酶的基因和所述自殺基因被插入MVA基因組中的天然存在的缺失體的位點(diǎn)，所述缺失體選自缺失體I、II、III、IV、V和VI。
22.權(quán)利要求22的重組載體，其中所述基因被插入天然存在的缺失體III的位點(diǎn)。
23.權(quán)利要求20的重組載體，其中所述載體是額外缺失全部或部分非必需的E3區(qū)的腺病毒載體。
24.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的試劑盒或權(quán)利要求16到23中任一項(xiàng)的重組載體。
25.權(quán)利要求24的藥物組合物在制備藥物中的應(yīng)用。
26.權(quán)利要求24的藥物組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含編碼通透酶的核酸序列和含有一個(gè)核堿基部分的藥物或其前體的試劑盒。本發(fā)明還涉及包含含有編碼通透酶的基因和包含自殺基因的核酸序列的藥物前體的試劑盒。本發(fā)明還涉及包含編碼通透酶的基因和自殺基因的載體。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101072792SQ200580037677
公開日2007年11月14日 申請日期2005年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月8日
發(fā)明者P·埃爾布 申請人:特蘭斯吉恩股份有限公司