天然氨基酸作為側(cè)基的陽離子功能聚合物、制備方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一類由天然氨基酸作為側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物、制備方法以及其用途。應(yīng)用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合反應(yīng)對Boc-氨基酸功能化丙烯酸酯類單體進行可控聚合，脫去Boc保護基團制備得到系列具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物。制備方法具有操作簡單方便、聚合物結(jié)構(gòu)規(guī)整、分子量分布窄、原料易得、成本低廉等優(yōu)點。該類具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物由天然氨基酸作為重要砌塊構(gòu)成，在多細胞系中以商業(yè)化的線性聚賴氨酸PLL（15-30K）和枝化聚乙烯亞胺bPEI-25K作為參照呈現(xiàn)很低的細胞毒性，作為陽離子基因載體材料在多細胞株中均呈現(xiàn)高效率的基因轉(zhuǎn)染，在低毒高效的陽離子聚合物基因載體應(yīng)用領(lǐng)域具有良好的前景。
【專利說明】天然氨基酸作為側(cè)基的陽離子功能聚合物、制備方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物功能材料 領(lǐng)域。具體涉及到通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)反應(yīng)制備系列天然氨基酸作為側(cè)基的陽離子功能聚合物的方法及其作為生物功能載體材料的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療是指將外源功能治療基因藥物通過合適的載體導(dǎo)入發(fā)生病變的細胞或組織中，通過細胞內(nèi)整合與功能表達，實現(xiàn)糾正或補償因基因缺陷、異常所引起的疾病，達到治療目的。隨著當(dāng)今分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人類基因組計劃的飛躍進展，人們研究了許多重要先天獲得性遺傳疾病的分子生物起源，發(fā)現(xiàn)可以通過缺陷基因的修復(fù)與表達，發(fā)展新型生物醫(yī)學(xué)治療手段。當(dāng)前圍繞基因治療相關(guān)分子生物學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的發(fā)展非常迅猛，如何將治療用核酸類功能分子(DNA、小分子RNA干擾RNA1、0DNA、Micro-RNA)輸送到目標(biāo)細胞內(nèi)進行安全有效的表達或功能實現(xiàn)是基因治療相關(guān)科學(xué)與技術(shù)中尚存在的關(guān)鍵問題之一。與早期的病毒載體相比，基于合成材料的非病毒載體具有低毒性、低免疫原性、分子及結(jié)構(gòu)設(shè)計具有較大的彈性的等顯著優(yōu)點，最近在生物醫(yī)用材料相關(guān)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用開拓倍受關(guān)注。目前常用的非病毒載體小分子脂質(zhì)體和功能陽離子聚合物，由于陽離子聚合物與小分子脂質(zhì)體相比，具有重要的協(xié)同效應(yīng)和穩(wěn)定基因/載體復(fù)合物微納米結(jié)構(gòu)，因此研究應(yīng)用較為廣泛，其中具有代表性的陽離子功能聚合物有聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺胺樹枝狀聚合物(PAMAM)、聚甲基丙烯酸N，N’ - 二甲氨基乙酯(PDMAEMA)等，它們的特點是含有大量的陽離子片段，能夠與攜帶陰離子的DNA或RNA生物大分子通過靜電物理相互作用高效結(jié)合，壓縮塌陷形成微納米尺度穩(wěn)定的膠體顆粒復(fù)合物，實現(xiàn)所負載輸送的基因免于細胞內(nèi)外核酸酶(如DNase、RNase等)的降解，進一步實現(xiàn)高效基因藥物的負載與輸送。然而，到目前為止研究的基因藥物的功能載體聚合物大多由非天然材料合成制備得到，存在生物相容性差、細胞毒性高等缺點，客觀上制約了其作為功能載體在臨床基因治療中的實際有效應(yīng)用。
[0003]為了克服合成高分子功能基因載體材料的既有不足，利用具有生物相容性的天然廣物構(gòu)筑新型生物功能載體，為進一步發(fā)展聞效低毒的基因功能載體提供了一條新的可能途徑。由天然氨基酸為出發(fā)原料砌塊合成制備得到的功能陽離子聚合物與其他合成聚合物相比，其作為輸送載體具有較高的體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染效率，同時具有良好的生物相容性和較低的細胞毒性，載體的最終降解產(chǎn)物可以通過既有的生物化學(xué)途徑代謝。近年來，樹枝狀大分子(如樹枝狀聚賴氨酸)在基因載體應(yīng)用方面研究較為廣泛，其大分子結(jié)構(gòu)規(guī)整，分子量分布窄，聞代數(shù)的樹枝狀陽尚子大分子(如五代以上的賴氨酸樹枝狀功能大分子)作為基因載體呈現(xiàn)良好的轉(zhuǎn)染效率，同時活細胞基因轉(zhuǎn)染的效率隨樹枝狀大分子代數(shù)的提高可進一步上升，但同時伴隨較為明顯的細胞毒性，限制了其實際應(yīng)用。與此同時，樹枝狀結(jié)構(gòu)的功能大分子一般需采用多次重復(fù)的官能團保護、偶聯(lián)、純化分離、官能團去保護反應(yīng)步驟制備得到，因此高代數(shù)的樹枝狀功能大分子客觀存在制備效率低、成本高，不宜大規(guī)模制備以及應(yīng)用。另一方面，由氨基酸芐酯環(huán)內(nèi)酸酐(NCA)功能單體的催化開環(huán)聚合反應(yīng)(J.Polym.Sc1.，Part A:Polym.Chem 2000 ；38:3011-3018)可以制備具有線性結(jié)構(gòu)的聚氨基酸陽離子功能大分子(如聚賴氨酸PLL、聚精氨酸、聚組氨酸等)，但上述開環(huán)聚合反應(yīng)需在無水無氧的苛刻條件下進行，一般情況下制備所得的聚合物產(chǎn)物的分子量分布較寬，大分子結(jié)構(gòu)規(guī)整度差。為了進一步發(fā)展基于天然氨基酸的樹枝狀大分子、線性高分子以外的簡便合成新方法，Sanda.F等曾采用自由基聚合方法合成了偶聯(lián)氨基酸側(cè)基結(jié)構(gòu)的功能大分子(Macromo1.Chem.Phys 1999 ；200:2651-2661),同時高超等人米用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法(ATRP)制備了偶聯(lián)有多種氨基酸側(cè)基的功能聚合物(Biomacromolecu Ies 2010 ；11:3609-3616)，但上述聚合方法未能實現(xiàn)由天然氨基酸構(gòu)建分子量單分散的新型陽離子功能聚合物，并且ATRP制備方法中使用的金屬催化劑很可能導(dǎo)致微量金屬離子殘留，不利于其作為生物功能材料的應(yīng)用。到目前為止國內(nèi)外尚沒有基于上述兩方法合成制備的由氨基酸衍生的具有氨基酸側(cè)基的功能大分子作為基因載體的研究報道。本發(fā)明致力發(fā)展一種基于氨基酸的新型功能陽離子聚合物的簡單高效并且結(jié)構(gòu)可控的制備新方法，并將其作為高效低毒的基因載體應(yīng)用于基因輸送。
[0004]發(fā)明的內(nèi)容
[0005]本發(fā)明的目的之一在于提供一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之三在于提供一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物作為基因功能載體的應(yīng)用。
[0008]根據(jù)本發(fā)明所提供的一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物，其由如下結(jié)構(gòu)式(I)表示:
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物，其由如下結(jié)構(gòu)式(I)表示:
Ri 4-^Hn 0^0.VMN'





，(I)
+H,N^Kiw+ 上式(I)中，R1 = H^CH3,r或^A_表示陰離子:氯離子、溴離子或三氟乙酸根離子；n為具有氨基酸側(cè)基的功能丙烯酸酯類聚合物的聚合度為5~500。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法，其特征是采用了以下合成步驟: (1)、Boc-氨基酸功能化丙烯酸酯類單體的合成制備: 首先將丙烯酸羥乙 酯或甲基丙烯酸羥乙酯、Boc保護的氨基酸、縮合劑和催化量的堿，在有機溶劑中和10-65°C溫度下反應(yīng)I~24小時得到Boc-氨基酸功能化的丙烯酸酯類單體，其通式如下式(II)所示，

O
ONHBoc






5? Il,) 其中，所述的丙烯酸羥乙酯或甲基丙烯酸羥乙酯、Boc保護的氨基酸、縮合劑和催化量的堿的摩爾比為1:1~8:1~24:0.I~0.5 ; 所述的縮合劑為N，N’- 二環(huán)己基碳二亞胺、N，N' - 二異丙基碳二亞胺、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、苯并三唑-1-三(三甲氨基)_三氟磷酸酯或苯并三氮唑-N, N, N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽； (2)、將步驟(1)所得的Boc-氨基酸功能化丙烯酸酯類單體、RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑、引發(fā)劑溶于有機溶劑中，在60-130°C溫度下聚合反應(yīng)10-40h得Boc-氨基酸功能化丙烯酸酯類聚合物，其結(jié)構(gòu)式如下式(IIII)所示:
3.如權(quán)利要求2所述的一種具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法，其特征是步驟(1)、(2)、(3)中`所述的R1 = H或CH3, 、H2U/NH+或Μμι + BocN^nR3=^=7 現(xiàn)//^NHB0C。
4.如權(quán)利要求2所述的一種具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法，其特征是步驟(1)中所述的堿為二乙胺、三乙胺、碳酸鈉、碳酸鉀、1，4_ 二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷、1，8_ 二氮雜環(huán)[5，4，0] 十一烯-7、吡唆、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。
5.如權(quán)利要求2所述的一種具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法，其特征是步驟(1)、(2)、(3)中，所述有機溶劑為二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、1，4_ 二氧六環(huán)、四氫呋喃、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮、苯或甲苯。
6.如權(quán)利要求2所述的一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法，其特征是步驟(1)的產(chǎn)物經(jīng)過過濾、濾液濃縮、柱層析分離、純化得到Boc-氨基酸功能化的丙烯酸酯類單體；其中柱層析純化過程使用的有機溶劑為石油醚、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、1，4_ 二氧六環(huán)、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、乙腈、丙酮、甲苯及其混合的溶劑體系。
7.如權(quán)利要求2所述的一種具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法，其特征是步驟(2)獲得的Boc-氨基酸功能化丙烯酸酯類聚合物的分子量為2千~40萬；分子量分布系數(shù)1.0~2.0，優(yōu)選1.0~1.5。
8.如權(quán)利要求2所述的一種具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法，其特征是步驟(3)中所述酸為鹽酸、氫溴酸或三氟乙酸。
9.如權(quán)利要求2所述的一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物的制備方法，其特征是步驟(1)中的反應(yīng)溫度為10_65°C ;所述合成步驟(2)中的反應(yīng)溫度為60-130°C ;所述合成步驟(3)中的反應(yīng)溫度為20-60°C。
10.一種如權(quán)利要求1所述的一種由天然氨基酸構(gòu)建的具有氨基酸側(cè)基的水溶性陽離子功能聚合物作為低毒、`高效的生物載體材料在基因藥物輸送中的應(yīng)用。
【文檔編號】C08F120/36GK103665222SQ201210359298
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月24日
【發(fā)明者】曹阿民, 孫景景, 羅挺, 盛瑞隆 申請人:中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所