專利名稱：一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法，屬于中藥多糖的結(jié)構(gòu)改造技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多糖廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物組織中，是由單糖聚合而成的天然高分子化 合物，是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外又一類重要的生物大分子，具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，特別是當(dāng)引入某些化學(xué)基團(tuán)時(shí)，使糖鏈的柔韌性和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引起多糖的生物學(xué)活性改變或使多糖產(chǎn)生新的活性。因此，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾是多糖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。多糖的化學(xué)修飾主要有硫酸化、磷酸化的、硒化等方法。由于硫酸化修飾能顯著提高多糖的抗病毒活性而倍受關(guān)注。常用硫酸化修飾方法有濃硫酸法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法、三氧化硫-吡啶法等。其中氯磺酸-吡啶法以其試劑易制備、反應(yīng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單、產(chǎn)物回收方便等優(yōu)點(diǎn)而最為常用。影響氯磺酸-吡啶法修飾的主要因素有氯磺酸-吡啶配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間。麥冬是傳統(tǒng)的滋陰類中藥，具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心的功效，主治心腹結(jié)氣、肺燥干咳、虛癆咳嗽、津傷口渴、心煩失眠、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘等病癥。研究表明，麥冬含有多種有效成分，包括留體皂苷、多糖、高異黃酮類、氨基酸等。麥冬多糖是主要有效成分之一，具有增強(qiáng)免疫、抗心肌缺血、降血糖、耐缺氧、抗過(guò)敏等作用，而麥冬多糖的抗病毒活性鮮見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)文獻(xiàn)和本研究室的前期工作證明，硫酸化修飾能夠顯著提高多糖的生物活性、尤其是抗病毒活性。本發(fā)明首次對(duì)麥冬多糖進(jìn)行硫酸化修飾，建立了麥冬多糖的硫酸化修飾方法，基于產(chǎn)物的抗病毒活性優(yōu)化了修飾條件，發(fā)現(xiàn)硫酸化修飾能顯著麥冬多糖的抗病毒活性。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明針對(duì)中藥多糖生物活性低的問(wèn)題，提供一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法，達(dá)到顯著提高麥冬多糖的抗病毒活性的目的。技術(shù)方案一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法，包括提取、純化麥冬多糖，用氯磺酸-吡啶法對(duì)麥冬多糖進(jìn)行硫酸化修飾，其特征在于，基于產(chǎn)物的抗病毒活性確定的最佳修飾條件為氯磺酸與吡啶的質(zhì)量比I : 4，反應(yīng)溫度60°C，反應(yīng)時(shí)間2h ;并篩選出一種活性最好的硫酸化麥冬多糖產(chǎn)品。有益效果I.建立了麥冬多糖的硫酸化修飾方法，以產(chǎn)物的的抗病毒活性為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了麥冬多糖的硫酸化修飾條件。
2.證明硫酸化修飾能夠顯著提高麥冬多糖的抗病毒活性，并篩選出一種抗病毒活性最好的硫酸化麥冬多糖，為研制抗病毒制劑提供材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下I.麥冬多糖的硫酸化修飾國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道,本發(fā)明提供了一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法及其優(yōu)化的修飾條件，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外研究的空白。2.麥冬多糖的抗病毒活性未見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施，證明天然麥冬多糖的抗病毒作用微弱，通過(guò)硫酸化修飾能夠顯著提高其抗病毒活性，并篩選出一種活性最好的硫酸化麥冬多糖，可以作為新型抗病毒藥物的材 料。
具體實(shí)施例方式I.麥冬多糖的提取取麥冬飲片lOOOg，粉碎成0. 3 Icm3小塊，加95%乙醇2000mL浸泡12h，80°C水浴回流2次，每次I. 5h，藥渣晾12h后加9倍量水煎煮3次，時(shí)間依次為90、60、60min，合并濾液，濃縮至1000mL，2500rpm離心20min，上清液加入95%乙醇使醇含量達(dá)80%，4°C靜置24h，回收乙醇，離心，沉淀凍干燥，得到粗的麥冬多糖。2.麥冬多糖的純化將粗麥冬多糖用三氯乙酸法去蛋白，用蒸餾水溶解成50mg mL—1，上DEAE-纖維素-52 (2. 5cmX 30cm)層析柱,用蒸懼水洗脫,流速ImL^mirT1,自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，每管5mL，用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖，繪制洗脫曲線(得到I個(gè)峰)。合并含糖管洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到純化的麥冬多糖(0PS)。3.麥冬多糖的硫酸化修飾(I)修飾條件優(yōu)化由于試劑配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間是影響多糖硫酸酯化的主要因素，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氯磺酸與吡啶的體積比(A)、反應(yīng)溫度(B)和反應(yīng)時(shí)間(C)為因素，按3因素3水平的L9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9種修飾條件(表I)。表IL9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表
因素
水平---------
AB (°C)C (h)
1I 460I
2I 6802
3I 8953(2)酯化試劑制備將帶有攪拌和冷凝裝置的三頸燒瓶置冰鹽水浴中，按表I設(shè)定的試劑配比加入預(yù)冷的無(wú)水吡啶25mL，快速攪拌，充分冷卻后，逐滴加入氯磺酸，于40min內(nèi)加完，見(jiàn)燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體時(shí)停止反應(yīng)。共制備9種酯化試劑。(3)修飾操作取麥冬多糖(OPS) 3. 6g平均分成9份，分別混懸于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)后，加入到酯化試劑中，按表I設(shè)定的反應(yīng)溫度和時(shí)間在水浴中振蕩反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后加入IOOmL冰水終止反應(yīng),冷卻至室溫,用飽和氫氧化鈉溶液中和pH至7 8,邊攪拌邊緩慢加入3倍體積的無(wú)水乙醇，靜置24h，離心，取沉淀用自來(lái)水透析2d、蒸餾水透析Id,透析液冷凍干燥,分別得到9個(gè)硫酸化麥冬多糖(sulfated OPSs, sOPSs),依次標(biāo)記為SOPS1 sOPS9。用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，氯化鋇-明膠法測(cè)定硫酸根含量，按下式計(jì)算取代度(DS) DS = (I. 62XS% )/(32-1. 02XS% )正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，SOPS2的產(chǎn)物量最高，為874mg，其次是sOPS5、SOPS1和sOPS3 ；SOPS2的取代度最高，為I. 62%，其次是sOPS5、SOPS1, sOPS8和sOPS3 ；sOPS4的糖含量最高，% 50. 3%,其次是 SOPS1、SOPS3 和 SOPS7(表 2)。表2L9 (34)正交試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種麥冬多糖的硫酸化修飾方法，包括提取、純化麥冬多糖，用氯磺酸-吡啶法對(duì)麥冬多糖進(jìn)行硫酸化修飾，其特征在于，修飾條件為氯磺酸與吡啶的質(zhì)量比I : 4，反應(yīng)溫度60°C，反應(yīng)時(shí)間2h。
2.權(quán)利要求I所述方法獲得的硫酸化麥冬多糖的抗病毒活性最強(qiáng)，較未修飾的麥冬多糖的活性顯著提高。
全文摘要
本發(fā)明為一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法，屬于中藥多糖的結(jié)構(gòu)改造技術(shù)領(lǐng)域。提取、純化麥冬多糖，用氯磺酸-吡啶法進(jìn)行硫酸化修飾，以產(chǎn)物的抗病毒活性為指標(biāo)，用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)試劑配比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間3因素進(jìn)行優(yōu)選，確定最佳修飾條件為氯磺酸與吡啶的質(zhì)量比1∶4，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間2h，所得硫酸化麥冬多糖的抗病毒活性最強(qiáng)。本發(fā)明能顯著提高麥冬多糖的抗病毒活性。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102718883SQ20121022604
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者劉家國(guó), 張靖, 王德云, 胡元亮, 陳興潁, 陳曉蘭 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)