專利名稱：靶向腫瘤多功能聚蘋果酸載體藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向腫瘤多功能聚蘋果酸載體藥物。
背景技術(shù)：
化學(xué)藥物治療是惡性腫瘤綜合治療的主要手段之一?？鼓[瘤藥物通常有極高的生物毒性而較少有生物選擇性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，亦殺傷正常組織細(xì)胞。由于非特異毒性、缺乏腫瘤選擇性以及腫瘤的多藥耐藥性，大多數(shù)抗腫瘤藥物并不像預(yù)期那樣有效，其對(duì)正常組織的毒副作用更是困擾化療的主要問題。具有生物相容性和生物可降解性的高分子材料作為小分子藥物的載體可在病灶部位選擇性地釋放藥物，能極大地提高藥物的生物利用率，有效地降低藥物的毒副作用和用藥劑量；將靶向分子引入聚合物，還可將藥物主動(dòng)靶向至病變部位。目前制備聚合物前藥中應(yīng)用較多的高分子材料有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚谷氨酸等。聚乳酸、聚乙醇酸不溶于水，交聯(lián)的藥物分子在體內(nèi)釋放很慢，影響藥效，而聚谷氨酸等吸水性又太強(qiáng)，容易崩解，所以都不能作為最佳藥物載體的選擇。聚蘋果酸(Polymalic acid, PMLA)是以蘋果酸為唯一單體相互通過酯鍵連接而成的一種脂肪族聚酯。其在生理?xiàng)l件下的相對(duì)高溶解性、高自發(fā)降解速率和免疫惰性使得它成為優(yōu)于多糖和多肽類生物高分子的新型藥物控釋載體材料。3 -聚蘋果酸結(jié)構(gòu)規(guī)整，具有多個(gè)活性中心，可共價(jià)連接多個(gè)具有生物學(xué)功能的基團(tuán)，如同時(shí)攜帶多種藥物、多重靶向分子及熒光示蹤劑等形成納米共聚物，是抗腫瘤藥物的高效載體。迄今為止，以Vert、Cammas和Kajiyaina等為代表的國(guó)外學(xué)者已對(duì)聚蘋果酸的合成、性能和應(yīng)用做了較深入的研究；用其做載體制備的腦靶向聚合物前藥，不但具有良好的生物相容性及降解性,且改善了藥物性質(zhì)。盡管很多藥物運(yùn)載系統(tǒng)表現(xiàn)出了相當(dāng)好的腫瘤靶向性，通過抗原-抗體、受體-配體之間特異性結(jié)合將藥物主動(dòng)靶向至腫瘤細(xì)胞表面，但腫瘤通常呈現(xiàn)多樣細(xì)胞群，細(xì)胞表面有不同受體或抗原表達(dá)，且與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)的“癌癥干細(xì)胞”具有不同于其他腫瘤細(xì)胞的顯型。因此，通常為特定抗原或受體設(shè)計(jì)的主動(dòng)靶向方法對(duì)于殺傷癌細(xì)胞并非一定有效。且通常載體與靶細(xì)胞結(jié)合后入胞能力較弱，并不能提供足夠高的胞內(nèi)藥物濃度，而細(xì)胞毒性藥物必須進(jìn)入細(xì)胞才能發(fā)揮作用，因而無法有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，特別是耐藥腫瘤細(xì)胞；且載體在胞外釋放的藥物擴(kuò)散后有可能重新分布到正常組織，降低靶向藥物的特異性。因此，生物活性分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)仍是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的一個(gè)關(guān)鍵問題。細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的短肽，其穿膜作用不依賴經(jīng)典的胞吞作用，具有細(xì)胞膜親和性高、穿膜速度快、可迅速被降解等優(yōu)勢(shì)，尤以TAT (transcriptional activator protein)穿膜肽研究最為成熟。通過無受體介導(dǎo)、無耗能的方式，穿膜肽可將肽段、蛋白質(zhì)、甚至比自身分子量大很多倍的寡聚核苷酸、脂質(zhì)體帶入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)率幾乎能達(dá)到100%。但穿膜肽用于體內(nèi)遞藥系統(tǒng)研究時(shí)療效并不理想，存在的主要問題是CPP缺乏靶特異性，對(duì)所有的細(xì)胞具有相同的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；非靶向組織通過CPP介導(dǎo)，也可通過非特異性的細(xì)胞內(nèi)化作用攝取嵌合體。、
Sethuraman等以pH敏感的聚合物和細(xì)胞穿膜肽TAT為基礎(chǔ)構(gòu)建了一種多功能聚合物膠束系統(tǒng)，該系統(tǒng)由兩部分組成一部分是TAT為靶頭的膠束，聚乳酸(PLLA)構(gòu)成疏水內(nèi)核，TAT連接于親水嵌段聚乙二醇(PEG)的末端；另一部分為pH敏感的二嵌段共聚物聚磺胺間二甲氧嘧啶-聚乙二醇(PSD-PEG)。在生理?xiàng)l件下，帶負(fù)電的PSD與帶正電的TAT相結(jié)合，PSD-PEG覆蓋于TAT膠束的外面，將靶頭TAT隱藏，在腫瘤部位的pH環(huán)境下，PSD-PEG與TAT膠束分離而將靶頭暴露出來。與之類似，Lee等制備的多功能混合膠束，在生理環(huán)境下(pH7.4)，TAT通過pH敏感的聚組氨酸(polyHis)錨定在疏水內(nèi)核上。當(dāng)膠束暴露在腫瘤或者炎癥部位時(shí)(6. 5<pH<7. 0)，polyHis 一定程度被質(zhì)子化，親水性增加，TAT暴露出來并介導(dǎo)內(nèi)吞。但受膠束穩(wěn)定性的限制，穿膜肽在到達(dá)靶位前能否被安全保護(hù)，仍面臨著挑戰(zhàn)。因此，如何構(gòu)建兼有腫瘤靶向特異性及高效入胞釋藥特性雙重功能的靶向釋藥體系是提高腫瘤靶向制劑療效的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種兼有腫瘤靶向特異性及高效入胞釋藥特性的多功能聚蘋果酸載體藥物。 本發(fā)明另一目的是提供上述聚蘋果酸載體藥物的制備方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下
一種聚蘋果酸載體藥物，是將藥物固定在聚蘋果酸載體上，其特征在于
(1)所述藥物為含有氨基或可引入氨基的抗腫瘤藥物及其衍生物；
(2)聚蘋果酸載體上連接有穿膜肽；
(3)靶向基團(tuán)Ligand或柔性鏈修飾的靶向基團(tuán)通過易斷裂鍵(如腙鍵)連接在聚蘋果酸載體上。所述柔性鏈可以為聚乙二醇連接，分子量為3000 7000。所述的聚蘋果酸的分子量為1000 200，000。所述抗腫瘤藥物或其衍生物為阿霉素(D0X)、氨基喜樹堿(CPT_NH2)、阿扎胞苷或克拉曲濱。所述穿膜肽CPP通過柔性短鏈修飾或直接連接到聚蘋果酸載體上，所述柔性短鏈為聚乙二醇連接，分子量為500 3000，其還包括具有穿過細(xì)胞核、細(xì)胞膜功能的短肽，如核定位信號(hào)肽(NLS)等。所述靶向基團(tuán)為具有腫瘤細(xì)胞靶向作用的物質(zhì)，包括所有實(shí)體瘤組織表面有其對(duì)應(yīng)的相對(duì)高表達(dá)的受體的配體，種類為維生素、蛋白、肽類、多糖、整合素等，如葉酸(FA)、促黃體激素釋放激素(LHRH)、生物素(biotin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白、甘草次酸、凝集素、抗腫瘤融合蛋白、單克隆抗體或人工合成配體(如Angiopep-2)。上述聚蘋果酸載體藥物的制備方法，包括以下步驟
(1)在I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC_HC1)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和三乙胺(TEA)的催化下，聚蘋果酸(PMLA)與水合肼反應(yīng)制備得到PMLA-NH2，其中聚蘋果酸中含有的羧基和水合肼的摩爾比在l(Tl之間；
(2)選用含有醛基的聚乙二醇和靶向基團(tuán)Ligand反應(yīng)制備得到靶向基團(tuán)修飾化的聚乙二醇OHC-PEG-Ligand，選用的含有醛基的聚乙二醇的分子量在3500 7000，其中Ligand與醛基聚乙二醇的反應(yīng)摩爾比在0. rio之間；
(3)將PMLA-NH2與OHC-PEG-Ligand溶解到DMF溶劑中，室溫下發(fā)生反應(yīng)得到PMLA-Hz-PEG-Ligand，形成所需的腙鍵間隔基，其中PMLA-NH2中氨基與OHC-PEG-Ligand的反應(yīng)摩爾比在0. 5^1 ；
(4)PMLA-Hz-PEG-Ligand和穿膜肽 TAT 或 TAT-PEG 反應(yīng)得到 TAT-PMLA-Hz-PEG-Ligand或 TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand，其中短鏈 PEG 的分子量 500 3000 ；
(5)在I-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC_HC1)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和三乙胺(TEA)的催化下，將TAT- PMLA-Hz-PEG-Ligand或TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand和含有氨基的抗腫瘤藥物或其衍生物反應(yīng)制備得到聚蘋果酸載體藥物 TAT- PMLA (drug)-Hz-PEG-Ligand 或 TAT-PEG-PMLA (drug)-Hz-PEG-Ligand0
PMLA-Hz-PEG6-FA 的合成路線如下·
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P 關(guān) L歲
權(quán)利要求
1.一種聚蘋果酸載體藥物，是將藥物固定在聚蘋果酸載體上，其特征在于 (1)所述藥物為含有氨基或可引入氨基的抗腫瘤藥物及其衍生物； (2)聚蘋果酸載體上連接有穿膜肽； (3)靶向基團(tuán)或柔性鏈修飾的靶向基團(tuán)通過易斷裂鍵連接在聚蘋果酸載體上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚蘋果酸載體藥物，其特征在于所述抗腫瘤藥物或其衍生物為阿霉素、氨基喜樹堿、阿扎胞苷或克拉曲濱。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚蘋果酸載體藥物，其特征在于所述穿膜肽CPP通過柔性短鏈修飾或直接連接到聚蘋果酸載體上，所述柔性短鏈為聚乙二醇連接，分子量為500 3000。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚蘋果酸載體藥物，其特征在于所述的聚蘋果酸的分子量為 1000 200，000。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚蘋果酸載體藥物，其特征在于所述柔性鏈為聚乙二醇連接，分子量為3000 7000。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的聚蘋果酸載體藥物，其特征在于所述穿膜肽還包括具有穿過細(xì)胞核、細(xì)胞膜功能的核定位信號(hào)肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚蘋果酸載體藥物，其特征在于所述靶向基團(tuán)為具有腫瘤細(xì)胞靶向作用的物質(zhì)，包括所有實(shí)體瘤組織表面有其對(duì)應(yīng)的相對(duì)高表達(dá)的受體的配體，種類為維生素、蛋白、肽類、多糖或整合素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚蘋果酸載體藥物，其特征在于所述靶向基團(tuán)為葉酸、促黃體激素釋放激素、生物素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白、甘草次酸、凝集素、抗腫瘤融合蛋白、單克隆抗體或人工合成配體。
9.權(quán)利要求I所述聚蘋果酸載體藥物的制備方法，包括以下步驟 (1)在I-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基丁二酰亞胺和三乙胺的催化下，聚蘋果酸PMLA與水合肼反應(yīng)制備得到PMLA-NH2，其中聚蘋果酸中含有的羧基和水合肼的摩爾比在l(Tl之間； (2)選用含有醛基的聚乙二醇和靶向基團(tuán)Ligand反應(yīng)制備得到靶向基團(tuán)修飾化的聚乙二醇OHC-PEG-Ligand，選用的含有醛基的聚乙二醇的分子量在3500 7000，其中Ligand與醛基聚乙二醇的反應(yīng)摩爾比在0. rio之間； (3)將PMLA-NH2與OHC-PEG-Ligand溶解到DMF溶劑中，室溫下發(fā)生反應(yīng)得到PMLA-Hz-PEG-Ligand，形成所需的腙鍵間隔基，其中PMLA-NH2中氨基與OHC-PEG-Ligand的反應(yīng)摩爾比在0. 5^1 ； (4)PMLA-Hz-PEG-Ligand和穿膜肽 TAT 或 TAT-PEG 反應(yīng)得到 TAT-PMLA-Hz-PEG-Ligand或 TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand，其中短鏈 PEG 的分子量 500 3000 ； (5)在I-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基丁二酰亞胺和三乙胺的催化下，將 TAT- PMLA-Hz-PEG-Ligand 或 TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand 和含有氨基的抗腫瘤藥物或其衍生物反應(yīng)制備得到聚蘋果酸載體藥物。
10.權(quán)利要求I所述的聚蘋果酸載體藥物在制備兼具腫瘤靶向特異性及高效入胞釋藥特性藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚蘋果酸載體藥物，是將藥物固定在聚蘋果酸載體上，所述藥物為含有氨基或可引入氨基的抗腫瘤藥物及其衍生物，聚蘋果酸載體上連接有穿膜肽，靶向基團(tuán)Ligand或柔性鏈修飾的靶向基團(tuán)通過易斷裂鍵連接在聚蘋果酸載體上。本發(fā)明充分利用聚蘋果酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將不同生物特性的活性分子依次連接在聚蘋果酸上，通過屏蔽-去屏蔽效應(yīng)，構(gòu)建了兼有腫瘤靶向、高效入胞釋藥特性的聚合物藥物體系。該體系通過配體-受體、抗體-抗原特異性的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向腫瘤部位的功能。
文檔編號(hào)C08G81/00GK102716495SQ20121020509
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者喬友備, 吳紅, 李偉, 李飛, 范黎, 陶陽春 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)