本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生嵌合病毒蛋白質(zhì)。更具體地，本發(fā)明還涉及在植物中產(chǎn)生包含嵌合病毒蛋白質(zhì)的病毒樣顆粒。

背景技術(shù)：
疫苗接種(vaccination)通過(guò)誘導(dǎo)對(duì)象在感染前進(jìn)行防御而提供對(duì)抗由類似病原體(agent)所導(dǎo)致之疾病的保護(hù)。常規(guī)地，這通過(guò)使用感染性病原體(infectiousagent)(如免疫原)的活的減毒形式或完整的滅活形式來(lái)完成。為了避免使用完整的病毒(例如死病毒或減毒病毒)作為疫苗的危險(xiǎn)，將重組病毒蛋白質(zhì)(例如亞單位)用作疫苗。肽疫苗和亞單位疫苗均受到許多潛在的局限。亞單位疫苗可展現(xiàn)出較差的免疫原性(由于不正確折疊)、較差的抗原呈遞或者糖類和脂質(zhì)組成的差異。主要的問(wèn)題是很難確保經(jīng)改造蛋白質(zhì)的構(gòu)象模仿該抗原在其自然環(huán)境中的構(gòu)象。必須使用合適的佐劑和(在肽的情況中)載體蛋白以加強(qiáng)免疫應(yīng)答。另外，這些疫苗主要引起體液應(yīng)答，因此可能無(wú)法引發(fā)有效的免疫。亞單位疫苗對(duì)于疾病常常是無(wú)效的，但可證明完整的滅活病毒提供對(duì)所述疾病的保護(hù)。病毒樣顆粒(virus-likeparticle，VLP)對(duì)于免疫原性組合物的內(nèi)含物而言是潛在的候選物。VLP與成熟的病毒體非常類似，但是它們不含有病毒基因組物質(zhì)。因此，VLP本身是非復(fù)制性的，這使得它們作為疫苗施用是安全的。另外，可將VLP改造以在VLP的表面上表達(dá)病毒糖蛋白，這是它們最天然的生理構(gòu)型。此外，由于VLP類似完整的病毒體并且是多價(jià)的微粒結(jié)構(gòu)，所以VLP在誘導(dǎo)針對(duì)糖蛋白的中和抗體中可比可溶性包膜蛋白抗原更有效。已在用于疫苗目的的昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中產(chǎn)生了超過(guò)三十種不同病毒的VLP(Noad，R.和Roy，P.，2003，TrendsMicrobiol11：438-44)。數(shù)項(xiàng)研究已證明，重組流感蛋白質(zhì)在使用哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒或桿狀病毒載體的細(xì)胞培養(yǎng)物中自裝配成VLP(例如Gomez-Puertas等，1999，J.Gen.Virol，80，1635-1645；Neumann等，2000，J.Virol.，74，547-551；Latham和Galarza，2001，J.Virol.，75，6154-6165)。Gomez-Puertas等(1999，J.Gen.Virol.，80，1635-1645)證明，流感VLP的高效形成取決于病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。Neumann等(2000，J.Virol.，74，547-551)建立了基于哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒的系統(tǒng)，其用于完全從克隆的cDNA產(chǎn)生感染性流感病毒樣顆粒。Latham和Galarza(2001，J.Virol.，75，6154-6165)報(bào)道了在用共表達(dá)HA、NA、M1和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中形成流感VLP。該研究證明，流感病毒體蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中共表達(dá)后進(jìn)行自裝配，并且證明M1基質(zhì)蛋白對(duì)于VLP的產(chǎn)生是必需的。在數(shù)種表達(dá)系統(tǒng)(包括桿狀病毒、牛痘病毒、果蠅(DS-2)細(xì)胞、Vero細(xì)胞和酵母球芽(yeastspheroblast))中，Pr55gag從人類免疫缺陷病毒(HIV)的表達(dá)導(dǎo)致了在形態(tài)上類似于不成熟HIV病毒體的病毒樣顆粒(VLP)的裝配和釋放(由Deml等，2005，MolecularImmunology42：259-277綜述)。HIV包膜蛋白gp160可并入Gag來(lái)源的VLP。然而，盡管Pr55gag的高表達(dá)，但是僅合并了有限數(shù)目的包膜蛋白。Wang等示出，將HIV包膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(cytosolictail)結(jié)構(gòu)域(TM/CT)用另一病毒包膜蛋白(包括流感血凝素)的那些替換導(dǎo)致了提高包膜蛋白并入到Pr55gag來(lái)源的VLP中(JournalofVirology，2007，81：10869-10878)。還示出，當(dāng)在使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲(chóng)細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，包含HATM/CT的嵌合HIV包膜蛋白并入到流感M1來(lái)源的VLP中(WO2008/005777)。流感病毒穿入細(xì)胞取決于HA依賴性受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。流感病毒感染周期是從病毒體表面HA蛋白與含有唾液酸的細(xì)胞受體(糖蛋白和糖脂)結(jié)合開(kāi)始的。神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)蛋白介導(dǎo)對(duì)唾液酸受體的處理。在含有流感病毒體的內(nèi)化內(nèi)體(internalizedendosome)的酸性界限內(nèi)，HA蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，這導(dǎo)致病毒與細(xì)胞膜融合，病毒脫殼以及M2介導(dǎo)的從核衣殼相關(guān)核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)釋放M1蛋白，M1蛋白遷移到細(xì)胞核中用于病毒RNA合成。Latham和Galarza，200，J.Virol.75，6154-6165)報(bào)道了在用共表達(dá)HA、NA、M1和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中形成流感VLP。另外，Gomez-Puertas等，2000，JVirol.74，11538-11547)教導(dǎo)，除了血凝素(HA)以外，流感病毒的基質(zhì)蛋白(M1)對(duì)于VLP從昆蟲(chóng)細(xì)胞出芽也是必需的。然而，Chen等(2007，J.Virol.81，7111-7123)教導(dǎo)了M1可能不是VLP形成所必需的。大多數(shù)經(jīng)表征的出芽機(jī)制使用宿主的空泡蛋白分選(vacuolarproteinsorting，VPS)途徑(參見(jiàn)Chen和Lamb，Virology372，2008)。已經(jīng)顯示了許多包膜病毒與VPS途徑的蛋白質(zhì)相互作用，這需要運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合物(endosomalsortingcomplexrequiredfortransport，ESCRT)蛋白復(fù)合物的作用(參見(jiàn)Chen和Lamb2008的表I)。在病毒的核心和基質(zhì)蛋白上發(fā)現(xiàn)了與VPS途徑的蛋白質(zhì)相互作用的后期蛋白結(jié)構(gòu)域(lateproteindomain)，因此VPS依賴性出芽需要存在基質(zhì)或核心蛋白。流感HA的胞質(zhì)尾區(qū)的棕櫚酰化對(duì)于出芽是必需的，但是機(jī)制仍不清楚，可能涉及其他表面蛋白結(jié)構(gòu)域的參與。出芽的最低要求仍尚未知曉，不能排除胞外域參與該過(guò)程。另外，植物中的VPS途徑尚不清楚(參見(jiàn)SchellmannS.，和PimplP.，CurrentOpPlantBiol12：670-676，200)。已知流感的出芽不依賴于VPS途徑。流感病毒的出芽涉及Rab11途徑(Bruce等，J.Virol84：5848-5859，2010)。Rab蛋白是位于細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸小泡(transportvesicle)之表面的GTP酶錨(GTPaseanchor)，并且它們參與從供體區(qū)室(donorcompartment)形成小泡、運(yùn)輸、?？?docking)對(duì)接和與接受體區(qū)室(acceptorcompartment)融合(Vazquez-Martinez和MalagonFrontiers，Endocrinology2：1-9，2011)。在植物中已經(jīng)鑒別了Rab11途徑的組分。然而，植物的運(yùn)輸組分已經(jīng)進(jìn)化，導(dǎo)致植物內(nèi)膜系統(tǒng)的數(shù)個(gè)特定特性(包括例如大且?；囊号?，高爾基體堆疊的快速移動(dòng)和內(nèi)體區(qū)室的獨(dú)特組織)和擴(kuò)大數(shù)量的RabGTP酶(RojoE.，和DenekeJ.，PlantPhys147：1493-1503，2008)。流感顆粒或病毒出芽取決于Rab11(Bruce等，J.Virol84：5848-5859，2010)，但是尚未鑒別出與Rab11或Rab11相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。然而，還不知道可能對(duì)于出芽過(guò)程和VLP產(chǎn)生所必需的HA的最小結(jié)構(gòu)域。在植物中，如果在葉綠體中對(duì)積累沒(méi)有進(jìn)行改造，那么HIVPr55gag以極其低的水平積累(Meyers等，2008，BMCBiotechnology8：53；Scotti等，2010，Planta229：1109-1122)。然而，在葉綠體中的積累與合并正確折疊的HIV包膜蛋白不相符，因?yàn)楹笳叩某墒旌驼郫B需要分泌途徑特異性的翻譯后修飾。Rybicki等(2010，PlantBiotechnologyJournal8：620-637)指出“...似乎沒(méi)有人在植物中以合理的產(chǎn)量成功地表達(dá)完整的HIVEnvgp160蛋白或甚至是所述蛋白的大部分...”。狂犬病病毒(rabiesvirus，RV)是彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的成員。像該科的大部分成員一樣，RV為不分節(jié)負(fù)鏈RNA病毒(non-segmented，negativestrandedRNAvirus)，其基因組編碼五種病毒蛋白質(zhì)：RNA依賴性RNA聚合酶(L)；核蛋白(N)；磷酸化蛋白質(zhì)(P)；位于病毒蛋白質(zhì)包膜內(nèi)側(cè)的基質(zhì)蛋白(M)；以及外表面糖蛋白(G)。DietzscholdB等(1991)，Crit.Rev.Immunol.10：427-439。用于狂犬病的基于細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗局限于在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的滅活病毒菌株。這些疫苗包含培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒。當(dāng)前生物技術(shù)方法針對(duì)表達(dá)狂犬病病毒的外殼蛋白基因以開(kāi)發(fā)可用作活性疫苗的安全重組蛋白質(zhì)。已經(jīng)顯示在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白(Burger等，1991)。獲得了與從病毒感染細(xì)胞分離的與G蛋白共遷移的67K的全長(zhǎng)糖基化蛋白質(zhì)。WO/1993/001833教導(dǎo)了在含有RNA基因組的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生病毒樣顆粒(VLP)，該基因組包含由狂犬病M蛋白和狂犬病M1蛋白的鞘包圍的3′結(jié)構(gòu)域和填充結(jié)構(gòu)域(fillerdomain)。VLP還包含狂犬病G蛋白的脂質(zhì)包膜。水痘帶狀皰疹病毒(VaricellaZostervirus，VZV)(還稱為人皰疹病毒3(HHV-3))是病毒的皰疹病毒科(Herpesviridae)的α皰疹病毒亞科(alphaherpesvirus)的成員。先前已經(jīng)從不同皰疹病毒科成員產(chǎn)生了表達(dá)糖蛋白或殼皮蛋白(tegumentprotein)的VLP。從用1型單純性皰疹病毒(HSV-1)、馬皰疹病毒(EHV-1)或假狂犬病病毒感染的細(xì)胞獲得了包含包膜的殼皮蛋白的輕顆粒(L-顆粒)(McLauchlan和Rixon(1992)J.Gen.Virol.73：269-276；美國(guó)專利No.5,384,122)。可從用存在病毒DNA復(fù)制抑制子的HSV-1感染的細(xì)胞產(chǎn)生不同類型的VLP，稱為前病毒DNA復(fù)制包膜顆粒(pre-viralDNAreplicationenvelopedparticle，PREP)。PREP在結(jié)構(gòu)上與L-顆粒類似，但是含有不同的蛋白質(zhì)組成(Dargan等(1995)J.Virol.69：4924-4932；美國(guó)專利No.5,994,116)。通過(guò)使用由酵母Ty逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼的蛋白質(zhì)p1的技術(shù)產(chǎn)生了從VZV表達(dá)gE蛋白片段的雜合VLP(Garcia-Valcarcel等(1997)Vaccine15：709-719；Welsh等(1999)J.Med.Virol.59：78-83；美國(guó)專利No.6,060,064)。US2011/0008838描述了嵌合VLP，其包含至少一種VZV蛋白質(zhì)，但是不包含酵母Ty蛋白。所述嵌合VLP包含病毒核心蛋白(例如流感M1或新城疫蛋白M)以及至少一種水痘帶狀皰疹病毒(VZV)蛋白質(zhì)。2003年新進(jìn)化的冠狀病毒(coronavirus，CoV)的傳播引起了嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)大流行的全球性威脅(Kuiken，T.等，2003，Lancet362：263-270)。正如其他冠狀病毒，采用典型的外圍投影(peripheralprojection)，SARS-CoV具有包膜顆粒的形態(tài)，稱為“冠狀物(corona)”或“刺突(spike)”，其圍繞病毒核心的表面(Ksiazek，T.G.等，2003，NEnglJMed348：1953-1966；Lin，Y.等，2004，AntivirTher9：287-289)。冠狀病毒顆粒核心的外部是一層脂質(zhì)包膜，其主要含有三種膜蛋白，最豐富的M(膜)蛋白、小的E(包膜)蛋白和S(刺突)蛋白。S蛋白的同三聚體共同地形成上述冠狀物，其參與病毒與宿主受體結(jié)合、用于病毒進(jìn)入的膜融合、細(xì)胞至細(xì)胞傳播和冠狀病毒的組織嗜性(tissuetropism)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)用于產(chǎn)生SARS病毒VLP(Ho，Y.等，2004，BiochemBiophysResCommun318：833-838；Mortola，E.和Roy，P.，2004，F(xiàn)EBSLett576：174-178)。然而，由于昆蟲(chóng)細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞之間的固有差異，在昆蟲(chóng)細(xì)胞(SF9)中裝配的VLP在直徑上展現(xiàn)出110nm大小，這比真正的SARS-CoV病毒體的78nm大得多(Lin，Y.等，2004，supra，和Ho，Y.等，2004，supra)。另外，基于昆蟲(chóng)細(xì)胞之SARS-VLP的免疫原性尚未被研究。另一些研究人員還嘗試將哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)用于產(chǎn)生SARSVLP(Huang，Y.等，2004，JVirol78：12557-65)。然而，VLP的細(xì)胞外釋放并不高效并且VLP的產(chǎn)量不令人滿意。例如，WO/2005/035556描述了在哺乳動(dòng)物中制備包含表達(dá)SARS-CoVE-蛋白、SARS-CoVM-蛋白和SARS-CoVS-蛋白的一種或更多種重組載體的SARS-CoV-病毒樣顆粒(SARS-CoV-VLP)的系統(tǒng)。在任何系統(tǒng)中，VLP的形成對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)提出了相當(dāng)大的要求——改變蛋白質(zhì)序列的伸展對(duì)多肽本身的表達(dá)可不具有很大的影響，但是結(jié)構(gòu)研究缺乏證明這種改變對(duì)形成VLP之作用的結(jié)構(gòu)研究。蛋白質(zhì)的多個(gè)區(qū)域和結(jié)構(gòu)的合作隨著病毒一起進(jìn)化并且在不喪失VLP形成下可能不可修正類似的改變。為了改進(jìn)作為候選疫苗的VLP，除了昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞之外，需要開(kāi)發(fā)其他表達(dá)系統(tǒng)。因此，需要評(píng)估植物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)VLP的能力。特別是需要鑒別將裝配成VLP之病毒蛋白質(zhì)的最小數(shù)目并且需要評(píng)價(jià)這些VLP的形態(tài)和免疫原性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生嵌合病毒蛋白質(zhì)。更具體地，本發(fā)明還涉及在植物中產(chǎn)生包含嵌合病毒蛋白質(zhì)的病毒樣顆粒。本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括，a)將包含調(diào)節(jié)區(qū)的核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，所述調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與嵌合核苷酸序列可操作地相連接，所述嵌合核苷酸序列串聯(lián)地編碼與流感跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)相融合的來(lái)自病毒三聚體表面蛋白或其片段的胞外域，所述胞外域來(lái)自非流感病毒三聚體表面蛋白并且相對(duì)于所述流感跨膜結(jié)構(gòu)域和所述胞質(zhì)尾區(qū)是異源的，以及b)在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或所述植物部分，從而產(chǎn)生所述VLP。如上所述的方法還包括收獲所述植物并純化所述VLP的步驟(c)。另外，所述VLP可不含有病毒基質(zhì)或核心蛋白。本發(fā)明提供了上述方法，其中來(lái)自所述病毒三聚體表面蛋白或其片段的所述胞外域可源自逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、皰疹病毒科(Herpesviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)或絲狀病毒科(Filoviridae)的病毒。來(lái)自所述病毒三聚體表面蛋白的所述胞外域可源自例如，慢病毒屬(Lentivirus)、狂犬病病毒屬(Lyssavirus)、水痘病毒屬(Varicellovirus)、冠狀病毒屬(Coronavirus)或埃博拉病毒屬(Ebolavirus)。來(lái)自所述病毒三聚體表面蛋白的所述胞外域可源自例如但不限于HIV、狂犬病病毒、VZV、RSV、SARS病毒、埃博拉病毒、麻疹、腮腺炎(Mumps)、水痘、巨細(xì)胞病毒、埃博拉/絲狀病毒、皰疹病毒、EB病毒(Epstein-Barrvirus)或天花。天然形式的所述病毒三聚體表面蛋白可包含胞外域和跨膜結(jié)構(gòu)域/胞質(zhì)尾區(qū)，例如但不限于F蛋白(RSV、麻疹病毒、腮腺炎、新城疫)、S蛋白(SARS病毒)、env蛋白(HIV)、G蛋白(狂犬病)、包膜糖蛋白(包括E、B、C、I、H)(VZV、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒、EB病毒)、GP糖蛋白(埃博拉(ebola)、馬爾堡(marburg))，血凝素(天花病毒、牛痘病毒)。本發(fā)明還包括上述方法，其中所述流感跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)獲自H5(A/印度尼西亞/05/2005)或H3(A/布里斯班/10/2007)。所述跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)可包含SEQIDNO：41或SEQIDNO：42中所限定的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了上述方法，其中在所述引入步驟(步驟a)中，所述核酸在所述植物中瞬時(shí)表達(dá)?；蛘?，在所述引入步驟(步驟a)中，所述核酸可在所述植物中穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明還包括上述方法，其中在所述引入步驟(步驟a)中，向所述植物中引入一種或多于一種另外的核酸，其選自編碼一種或多于一種伴侶蛋白、質(zhì)子通道蛋白、蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor)或其組合的核苷酸序列。本發(fā)明提供了由上述方法產(chǎn)生的VLP。所述VLP的所述嵌合病毒三聚體表面蛋白可包含植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾N-聚糖。所述VLP還可包含源自所述植物的一種或多于一種脂質(zhì)。本發(fā)明包括組合物，其包含用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有效劑量的上述VLP和可藥用載體。本發(fā)明涉及由逆轉(zhuǎn)錄病毒科、彈狀病毒科、皰疹病毒科、冠狀病毒科或絲狀病毒科的病毒產(chǎn)生嵌合病毒三聚體表面蛋白以及在植物中產(chǎn)生包含這些嵌合病毒三聚體表面蛋白的病毒樣顆粒。另外，本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生人類免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病病毒、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)病毒或埃博拉病毒的嵌合三聚體表面蛋白。本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生HIV、狂犬病、VZV、SARS和埃博拉嵌合病毒樣顆粒。根據(jù)本發(fā)明，提供了在植物中產(chǎn)生嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉VLP的方法，其包括將與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉病毒蛋白質(zhì)的核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，以及在允許所述核酸表達(dá)的條件下孵育所述植物或所述植物部分，從而產(chǎn)生所述嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉VLP。本發(fā)明還提供了包含嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉蛋白質(zhì)的VLP。可通過(guò)如本發(fā)明所提供的方法產(chǎn)生所述VLP。也可在植物內(nèi)產(chǎn)生HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉VLP。根據(jù)本發(fā)明，由HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉來(lái)源的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的嵌合VLP或VLP不包含M1蛋白。已知所述M1蛋白結(jié)合RNA，可認(rèn)為所述RNA是VLP制備物中的污染物。當(dāng)為抗原性(VLP)產(chǎn)品獲得監(jiān)管部門批準(zhǔn)時(shí)，RNA的存在是不期望的，因此沒(méi)有RNA的嵌合VLP制備物可以是有利的。盡管天然HIVEnv蛋白在植物中難以積累，但是與來(lái)自流感HA之跨膜(TM)和胞質(zhì)尾區(qū)(CT)結(jié)構(gòu)域相融合的嵌合HIVEnv蛋白在植物中以高水平積累并且在不存在核心蛋白或基質(zhì)蛋白下出芽進(jìn)入到HIVVLP中。該發(fā)明概述不一定描述本發(fā)明的所有特征。附圖簡(jiǎn)述通過(guò)參照附圖的以下描述，本發(fā)明的這些和其他特征會(huì)更加顯而易見(jiàn)，其中：圖1示出了根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的HIV的數(shù)個(gè)核苷酸和氨基酸序列以及表達(dá)盒。圖1A示出了HIVConSΔCFI的共有核酸序列(SEQIDNO：1)(天然信號(hào)肽用粗體表示，天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域用下劃線表示)。圖1B示出了寡核苷酸IF-ApaI-SpPDI.c的核苷酸序列(SEQIDNO：2)。圖1C示出了寡核苷酸SpPDI-HIVgp145.r的核苷酸序列(SEQIDNO：3)。圖1D示出了寡核苷酸IF-SpPDI-gp145.c的核苷酸序列(SEQIDNO：4)。圖1E示出了寡核苷酸WtdTm-gp145.r的核苷酸序列(SEQIDNO：5)。圖1F示出了995號(hào)表達(dá)盒的核苷酸序列(SEQIDNO：6)，從PacI(啟動(dòng)子上游)至AscI(緊鄰NOS終止子下游)。消除的SbfI限制性位點(diǎn)用粗體表示。PDISP-HIVConSΔCFI用下劃線表示。圖1G示出了PDISP-HIVConSΔCFI的氨基酸序列(SEQIDNO：7)。圖1H示出了995號(hào)構(gòu)建體的示意圖。圖2示出了根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的HIV的數(shù)個(gè)核苷酸和氨基酸序列以及表達(dá)盒。圖2A示出了寡核苷酸IF-H3dTm+gp145.r的核苷酸序列(SEQIDNO：8)。圖2B示出了寡核苷酸Gp145+H3dTm.c的核苷酸序列(SEQIDNO：9)。圖2C示出了寡核苷酸H3dTm.r的核苷酸序列(SEQIDNO：10)。圖2D示出了997號(hào)表達(dá)盒的核苷酸序列(SEQIDNO：11)，從PacI(啟動(dòng)子上游)至AscI(緊鄰NOS終止子下游)。消除的SbfI限制性位點(diǎn)用粗體表示。PDISP-HIVConSΔCFI-A/布里斯班/10/2007H3TM+CT用下劃線表示。圖2E示出了PDISP-HIVConSΔCFI-A/布里斯班/10/2007H3TM+CT的氨基酸序列(SEQIDNO：12)。圖2F示出了997號(hào)構(gòu)建體的示意圖。圖3示出了根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的HIV的數(shù)個(gè)核苷酸和氨基酸序列以及表達(dá)盒。圖3A示出了寡核苷酸IF-H5dTm+gp145.r的核苷酸序列(SEQIDNO：13)。圖3B示出了寡核苷酸Gp145+H5dTm.c的核苷酸序列(SEQIDNO：14)。圖3C示出了寡核苷酸IF-H5dTm.r的核苷酸序列(SEQIDNO：15)。圖3D示出了999號(hào)表達(dá)盒的核苷酸序列(SEQIDNO：16)，從PacI(啟動(dòng)子上游)至AscI(緊鄰NOS終止子下游)。消除的SbfI限制性位點(diǎn)用粗體表示。PDISP-HIVConSΔCFI-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT用下劃線表示。圖3E示出了PDISP-HIVConSΔCFI-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列(SEQIDNO：17)。圖3F示出了999號(hào)構(gòu)建體的示意圖。圖4示出了根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的p19的氨基酸序列和數(shù)個(gè)表達(dá)盒。圖4A示出了172號(hào)表達(dá)盒的核苷酸序列(SEQIDNO：18)，從XmaI(質(zhì)體藍(lán)素(plastocyanin)啟動(dòng)子上游)至EcoRI(緊鄰質(zhì)體藍(lán)素終止子下游)。TBSVP19核酸序列用下劃線表示。圖4B示出了TBSVP19沉默抑制子的氨基酸序列(SEQIDNO：19)。圖4C示出了172號(hào)構(gòu)建體的示意圖。圖5示出了如本文中所述表達(dá)的嵌合HIVEnv基因的示意圖。圖6示出了在農(nóng)桿菌滲入的(agroinfiltrated)本塞姆氏煙草(Nicotianabenthamiana)葉中HIVEnv蛋白表達(dá)的Western印跡分析。泳道1至4，在從模擬滲入的植物提取的20μg葉蛋白質(zhì)中的分別為100、50、10和5ng的重組HIV-1gp160(ab68171)(陽(yáng)性對(duì)照)。泳道5，來(lái)自模擬滲入的植物的20μg蛋白質(zhì)(陰性對(duì)照)。泳道6至8，從AGL1/995滲入的葉提取的蛋白質(zhì)(分別為20μg、10μg和2μg，用從模擬滲入的植物提取的葉蛋白質(zhì)補(bǔ)充至20μg)。泳道9和10，從AGL1/997滲入的葉提取的蛋白質(zhì)(分別為20μg和10μg，用從模擬滲入的植物提取的葉蛋白質(zhì)補(bǔ)充至20μg)。泳道11和12，從AGL1/999滲入的葉提取的蛋白質(zhì)(分別為20μg和10μg，用從模擬滲入的植物提取的葉蛋白質(zhì)補(bǔ)充至20μg)。圖7示出了通過(guò)尺寸排阻色譜表征HIVConSΔCFI來(lái)源的構(gòu)建體。采用校準(zhǔn)的S-500高分辨率柱通過(guò)凝膠過(guò)濾分離來(lái)自用產(chǎn)生Env/H5嵌合蛋白之AGL1/999滲入的葉的蛋白質(zhì)提取物。(A)通過(guò)使用抗gp120抗體的免疫檢測(cè)揭示了洗脫級(jí)分的HIVEnv蛋白質(zhì)含量。泳道1至4，在從模擬滲入的植物提取的20μg葉蛋白質(zhì)中的分別為100、50、10和5ng的重組HIV-1gp160(ab68171)(陽(yáng)性對(duì)照)。泳道5，來(lái)自模擬滲入的植物的20μg蛋白質(zhì)(陰性對(duì)照)。泳道6，從AGL1/999滲入的葉提取的20μg蛋白質(zhì)。泳道7至18，來(lái)自凝膠過(guò)濾色譜的洗脫級(jí)分7至18。(B)來(lái)自凝膠過(guò)濾色譜的洗脫級(jí)分7至18的相對(duì)蛋白質(zhì)含量。圖8示出了根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的狂犬病的數(shù)個(gè)核苷酸和氨基酸序列以及表達(dá)盒。圖8A示出了構(gòu)建體1074(在含有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素沉默抑制子的載體上的C-2X35S-狂犬病糖蛋白G(RabG)+H5A/印度尼西亞/5/2005跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM+CT)-NOS)的示意圖。圖8B示出了引物IF-RabG-S2+4.c(SEQIDNO：32)。圖8C示出了引物RabG+H5dTm.r(SEQIDNO：33)。圖8D示出了合成的RabG基因(對(duì)應(yīng)于來(lái)自Genebank檢索號(hào)EF206707的nt3317～4891；天然信號(hào)肽用粗體表示，天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域用下劃線表示；SEQIDNO：34)。圖8E示出了引物IF-H5dTm.c(SEQIDNO：35)。圖8F示出了構(gòu)建體141，從左至右t-DNA(下劃線)。具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素沉默抑制子表達(dá)盒的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS表達(dá)系統(tǒng)(SEQIDNO：36)。圖8G示出了構(gòu)建體141的示意圖。在示意圖上注釋了用于質(zhì)粒線性化的SbfI和StuI限制性酶位點(diǎn)。圖8H示出了1074號(hào)表達(dá)盒的核苷酸序列，從2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子。PDISP-RabG-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT用下劃線表示(SEQIDNO：37)。圖8I示出了PDISP-RabG-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列(SEQIDNO：38)。圖8J示出了構(gòu)建體144的核苷酸序列，從左至右t-DNA(下劃線)。引入到具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素沉默抑制子表達(dá)盒之BeYDV+復(fù)制酶表達(dá)系統(tǒng)中的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS(SEQIDNO：39)。圖8K示出了構(gòu)建體144的示意圖。在示意圖上注釋了用于質(zhì)粒線性化的SbfI和StuI限制性酶位點(diǎn)。圖8L示出了1094號(hào)表達(dá)盒的核苷酸序列，從右至左BeYDVLIR。PDISP-RabG-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT用下劃線表示(SEQIDNO：40)。圖8M示出了1094號(hào)構(gòu)建體的示意圖。圖8N示出了在植物中狂犬病G蛋白表達(dá)的免疫印跡分析?？袢蛋白在與PDISp(構(gòu)建體1071)、BeYDV+rep、H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域或其組合的融合體(fusion)中表達(dá)。更具體地，構(gòu)建體1074是狂犬病G蛋白與PDISp和H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域的融合體。構(gòu)建體1094是狂犬病G蛋白與BeYDV+rep、PDISp和H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域的融合體。構(gòu)建體1091是狂犬病G蛋白與PDISp和BeYDV+rep的融合體。圖8O示出了對(duì)由構(gòu)建體1074和構(gòu)建體1094表達(dá)之蛋白質(zhì)的濃縮和澄清提取物之尺寸排阻色譜的免疫印跡分析。圖9A示出了由構(gòu)建體1074表達(dá)的純化狂犬病G蛋白的免疫印跡分析。圖9B示出了源自構(gòu)建體1074之表達(dá)的純化VLP的透射電子顯微鏡照片。圖10示出了用于制備A-2X35S-水痘帶狀皰疹病糖蛋白E(VZVgE)+H5A/印度尼西亞/5/2005跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM+CT)-NOS(946號(hào)構(gòu)建體)的序列。圖10A示出了引物IF-wtSp-VZVgE.c(SEQIDNO：20)；圖10B示出了引物IF-H5dTm+VZVgE.r(SEQIDNO：21)。圖10C示出了合成的VZVgE基因(SEQIDNO：22；對(duì)應(yīng)于來(lái)自Genebank檢索號(hào)AY013752.1的nt3477～5348)(天然信號(hào)肽用粗體表示，天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域用下劃線表示)。圖10D示出了用于VZVgE+H5dTm.c的引物(SEQIDNO：23)。圖10E示出了946號(hào)表達(dá)盒(SEQIDNO：24)，從PacI(啟動(dòng)子上游)至AscI(緊鄰NOS終止子下游)。VZVgE-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT用下劃線表示。圖10F示出了VZVgE-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列(SEQIDNO：25)。圖10G示出了946號(hào)構(gòu)建體的示意圖。圖11A示出了水痘帶狀皰疹病毒(VZV)E蛋白表達(dá)的免疫印跡分析。泳道1至5，分別為500、100、50、10和5ng重組VZVgE(陽(yáng)性對(duì)照)。泳道6，來(lái)自模擬滲入的葉的提取物(陰性對(duì)照)。泳道7～9，來(lái)自構(gòu)建體946的分別為20、10和2μg提取物的重組蛋白質(zhì)。構(gòu)建體946包含具有野生型信號(hào)肽和H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域的VZVgE基因。圖11B示出了對(duì)粗提取物(構(gòu)建體946)之尺寸排阻色譜的表達(dá)免疫印跡分析。圖12示出了根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的SARS病毒的數(shù)個(gè)核苷酸和氨基酸序列以及表達(dá)盒。圖12A示出了916號(hào)構(gòu)建體(B-2X35S-嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒糖蛋白S(SARSgS)+H5A/印度尼西亞/5/2005跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM+CT)-NOS)的示意圖。圖12B示出了引物IF-wtSp-SARSgS.c(SEQIDNO：26)。圖12C示出了引物IF-H5dTm+SARSgS.r(SEQIDNO：27)。圖12D示出了合成的SARSgS基因(SEQIDNO：28；對(duì)應(yīng)于來(lái)自Genebank檢索號(hào)AY278741.1的nt21492～25259；天然信號(hào)肽用粗體表示，天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域用下劃線表示)。圖12E示出了引物SARSgS+H5dTm.c(SEQIDNO：29)。圖12F示出了916號(hào)表達(dá)盒的核苷酸序列(SEQIDNO：30)，從PacI(啟動(dòng)子上游)至AscI(緊鄰NOS終止子下游)。SARSgS-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT用下劃線表示。圖12G示出了SARSgS-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列(SEQIDNO：31)。圖12H示出了嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒蛋白S表達(dá)的免疫印跡分析。構(gòu)建體916包含具有野生型信號(hào)肽以及H5A/Indo跨膜和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域的SARSgS基因。泳道1，來(lái)自模擬滲入的植物的提取物(陰性對(duì)照)。泳道2至4，來(lái)自構(gòu)建體916的重組蛋白質(zhì)(20、10和5μg提取物)。圖13示出了根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的埃博拉的數(shù)個(gè)核苷酸和氨基酸序列以及表達(dá)盒。圖13A示出了引物IF-Opt_EboGP.s2+4c的核苷酸序列(SEQIDNO：43)。圖13B示出了引物H5iTMCT+Opt_EboGP.r的核苷酸序列(SEQIDNO：44)。圖13C示出了經(jīng)優(yōu)化合成的GP基因的核苷酸序列(對(duì)于野生型基因序列而言對(duì)應(yīng)于來(lái)自Genebank檢索號(hào)AY354458的nt6039～8069。針對(duì)密碼子使用(codonusage)和GC含量、刪除隱蔽剪接位點(diǎn)、Shine-Delgarno序列、RNA促降解序列(RNAdestabilizingsequence)以及原核生物核糖體進(jìn)入位點(diǎn)對(duì)序列(SEQIDNO：45)進(jìn)行優(yōu)化；天然信號(hào)肽用粗體表示，天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域用下劃線表示)。圖13D示出了引物opt_EboGP+H5iTMCT.c的核苷酸序列(SEQIDNO：46)。圖13E示出了構(gòu)建體1192的示意圖。在示意圖上注釋了用于質(zhì)粒線性化的SacII和StuI限制性酶位點(diǎn)。圖13F示出了構(gòu)建體1192的核苷酸序列，從左至右t-DNA邊界(下劃線)。具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素沉默抑制子表達(dá)盒的2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS(SEQIDNO.47)。圖13G示出了1366號(hào)表達(dá)盒的核苷酸序列，從2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子。來(lái)自A/印度尼西亞/5/2005序列之扎伊爾95埃博拉病毒-H5TM+CT的PDISP-GP用下劃線表示(SEQIDNO：48)。圖13H示出了來(lái)自A/印度尼西亞/5/2005之扎伊爾95埃博拉病毒-H5TM+CT的PDISP-GP的氨基酸序列(SEQIDNO：49)。圖13I示出了1366號(hào)構(gòu)建體的示意圖。圖13J示出了埃博拉病毒糖蛋白(GP)蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫印跡分析。在從模擬滲入的植物提取的20μg蛋白質(zhì)中加入(spike)五百納克并且作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行加載(C+)。作為陰性對(duì)照而加載從模擬滲入的植物提取的20微克蛋白質(zhì)(C-)。構(gòu)建體1366包含具有野生型信號(hào)肽和H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域的埃博拉病毒GP基因。括號(hào)中的數(shù)字表示用于制備用于滲入之接種物的初始細(xì)菌培養(yǎng)物的量。(200)表示200ml培養(yǎng)物與2.3L滲入緩沖液混合，(400)表示400ml培養(yǎng)物與2.1L滲入緩沖液混合。發(fā)明詳述以下是對(duì)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的描述。本發(fā)明涉及病毒樣顆粒(VLP)。更具體地，本發(fā)明涉及包含嵌合病毒蛋白質(zhì)的VLP以及在植物中產(chǎn)生嵌合VLP的方法。VLP包含融合(嵌合)蛋白，其包含與跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT)相融合的串聯(lián)的來(lái)自病毒三聚體表面蛋白(病毒的三聚體表面蛋白)或其片段的胞外域。所述來(lái)自病毒三聚體表面蛋白的胞外域相對(duì)于所述TM/CT是異源的。TM/CT為來(lái)自流感血凝素(HA)的TM/CT。病毒三聚體表面蛋白(也稱為病毒的三聚體表面蛋白)是見(jiàn)于包膜病毒表面上的三聚體(一般為同三聚體)形式的蛋白質(zhì)并且包含位于各單體之C-末端的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT)以及位于各單體之N-末端區(qū)域的胞外域。病毒三聚體表面蛋白可以是糖蛋白或包膜蛋白。三聚體為由三個(gè)通常為非共價(jià)連接的蛋白質(zhì)形成的大分子復(fù)合物。不希望受理論限制，蛋白質(zhì)的三聚化結(jié)構(gòu)域可能對(duì)于此類三聚體的形成是重要的。因此，病毒三聚體表面蛋白或其片段的單體可包含三聚化結(jié)構(gòu)域。病毒三聚體表面蛋白或其片段還包含胞外域。三聚體表面蛋白的胞外域暴露于外部環(huán)境并且不包含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域。如本文中描述的，來(lái)自病毒三聚體表面蛋白的胞外域不源自流感病毒。如果如本文中描述的使用病毒三聚體表面蛋白的片段，那么優(yōu)選地，該病毒三聚體表面蛋白保持形成三聚體的能力。通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可容易地鑒別出病毒三聚體表面蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM/CT)、流感蛋白質(zhì)的TM/CT、或這二者，例如，通過(guò)例如使用跨膜預(yù)測(cè)程序(例如蛋白質(zhì)分析專家系統(tǒng)(ExpertProteinAnalysisSystem)；由瑞士生物信息學(xué)研究所(SwissInstituteofBioinformatics)運(yùn)作的ExPASy.org；或稠密對(duì)齊表面法(DenseAlignmentSurfaceMethod)，CserzoM.，等1997，Prot.Eng.第10卷，第6期，673-676；LolkemaJ.S.1998，F(xiàn)EMSMicrobiolRev.22，第4期，305-322)測(cè)定蛋白質(zhì)之氨基酸序列的疏水程度，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)之氨基酸序列的親水性分布圖(例如Kyte-Doolittle親水性分布圖)，通過(guò)測(cè)定三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及鑒定膜中熱力學(xué)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)(例如單個(gè)α螺旋、數(shù)個(gè)跨膜α螺旋的穩(wěn)定復(fù)合物、跨膜β桶(betabarrel)、β-螺旋或在膜中熱力學(xué)穩(wěn)定的任何其他結(jié)構(gòu))。一經(jīng)鑒別，病毒三聚體表面蛋白的TM/CT區(qū)域可替換為從如下文描述的流感病毒獲得的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)。根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的嵌合VLP包含病毒的三聚體表面蛋白或其片段，來(lái)自其的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT)被替換為從流感HA獲得的TM/CT。病毒三聚體表面蛋白相對(duì)于TM/CT是異源的。所述病毒三聚體表面蛋白或其片段可源自但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、彈狀病毒科、皰疹病毒科、冠狀病毒科、副黏病毒科、痘病毒科或絲狀病毒科的病毒。所述病毒三聚體表面蛋白可源自例如慢病毒屬、狂犬病病毒屬、水痘病毒屬、冠狀病毒屬或埃博拉病毒屬。病毒三聚體表面蛋白可源自例如但不限于HIV、狂犬病病毒、VZV、RSV、SARS病毒、埃博拉病毒、麻疹、腮腺炎、水痘、巨細(xì)胞病毒、埃博拉/絲狀病毒、皰疹病毒、EB病毒或天花。所述病毒三聚體表面蛋白可以是例如三聚體表面蛋白并且在其天然形式中可包含跨膜結(jié)構(gòu)域/胞質(zhì)尾區(qū)，例如但不限于：a.F蛋白(副黏病毒科：RSV、麻疹、腮腺炎、新城病)；b.S蛋白(冠狀病毒科：SARS病毒)；c.env蛋白(逆轉(zhuǎn)錄病毒科：HIV)；d.G蛋白(彈狀病毒科：狂犬病)；e.包膜糖蛋白如E、B、C、I、H(皰疹病毒科：VZV、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒、EB病毒)；f.GP糖蛋白(絲狀病毒科：埃博拉、馬爾堡)；g.血凝素(痘病毒科：天花病毒、牛痘病毒)?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的數(shù)種病毒三聚體表面蛋白的非限制性實(shí)例在下文中更詳細(xì)地描述。HIV本發(fā)明提供了包含嵌合人類免疫缺陷(HIV)蛋白質(zhì)的VLP和產(chǎn)生嵌合HIVVLP的方法，嵌合HIV蛋白質(zhì)包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT))和HIVEnv蛋白的融合蛋白。本發(fā)明提供了核酸，其包含與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合HIV蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生嵌合HIVVLP的方法。本方法涉及將與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合HIV蛋白質(zhì)的核酸引入植物或植物的一部分中，以及在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或植物部分，從而產(chǎn)生所述嵌合HIVVLP。本發(fā)明還提供了包含嵌合HIV蛋白質(zhì)的VLP?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明所提供的方法產(chǎn)生所述VLP?？袢〔《颈景l(fā)明還提供了包含嵌合狂犬病病毒蛋白質(zhì)的VLP和產(chǎn)生嵌合狂犬病病毒VLP的方法，嵌合狂犬病病毒蛋白質(zhì)包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT))和狂犬病G蛋白的融合蛋白。本發(fā)明提供了核酸，其包含與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合狂犬病病毒蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生嵌合狂犬病病毒VLP的方法。所述方法涉及將與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合狂犬病病毒蛋白質(zhì)的核酸引入植物或植物的一部分中，以及在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或植物部分，從而產(chǎn)生嵌合狂犬病病毒VLP。本發(fā)明還提供了包含嵌合狂犬病病毒蛋白質(zhì)的VLP。可通過(guò)本發(fā)明所提供的方法產(chǎn)生所述VLP。VZV本發(fā)明還涉及包含嵌合水痘帶狀皰疹病毒(VZV)蛋白質(zhì)的VLP和產(chǎn)生嵌合VZVVLP的方法，所述嵌合VZV蛋白質(zhì)包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT))和VZV糖蛋白E的融合蛋白。本發(fā)明提供了核酸，其包含與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合VZV蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生嵌合VZVVLP的方法。本方法涉及將與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合VZV蛋白質(zhì)的核酸引入到植物或植物的一部分中，以及在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或植物部分，從而產(chǎn)生所述嵌合VZVVLP。本發(fā)明還提供了包含嵌合VZV蛋白質(zhì)的VLP?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明所提供的方法產(chǎn)生所述VLP。SARS本發(fā)明還針對(duì)包含嵌合嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒蛋白質(zhì)的VLP和產(chǎn)生嵌合SARS病毒VLP的方法，所述嵌合SARS蛋白質(zhì)包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT))和SARS糖蛋白S的融合蛋白。本發(fā)明提供了核酸，其包含與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合SARS蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生嵌合SARS病毒VLP的方法。本方法涉及將與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合SARS病毒蛋白質(zhì)的核酸引入到植物或植物的一部分中，以及在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或植物部分，從而產(chǎn)生嵌合SARSVLP。本發(fā)明還提供了包含嵌合SARS病毒蛋白質(zhì)的VLP?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明所提供的方法產(chǎn)生所述VLP。埃博拉本發(fā)明還涉及包含嵌合埃博拉病毒蛋白質(zhì)的VLP和產(chǎn)生嵌合埃博拉VLP的方法，所述嵌合埃博拉病毒蛋白質(zhì)包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT))和埃博拉病毒包膜糖蛋白的融合蛋白。本發(fā)明提供了核酸，其包含與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合埃博拉病毒蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生嵌合埃博拉VLP的方法。所述方法涉及將與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接的編碼嵌合埃博拉病毒蛋白質(zhì)的核酸引入到植物或植物的一部分中，以及在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或植物部分，從而產(chǎn)生嵌合埃博拉病毒VLP。本發(fā)明還提供了包含嵌合埃博拉病毒蛋白質(zhì)的VLP?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明所提供的方法產(chǎn)生所述VLP。嵌合化和VLP形成水泡性口炎病毒(彈狀病毒如狂犬病)和單純皰疹病毒(皰疹病毒如水痘帶狀皰疹病毒)均以VSP4依賴性方式出芽(Taylor等J.Virol81：13631-13639，2007；Crump等，J.Virol81：7380-7387，2007)。由于VSP4與基質(zhì)蛋白的晚期結(jié)構(gòu)域(latedomain)相互作用，這表明基質(zhì)蛋白對(duì)于出芽以及作為推論對(duì)于VLP產(chǎn)生是必需的。然而，如本文中所述，當(dāng)TM/CT結(jié)構(gòu)域被流感HA的那些替換時(shí)可在沒(méi)有基質(zhì)蛋白下產(chǎn)生狂犬病和VZVVLP。不希望受理論限制，這表明嵌合化可消除對(duì)用于針對(duì)狂犬病和VZV之VLP形成的基質(zhì)蛋白共表達(dá)的依賴性。上述病毒三聚體表面蛋白的胞外域與跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域(TM/CT)相融合，使得病毒三聚體表面蛋白相對(duì)于TM/CT是異源的。所述TM/CT可以是來(lái)自流感血凝素(HA)的TM/CT，例如來(lái)自H5或H3的TM/CT，例如但不限于A/印度尼西亞/5/05亞型(H5N1；“H5/Indo”；GenBank檢索號(hào)ABW06108.1)、H5A/越南/1194/2004(A-越南；GenBank檢索號(hào)ACR48874.1)、H5A/安徽/1/2005(A-安徽；GenBank檢索號(hào)ABD28180.1)；H3A/布里斯班/10/2007(“H3/Bri”；GenBank檢索號(hào)ACI26318.1)、H3A/威斯康星/67/2005(A-WCN；GenBank檢索號(hào)ABO37599.1)。數(shù)個(gè)H3和H5序列邊界的TM/CT描述于WO2010/148511中(其通過(guò)引用并入本文中)。例如，對(duì)于TM/CT而言認(rèn)為沒(méi)有限制的氨基酸序列可包括：H5(A/印度尼西亞/05/2005)TM/CT(SEQIDNO：41)：QILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICIH3(A/布里斯班/10/2007)TM/CT(SEQIDNO：42)：DWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI和編碼SEQIDNO：41或42之氨基酸序列的任何核苷酸序列。本發(fā)明中所涉及的特定核酸序列可與在嚴(yán)格雜交條件下與本文中限定的一個(gè)或多于一個(gè)核苷酸序列相雜交的序列或該序列之互補(bǔ)序列“基本同源”或“基本類似”。當(dāng)在整個(gè)核苷酸序列的限定長(zhǎng)度上有至少約70％或更優(yōu)選75％的核苷酸匹配時(shí)，序列為“基本同源”或“基本類似”，前提是這樣的同源序列展現(xiàn)出本文中所述序列或編碼產(chǎn)物的一個(gè)或多于一個(gè)的特性。例如，與從H3或H5獲得的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域相融合的來(lái)自病毒三聚體表面蛋白的基本同源的胞外域、與H3或H5之TM/CT基本同源的并與來(lái)自病毒三聚體表面蛋白之胞外域相融合的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)，或者基本同源的TM/CT和來(lái)自病毒三聚體表面蛋白的基本同源的胞外域二者，形成VLP。嵌合蛋白質(zhì)的正確折疊對(duì)于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、多聚體形成、VLP形成和功能可以是重要的。蛋白質(zhì)折疊可受一個(gè)或更多個(gè)因素影響，包括但不限于蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)相對(duì)豐度，細(xì)胞內(nèi)擁擠程度(degreeofintracellularcrowding)，可與折疊的、部分折疊的或未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合或瞬時(shí)締合(transientlyassociated)的輔因子的可用性?？墒褂美缭贒NASIS(使用例如但不限于以下參數(shù)：GAP罰分為5，頂部對(duì)角的#為5，固定GAP罰分為10，K串(k-tuple)為2，浮動(dòng)缺口(floatinggap)為10，并且窗口大小為5)內(nèi)提供的核苷酸序列比較程序來(lái)確定此類序列相似性。然而，用于比較的比對(duì)序列的其他方法為本領(lǐng)域所熟知，例如Smith&Waterman(1981，Adv.Appl.Math.2：482)、Needleman&Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson&Lipman(1988，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85：2444)的算法，以及通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST，可通過(guò)HIN使用。)，或者通過(guò)手工比對(duì)和目視檢查(參見(jiàn)，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等編1995增刊)，或者在嚴(yán)格條件下使用Southern或Northern雜交(參見(jiàn)Maniatis等，inMolecularCloning(ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory，1982)。優(yōu)選地，基本同源的序列在整個(gè)分子之限定長(zhǎng)度上展現(xiàn)出至少約80％和最優(yōu)選至少約90％的序列相似性。一種這樣的嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)實(shí)例可以是在65℃下于4×SSC中雜交過(guò)夜(約16～20小時(shí))，然后在65℃下于0.1×SSC中洗滌1小時(shí)，或在65℃下于0.1×SSC中洗滌兩次(每次20或30分鐘)?；蛘?，一個(gè)示例性的嚴(yán)格雜交條件可以是在42℃下于50％甲酰胺、4×SSC中過(guò)夜(16～20小時(shí))，然后在65℃下于0.1×SSC中洗滌1小時(shí)，或在65℃下于0.1×SSC中洗滌2次(每次20或30分鐘或者過(guò)夜(16～20小時(shí)))，或者在65℃下于Church水性磷酸鹽緩沖液(7％SDS；0.5MNaPO4緩沖液(pH7.2)；10mMEDTA)中雜交，在50℃下于0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌2次(每次20或30分鐘)，或者對(duì)于獨(dú)特序列區(qū)域在65℃下于2×SSC、0.1％SDS中洗滌2次(每次20或30分鐘)。編碼嵌合多肽、嵌合蛋白質(zhì)、融合蛋白、嵌合病毒蛋白質(zhì)或嵌合病毒三聚體表面蛋白的核酸可被描述為“嵌合核酸”或“嵌合核苷酸序列”。例如(不認(rèn)為這是限制性的)，包含嵌合HIV蛋白質(zhì)、嵌合狂犬病病毒蛋白質(zhì)、嵌合VZV蛋白質(zhì)、嵌合SARS或嵌合埃博拉病毒蛋白質(zhì)的病毒樣顆?？杀幻枋鰹椤扒逗蟅LP”?！扒逗系鞍踪|(zhì)”或“嵌合多肽”還指融合蛋白，其意指包含來(lái)自兩個(gè)或多于兩個(gè)來(lái)源之氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽，例如但不限于來(lái)自病毒三聚體表面蛋白或其片段的胞外域，例如F蛋白(例如，RSV、麻疹、腮腺炎、新城病)、S蛋白(例如，SARS病毒)、env蛋白(HIV)、G蛋白(狂犬病)、包膜糖蛋白如E、B、C、I、H(VZV、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒、EB病毒)、GP糖蛋白(例如，埃博拉、馬爾堡)、血凝素(例如天花病毒、牛痘病毒)，以及例如HA的TM/CT(其融合為單個(gè)多肽)。嵌合蛋白質(zhì)或多肽可包含與該多肽或蛋白質(zhì)之其余部分相同或異源的信號(hào)肽。術(shù)語(yǔ)“信號(hào)肽”為本領(lǐng)域所熟知并且通常指通常見(jiàn)于多肽的N-端的短(約5～30個(gè)氨基酸)氨基酸序列，其可指導(dǎo)新翻譯之多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至特定細(xì)胞器或輔助多肽鏈之特定區(qū)域(相對(duì)于其他)的定位。作為非限制性實(shí)例，信號(hào)肽可靶向蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)和/或有助于新生多肽相對(duì)于膜錨定結(jié)構(gòu)域之近N-端結(jié)構(gòu)域的定位，以輔助成熟蛋白質(zhì)(例如(不認(rèn)為這是限制性的)成熟HA蛋白)的切割和折疊。信號(hào)肽(SP)可以是蛋白質(zhì)或病毒蛋白質(zhì)原有的，或者信號(hào)肽可相對(duì)于被表達(dá)之蛋白質(zhì)或病毒蛋白質(zhì)的一級(jí)序列是異源的。蛋白質(zhì)或病毒蛋白質(zhì)可包含來(lái)自第一流感類型、亞型或菌株的信號(hào)肽，而HA其余部分來(lái)自一種或多于一種不同流感類型、亞型或菌株。例如，HA亞型BH1、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B型流感病毒的天然信號(hào)肽可用于在植物系統(tǒng)中表達(dá)嵌合病毒蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，SP可以是B型流感H1、H3或H5；或者是H1/Bri、H1/NC、H5/Indo、H3/Bri或B/Flo亞型。在一些實(shí)施方案中，SP可以是HIVEnv蛋白、狂犬病G蛋白、VZV糖蛋白E、SARS糖蛋白S或埃博拉病毒包膜糖蛋白。信號(hào)肽也可以是非天然的，例如來(lái)自蛋白質(zhì)、病毒蛋白質(zhì)、病毒三聚體表面蛋白或非病毒三聚體表面蛋白的病毒血凝素，或者來(lái)自植物、動(dòng)物或細(xì)菌多肽?？墒褂玫男盘?hào)肽的非限制性實(shí)例為苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(alfalfaproteindisulfideisomerase)(PDISP；檢索號(hào)Z11499的32～103位核苷酸)。因此，本發(fā)明提供了包含天然或非天然信號(hào)肽的嵌合病毒蛋白質(zhì)以及編碼此類嵌合病毒蛋白質(zhì)的核酸。所表達(dá)的嵌合病毒蛋白質(zhì)的正確折疊對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、多聚體形成、VLP形成、嵌合病毒蛋白質(zhì)的功能和嵌合病毒蛋白質(zhì)通過(guò)抗體的識(shí)別等特征可以是重要的。蛋白質(zhì)的折疊和積累可受一個(gè)或更多個(gè)因素影響，包括但不限于：蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)相對(duì)豐度，細(xì)胞內(nèi)擁擠程度，細(xì)胞區(qū)室中的pH，可與折疊的、部分折疊的或未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合或瞬時(shí)締合的輔因子的可用性，一種或更多種伴侶蛋白的存在情況，等。熱休克蛋白(heatshockprotein，Hsp)或應(yīng)激蛋白是伴侶蛋白的實(shí)例，其可參與多種細(xì)胞過(guò)程，包括蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、防止錯(cuò)誤折疊、防止蛋白質(zhì)凝集、蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配和接裝配、蛋白質(zhì)折疊、以及蛋白質(zhì)解聚。此類伴侶蛋白的實(shí)例包括但不限于Hsp60、Hsp65、Hsp70、Hsp90、Hsp100、Hsp20-30、Hsp10、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、TF55、FKBP、親環(huán)蛋白(cyclophilin)、ClpP、GrpE、泛素、鈣聯(lián)接蛋白(calnexin)和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(參見(jiàn)，例如Macario，A.J.L.，ColdSpringHarborLaboratoryRes.25：59-70.1995；Parsell，D.A.&Lindquist，S.Ann.Rev.Genet.27：437-496(1993)；美國(guó)專利No.5,232,833)。如本文中所述，伴侶蛋白(例如但不限于Hsp40和Hsp70)可用于確保嵌合病毒蛋白質(zhì)的折疊。Hsp70的實(shí)例包括來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Hsp72和Hsc73、來(lái)自細(xì)菌(特別是分枝桿菌，例如麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(例如卡介苗(Bacille-CalmetteGuerin)：本文中稱為Hsp71))的DnaK。來(lái)自大腸桿菌、酵母和其他原核生物的DnaK，以及來(lái)自真核生物(例如擬南芥(A.thaliana))的BiP和Grp78(Lin等，2001(CellStressandChaperones6：201-208))。Hsp70的一個(gè)具體實(shí)例是擬南芥Hsp70(由Genbankref：AY120747.1編碼)。Hsp70能夠特異性地結(jié)合ATP以及未折疊多肽和肽，從而參與蛋白質(zhì)折疊和解折疊以及參與蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配和接裝配。Hsp40的實(shí)例包括來(lái)自原核生物(例如大腸桿菌和分枝桿菌)的DnaJ以及來(lái)自真核生物(例如苜蓿)的HSJ1、HDJ1和Hsp40(Frugis等，1999.PlantMolecularBiology40：397-408)。Hsp40的一個(gè)具體實(shí)例是紫花苜蓿(M.sativa)MsJ1(Genbankref：AJ000995.1)。Hsp40在蛋白質(zhì)折疊、耐熱性和DNA復(fù)制等細(xì)胞活動(dòng)中作為分子伴侶而發(fā)揮作用。在各Hsp中，Hsp70及其輔伴侶分子(co-chaperone)Hsp40參與在合成完成前穩(wěn)定翻譯和新合成的多肽。不希望受理論限制，Hsp40與未折疊(新生或新轉(zhuǎn)移的)多肽的疏水補(bǔ)丁(hydrophobicpatch)相結(jié)合，因而有利于Hsp70-ATP復(fù)合物與該多肽的相互作用。ATP水解導(dǎo)致多肽、Hsp70和ADP之間形成穩(wěn)定的復(fù)合物并釋放Hsp40。Hsp70-ADP復(fù)合物與多肽之疏水補(bǔ)丁的締合阻止所述復(fù)合物與其他疏水補(bǔ)丁的相互作用，并防止不正確折疊以及與其他蛋白質(zhì)形成凝集體(綜述見(jiàn)于Hartl，F(xiàn)U.1996.Nature381：571-579)。天然伴侶蛋白能夠有利于低水平重組蛋白質(zhì)的正確折疊，然而當(dāng)表達(dá)水平提高時(shí)，大量的天然伴侶蛋白可變?yōu)橄拗埔蛩亍＝?jīng)農(nóng)桿菌滲入之葉中嵌合病毒蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)可導(dǎo)致嵌合病毒蛋白質(zhì)在胞質(zhì)溶膠中累積，而與一種或多于一種伴侶蛋白(例如Hsp70、Hsp40或者Hsp70及Hsp40二者)的共表達(dá)可降低錯(cuò)誤折疊或凝集之蛋白質(zhì)的水平，并提高蛋白質(zhì)(其展現(xiàn)出允許發(fā)生病毒樣顆粒形成的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)特征)的數(shù)目。因此，本發(fā)明還提供了在植物中產(chǎn)生嵌合病毒蛋白質(zhì)VLP的方法，其中將編碼嵌合病毒蛋白質(zhì)的第一核酸與編碼伴侶蛋白的第二核酸共表達(dá)。第一和第二核酸可在同一步驟中引入植物，或者可先后引入植物。根據(jù)本發(fā)明，由病毒來(lái)源的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的嵌合VLP不包含病毒基質(zhì)或核心蛋白。病毒基質(zhì)蛋白是組織并維持病毒體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。病毒基質(zhì)蛋白一般直接與細(xì)胞膜相互作用并且可參與出芽過(guò)程。病毒核心蛋白是組成核衣殼之一部分的蛋白質(zhì)并且通常直接與病毒核酸相締合。病毒基質(zhì)或核心蛋白的實(shí)例為流感M1、RSVM和逆轉(zhuǎn)錄病毒gag蛋白。已知M1蛋白結(jié)合RNA(WakefieldL.，和BrownleeG.G.，NuclAcidsres11：8569-8580，1989)，而RNA是VLP制備物中的污染物。當(dāng)獲得嵌合VLP產(chǎn)品的監(jiān)管部門審批時(shí)，不期望存在RNA，因此不含RNA的VLP制備物可以是有利的。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)區(qū)”、“調(diào)節(jié)元件”或“啟動(dòng)子”意指反映通常(但不總是)位于基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游的一部分核酸，其可由DNA或RNA或者DNA和RNA二者構(gòu)成。當(dāng)調(diào)節(jié)區(qū)有活性并與目的基因可操作地締合或可操作地相連接時(shí)，可導(dǎo)致所述目的基因的表達(dá)。調(diào)節(jié)元件能夠介導(dǎo)器官特異性，或控制發(fā)育基因或時(shí)序基因的活化?！罢{(diào)節(jié)區(qū)”可包括啟動(dòng)子元件、展現(xiàn)出基礎(chǔ)啟動(dòng)子活性的核心啟動(dòng)子元件、可響應(yīng)于外部刺激而誘導(dǎo)的元件、介導(dǎo)啟動(dòng)子活性的元件(例如負(fù)調(diào)節(jié)元件或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。本文中使用的“調(diào)節(jié)區(qū)”還可包括轉(zhuǎn)錄后有活性的元件，例如調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件(例如翻譯和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯和轉(zhuǎn)錄抑制子)、上游活化序列以及mRNA不穩(wěn)定性決定子(mRNAinstabilitydeterminant)。這后幾種元件中的幾種可位于編碼區(qū)附近。在本公開(kāi)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”或“調(diào)節(jié)區(qū)”通常是指一般(但不總是)位于結(jié)構(gòu)基因的編碼序列上游(5’)的DNA序列，其通過(guò)提供對(duì)RNA聚合酶和/或轉(zhuǎn)錄所需其他因子的識(shí)別來(lái)控制編碼區(qū)在特定位點(diǎn)起始表達(dá)。然而，應(yīng)理解，位于內(nèi)含子內(nèi)或序列3’端的其他核苷酸序列也可有助于調(diào)節(jié)目的編碼區(qū)的表達(dá)。提供對(duì)RNA聚合酶或其他轉(zhuǎn)錄因子之識(shí)別以確保在特定位點(diǎn)起始的調(diào)節(jié)元件的一個(gè)實(shí)例是啟動(dòng)子元件。大多數(shù)(但不是全部)真核生物啟動(dòng)子元件含有TATA盒，其是由腺苷和胸苷核苷酸堿基對(duì)構(gòu)成的保守核酸序列，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25個(gè)堿基對(duì)處。啟動(dòng)子元件包含負(fù)責(zé)起始轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)啟動(dòng)子元件以及修飾基因表達(dá)的其他調(diào)節(jié)元件(如上文所列舉)。存在數(shù)種類型的調(diào)節(jié)區(qū)，包括受發(fā)育調(diào)節(jié)的、誘導(dǎo)型的或組成型的調(diào)節(jié)區(qū)。受發(fā)育調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)區(qū)或?qū)λ刂苹虻牟町惐磉_(dá)進(jìn)行控制的調(diào)節(jié)區(qū)在特定器官或器官之組織內(nèi)、在該器官或組織的發(fā)育期間的特定時(shí)間被活化。然而，受發(fā)育調(diào)節(jié)的一些調(diào)節(jié)區(qū)也可偏好性地在某些器官或組織內(nèi)在特定發(fā)育階段有活性，它們還可以以受發(fā)育調(diào)節(jié)的方式有活性，或在植物內(nèi)的其他器官或組織中有基礎(chǔ)水平的活性。組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)的實(shí)例(例如參見(jiàn)特異性調(diào)節(jié)區(qū))包括napin啟動(dòng)子和cruciferin啟動(dòng)子(Rask等，1998，J.PlantPhysiol.152：595-599；Bilodeau等，1994，PlantCell14：125-130)。葉特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(參見(jiàn)US7,125,978，其通過(guò)引用并入本文)。誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)是能夠響應(yīng)于誘導(dǎo)物而直接或間接活化一種或更多種DNA序列或基因之轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)。當(dāng)不存在誘導(dǎo)物時(shí)，DNA序列或基因?qū)⒉粫?huì)被轉(zhuǎn)錄。通常，特異性結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)以活化轉(zhuǎn)錄的蛋白因子可以以無(wú)活性形式存在，然后通過(guò)誘導(dǎo)物直接或間接地轉(zhuǎn)化成活性形式。然而，也可以不存在蛋白因子。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)劑，例如蛋白質(zhì)、代謝物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物；或者通過(guò)加熱、冷卻、鹽或毒性元素直接施加的生理應(yīng)激，或通過(guò)病原體或致病物(diseaseagent)(例如病毒)的作用間接產(chǎn)生的生理應(yīng)激?？赏ㄟ^(guò)向細(xì)胞或植物外部施加誘導(dǎo)物(例如通過(guò)噴霧、澆水、加熱或類似方法)使含有誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)的植物細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)物。誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件可源自植物基因或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk，LR.P.，1998，TrendsPlantSci.3，352-358；其通過(guò)引用并入本文)?？赡艿恼T導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz，C.，1997，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.BioI.48，89-108；其通過(guò)引用并入本文)、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Aoyama.T.和Chua，N.H.，1997，Plant1.2，397-404；其通過(guò)引用并入本文)和乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Salter，M.G.，等，1998，Plant10urnal16，127-132；Caddick，M.X.，etal，1998，NatureBiotech.16，177-180，其通過(guò)引用并入本文)、細(xì)胞分裂素(cytokinin)誘導(dǎo)型IB6和CKI1基因(Brandstatter，I.和K.ieber，1.1.，1998，PlantCell10，1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science274，982-985；其通過(guò)引用并入本文)以及生長(zhǎng)素(auxin)誘導(dǎo)型元件DR5(Ulmasov，T.，等，1997，PlantCell9，1963-1971；其通過(guò)引用并入本文)。組成型調(diào)節(jié)區(qū)指導(dǎo)基因在整個(gè)植物的各部分中表達(dá)，以及在整個(gè)植物發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)。已知的組成型調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括與如下相關(guān)的啟動(dòng)子：CaMV35S轉(zhuǎn)錄物(Odell等，1985，Nature，313：810-812)、水稻肌動(dòng)蛋白1(Zhang等，1991，PlantCell，3：1155-1165)、肌動(dòng)蛋白2(An等，1996，PlantJ.，10：107-121)或tms2(U.S.5,428,147，其通過(guò)引用并入本文)以及磷酸丙糖異構(gòu)酶1(Xu等，1994，PlantPhysiol.106：459-467)基因、玉米泛素1基因(Cornejo等，1993，PlantMol.BioI.29：637-646)、擬南芥泛素1和6基因(Holtorf等，1995，PlantMol.BioI.29：637-646)以及煙草翻譯起始因子4A基因(Mandel等，1995，PlantMol.BioI.29：995-1004)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“組成型”不一定是指受組成型調(diào)節(jié)區(qū)控制的基因在所有細(xì)胞類型中以相同水平表達(dá)，而是指所述基因在很多種細(xì)胞類型中表達(dá)，但是常常觀察到不同的豐度。組成型調(diào)節(jié)元件可與另一些序列偶聯(lián)以進(jìn)一步增強(qiáng)與其可操作地相連接之核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，CMPV-HT系統(tǒng)源自豇豆花葉病毒(cowpeamosaicvirus，CPMV)的非翻譯區(qū)，并表明增強(qiáng)相關(guān)編碼序列的翻譯?！疤烊弧币庵负怂峄虬被嵝蛄惺翘烊坏模颉耙吧汀??！翱刹僮鞯叵噙B接”意指特定序列(例如調(diào)節(jié)元件和目的編碼區(qū))直接或間接地相互作用以實(shí)現(xiàn)預(yù)期功能(例如介導(dǎo)或調(diào)節(jié)基因表達(dá))?？刹僮鞯叵噙B接之序列的相互作用可例如通過(guò)與所述可操作地相連接之序列相互作用的蛋白質(zhì)來(lái)介導(dǎo)?？稍诎诓《镜?DNA或RNA)表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)或多肽，該表達(dá)系統(tǒng)例如但不限于基于豇豆花葉病毒組(comovirus)的表達(dá)盒(expressioncassette)和基于雙粒病毒組(geminivirus)的擴(kuò)增元件。本文中描述的表達(dá)系統(tǒng)可包含基于雙分體病毒(bipartitevirus)或具有二重基因組(bipartitegenome)之病毒的表達(dá)盒。例如，雙分體病毒可以為豇豆花葉病毒科(Comoviridae)。豇豆花葉病毒科的屬包括豇豆花葉病毒屬(Comovirus)、線蟲(chóng)傳多面體病毒屬(Nepovirus)、蠶豆病毒屬(Fabavirus)、櫻桃銼葉病毒屬(Cheravirus)和溫州蜜柑矮縮病毒屬(Sadwavirus)。豇豆花葉病毒屬包括豇豆花葉病毒(Cowpeamosaicvirus，CPMV)、豇豆重型花葉病毒(Cowpeaseveremosaicvirus，CPSMV)、南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus，SqMV)、紅三葉草斑駁病毒(Redclovermottlevirus，RCMV)、菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)、蕪菁環(huán)斑病毒(Turnipringspotvirus，TuRSV)、蠶豆真花葉病毒(Broadbeantruemosaicvirus，BBtMV)、蠶豆染色病毒(Broadbeanstainvirus，BBSV)、蘿卜花葉病毒(Radishmosaicvirus，RaMV)。包含可用于本發(fā)明多個(gè)方面之增強(qiáng)子元件的豇豆花葉病毒屬RNA-2序列的實(shí)例包括但不限于：CPMVRNA-2(GenBank檢索號(hào)NC_003550)、RCMVRNA-2(GenBank檢索號(hào)NC_003738)、BPMVRNA-2(GenBank檢索號(hào)NC_003495)、CPSMVRNA-2(GenBank檢索號(hào)NC_003544)、SqMVRNA-2(GenBank檢索號(hào)NC_003800)、TuRSVRNA-2(GenBank檢索號(hào)NC_013219.1)、BBtMVRNA-2(GenBank檢索號(hào)GU810904)、BBSVRNA2(GenBank檢索號(hào)FJ028650)、RaMV(GenBank檢索號(hào)NC_003800)。雙分體豇豆花葉病毒屬的RNA基因組的片段被稱為RNA-1和RNA-2。RNA-1編碼涉及復(fù)制的蛋白質(zhì)，而RNA-2編碼細(xì)胞至細(xì)胞移動(dòng)所必需的蛋白質(zhì)和兩種衣殼蛋白?？墒褂萌魏魏线m的基于豇豆花葉病毒屬的盒包括CPMV、CPSMV、SqMV、RCMV或BPMV，例如表達(dá)盒可基于CPMV?！氨磉_(dá)盒”指這樣的核苷酸序列，其包含受用于在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄目的核酸的適當(dāng)啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)元件控制并與其可操作地相連接的目的核酸。表達(dá)系統(tǒng)還可包含來(lái)自雙生病毒組的擴(kuò)增元件，例如來(lái)自菜豆黃矮病毒(beanyellowdwarfvirus，BeYDV)的擴(kuò)增元件。BeYDV屬于適于雙子葉植物的玉米線條病毒屬(Mastrevirus)。BeYDV為具有單鏈環(huán)狀DNA基因組的單組分并且可通過(guò)滾環(huán)機(jī)制進(jìn)行復(fù)制以達(dá)到非常高的拷貝數(shù)。源自BeYDV的DNA復(fù)制子載體系統(tǒng)已經(jīng)用于在植物中迅速高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。本文中使用的短語(yǔ)“復(fù)制元件”指包含雙生病毒組基因組之一個(gè)或更多個(gè)長(zhǎng)基因間隔區(qū)(longintergenicregion，LIR)的至少一部分的核酸區(qū)段。本文中使用的“長(zhǎng)基因間隔區(qū)”指包含能夠通過(guò)雙生病毒組Rep蛋白質(zhì)介導(dǎo)切除和復(fù)制的rep結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)基因間隔區(qū)的區(qū)域。在一些方面中，包含一個(gè)或更多個(gè)LIR的核酸片段還可包含雙生病毒組基因組的短基因間隔區(qū)(shortintergenicregion，SIR)。本文中使用的“短基因間隔區(qū)”指互補(bǔ)鏈(玉米線條病毒屬的短IR(SIR))。本文中可使用任何合適的雙生病毒來(lái)源的復(fù)制元件。參見(jiàn)，例如，WO2000/20557；WO2010/025285；ZhangX.等(2005，BiotechnologyandBioengineering，第93卷，271-279)，HuangZ.等(2009，BiotechnologyandBioengineering，第103卷，706-714)，HuangZ.等(2009，BiotechnologyandBioengineering，第106卷，9-17)；其通過(guò)引用并入本文?？勺鳛閬?lái)自嵌合核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)或嵌合多肽，并且合成后對(duì)嵌合蛋白質(zhì)或嵌合多肽進(jìn)行切割，需要時(shí)進(jìn)行締合以形成多聚體蛋白質(zhì)。因此，嵌合蛋白質(zhì)或嵌合多肽還包含含有通過(guò)二硫鍵(disulphidebridge)締合之亞單位的蛋白質(zhì)或多肽(即，多聚體蛋白質(zhì))。例如，包含來(lái)自兩個(gè)或多于兩個(gè)來(lái)源之氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亞單位，并且該亞單位通過(guò)二硫鍵締合以產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)或嵌合多肽。根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的嵌合病毒蛋白質(zhì)包含來(lái)自流感HA的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM/CT)。TM/CT可以是來(lái)自任何流感病毒類型或亞型(包括，例如B、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16類型或亞型)的天然HATM/CT。H1、H3、H5或B類型或亞型的非限制性實(shí)例包括A/新喀里多尼亞/20/99亞型(H1N1)、H1A/加利福尼亞/04/09亞型(H1N1)、A/印度尼西亞/5/05亞型(H5N1)、A/布里斯班/59/2007、B/佛羅里達(dá)/4/2006和H3A/布里斯班/10/2007(參見(jiàn)例如WO2009/009876；WO2009/076778；WO2010/003225；WO2010/003235，其通過(guò)引用并入本文)。另外，TM/CT可以是那些HATM/CT中的任何一個(gè)，其中缺失了1、2、3、4或5個(gè)氨基酸，或添加了1、2、3、4或5個(gè)氨基酸的任何種類間隔區(qū)或接頭序列。優(yōu)選地，TM/CT來(lái)自H5或H3，例如但不限于A/印度尼西亞/5/05亞型(H5N1；“H5/Indo”；GenBank檢索號(hào)ABW06108.1)、H5A/越南/1194/2004(A-越南；GenBank檢索號(hào)ACR48874.1)、H5A/安徽/1/2005(A-安徽；GenBank檢索號(hào)ABD28180.1)；H3A/布里斯班/10/2007(“H3/Bri”；GenBank檢索號(hào)ACI26318.1)、H3A/威斯康星/67/2005(A-WCN；GenBank檢索號(hào)ABO37599.1)。數(shù)個(gè)H3和H5序列邊界的TM/CT描述于WO2010/148511(其通過(guò)引用并入本文)。TM/CT之氨基酸序列的非限制性實(shí)例包括SEQIDNO：41和42，以及編碼SEQIDNO：41或42之氨基酸序列的任何核苷酸序列。在流感病毒的血凝素中允許氨基酸變異。這樣的變異提供了不斷被鑒定的新菌株。新菌株之間的感染性可不同。然而，維持血凝素三聚體的形成(隨后形成VLP)。因此，本發(fā)明提供了包含血凝素氨基酸序列的嵌合病毒蛋白質(zhì)，或編碼包含血凝素氨基酸序列之嵌合病毒蛋白質(zhì)的核酸，所述嵌合病毒蛋白質(zhì)在植物中形成VLP并且包括可開(kāi)發(fā)的已知序列和變體HA序列。術(shù)語(yǔ)“病毒樣顆粒(VLP)”或者“病毒樣顆?！被颉癡LP”指自裝配并且包含結(jié)構(gòu)蛋白(例如嵌合病毒蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)。VLP和嵌合VLP通常在形態(tài)上和抗原性上與感染中產(chǎn)生的病毒體類似，但是缺乏足以復(fù)制的遺傳信息，因此是非感染性的。可在合適的宿主細(xì)胞(包括植物宿主細(xì)胞)中產(chǎn)生VLP和嵌合VLP。從宿主細(xì)胞提取之后，在合適的條件下分離并進(jìn)一步純化后，VLP和嵌合VLP可作為完整結(jié)構(gòu)來(lái)純化。本發(fā)明的嵌合VLP可以在特征在于缺少使蛋白質(zhì)唾液酸化之能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，所述宿主細(xì)胞例如植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、真菌和其他生物(包括海綿動(dòng)物(sponge)、腔腸動(dòng)物(coelenterara)、環(huán)節(jié)動(dòng)物(annelida)、節(jié)肢動(dòng)物(arthoropoda)、軟體動(dòng)物(mollusca)、線形動(dòng)物(nemathelminthea)、擔(dān)輪動(dòng)物(trochelmintes)、扁形動(dòng)物(plathelminthes)、毛顎動(dòng)物(chaetognatha)、觸手動(dòng)物(tentaculate)、衣原體(chlamydia)、螺旋體(spirochetes)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(gram-positivebacteria)、藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)、古細(xì)菌(archaebacteria)等。參見(jiàn)，例如Gupta等，1999.NucleicAcidsResearch27：370-372；Toukach等，2007.NucleicAcidsResearch35：D280-D286；Nakahara等，2008.NucleicAcidsResearch36：D368-D371。本發(fā)明還提供了從細(xì)胞的質(zhì)膜獲得脂質(zhì)包膜的嵌合VLP，所述細(xì)胞中表達(dá)嵌合VLP。例如，如果嵌合病毒在基于植物的系統(tǒng)中表達(dá)，那么所得嵌合VLP可從該植物細(xì)胞的質(zhì)膜獲得脂質(zhì)包膜。通常，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)”指脂溶性的(親脂性的)天然分子。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，在植物中產(chǎn)生的嵌合VLP可與植物來(lái)源的脂質(zhì)復(fù)合。植物來(lái)源的脂質(zhì)可以是脂雙層形式，并且還可包含圍繞VLP的包膜。植物來(lái)源的脂質(zhì)可包含產(chǎn)生VLP之植物的質(zhì)膜的脂質(zhì)組分，包括磷脂、甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯，以及脂溶性固醇或包含固醇的代謝物。實(shí)例包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、鞘糖脂、植物固醇或其組合。植物來(lái)源的脂質(zhì)可作為替代地稱為“植物脂質(zhì)”。植物固醇的實(shí)例包括菜油固醇(campesterol)、豆固醇(stigmasterol)、麥角固醇(ergosterol)、菜子固醇(brassicasterol)、Δ-7-豆固醇、Δ-7-燕麥固醇(delta-7-avenasterol)、胡蘿卜固醇(daunosterol)、谷固醇(sitosterol)、24-甲基膽固醇、膽固醇或β-谷固醇(參見(jiàn)，例如Mongrand等，2004)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)組成可隨細(xì)胞或獲得細(xì)胞之生物或物種的培養(yǎng)或生長(zhǎng)條件而不同。通常，β-谷固醇是最大量的植物固醇。細(xì)胞膜通常包含脂雙層以及各種功能的蛋白質(zhì)。在脂雙層中可發(fā)現(xiàn)局部集中的特定脂質(zhì)，稱為“脂質(zhì)筏(lipidraft)”。這些脂質(zhì)筏微結(jié)構(gòu)域可富含鞘脂和固醇。不希望受理論限制，脂質(zhì)筏可在胞吞和胞吐作用、病毒或其他感染性病原體的進(jìn)入或逸出(egress)、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、與細(xì)胞或生物體的其他結(jié)構(gòu)組分(例如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì))相互作用中發(fā)揮重要作用。在植物內(nèi)產(chǎn)生的VLP可誘導(dǎo)包含植物特異性N-聚糖的嵌合病毒蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明還提供了包含具有植物特異性N-聚糖之嵌合病毒蛋白質(zhì)的VLP。此外，植物中N-聚糖的修飾是已知的(參見(jiàn)例如U.S.60/944,344；其通過(guò)引用并入本文)，并且可產(chǎn)生具有經(jīng)修飾N-聚糖的嵌合病毒蛋白質(zhì)?？色@得包含經(jīng)修飾糖基化模式(例如巖藻糖基化降低、木糖基化降低、或巖藻糖基化和木糖基化二者均減少)之N-聚糖的嵌合病毒蛋白質(zhì)，或者可獲得具有經(jīng)修飾糖基化模式的嵌合病毒蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)缺少巖藻糖基化、木糖基化或兩者皆缺少，并包含提高的半乳糖基化。此外，與表達(dá)嵌合病毒蛋白質(zhì)的野生型植物相比，翻譯后修飾的調(diào)節(jié)(例如添加末端半乳糖)可導(dǎo)致所表達(dá)嵌合病毒蛋白質(zhì)的巖藻糖基化和木糖基化降低。例如(但不視為限制)，合成具有經(jīng)修飾糖基化模式的嵌合病毒蛋白質(zhì)可通過(guò)使嵌合病毒蛋白質(zhì)與編碼β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)(例如，但不限于哺乳動(dòng)物GalT或人GalT，但是也可以使用其他來(lái)源的GalT)的核苷酸序列一起共表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。還可將GalT的催化結(jié)構(gòu)域與N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(GNT1)的CTS結(jié)構(gòu)域(即胞質(zhì)尾區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、主干區(qū)(stemregion))相融合以產(chǎn)生GNT1-GalT雜交酶(hybridenzyme)，并且所述雜交酶可與嵌合病毒蛋白質(zhì)共表達(dá)。嵌合病毒蛋白質(zhì)還可與編碼N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(GnT-III)(例如但不限于哺乳動(dòng)物GnT-III或人GnT-III，還可使用其他來(lái)源的GnT-III)的核苷酸序列一起共表達(dá)。另外，還可使用包含與GnT-III相融合之GNT1的CTS的GNT1-GnT-III雜交酶。因此，本發(fā)明還提供了包含具有經(jīng)修飾N-聚糖的嵌合病毒蛋白質(zhì)的VLP。不希望受理論限制，嵌合病毒蛋白質(zhì)上存在植物N-聚糖可通過(guò)促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞與嵌合病毒蛋白質(zhì)的結(jié)合來(lái)刺激免疫應(yīng)答。Saint-jore-Dupas等(2007)已提出使用植物N-聚糖來(lái)刺激免疫應(yīng)答。此外，VLP的構(gòu)象對(duì)于抗原的呈遞可以是有利的，并且當(dāng)與植物來(lái)源的脂質(zhì)層復(fù)合時(shí)增強(qiáng)VLP的佐劑作用?？赏ㄟ^(guò)例如血細(xì)胞凝集測(cè)定、電子顯微鏡或通過(guò)尺寸排阻色譜來(lái)評(píng)估VLP的結(jié)構(gòu)和大小。對(duì)于尺寸排阻色譜而言，可通過(guò)以下方法從植物組織提取總可溶性蛋白質(zhì)：將冷凍粉碎的植物材料的樣品在提取緩沖液中勻漿(Polytron)，并通過(guò)離心除去不溶性的物質(zhì)。用冰冷的丙酮或PEG進(jìn)行沉淀也可以是有益的。對(duì)可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，并將提取物通過(guò)SephacrylTM柱(例如SephacrylTMS500柱)。BlueDextran2000可用作校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施色譜之后，可通過(guò)免疫印跡進(jìn)一步分析級(jí)分以確定級(jí)分的蛋白質(zhì)全量(complement)。經(jīng)分離的級(jí)分可以是例如上清液(如果離心、沉降或沉淀)或?yàn)V液(如果過(guò)濾)，并且富含蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(例如花結(jié)樣結(jié)構(gòu)(rosette-likestructure)或更高級(jí)更高分子量的顆粒如VLP)。還可通過(guò)額外的離心步驟、沉淀、色譜步驟(例如尺寸排阻、離子交換、親和色譜)切向流過(guò)濾(tangentialflowfiltration)或其組合來(lái)處理經(jīng)分離的級(jí)分以對(duì)蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純化、濃縮或其組合。可通過(guò)例如非變性PAGE或SDS-PAGE、使用適當(dāng)檢測(cè)抗體的Western分析、毛細(xì)管電泳、電子顯微鏡或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言顯然的任何其他方法來(lái)確證經(jīng)純化的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的存在。洗脫譜可根據(jù)所用洗脫條件而不同。圖7、8O和11B示出了包含嵌合VLP之植物提取物的尺寸排阻色譜分析的洗脫譜。在這種情況中，在柱的空體積洗脫出包含嵌合HIV、嵌合狂犬病G和嵌合VZV病毒三聚體表面蛋白的VLP，從約級(jí)分13至14洗脫出花結(jié)和高分子量結(jié)構(gòu)，以及在來(lái)自約15至約17的級(jí)分中洗脫出低分子量或可溶性形式的嵌合病毒三聚體表面蛋白?？墒褂萌魏魏线m的方法(例如化學(xué)或生物化學(xué)提取)純化或提取VLP。VLP對(duì)干燥、加熱、pH、表面活性劑和去污劑相對(duì)敏感。因此，可用于使用這樣的方法：使產(chǎn)量最大化、使具有細(xì)胞蛋白質(zhì)之VLP級(jí)分的污染最小化、維持蛋白質(zhì)或VLP和(需要時(shí))締合脂質(zhì)包膜或膜的完整性的方法，使細(xì)胞壁松動(dòng)以釋放蛋白質(zhì)或VLP的方法。例如，可使用產(chǎn)生原生質(zhì)體/原生質(zhì)球的方法(參見(jiàn)例如WO2011/035422，其通過(guò)引用并入本文)以獲得本文中描述的VLP。盡可能減小或消除使用去污劑或表面活性劑(例如SDS或TritonX-100)可對(duì)提高VLP提取的產(chǎn)率有益。隨后，可通過(guò)例如電子顯微鏡或通過(guò)如上所述尺寸排阻色譜來(lái)評(píng)估VLP的結(jié)構(gòu)和大小。本發(fā)明的一種或多于一種或更多種嵌合基因構(gòu)建體可在由本發(fā)明的核苷酸序列、構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的任意合適的植物宿主中表達(dá)。合適宿主的實(shí)例包括但不限于農(nóng)作物，包括苜蓿、油菜、蕓苔屬(Brassicaspp.)、玉米、煙草屬(Nicotianaspp.)、苜蓿、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、稻、大豆、小麥、大麥、向日葵和棉花等。本發(fā)明的一種或更多種嵌合基因構(gòu)建體還可包含3’非翻譯區(qū)。3’非翻譯區(qū)是指這樣的基因部分，其包含含有多腺苷酸化信號(hào)和能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)之任意其他調(diào)節(jié)信號(hào)的DNA區(qū)段。多腺苷酸化信號(hào)的特征一般在于向mRNA前體的3’端添加聚腺苷酸鏈(polyadenylicacidtrack)。多腺苷酸化信號(hào)常通過(guò)存在與規(guī)范形式5’AATAAA-3’的同源性來(lái)識(shí)別，但是也會(huì)出現(xiàn)變異。合適的3’區(qū)的非限制性實(shí)例是含有以下基因之多腺苷酸化信號(hào)的3’經(jīng)轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)：農(nóng)桿菌(Agrobacterium)腫瘤誘導(dǎo)(tumorinducing，Ti)質(zhì)?；?例如胭脂氨酸合成酶(nopalinesynthase，NOS)基因)、植物基因(例如大豆貯藏蛋白基因)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞單位的基因(ssRUBISCO；US4,962,028；其通過(guò)引用并入本文)、在US7,125,978(其通過(guò)引用并入本文)中描述的用于調(diào)節(jié)質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)的啟動(dòng)子。需要時(shí)，本發(fā)明的一種或更多種嵌合基因構(gòu)建體還可包含另外的增強(qiáng)子(翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。增強(qiáng)子可位于轉(zhuǎn)錄序列的5′或3′。增強(qiáng)子區(qū)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可包括ATG起始密碼子、鄰近序列等。如果存在，起始密碼子可在編碼序列的閱讀框內(nèi)(“框內(nèi)的”)，以提供經(jīng)轉(zhuǎn)錄序列的正確翻譯?？墒褂肨i質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等將本發(fā)明的構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞中。此類技術(shù)的綜述參見(jiàn)例如Weissbach和Weissbach，MethodsforPlantMolecularBiology，AcademyPress，紐約VIII，421-463頁(yè)(1988)；Geierson和Corey，PlantMolecularBiology，第2版(1988)；以及Miki和Iyer；FundamentalsofGeneTransferinPlants.PlantMetabolism，第2版，DT.Dennis，DHFurpin，DDLefebrve，DBLayzell(編)，AddisonWesly，LangmansLtd.London，561-579頁(yè)(1997)。其他的方法包括直接DNA攝入、使用脂質(zhì)體、電穿孔(例如使用原生質(zhì)體)、顯微注射、微粒(microprojectile)或晶須(whiskers)、以及真空滲入(vacuuminfiltration)。參見(jiàn)例如Bilang等(Gene100：247-250(1991))、Scheid等(Mol.Gen.Genet.228：104-112，1991)、Guerche等(PlantScience52：111-116，1987)、Neuhause等(Theor.ApplGenet.75：30-36，1987)、Klein等，Nature327：70-73(1987)、Howell等(Science208：1265，1980)、Horsch等(Science227：1229-1231，1985)、DeBlock等，PlantPhysiology91：694-701，1989)，MethodsforPlantMolecularBiology(Weissbach和Weissbach編，AcademicPressInc.，1988)、MethodsinPlantMolecularBiology(Schuler和Zielinski編，AcademicPressInc.，1989)、Liu和Lomonossoff(J.VirolMeth，105：343-348，2002)；美國(guó)專利No.4,945,050；5,036,006；和5,100,792，1995年5月10日提交的序列號(hào)為08/438,666的美國(guó)專利申請(qǐng)和1992年9月25日提交的序列號(hào)為07/951,715的美國(guó)專利申請(qǐng))(所有這些文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文)。如下文所述，可使用瞬時(shí)表達(dá)法表達(dá)本發(fā)明的構(gòu)建體(參見(jiàn)Liu和Lomonossoff，2002，JournalofVirologicalMethods，105：343-348；其通過(guò)引用并入本文)?；蛘撸墒褂没谡婵盏乃矔r(shí)表達(dá)法，如Kapila等，1997(其通過(guò)引用并入本文)所述。這些方法可包括例如但不限于農(nóng)桿菌接種法或農(nóng)桿菌滲入法、注射器滲入法，然而，還可使用其他瞬時(shí)方法，如上所述。使用農(nóng)桿菌接種法、農(nóng)桿菌滲入法或注射器滲入法時(shí)，包含期望核酸的農(nóng)桿菌混合物進(jìn)入組織(例如葉、植物的地上部分(包括莖、葉和花)、植物的其他部分(莖、根、花)或整個(gè)植株)的細(xì)胞間隙中。穿過(guò)表皮后，農(nóng)桿菌感染細(xì)胞并將t-DNA拷貝轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。t-DNA以附加體形式轉(zhuǎn)錄并且其mRNA被翻譯，導(dǎo)致在感染細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白，然而，t-DNA在細(xì)胞核內(nèi)的這種傳遞是瞬時(shí)的。為了幫助鑒定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，可進(jìn)一步處理本發(fā)明的構(gòu)建體以使其包含植物選擇標(biāo)記?？捎玫倪x擇標(biāo)記包括提供針對(duì)化學(xué)品(例如抗生素，如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草劑，如膦絲菌素(phosphinothrycin)、草甘膦(glyphosate)、氯磺隆(chlorosulfuron)等)之抗性的酶。類似地，可使用產(chǎn)生可通過(guò)顏色變化進(jìn)行鑒別之化合物的酶(例如GUS(β-葡萄糖醛酸酶))或化學(xué)發(fā)光的酶(螢光素酶或GFP)。作為本發(fā)明的一部分，還考慮含有本發(fā)明的嵌合基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或種子。從植物細(xì)胞再生完整植物的方法也是本領(lǐng)域中已知的。通常，將經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，該培養(yǎng)基可含有選擇劑(例如抗生素)，其中使用選擇標(biāo)記以有利于鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。愈傷組織(callus)一旦形成，可根據(jù)已知的方法施用適當(dāng)?shù)闹参锛に貋?lái)促進(jìn)芽的形成，并將芽移至生根培養(yǎng)基(rootingmedium)中用于植物的再生。然后，通過(guò)種子或利用植物營(yíng)養(yǎng)繁殖(vegetativepropagation)技術(shù)，該植物可反復(fù)用于形成子代。還可不使用組織培養(yǎng)物來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明包括核苷酸序列：表1.序列識(shí)別碼的列表。將在以下實(shí)施例中進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1：用HIV蛋白質(zhì)裝配表達(dá)盒2X35S-CPMVHT-PDISP-HIVConSΔCFI-NOS(995號(hào)表達(dá)盒)如下所述，將編碼與具有天然跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)之HIVConSΔCFI相融合的苜蓿DPI信號(hào)肽的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表達(dá)系統(tǒng)中。首先，根據(jù)Liao等(2006，Virology353：268-282)公開(kāi)的序列通過(guò)GeneArtAG(Regensburg，Germany)合成包含天然信號(hào)肽以及跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之HIVConSΔCFI基因的核酸序列。HIVConSΔCFI的核酸序列如圖1A所示(SEQIDNO：1)。通過(guò)由Darveau等(MethodsinNeuroscience26：77-85(1995))所示的基于RCP的連接方法，將苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的信號(hào)肽(PDISP)(32～103位核苷酸；檢索號(hào)Z11499)與HIVConSΔCFI相連接。在第一輪PCR中，利用540號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于540號(hào)構(gòu)建體的序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖52，SEQIDNO：61，其通過(guò)引用并入本文)作為模板，使用引物IF-ApaI-SpPDI.c(圖1B，SEQIDNO：2)和SpPDI-HIVgp145.r(圖1C，SEQIDNO：3)擴(kuò)增含有PDISP的片段。利用合成的ConSΔCFI片段(圖1A，SEQIDNO：1)作為模板，使用引物IF-SpPDI-gp145.c(圖1D，SEQIDNO：4)和WtdTm-gp145.r(圖1E，SEQIDNO：5)擴(kuò)增含有沒(méi)有天然信號(hào)肽之ConSΔCFI的第二片段。在第二輪PCR中，將引物IF-ApaI-SpPDI.c(圖1B，SEQIDNO：2)和WtdTm-gp145.r(圖1E，SEQIDNO：5)與來(lái)自第一輪PCR的作為模板的兩個(gè)PCR產(chǎn)物一起使用。將所得PCR產(chǎn)物用ApaI限制性酶酶切消化并克隆到用ApaI-StuI酶切消化的修飾972構(gòu)建體中。對(duì)經(jīng)修飾的972接受體質(zhì)粒(對(duì)于972號(hào)構(gòu)建體的原始序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖94，SEQIDNO：134，其通過(guò)引用并入本文)進(jìn)行處理以消除2X35S啟動(dòng)子上游的SbfI限制性位點(diǎn)。通過(guò)以下方法來(lái)消除SbfI位點(diǎn)，用SbfI酶切消化質(zhì)粒972，用T4DNA聚合酶處理所得質(zhì)粒以移除3’突出端，然后使經(jīng)處理的質(zhì)粒再連接，從而得到?jīng)]有SbfI位點(diǎn)的經(jīng)修飾972質(zhì)粒。將所得構(gòu)建體命名為995號(hào)(圖1F，SEQIDNO：6)。PDISP-HIVConSΔCFI的氨基酸序列如圖1G所示(SEQIDNO：7)。995號(hào)質(zhì)粒的示意圖如圖1H所示。該構(gòu)建體不編碼M1蛋白。2X35S-CPMVHT-PDISP-HIVConSΔCFI+H3A/布里斯斑/10/2007(TmD+Cyto尾)-NOS(997號(hào)構(gòu)建體)使用由Darveau等(MethodsinNeuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的連接方法，將編碼與HIVConSΔCFI以及與H3A/布里斯班/10/2007之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相融合的苜蓿DPI信號(hào)肽的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表達(dá)系統(tǒng)中。在第一輪PCR中，利用995號(hào)構(gòu)建體(圖1F，SEQIDNO：6)作為模板，使用引物IF-ApaI-SpPDI.c(圖1B，SEQIDNO：2)和IF-H3dTm+gp145.r(圖2A，SEQIDNO：8)擴(kuò)增含有沒(méi)有天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之PDISP-HIVConSΔCFI的片段。利用776號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于776號(hào)構(gòu)建體的序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖60，SEQIDNO：69，其通過(guò)引用并入本文)作為模板，使用引物Gp145+H3dTm.c(圖2B，SEQIDNO：9)和H3dTm.r(圖2C，SEQIDNO：10)擴(kuò)增含有H3A/布里斯班/10/2007之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的第二片段。然后將來(lái)自這兩次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物混合并作為模板用于使用IF-ApaI-SpPDI.c(圖1B，SEQIDNO：2)和H3dTm.r(圖2C，SEQIDNO：10)作為引物的第二輪擴(kuò)增。之后用ApaI酶切消化第二PCR的產(chǎn)物并克隆到用ApaI和StuI限制性酶酶切消化的995號(hào)構(gòu)建體(圖1F，SEQIDNO：6)中。將所得構(gòu)建體命名為997號(hào)(圖2D，SEQIDNO：11)。PDISP-HIVConSΔCFI-A/布里斯班/10/2007H3TM+CT的氨基酸序列如圖2E所示(SEQIDNO：12)。997質(zhì)粒示意圖如圖2F所示。該構(gòu)建體不編碼M1蛋白。2X35S-CPMVHT-PDISP-HIVConSΔCFI-H5A/印度尼西亞/5/2005(TmD+Cyto尾區(qū))-NOS(999號(hào)構(gòu)建體)如下使用由Darveau等(MethodsinNeuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的連接方法，將編碼與HIVConSΔCFI以及與H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相融合的苜蓿DPI信號(hào)肽的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表達(dá)系統(tǒng)中。在第一輪PCR中，利用995號(hào)構(gòu)建體(圖1F，SEQIDNO：6)作為模板，使用引物IF-ApaI-SpPDI.c(圖1B，SEQIDNO：2)和IF-H5dTm+gp145.r(圖3A，SEQIDNO：13)擴(kuò)增含有沒(méi)有天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之PDISP-HIVConSΔCFI的片段。利用972號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于972號(hào)構(gòu)建體序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖94，SEQIDNO：134，其通過(guò)引用并入本文)作為模板，使用引物Gp145+H5dTm.c(圖3B，SEQIDNO：15)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)擴(kuò)增含有H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的第二片段。之后將來(lái)自這兩次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物混合并作為模板用于使用IF-ApaI-SpPDI.c(圖1B，SEQIDNO：2)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)作為引物的第二輪擴(kuò)增。之后用ApaI酶切消化第二PCR的產(chǎn)物并克隆到用ApaI和StuI限制性酶酶切消化的995號(hào)構(gòu)建體(圖1F，SEQIDNO：6)中。將所得構(gòu)建體命名為999號(hào)(圖3D，SEQIDNO：16)。PDISP-HIVConSΔCFI-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如圖3E所示(SEQIDNO：17)。999號(hào)質(zhì)粒示意圖如圖3F所示。該構(gòu)建體不編碼M1蛋白。質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素(構(gòu)建體172號(hào)構(gòu)建體)如下所述，在苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子與3’UTR和終止子之間克隆編碼來(lái)自番茄叢矮病毒(TomatoBushyStuntVirus，TBSV)之P19沉默抑制子的序列。用限制性酶DraIII(起始ATG上游的84個(gè)堿基對(duì))和SacI(終止密碼子下游的9個(gè)堿基對(duì))酶切消化R472號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于裝配，參見(jiàn)WO2010/003225A1，其通過(guò)引用并入本文；對(duì)于R472質(zhì)粒的示意圖，參見(jiàn)WO2010/003225A1的圖86)，以移除包含來(lái)自苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和編碼TBSVP19沉默抑制子之序列的84bp的片段。將所得片段克隆到預(yù)先用DraIII和SacI酶切消化的構(gòu)建體540(對(duì)于裝配，參見(jiàn)WO2010/003225，其通過(guò)引用并入本文；對(duì)于540號(hào)質(zhì)粒的示意圖，參見(jiàn)同一專利的圖6)中。將所得構(gòu)建體命名為172號(hào)(SEQIDNO：4A，圖18)。TBSVP19蛋白質(zhì)的氨基酸序列如圖4B所示(SEQIDNO：19)。172號(hào)質(zhì)粒示意圖如圖4C所示。植物生物質(zhì)的制備、接種和農(nóng)桿菌滲入本文中使用的術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”和“植物物質(zhì)”意指反映源自植物的任何物質(zhì)。生物質(zhì)或植物物質(zhì)可包括整個(gè)植物、組織、細(xì)胞或其任何級(jí)分。另外，生物質(zhì)或植物物質(zhì)可包括細(xì)胞內(nèi)植物組分、細(xì)胞外植物組分、植物的體液或固體提取物、或其組合。另外，生物質(zhì)或植物物質(zhì)可包括來(lái)自植物葉、莖、果實(shí)、根或其組合的植物、植物細(xì)胞、組織、液體提取物、或其組合。植物的一部分可包括植物物質(zhì)或生物質(zhì)。在填裝市售的泥炭蘚(peatmoss)基質(zhì)的平地中由種子培養(yǎng)本塞姆氏煙草。使植物生長(zhǎng)在溫室中，16/8光照周期，溫度方案為白天25℃/晚上20℃。播種3周后，挑出單個(gè)小植株，移栽到盆中，并在同樣的環(huán)境條件下在溫室中再生長(zhǎng)3周。在補(bǔ)充有10mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧芐青霉素的YEB培養(yǎng)基(pH5.6)中培養(yǎng)用每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，直至其OD600達(dá)到0.6至1.6。使用前將農(nóng)桿菌懸液離心并重懸在滲入培養(yǎng)基(10mMMgCl2和10mMMES，pH5.6)中，然后儲(chǔ)存在4℃過(guò)夜。在滲入當(dāng)天，將分批培養(yǎng)物稀釋成2.5倍培養(yǎng)物體積并在使用前溫?zé)?。?0～40托(Torr)真空下，使本塞姆氏煙草的整個(gè)植株倒置于氣密性不銹鋼罐中的細(xì)菌懸液中2分鐘。將植株移回溫室中培養(yǎng)2～6天直至收獲。除非另有指明，否則所有滲入均通過(guò)與菌株AGL1/172以1∶1的比率共滲入來(lái)進(jìn)行。通過(guò)使用“AGL1”前綴來(lái)表示包含本文中描述的多種構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)菌株。例如，包含995號(hào)構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌(參見(jiàn)圖1H)命名為“AGL1/995”。葉收獲和總蛋白質(zhì)提取孵育后，收獲植物的地上部分，冷凍在-80℃，破碎成碎片。通過(guò)將每個(gè)冷凍破碎植物材料的樣品在3倍體積的冷的50mMTris(pH8.0)、0.15MNaCl、0.1％TritonX-100和1mM苯甲基磺酰氟中勻漿(Polytron)而提取總可溶性蛋白質(zhì)。勻漿后，于4℃下以10,000g對(duì)漿液離心10分鐘，保存這些澄清的粗提物(上清液)用于分析。蛋白質(zhì)分析和免疫印跡使用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Bradford測(cè)定(Bio-Rad，Hercules，CA)對(duì)澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylenedifulorid，PVDF)膜(RocheDiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)上用于免疫檢測(cè)。在免疫印跡之前，用Tris緩沖鹽水中的5％脫脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封閉該膜16～18小時(shí)。通過(guò)用1∶2500稀釋的2μg/ml山羊多克隆抗gp120一抗(Abcam，ab21179)(在2％脫脂乳、0.1％TBS-Tween20中)孵育進(jìn)行免疫印跡。在與1∶10000稀釋的過(guò)氧化物酶綴合的驢抗山羊二抗(JIR705-035-147)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脫脂乳中)孵育之后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。使用魯米諾(luminol)(RocheDiagnosticsCorporation)作為底物，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)免疫反應(yīng)性復(fù)合物。實(shí)施例2：天然和嵌合HIV包膜蛋白在植物中的表達(dá)HIVConSΔCFI為gp41中具有縮短可變環(huán)、缺失切割位點(diǎn)、融合結(jié)構(gòu)域和免疫顯性區(qū)的共有序列HIVM組包膜蛋白。表明引起跨亞型中和抗體與豚鼠中野生型包膜蛋白的寬度或滴度類似或比其更大(Liao等，Virology(2006)353：268-282)。圖5示出了在該研究中使用的構(gòu)建體，在995號(hào)構(gòu)建體中，包含天然TM/CT的成熟HIVConSΔCFI(后文稱之為Env)的編碼區(qū)受CPMV-HT表達(dá)系統(tǒng)的控制。在997和999號(hào)構(gòu)建體中，HIVEnv的TM/CT結(jié)構(gòu)域被分別來(lái)自A/布里斯班/10/2007(H3N2)和A/印度尼西亞/05/2005(H5N1)之流感血凝素(HA)的那些替換。在所有情況中，植物來(lái)源的信號(hào)肽(來(lái)自苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(DPI)蛋白質(zhì))替換了天然HIVEnv蛋白信號(hào)肽。在經(jīng)農(nóng)桿菌滲入的本塞姆氏煙草中比較了來(lái)自構(gòu)建體995、997和999的HIVEnv的產(chǎn)生。通過(guò)Western印跡分析了來(lái)自用AGL1/995、AGL1/997和AGL1/999滲入之植物的蛋白質(zhì)提取物，結(jié)果如圖6所示，其中泳道1至4為包含不同量重組HIV-1gp160(ab68171)的陽(yáng)性對(duì)照；泳道5，陰性對(duì)照；泳道6至8，從AGL1/995滲入的葉提取的蛋白質(zhì)；泳道9和10，從AGL1/997滲入的葉提取的蛋白質(zhì)；泳道11和12，從AGL1/999滲入的葉提取的蛋白質(zhì)。如圖6所示，在用于檢測(cè)的條件中可能沒(méi)有檢測(cè)到天然HIVEnv的表達(dá)，確證HIVEnv蛋白在植物中的先前報(bào)道的非常低的積累水平(Rybicki等，2010，PlantBiotechnologyJournal8：620-637)。Env的嵌合形式(其中TM/CT結(jié)構(gòu)域被替換為流感病毒H3(構(gòu)建體#997)或H5(構(gòu)建體#999)的結(jié)構(gòu)域)以比天然形式高的多的水平積累。如上所述，#997和#999構(gòu)建體不編碼M1蛋白。實(shí)施例3：嵌合HIVEnv裝配成病毒樣顆粒還檢測(cè)了在不存在核心蛋白或基質(zhì)蛋白下嵌合HIVEnv在植物中裝配成VLP的能力。使來(lái)自AGL1/997(Env/H3)和AGL1/999(Env/H5)的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜，然后對(duì)于Env含量使用山羊抗gp120抗體分析洗脫級(jí)分。圖7A所示的Western印跡示出了，對(duì)于來(lái)自AGL1/999-滲入的植物的提取物，洗脫級(jí)分中的嵌合Env/H5含量在級(jí)分7至10中出現(xiàn)峰值，表明其以大于2百萬(wàn)道爾頓的非常高分子量的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了裝配。級(jí)分7至18中的相對(duì)蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)清楚地示出了在級(jí)分11至18中洗脫出了很大一部分宿主蛋白質(zhì)(圖7B)。這些結(jié)果顯示，Env/H5裝配成了超過(guò)預(yù)期的同三聚體分子量之大小的高分子量結(jié)構(gòu)。對(duì)于AGL1/997-滲入的植物中的Env/H3，獲得了類似的結(jié)果。這些結(jié)果共同表明，嵌合HIVEnv/H5在經(jīng)農(nóng)桿菌滲入的植物中以高水平積累，并且在不存在核心蛋白或基質(zhì)蛋白下裝配成了病毒樣顆粒。這些結(jié)果還表明，流感病毒HA之TM/CT與非流感病毒抗原融合足以裝配并釋放呈現(xiàn)非流感病毒抗原的VLP。實(shí)施例4：用狂犬病蛋白質(zhì)裝配表達(dá)盒C-2X35S-CPMVHT-PDISP-狂犬病糖蛋白G(RabG)+H5A/印度尼西亞/5/2005跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM+CT)-NOS(1074號(hào)構(gòu)建體；圖8A、8H)如下使用由Darveau等(MethodsinNeuroscience26：77-85(1995))所示的基于PCR的連接方法，將編碼與H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相融合的狂犬病糖蛋白G(RabG)胞外域的序列克隆到包含質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素之質(zhì)粒的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS表達(dá)系統(tǒng)中。在第一輪PCR中，利用合成的RabG基因(對(duì)應(yīng)于來(lái)自Genebank檢索號(hào)EF206707的nt3317～4891)(圖8D，SEQIDNO：34)作為模板，使用引物IF-RabG-S2+4.c(圖8B，SEQIDNO：32)和RabG+H5dTm.r(圖8C，SEQIDNO：33)擴(kuò)增含有沒(méi)有天然信號(hào)肽、跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之RabG胞外域的片段。利用972號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于972號(hào)構(gòu)建體的序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖94，SEQIDNO：134，其通過(guò)引用并入本文)作為模板，使用引物IF-H5dTm.c(圖8E，SEQIDNO：35)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)擴(kuò)增包含H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的第二片段。之后，將來(lái)自這兩次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物混合并作為模板用于使用IF-RabG-S2+4.c(圖8B，SEQIDNO：32)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)作為引物的第二輪擴(kuò)增。通過(guò)Clontech(MountainView，CA)使用In-Fusion克隆系統(tǒng)在2X35S-CPMVHT-NOS表達(dá)系統(tǒng)中具有苜蓿PDI信號(hào)肽的框內(nèi)克隆所得片段。用SbfI和StuI限制性酶酶切消化構(gòu)建體141(圖8F、8G)并將其用于In-Fusion裝配反應(yīng)。141號(hào)構(gòu)建體為意欲在基于CPMVHT的表達(dá)盒中“InFusion”克隆目的基因的接受體質(zhì)粒。其還合并了用于在苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因啟動(dòng)子和終止子下共表達(dá)TBSVP19沉默抑制子的基因構(gòu)建體。載體為基于pCAMBIA的質(zhì)粒并且從左至右t-DNA邊界的序列如圖8F所示(SEQIDNO：36)。載體141的示意圖如圖8G所示。將所得構(gòu)建體命名為1074號(hào)(圖8H，SEQIDNO：37)。PDISP-RabG-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如圖8I所示(SEQIDNO：38)。1074質(zhì)粒示意圖如圖8A所示。該構(gòu)建體不編碼M1蛋白。引入BeYDV+復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)的D-2X35S-PDISP-狂犬病糖蛋白G(RabG)+H5A/印度尼西亞/5/2005跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM+CT)-NOS(1094號(hào)構(gòu)建體；圖8L、8M)如下使用由Darveau等(MethodsinNeuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的連接方法，將編碼與H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相融合的狂犬病糖蛋白G(RabG)胞外域的序列克隆到引入到含有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒之質(zhì)粒的BeYDV+復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)中的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS中。在第一輪PCR中，利用合成的RabG基因(對(duì)應(yīng)于來(lái)自Genebank檢索號(hào)EF206707的nt3317～4891)(圖8D，SEQIDNO：34)作為模板，使用引物IF-RabG-S2+4.c(圖8B，SEQIDNO：32)和RabG+H5dTm.r(圖8C，SEQIDNO：33)擴(kuò)增含有沒(méi)有天然信號(hào)肽、跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之RabG胞外域的片段。利用972號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于972號(hào)構(gòu)建體的序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖94，SEQIDNO：134，其通過(guò)引用并入本文)作為模板，使用引物IF-H5dTm.c(圖8E，SEQIDNO：35)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)擴(kuò)增包含H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的第二片段。之后，將來(lái)自這兩次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物混合并作為模板用于使用IF-RabG-S2+4.c(圖8B，SEQIDNO：32)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)作為引物的第二輪擴(kuò)增。通過(guò)Clontech(MountainView，CA)使用In-Fusion克隆系統(tǒng)在引入到BeYDV+復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)的2X35S-CPMVHT-NOS表達(dá)盒中具有苜蓿PDI信號(hào)肽的框內(nèi)克隆所得片段。用SbfI和StuI限制性酶酶切消化的構(gòu)建體144并將其用于In-Fusion裝配反應(yīng)。144號(hào)構(gòu)建體為意欲在引入BeYDV擴(kuò)增系統(tǒng)的基于CPMVHT的表達(dá)盒中“InFusion”克隆目的基因的接受體質(zhì)粒。其還合并了用于在苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因啟動(dòng)子和終止子下共表達(dá)TBSVP19沉默抑制子的基因構(gòu)建體。載體為基于pCAMBIA的質(zhì)粒并且從左至右t-DNA邊界的序列如圖8J所示(SEQIDNO：39)。載體144的示意圖如圖8K所示。將所得構(gòu)建體命名為1094號(hào)(圖8L，SEQIDNO：40)。PDISP-RabG-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如圖8I所示(SEQIDNO：38)。1094號(hào)質(zhì)粒示意圖如圖8M所示。該構(gòu)建體不編碼M1蛋白。實(shí)施例5：嵌合狂犬病蛋白質(zhì)在植物中的表達(dá)G蛋白在與PDISp的融合體中表達(dá)(構(gòu)建體1071)。構(gòu)建體1074為狂犬病G蛋白與PDISp和H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域的融合體。構(gòu)建體1094為狂犬病G蛋白與BeYDV+rep、PDISp和H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域的融合體。構(gòu)建體1091為狂犬病病毒G蛋白與PDISp和BeYDV+rep的融合體。在填裝市售的泥炭蘚基質(zhì)的平地中由種子培養(yǎng)本塞姆氏煙草。使植物生長(zhǎng)在溫室中，16/8光照周期，溫度方案為白天25℃/晚上20℃。播種3周后，挑出單個(gè)小植株(plantlet)，移栽到盆中，并在同樣的環(huán)境條件下在溫室中再生長(zhǎng)3周。在補(bǔ)充有10mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧芐青霉素的YEB培養(yǎng)基(pH5.6)中培養(yǎng)用每種構(gòu)建體(構(gòu)建體1071、1071、1074、1091和1094)轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，直至其OD600為0.6至1.6。使用前將農(nóng)桿菌懸液離心并重懸在滲入培養(yǎng)基(10mMMgCl2和10mMMES，pH5.6)中，然后儲(chǔ)存在4℃過(guò)夜。在滲入當(dāng)天，將分批培養(yǎng)物稀釋成2.5倍培養(yǎng)物體積并在使用前溫?zé)?。?0～40托真空下，使本塞姆氏煙草的整個(gè)植株倒置于氣密性不銹鋼罐中的細(xì)菌懸液中2分鐘。將植株移回溫室中培養(yǎng)2～6天直至收獲。除非另有指明，否則所有滲入均通過(guò)與菌株AGL1/172以1∶1比率共滲入來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)后，收獲植物的地上部分，冷凍在-80℃，破碎成碎片。通過(guò)將每個(gè)冷凍破碎植物材料的樣品在3倍體積的冷的50mMTris(pH8.0)、0.15MNaCl、0.1％TritonX-100和1mM苯甲基磺酰氟中勻漿(Polytron)而提取總可溶性蛋白質(zhì)。勻漿后，于4℃下以10,000g對(duì)漿液離心10分鐘，保存這些澄清的粗提物(上清液)用于分析。使用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Bradford測(cè)定(Bio-Rad，Hercules，CA)對(duì)定澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(RocheDiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)上用于免疫檢測(cè)。在免疫印跡之前，用Tris緩沖鹽水中的5％脫脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封閉該膜16～18小時(shí)。通過(guò)用0.5μg/mlSantaCruzSE-57995一抗(在0.1％TBS-Tween20中的2％中)孵育進(jìn)行免疫印跡。在與1∶10,000稀釋的過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗鼠二抗(JIR，115-035-146)(在0.1％TBS-Tween20中中的2％脫脂乳中)孵育之后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。使用魯米諾(RocheDiagnosticsCorporation)作為底物，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)免疫反應(yīng)性復(fù)合物。如圖8N所示，狂犬病G蛋白在與PDISp(構(gòu)建體1071)、BeYDV+rep(構(gòu)建體1094或1091)、H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域(構(gòu)建體1074)或其組合的融合體中表達(dá)。實(shí)施例6：嵌合狂犬病病毒G蛋白裝配成病毒樣顆粒還檢測(cè)了在不存在核心蛋白或基質(zhì)蛋白下嵌合狂犬病病毒G蛋白在植物中裝配成VLP的能力。將來(lái)自使用構(gòu)建體1074或構(gòu)建體1094轉(zhuǎn)化之植物的蛋白質(zhì)提取物澄清并進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜，然后使用SantaCruzSE-57995一抗分析洗脫級(jí)分的狂犬病G蛋白含量。圖8O所示的Western印跡顯示，來(lái)自經(jīng)滲入植物的提取物，對(duì)于使用構(gòu)建體1074產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，洗脫級(jí)分中的嵌合狂犬病G含量在級(jí)分8至14中出現(xiàn)峰值，對(duì)于使用構(gòu)建體1094制備的蛋白質(zhì)提取物，在級(jí)分8至12中洗脫出了大部分蛋白質(zhì)，表明其以大于2百萬(wàn)道爾頓的非常高分子量的結(jié)構(gòu)進(jìn)行裝配。這些結(jié)果顯示，狂犬病G裝配成了超過(guò)預(yù)期同三聚體分子量的大小的高分子量結(jié)構(gòu)。圖9A示出了由構(gòu)建體1074表達(dá)的經(jīng)純化的狂犬病G蛋白的免疫印跡分析。圖9B示出了源自構(gòu)建體1074之表達(dá)的經(jīng)純化的狂犬病G蛋白VLP的透射電子顯微照片，顯示了VLP的形態(tài)。因此，狂犬病G在經(jīng)農(nóng)桿菌滲入的植物中以高水平積累并且在不存在核心蛋白或基質(zhì)蛋白下裝配成了病毒樣顆粒。這些結(jié)果還表明，流感病毒HA之TM/CT結(jié)構(gòu)域與非流感病毒抗原(例如狂犬病G蛋白)融合足以裝配并釋放呈現(xiàn)非流感抗原的VLP。實(shí)施例7：用SARS裝配表達(dá)盒B-2X35S-CPMVHT-嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒糖蛋白S(SARSgS)+H5A/印度尼西亞/5/2005跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM+CT)-NOS(916號(hào)構(gòu)建體；圖12A、12F)如下使用由Darveau等(MethodsinNeuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的連接方法，將編碼與H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相融合的SARS糖蛋白S(SARSgS)胞外域的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表達(dá)系統(tǒng)中。在第一輪PCR中，利用合成的SARSgS基因(對(duì)應(yīng)于來(lái)自Genebank檢索號(hào)AY278741.1的nt21492～25259；圖12D，SEQIDNO：28)作為模板，使用引物IF-wtSp-SARSgS.c(圖12B，SEQIDNO：26)和IF-H5dTm+SARSgS.r(圖12C，SEQIDNO：27)擴(kuò)增含有沒(méi)有天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之SARSgS胞外域的片段。利用972號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于972號(hào)構(gòu)建體的序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖94，SEQIDNO：134，其通過(guò)引用并入本文)作為模板，使用引物SARSgS+H5dTm.c(圖12E，SEQIDNO：29)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)擴(kuò)增包含H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的第二片段。之后，將來(lái)自這兩次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物混合并作為模板用于使用IF-wtSp-SARSgS.c(圖12B，SEQIDNO：26)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)作為引物的第二輪擴(kuò)增。之后，用ApaI和StuI酶切消化第二PCR的產(chǎn)物并克隆到用ApaI和StuI限制性酶酶切消化的995號(hào)構(gòu)建體(圖1F，SEQIDNO：6)中。將所得構(gòu)建體命名為916號(hào)(圖12F，SEQIDNO：30)。SARSgS-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如圖12G所示(SEQIDNO：31)。質(zhì)粒916示意圖如圖12A所示。該構(gòu)建體不編碼M1蛋白。實(shí)施例8：利用具有或沒(méi)有產(chǎn)生增強(qiáng)因子的嵌合SARS在植物中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)使用包含具有野生型信號(hào)肽以及H5A/Indo跨膜和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域之SARSgS基因的構(gòu)建體916表達(dá)SARS病毒蛋白質(zhì)。在填裝市售的泥炭蘚基質(zhì)的平地中由種子培養(yǎng)本塞姆氏煙草。使植物生長(zhǎng)在溫室中，16/8光照周期，溫度方案為白天25℃/晚上20℃。播種3周后，挑出單個(gè)小植株，移栽到盆中，并在同樣的環(huán)境條件下在溫室中再生長(zhǎng)3周。在補(bǔ)充有10mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧芐青霉素的YEB培養(yǎng)基(pH5.6)中培養(yǎng)用每種構(gòu)建體(構(gòu)建體916)轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，直至其OD600為0.6至1.6。使用前將農(nóng)桿菌懸液離心并重懸在滲入培養(yǎng)基(10mMMgCl2和10mMMES，pH5.6)中，然后儲(chǔ)存在4℃過(guò)夜。在滲入當(dāng)天，將分批培養(yǎng)物稀釋成2.5倍培養(yǎng)物體積并在使用前溫?zé)?。?0～40托真空下，使本塞姆氏煙草的整個(gè)植株倒置于氣密性不銹鋼罐中的細(xì)菌懸液中2分鐘。將植株移回溫室中培養(yǎng)2～6天直至收獲。除非另有指明，否則所有滲入均通過(guò)與菌株AGL1/172以1∶1比率共滲入來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)后，收獲植物的地上部分，冷凍在-80℃，破碎成碎片。通過(guò)將每個(gè)冷凍破碎植物材料的樣品在3倍體積的冷的50mMTris(pH8.0)、0.15MNaCl、0.1％TritonX-100和1mM苯甲基磺酰氟中勻漿(Polytron)而提取總可溶性蛋白質(zhì)。勻漿后，于4℃下以10,000g對(duì)漿液離心10分鐘，保存這些澄清的粗提物(上清液)用于分析。使用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Bradford測(cè)定(Bio-Rad，Hercules，CA)對(duì)澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(RocheDiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)上用于免疫檢測(cè)。在免疫印跡之前，用Tris緩沖鹽水中(TBS-T)5％脫脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封閉該膜16～18小時(shí)。通過(guò)用2μg/mlImgenex.IMG-690一抗(在0.1％TBS-Tween20中的2％脫脂乳中)孵育進(jìn)行免疫印跡。在與1∶10,000稀釋的過(guò)氧化物酶綴合的小鼠抗兔IgG二抗(JIR，115-035-144)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脫脂乳中)孵育之后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。使用魯米諾(RocheDiagnosticsCorporation)作為底物，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)免疫反應(yīng)性復(fù)合物。圖12H示出了在煙草中表達(dá)嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒蛋白質(zhì)S的免疫印跡分析。觀察到了構(gòu)建體916(具有野生型信號(hào)肽以及H5A/Indo跨膜和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域的SARSgS基因)的表達(dá)。實(shí)施例9：用VZV蛋白質(zhì)裝配表達(dá)盒A-2X35S-CPMVHT-水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白E(VZVgE)+H5A/印度尼西亞/5/2005跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM+CT)-NOS(946號(hào)構(gòu)建體)如下使用由Darveau等(MethodsinNeuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的連接方法，將編碼與H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相融合的VZV糖蛋白E(VZVgE)胞外域的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表達(dá)系統(tǒng)中。在第一輪PCR中，利用合成的VZVgE基因(對(duì)應(yīng)于來(lái)自Genebank檢索號(hào)AY013752.1的nt3477～5348；圖10C，SEQIDNO：22)作為模板，使用引物IF-wtSp-VZVgE.c(圖10A，SEQIDNO：20)和IF-H5dTm+VZVgE.r(圖10B，SEQIDNO：21)擴(kuò)增含有沒(méi)有天然跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之VZVgE胞外域的片段。利用972號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于972號(hào)構(gòu)建體的序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖94，SEQIDNO：134，其通過(guò)引用并入本文)作為模板，使用引物VZVgE+H5dTm.c(圖10D，SEQIDNO：23)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)擴(kuò)增包含H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的第二片段。之后，將來(lái)自這兩次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物混合并作為模板用于使用IF-wtSp-VZVgE.c(圖10A，SEQIDNO：20)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)作為引物的第二輪擴(kuò)增。之后，用ApaI和StuI酶切消化第二PCR的產(chǎn)物并克隆到用ApaI和StuI限制性酶酶切消化的995號(hào)構(gòu)建體(圖1F，SEQIDNO：6)中。將所得構(gòu)建體命名為946號(hào)(圖A5，SEQIDNO：A5)。VZVgE-A/印度尼西亞/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如圖10F所示(SEQIDNO：25)。質(zhì)粒946示意圖如圖10G所示。該構(gòu)建體不編碼M1蛋白。實(shí)施例10：嵌合VZV蛋白質(zhì)在植物中的表達(dá)使用包含具有野生型信號(hào)肽和H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域之VZVgE基因的構(gòu)建體946表明了水痘帶狀皰疹病毒(VZV)E蛋白的表達(dá)。在填裝市售的泥炭蘚基質(zhì)的平地中由種子培養(yǎng)本塞姆氏煙草。使植物生長(zhǎng)在溫室中，16/8光照周期，溫度方案為白天25℃/晚上20℃。播種3周后，挑出單個(gè)小植株，移栽到盆中，并在同樣的環(huán)境條件下在溫室中再生長(zhǎng)3周。在補(bǔ)充有10mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧芐青霉素的YEB培養(yǎng)基(pH5.6)中培養(yǎng)用每種構(gòu)建體(構(gòu)建體946)轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，直至其OD600為0.6至1.6。使用前將農(nóng)桿菌懸液離心并重懸在滲入培養(yǎng)基(10mMMgCl2和10mMMES，pH5.6)中，然后儲(chǔ)存在4℃過(guò)夜。在滲入當(dāng)天，將分批培養(yǎng)物稀釋成2.5倍培養(yǎng)物體積并在使用前溫?zé)?。?0～40托真空下，使本塞姆氏煙草的整個(gè)植株倒置于氣密性不銹鋼罐中的細(xì)菌懸液中2分鐘。將植株移回溫室中培養(yǎng)2～6天直至收獲。除非另有指明，否則所有滲入均通過(guò)與菌株AGL1/172以1∶1比率共滲入來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)后，收獲植物的地上部分，冷凍在-80℃，破碎成碎片。通過(guò)將每個(gè)冷凍破碎植物材料的樣品在3倍體積的冷的50mMTris(pH8.0)、0.15MNaCl、0.1％TritonX-100和1mM苯甲基磺酰氟中勻漿(Polytron)而提取總可溶性蛋白質(zhì)。勻漿后，于4℃下以10,000g對(duì)漿液離心10分鐘，保存這些澄清的粗提物(上清液)用于分析。使用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Bradford測(cè)定(Bio-Rad，Hercules，CA)對(duì)澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(RocheDiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)上用于免疫檢測(cè)。在免疫印跡之前，用Tris緩沖鹽水中的5％脫脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封閉該膜16～18小時(shí)。通過(guò)用作為一抗的1μg/ml小鼠mAb抗VZVgE蛋白(abcam，ab52549)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脫脂乳中)孵育進(jìn)行免疫印跡。在與1∶10,000稀釋的過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗小鼠二抗(JIR，115-035-146)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脫脂乳中)孵育之后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。使用魯米諾(RocheDiagnosticsCorporation)作為底物，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)免疫反應(yīng)性復(fù)合物。圖11A示出了在泳道7～9中由構(gòu)建體946表達(dá)水痘帶狀皰疹病毒(VZV)E蛋白的免疫印跡分析(分別為20、10和2μg提取物)。泳道1至5，陽(yáng)性對(duì)照——重組VZVgE，分別為500、100、50、10和5ng；泳道6，陰性對(duì)照。還檢測(cè)了在不存在核心蛋白或基質(zhì)蛋白下嵌合VZVE蛋白在植物中裝配成VLP的能力。將來(lái)自使用構(gòu)建體946轉(zhuǎn)化之植物的蛋白質(zhì)提取物澄清并進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜，然后對(duì)于VZVE蛋白使用小鼠mAb抗VZVgE蛋白(abcam，ab52549)一抗對(duì)的洗脫級(jí)分進(jìn)行分析。圖11B所示的Western印跡顯示，在來(lái)自經(jīng)滲入的植物的提取物中，嵌合VZVE蛋白洗脫級(jí)分在級(jí)分10至13中出現(xiàn)峰值，表明VZVE蛋白以大于2百萬(wàn)道爾頓的非常高分子量的結(jié)構(gòu)進(jìn)行裝配。這些結(jié)果顯示，VZVE蛋白裝配成了超過(guò)預(yù)期同三聚體分子量的大小的高分子量結(jié)構(gòu)。因此，VZVE蛋白在經(jīng)農(nóng)桿菌滲入的植物中以高水平積累并且在不存在核心蛋白或基質(zhì)蛋白下裝配成了病毒樣顆粒。這些結(jié)果還表明，流感病毒HA之TM/CT結(jié)構(gòu)域與非流感病毒抗原(例如VZVE蛋白)融合足以裝配并釋放呈現(xiàn)非流感病毒抗原的VLP。實(shí)施例11：用嵌合埃博拉病毒糖蛋白(GP)裝配表達(dá)盒A-2X35S-CPMVHT-PDISP-扎伊爾埃博拉病毒GP(EboGP)+H5A/印度尼西亞/5/2005跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)(TM+CT)-NOS(1366號(hào)構(gòu)建體)如下使用由Darveau等(MethodsinNeuroscience26：77-85(1995))所示的基于PCR的連接方法，將編碼與H5A/印度尼西亞/5/2005之跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相融合的來(lái)自菌株扎伊爾1995之埃博拉病毒糖蛋白(GP)的胞外域的序列克隆到在包含質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒之質(zhì)粒的2X35S-CPMVHT-PDISP-NOS表達(dá)系統(tǒng)中。對(duì)于密碼子使用和對(duì)于GC含量從野生型基因序列(對(duì)應(yīng)于來(lái)自GenBank檢索號(hào)AY354458的nt6039～8069)對(duì)埃博拉GP基因進(jìn)行優(yōu)化。之后，從經(jīng)優(yōu)化的序列移除隱蔽剪接位點(diǎn)、Shine-Delgarno序列、RNA促降解序列和原核生物核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，以避免不期望的結(jié)構(gòu)和序列。在第一輪PCR中，利用合成的GP基因(圖13C，SEQIDNO：45)作為模板，使用引物IF-Opt_EboGP.s2+4c(圖13A，SEQIDNO：43)和H5iTMCT+Opt_EboGP.r(圖13B，SEQIDNO：44)擴(kuò)增包含編碼胞外域之序列(沒(méi)有信號(hào)肽以及跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)的經(jīng)優(yōu)化GP基因的片段。利用972號(hào)構(gòu)建體(對(duì)于972號(hào)構(gòu)建體的序列，參見(jiàn)WO2010/003225的圖94，SEQIDNO：134，其通過(guò)引用并入本文)作為模板，使用引物Opt_EboGP+H5iTMCT.c(圖13D，SEQIDNO：46)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)擴(kuò)增包含來(lái)自流感病毒A/印度尼西亞/5/2005之H5的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的第二片段。之后，將來(lái)自這兩次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物混合并作為模板用于使用IF-Opt_EboGP.s2+4c(圖13A，SEQIDNO：43)和IF-H5dTm.r(圖3C，SEQIDNO：15)作為引物的第二輪擴(kuò)增。之后，通過(guò)Clontech(MountainView，CA)使用In-Fusion克隆系統(tǒng)在2X35S-CPMVHT-NOS表達(dá)載體中具有苜蓿PDI信號(hào)肽的框內(nèi)克隆所得PCR產(chǎn)物。用SacII和StuI限制性酶酶切消化構(gòu)建體1192(圖13E)并將其用于In-Fusion裝配反應(yīng)。1192號(hào)構(gòu)建體是意欲在基于CPMVHT的表達(dá)盒中具有苜蓿PDI信號(hào)肽的框內(nèi)“In-Fusion”克隆目的基因的接受體質(zhì)粒。其還合并了用于在苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因啟動(dòng)子和終止子下共表達(dá)TBSVP19沉默抑制子的基因構(gòu)建體。該載體是基于pCAMBIA的質(zhì)粒并且從左至右t-DNA邊界的序列如圖13F所示(SEQIDNO：47)。將所得構(gòu)建體命名為1366號(hào)(圖13G，SEQIDNO：48)。來(lái)自A/印度尼西亞/5/2005之扎伊爾95埃博拉病毒-H5TM+CT的PDISP-GP的氨基酸序列如圖13H所示(SEQIDNO：49)。1366質(zhì)粒示意圖如圖13I所示。實(shí)施例12：嵌合埃博拉病毒GP在植物中的表達(dá)使用包含具有野生型信號(hào)肽和H5A/IndoTM+CT結(jié)構(gòu)域之EVGP基因的構(gòu)建體1366表明了埃博拉病毒(EV)糖蛋白(GP)的表達(dá)。在填裝市售的泥炭蘚基質(zhì)的平地中由種子培養(yǎng)本塞姆氏煙草。使植物生長(zhǎng)在溫室中，16/8光照周期，溫度方案為白天25℃/晚上20℃。播種3周后，挑出單個(gè)小植株，移栽到盆中，并在同樣的環(huán)境條件下在溫室中再生長(zhǎng)3周。在補(bǔ)充有10mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧芐青霉素的YEB培養(yǎng)基(pH5.6)中培養(yǎng)用每種構(gòu)建體(構(gòu)建體946)轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，直至其OD600為0.6至1.6。使用前將農(nóng)桿菌懸液離心并重懸在滲入培養(yǎng)基(10mMMgCl2和10mMMES，pH5.6)中，然后儲(chǔ)存在4℃過(guò)夜。在滲入當(dāng)天，將分批培養(yǎng)物稀釋成2.5倍培養(yǎng)物體積并在使用前溫?zé)帷Ｔ?0～40托真空下，使本塞姆氏煙草的整個(gè)植株倒置于氣密性不銹鋼罐中的細(xì)菌懸液中2分鐘。將植株移回溫室中培養(yǎng)2～6天直至收獲。培養(yǎng)后，收獲植物的地上部分，冷凍在-80℃，破碎成碎片。通過(guò)將每個(gè)冷凍破碎植物材料的樣品在3倍體積的冷的50mMTris(pH8.0)、0.15MNaCl、0.1％TritonX-100和1mM苯甲基磺酰氟中勻漿(Polytron)而提取總可溶性蛋白質(zhì)。勻漿后，于4℃下以10,000g對(duì)漿液離心10分鐘，保存這些澄清的粗提物(上清液)用于分析。使用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Bradford測(cè)定(Bio-Rad，Hercules，CA)對(duì)澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(RocheDiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)上用于免疫檢測(cè)。在免疫印跡之前，用Tris緩沖鹽水中的5％脫脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封閉該膜16～18小時(shí)。通過(guò)用作為一抗的150ng/ml親和純化的兔抗埃博拉GP扎伊爾(IBTBioservices，0301-012)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脫脂乳中)孵育進(jìn)行免疫印跡。在與1∶7500稀釋的過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔二抗(JIR11-035-144)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脫脂乳中)孵育之后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。使用魯米諾(RocheDiagnosticsCorporation)作為底物，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)免疫反應(yīng)性復(fù)合物。圖13J示出了在來(lái)自用1366號(hào)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化之植物的蛋白質(zhì)提取物中表達(dá)嵌合埃博拉病毒GP的免疫印跡分析。所獲得的結(jié)果顯示，嵌合埃博拉病毒GP瞬時(shí)表達(dá)。所有的引文通過(guò)引用據(jù)此合并。針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案描述了本發(fā)明。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可在不背離權(quán)利要求書(shū)中限定的本發(fā)明的范圍下進(jìn)行多種改變和修改。