專(zhuān)利名稱(chēng)：：獲得l－二氫乳清酸的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種通過(guò)在陰離子交換材料上、于堿水混合物中約1．1MPa至約40MPa的壓力下進(jìn)行層析得到L-二氫乳清酸(此后稱(chēng)作“L-DHO”)的方法。該方法可適用于研究N-(4-三氟甲基苯基)-5-甲基異噁唑-4-甲酰胺、N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羥基丁烯酰胺及類(lèi)似化合物的體外和體內(nèi)活性。利用硅膠層析法、隨后通過(guò)化學(xué)衍生法和比色分析法可以測(cè)量出L-DHO(Kesner，L．，Aronson，F(xiàn)．L．，Silverman，M．，Chan，P．C．，《臨床化學(xué)》(Clin．Chem)21／3(1975)353)。另一種方法是令L-DHO在由大鼠肝臟制備的L-二氫乳清酸脫氫酶(此后稱(chēng)為“DHODH”)的酶促作用下轉(zhuǎn)化為乳清酸，進(jìn)而化學(xué)衍生化，再通過(guò)比色變化來(lái)檢測(cè)乳清酸鹽(酯)(Rogers，L．E．，Nicolaisen，K．，《經(jīng)驗(yàn)》(Experientia)28／10(1972)1259)。這些方法的缺點(diǎn)在于，復(fù)雜生理溶液中所含的其他物質(zhì)對(duì)檢測(cè)造成干擾。此外，上述方法極其耗時(shí)，這歸因于樣本制備繁雜，所以無(wú)法在大規(guī)模的臨床研究中用作常規(guī)分析。在嘗試改進(jìn)獲得L-二氫乳清酸的分離和離析方法中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過(guò)在堿水混合物中、于陰離子交換材料上約1．1MPa-約40MPa的壓力下對(duì)L-DHO進(jìn)行層析可獲得相同的結(jié)果。該方法可用于定量檢測(cè)細(xì)胞溶解產(chǎn)物、哺乳動(dòng)物血清和人血清中的L-DHO。此方法具有高度的重現(xiàn)性、靈敏度和有效性。如權(quán)利要求書(shū)所述，本申請(qǐng)通過(guò)采用一種包括下列步驟的層析方法達(dá)到了該目的a)獲得含有耐壓陰離子交換材料的層析柱；b)將含有L-二氫乳清酸的樣本溶液進(jìn)樣至該層析柱中；c)進(jìn)行層析；d)用含有堿水混合物的洗脫劑來(lái)洗脫L-二氫乳清酸；該方法是在約1．1MPa-約40MPa的壓力下進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“耐壓陰離子交換材料”是指材料，例如，被鏈烷醇季銨改性的大孔(2000二乙烯基苯／乙基乙烯基苯的聚合物或與二乙烯基苯交聯(lián)的微孔聚乙烯基芐基銨聚合物或者其混合物；或乙烯基芐基氯／二乙烯基苯的大孔聚合物；或交聯(lián)聚乙基亞氨基聚合物；或用丙基三甲基銨改性的二氧化硅；或聚(苯乙烯-二乙烯基苯)三甲基銨。下列產(chǎn)品是特別優(yōu)選的IonPacAs11、CarboPacPA1或CarboPacMA1陰離子交換層析柱，由Dionex公司。Idstein，德國(guó)提供；GROM-SIL，StrongAnion．或GROM-SIL，WeakAnion．；由Grom提供；P1000SAX，IonospherSA或ChrompackPA由Chrompack提供；PRP-X100或RCX-10，由Hamilton提供。洗脫劑含有堿水混合物。適用的堿衍生自堿金屬或堿土金屬，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂或氫氧化鈣?；谧鳛槿軇┑乃瑝A的濃度是1mmol／l-約200mmol／l，優(yōu)選2mmol／1-約120mmol／l，更優(yōu)選100mmol／l。層析過(guò)程中的溫度約為0℃-約50℃，優(yōu)選約15℃-約30℃，更優(yōu)選約19℃-約25℃。層析中的工作壓力基本恒定。層析也可以在不同的壓力下進(jìn)行，例如可以在約1．1106Pa(1．1MPa)-約40106Pa(40MPa)，優(yōu)選4．1MPa-5．5btPa的壓力下進(jìn)行。洗脫劑的流速約為0．2ml／分鐘-約3ml／分鐘，優(yōu)選1ml／分鐘。層析柱的填裝、層析以及L-DHO的洗脫均采用已知的常規(guī)技術(shù)法。適用的洗脫過(guò)程是其中堿濃度表現(xiàn)為時(shí)間的梯度，特別是該梯度呈線性過(guò)程的洗脫。該濃度梯度可以通過(guò)例如在洗脫初始時(shí)令洗脫劑中含有低濃度的堿(極限情況中為0)，并且在洗脫過(guò)程中提高堿的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)。此方法能夠極其有效地分離出衍生自血清或細(xì)胞溶解產(chǎn)物的樣本中的L-DHO。優(yōu)選的堿梯度是在約1％NaOH(100mmol／l)和99％水(洗脫開(kāi)始時(shí))-約60％NaOH和40％水(在洗脫結(jié)束時(shí))內(nèi)變化，特別優(yōu)選介于約1％NaOH和99％水(洗脫開(kāi)始時(shí))-約15％NaOH和75％水(在洗脫結(jié)束時(shí))的范圍內(nèi)。堿水梯度在2．5分鐘-約14分鐘和14分鐘-約25分鐘間呈線性方式改變，其中，在這兩個(gè)時(shí)間段中梯度的陡度并不相同。更適當(dāng)?shù)南疵摽赏ㄟ^(guò)在分離過(guò)程開(kāi)始時(shí)采用約為1％的低堿濃度且使其保持約2．5分鐘來(lái)獲得。其結(jié)果是從層析柱的生物基質(zhì)中洗脫絕大多數(shù)干擾物。通過(guò)在總共14分鐘的測(cè)定時(shí)間段中使堿的梯度緩慢升高至約23％堿來(lái)分離出被分析物。隨后，堿濃度在4分鐘內(nèi)升高至約60％以便洗脫出強(qiáng)結(jié)合的物質(zhì)。使用60％堿應(yīng)不超過(guò)6分鐘，馬上用1％的堿水混合物再平衡。下一次的分析是在總長(zhǎng)45分鐘的分析時(shí)間之后進(jìn)行。堿水混合物中的水需經(jīng)過(guò)去離子化和脫氣處理。本發(fā)明的分離方法是在柱過(guò)程中進(jìn)行的。適宜在陰離子交換層析法中保持恒定的溫度可在很寬的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選的溫度范圍是約-10℃-約50℃，更優(yōu)選約15℃-約25℃。對(duì)L-DHO的洗脫發(fā)生在梯度開(kāi)始后的第10分鐘-12分鐘之間。洗脫過(guò)程的進(jìn)行時(shí)間為13分鐘-25分鐘。利用電導(dǎo)檢測(cè)器，例如Dionex公司提供的CD20型，來(lái)檢測(cè)L-DHO。為了使基線漂移減至最小并降低背景導(dǎo)電率，可以采用陰離子自再生抑制器，例如Dionex公司的ASRS-1型，4mm。本發(fā)明所述的方法特別適用于分析層析法，但也可以用于制備層析法，尤其當(dāng)本發(fā)明所述方法采用的是制備性高壓液相層析柱(HPLC)體系時(shí)。術(shù)語(yǔ)“制備性層析”是指目的在于得到而不僅是分析純凈產(chǎn)物的提純方法。純凈產(chǎn)物的量可以在很寬的界限內(nèi)改變，例如1mg-1000g，優(yōu)選50mg-500mg。本發(fā)明的方法可以用來(lái)檢測(cè)因抑制二氫乳清酸脫氫酶(DHO-DH)所致的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外L-DHO濃度的變化。DHO-DH酶負(fù)責(zé)嘧啶從頭合成過(guò)程中由L-二氫乳清酸轉(zhuǎn)化為乳清酸。對(duì)DHO-DH的抑制將導(dǎo)致L-DHO累積。本發(fā)明的方法可用于制劑的診斷分析。本發(fā)明的方法可以用來(lái)測(cè)定DHO-DH抑制劑的活性。DHO-DH抑制劑例如是N-4-(三氟甲基苯基)-5-甲基異噁唑-4-甲酰胺、布喹那(Brequinar)、N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羥基庚-2-烯-6-炔-甲酰胺、2-氰基-3-環(huán)丙基-3-羥基丙烯酸-(4-氰基苯基)-酰胺或N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羥基丁烯酰胺。本發(fā)明的方法可以用來(lái)檢測(cè)植物、細(xì)胞系、動(dòng)物和人體中的L-DHO濃度。對(duì)L-DHO的測(cè)定可用來(lái)監(jiān)控DHO-DH抑制劑在植物、哺乳動(dòng)物和人體中的活性。本發(fā)明所述方法將在下列實(shí)施例中作詳細(xì)描述。除非另外說(shuō)明，百分比數(shù)據(jù)均是指重量百分率。實(shí)施例11．1化學(xué)品和試劑化學(xué)品和試劑購(gòu)得如下無(wú)NaOH和KOH的碳酸鹽Baker，HollandL-二氫乳清酸(L-DHO)Sigma，MunichHClO4RiedeldeHaen，Seelze曙紅，氯仿RiedeldeHaen，SeelzeRPMI1640培養(yǎng)基Gibco，Eggenstein胎牛血清(FCS)BioWhitaker，Verviers，Belgium去離子水在使用前用氦氣脫氣1．2層析儀器HPLC系統(tǒng)是由下列設(shè)備構(gòu)成<tablesid="table1"num="001"><table>儀器型號(hào)制造商溶劑調(diào)節(jié)組件SCM400Thermoseparationproducts(TSP)二元梯度泵P2000TSP具有20μl回路的自動(dòng)進(jìn)樣器AS3000TSP連接器SP4510TSPAD變換器SN4000TSP電導(dǎo)檢測(cè)器CD20DIONEX陰離子自再生抑制器ASRS-I4mmDIONEX檢測(cè)穩(wěn)定器DS3-1DIONEXPCEI20，F(xiàn)LEXSCAN，F(xiàn)563-TESCON打印機(jī)DeskJet550CESCON軟件PC1000TSP</table></tables>在試驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程中使用聚醚醚酮(peek)材料。1．3HPLC條件層析分離采用了250×4mmI．D．IonPacAS11陰離子交換柱(粒度13μm；P／N044076，Dionex)，該柱裝配有IonPacAG1150×4mmI．D．前置柱(粒度13μm；P／N044078，Dionex)。此外，在梯度泵和注射閥之間安裝有一個(gè)陰離子俘獲柱ATC-1(P／N037151，Dionex)。為了使基線漂移減至最小并降低背景導(dǎo)電率，再安裝上在300mA下工作的ASRS-I抑制器。將檢測(cè)器范圍設(shè)定在1OμS。將自動(dòng)進(jìn)樣器冷卻至14℃，但分析試驗(yàn)本身是在室溫下進(jìn)行。流動(dòng)相由100mMNaOH(A)和去離子化脫氣水(B)組成。同時(shí)，利用該系統(tǒng)得到下列梯度<tablesid="table2"num="002"><table>時(shí)間(分鐘)A(％)B(％)01992．51991423771860402460402619945199</table></tables>流速為1ml／分鐘，洗脫時(shí)間為45分鐘。1．4標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量控制樣品通過(guò)將1mgL-DHO溶解在1ml水中制備標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。將400μl的等分試樣冷藏在-20℃下。這些溶液的穩(wěn)定性至少可以保持4周。將指定量的儲(chǔ)備溶液加入到細(xì)胞溶解產(chǎn)物和人或大鼠的血清中并進(jìn)行測(cè)量，以評(píng)估信號(hào)增量和尖峰L-DHO濃度之間的線性關(guān)系。利用具有在信號(hào)／濃度線性曲線上低、中和高濃度范圍的L-DHO成分的質(zhì)量控制(QC)樣品來(lái)測(cè)定本發(fā)明方法的精確度和準(zhǔn)確度。1．5樣品的制備1．5．1細(xì)胞由ATCC(TIB182)獲得Jurkat細(xì)胞并且按照1．5．1．1．所述的方法培養(yǎng)。1．5．1．1．組織培養(yǎng)條件將Jurkat細(xì)胞以5×105／ml接種，令其在RPMI1640培養(yǎng)基和10％胎牛血清(FCS)中生長(zhǎng)24小時(shí)。將細(xì)胞合并在新鮮的培養(yǎng)基中用于溶解細(xì)胞，利用曙紅、通過(guò)活體顯微鏡檢計(jì)算出細(xì)胞數(shù)量和死亡細(xì)胞的百分比。經(jīng)24小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)量增加1．6-1．8倍，同時(shí)死亡細(xì)胞低于7％。為測(cè)定L-DHO所取的Jurkat細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)的增殖率為1．6-1．8倍且死亡細(xì)胞少于7％。1．5．1．2細(xì)胞溶解產(chǎn)物的制備將細(xì)胞懸浮在指定的培養(yǎng)基體積中并且利用曙紅通過(guò)活體顯微鏡檢測(cè)定出樣品的細(xì)胞密度。取約10×106個(gè)細(xì)胞，在350×g下離心5分鐘使之成團(tuán)并且棄去上清液。將細(xì)胞團(tuán)再次懸浮在500μl的1．2MHClO4中以使細(xì)胞溶解。將該混合物轉(zhuǎn)移到2．0mlEppendorf帶蓋管中，通過(guò)高速離心2分鐘沉淀出蛋白質(zhì)。取出全部上清液，轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中，在加入500μl氯仿后通過(guò)2分鐘渦旋令其充分混合。在10℃下離心10分鐘(1502g)后用氯仿提取細(xì)胞脂質(zhì)。將純化的上清液收集在2mlEppendorf管中并儲(chǔ)存在-20℃下直至使用。為了進(jìn)行HPLC分析，用30μl6MKOH中和100μl該上清液。振搖約5秒鐘后，將樣品在冰上儲(chǔ)存30分鐘。此后，在15000rpm下離心5分鐘。取20μl澄清的上清液用于HPLC分析。1．5．2血清為了降低蛋白質(zhì)的含量，將200μl血清加入到Microcon濾器(10000D，10型，編號(hào)42407，Amicon)上并以13000轉(zhuǎn)／分鐘(rpm)離心30分鐘。過(guò)濾的流過(guò)物約為150μl且含有被分析物L(fēng)-DHO。由此液體中取20μl用于HPLC分析。1．6定量分析用積分儀測(cè)量被分析物的峰高。由測(cè)出的峰高(y)對(duì)不同生物基質(zhì)中的被分析物濃度繪圖得到校正曲線。利用加權(quán)線性回歸(l／y)反向計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)量控制品中的L-DHO濃度。由基于利用加權(quán)因子進(jìn)行的協(xié)方差模型分析的PROCGLM得到共同相關(guān)系數(shù)(commoncorrelationcoefficient)R。1．7穩(wěn)定性表1列出了-20℃下細(xì)胞溶解產(chǎn)物和血清樣本中的被分析物在各個(gè)樣品經(jīng)過(guò)2-3個(gè)冷凍／融化循環(huán)后的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。Jurkat細(xì)胞中的L-DHO在上述條件下于至少4周內(nèi)保持穩(wěn)定。但還無(wú)法解釋在一些大鼠血清樣本和一個(gè)人血清樣本中檢測(cè)到的被分析物經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)融化循環(huán)后濃度增高10％以上的現(xiàn)象，這表明這些情況中的準(zhǔn)確度一般降低達(dá)15％，在最壞的情況下降低達(dá)29％。因此，只能認(rèn)為大鼠和人血清樣本中L-DHO僅在至少一周內(nèi)明確保持穩(wěn)定。表1-20℃下細(xì)胞溶解產(chǎn)物和血清中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(n=1)<tablesid="table3"num="003"><table>時(shí)間(天)濃度120μg／ml殘余率(％)濃度2100μg／ml殘余率(％)Jurkat細(xì)胞019．34100100．05100719．2899．799．0999．014n．d．n．d．115．32115．32919．98103．399．3599．3時(shí)間濃度1殘余率(％)濃度2殘余率</table></tables><tablesid="table4"num="004"><table>(小時(shí))5μg／ml20μg／ml(％)大鼠血清4．3010019．9410074．52105．119．6298．4144．81111．920．93105．0215．55129．122．38112．2人血清04．6710020．2210084．81103．020．38100．8654．87104．323．20114．7</table></tables>殘余率(％)是指和測(cè)定起始時(shí)比較，濃度的百分率。n．d．=未測(cè)量為了模擬樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中等待期間的條件以使分析更精確，我們測(cè)定了14℃下18小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性。出于上述原因，將細(xì)胞溶解產(chǎn)物增敏(spiked)再在分析開(kāi)始之前用30μl6MKOH／100μl細(xì)胞溶解產(chǎn)物處理。相應(yīng)地，增敏血清樣本再按照1．5．2所述方法除去蛋白質(zhì)。由表2可以看出，細(xì)胞中L-DHO的含量在這些條件下略微降低，最多約為7％。在血清樣本中，被分析物在上述條件下保持穩(wěn)定。鑒于這些原因，只有制備如此多的HPLC樣品，以使它們?cè)谧詣?dòng)進(jìn)樣器中的最大滯留期少于18小時(shí)。表214℃下18小時(shí)的穩(wěn)定性(n=1)<tablesid="table5"num="005"><table>時(shí)間(小時(shí))濃度120μg／ml殘余率(％)濃度2100μg／ml殘余率(％)Jurkat細(xì)胞019．96100100．021001818．6093．297．4397．4時(shí)間濃度1殘余率(％)濃度2殘余率</table></tables><tablesid="table6"num="006"><table>(小時(shí))5μg／ml20μg／ml(％)大鼠血清04．610019．99100184．96107．620．53102．7人血清03．3410018．78100183．37100．922．09117．6</table></tables>1．8選擇性將未增敏Jurkat細(xì)胞溶解產(chǎn)物和相應(yīng)的用50μgL-DHO／ml增敏的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的層析進(jìn)行比較，對(duì)比顯示在11．983分鐘處有一個(gè)小尖峰，該峰和L-DHO的保留時(shí)間相同。此尖峰極有可能是由上述細(xì)胞中含有的天然被分析物引起的。所以，可以認(rèn)為由于用KOH處理細(xì)胞溶解產(chǎn)物，L-DHO峰裂分為2個(gè)峰。然而，KOH的處理是必需的，為的是在HPLC分析之前中和酸性細(xì)胞溶解產(chǎn)物。在上述條件下評(píng)估第二個(gè)峰(保留時(shí)間(RT)=11．954分鐘)的高度可以在線性和再現(xiàn)性方面得到改進(jìn)的結(jié)果。在大鼠和人血清的情況中還發(fā)現(xiàn)和L-DHO有相同保留時(shí)間的空白值。推測(cè)由此反映出生物中天然L-DHO的含量。對(duì)這兩個(gè)物種的至少10個(gè)不同樣本進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示出天然L-DHO的含量在檢測(cè)限1μg／ml以下。1．9線性對(duì)由細(xì)胞系和不同血清樣本獲得的5條校正曲線的檢測(cè)線性進(jìn)行評(píng)估。在不同的5天內(nèi)制備樣品并層析，L-DHO的濃度為1．5-150μg／ml(細(xì)胞溶解產(chǎn)物)和1-30μg／ml(血清樣品)。結(jié)果如表3-5所示。利用峰高來(lái)測(cè)出回歸線。基于此，反向計(jì)算出不同標(biāo)準(zhǔn)品的相應(yīng)濃度，示于不同表中。表3Jurkat細(xì)胞溶解產(chǎn)物中L-DHO測(cè)定的線性增敏后，用30μl6MKOH處理樣品，且隨后按照1．3分析1次。R=0．999b表4大鼠血清中L-DHO測(cè)定的線性增敏后，按照1．5．2所述除去樣品中的蛋白質(zhì)。R=0．9959表5表3人血清中L-DHO測(cè)定的線性增敏后，按照1．5．2所述除去樣品中的蛋白質(zhì)。R=0．9986*標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg／ml)-未測(cè)量如上表所示，各種情況中的線性已得到證實(shí)。這反映在各個(gè)相關(guān)系數(shù)“r”在所有情況中均＞0．99。在各表中描述了在不同的5天內(nèi)所得濃度曲線的平均值線性回歸線，顯示出斜率的重現(xiàn)性很好，最大變異為6．7％。反向計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)品濃度表現(xiàn)為平均C．V．小于6．5％，這表明這些數(shù)值的準(zhǔn)確度很高。共同相關(guān)值R高于0．99，這表明該方法的精確度和重現(xiàn)性皆很高。1．10定量的極限基于這些結(jié)果，Jurkat細(xì)胞中的定量極限為1．5μg／ml。在大鼠和人血清樣本中可以檢測(cè)到1μg／mlL-DHO。增敏樣品在這些濃度下的信噪比至少為1∶3。1．12準(zhǔn)確度和精確度表6-8概括出在不同的5天內(nèi)對(duì)三個(gè)不同濃度的L-DHO重復(fù)測(cè)定時(shí)的準(zhǔn)確度和精確度。準(zhǔn)確度表示為L(zhǎng)-DHO測(cè)量值相對(duì)于添加值的百分差(回收率)。利用同一樣品在一天內(nèi)測(cè)量?jī)纱嗡玫膬蓚€(gè)數(shù)值來(lái)算出當(dāng)日精確度，將其表示為C．V．(％)。不同天間的精確度也表示為C．V．(％)，是利用在不同的5天內(nèi)對(duì)各對(duì)照樣品的平均測(cè)量值來(lái)計(jì)算的。表6Jurkat細(xì)胞溶解產(chǎn)物在增敏和隨后用30μl6MKOH中和后的準(zhǔn)確度和精確度。n=2是指一個(gè)細(xì)胞溶解產(chǎn)物樣品用相應(yīng)濃度增敏并測(cè)量?jī)纱巍?lt;tablesid="table7"num="010"><table>對(duì)照樣品(μg／ml)天n準(zhǔn)確度平均測(cè)量值回收率(μg／ml)(％)精確度C．V．(％)C．V．(％)當(dāng)天不同天201220．10+0．51．42．92219．20-4．01．33219．40-2．83．94219．51-2．52．25218．55-7．21．3701269．12-1．30．12．82269．13-1．20．83273．69+5．30．24271．52+2．21．15269．64-0．50．913012123．21-5．22．86．022114．78-11．712．032135．1+4．00．242126．89-2．41．452122．43-5．84．1</table></tables>表7大鼠血清溶解產(chǎn)物在增敏及隨后去蛋白后的準(zhǔn)確度和精確度。n=2是指一個(gè)血清樣本用相應(yīng)濃度增敏并測(cè)量?jī)纱巍?lt;tablesid="table8"num="011"><table>對(duì)照樣品(μg／ml)天n準(zhǔn)確度平均測(cè)量值回收率(μg／ml)(％)精確度C．V．(％)C．V．(％)當(dāng)天不同天8127．68-4．00．43．0227．73-3．41．0327．83-2．22．1427．43-7．11．0528．06+0．70．6151214．53-3．16．81．8221473-1．81．33214．26-5．00．14214．85-1．00．45214．88-0．80．9251224．98-0．12．53．72225．83+3．31．33225．43+1．70．64224．31-2．82．05226．81+7．20．2</table></tables>表8人血清在增敏且隨即被去蛋白后的準(zhǔn)確度和精確度。n=2是指一個(gè)血清樣品用相應(yīng)濃度增敏并測(cè)量?jī)纱巍?lt;tablesid="table9"num="012"><table>對(duì)照樣品(μg／ml)天n準(zhǔn)確度平均測(cè)量值回收率(μg／ml)(％)精確度C．V．(％)C．V．(％)當(dāng)天不同天8127．77-2．90．73．8227．84-2．015．5327．43-7．110．9427．17-10．42．1527．80-2．51．2151213．88-7．50．96．02214．00-6．78．53215.10+0．61．54215．13+0．87．25216．03+6．812．8251226．56+6．23．44．22223．77-4．90．73224．80-0．84．74225．46+1．87．85224．54-1．90．2</table></tables>所列結(jié)果表明，在絕大多數(shù)情況中，對(duì)照值的最大變異為±10％，所以該方法極其準(zhǔn)確。只有在一個(gè)情況中，Jurkat細(xì)胞測(cè)定的回收率與對(duì)照值略微不同(-11．7％)。該現(xiàn)象可由當(dāng)天內(nèi)的變異高達(dá)12％得到解釋。在Jurkat細(xì)胞、大鼠或人血清中的當(dāng)天精確度分別小于5％、7％和10％。不同天間的精確度在所有被評(píng)估模型中均極低，它們的C．V．小于6．0％。這表明所得結(jié)果具有高度的重現(xiàn)性和精確度。實(shí)施例22．1組織培養(yǎng)的條件-制備無(wú)血清培養(yǎng)基將Iscove粉狀培養(yǎng)基(Biochrom)溶解在10升的雙蒸水中，該水中補(bǔ)加有18．95gNaCl，11．43gNaHCO3，700mgKCl，10ml35％NaOH溶液和0．5ml1M巰基乙醇溶液(RiedeldeHaen)并且經(jīng)過(guò)濾除菌。在使用前，向1L制備的Iscove培養(yǎng)基中加入32mg人全轉(zhuǎn)鐵蛋白(holo-transferrin)、1g牛白蛋白和1．5ml脂質(zhì)(Sigma)。-細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中(37℃，5％CO2)擴(kuò)大培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A20．2．J細(xì)胞。分析所采用的細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)具有2．2倍的增殖率。死亡細(xì)胞的百分率＜8％(3)。-用按照EP-0529500所述方法制備的N-(4-三氟甲基)-2-氰基-3-羥基-丁烯酰胺(此后稱(chēng)A771726)處理細(xì)胞。將A771726溶解在bidest水溶液(10mM)中，并進(jìn)一步稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中。隨后，向細(xì)胞加入適量的A771726，在37℃和5％CO2的條件下溫育。2．2．用于測(cè)定DHO的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的制備將制備的細(xì)胞再懸浮在指定的培養(yǎng)基體積中且達(dá)到一定的細(xì)胞密度。根據(jù)預(yù)期的DHO含量，取1-50百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，使之成團(tuán)(5min，350×g)并且棄去上清液。通過(guò)加入500μl1．2MHClO4使細(xì)胞溶解。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至2mlEppendorf帶蓋管中，通過(guò)高速離心2分鐘沉淀出蛋白質(zhì)。取出全部酸化細(xì)胞裂解產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中，在加入500μl氯仿后通過(guò)2分鐘渦旋令其充分混合。冷卻條件下離心10分鐘(1502×g；10℃)以提取細(xì)胞脂質(zhì)。將純化的上清液收集在2mlEppendorf管中并儲(chǔ)存在-20℃下至進(jìn)行高壓液相層析(HPLC)測(cè)定。2．3HPLC對(duì)DHO的測(cè)定按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行層析分離。將電導(dǎo)檢測(cè)器的范圍設(shè)定在10μS。分析是在室溫下進(jìn)行。流動(dòng)相由100mMNaOH(A)和水(B)組成。用該體系得到下列梯度<tablesid="table10"num="013"><table>時(shí)間(分鐘)A(％)B(％)01992．519914892228922860403260403419949199</table></tables>流速為1ml／分鐘；洗脫時(shí)間為49分鐘。2．4．結(jié)果與A771726一起溫育的A20．2．J細(xì)胞的胞內(nèi)DHO量增高(表9-11)。表9中的結(jié)果證實(shí)，DHO的水平與被提取細(xì)胞的數(shù)目直接相關(guān)。表9胞內(nèi)DHO濃度和與A771726共培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性<tablesid="table11"num="014"><table>細(xì)胞(×106)DHO濃度(μg／ml±SD)1Experiment1(E10B)14．08±2．40Experiment2(E14)11．75±0．23219.51±6．4728．27±0．79453．58±3．5057．20±2．76673．01±1．4985．38±2．33899．89±5．96107．02±3．4710113．37±4．24128．73±1．95</table></tables>A20．2．J細(xì)胞用5μMA771726處理并培養(yǎng)24小時(shí)(37℃，5％CO2)，隨后準(zhǔn)備用于DHO提取(n=3)。為了優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)法且測(cè)出最佳的細(xì)胞／A771726摩爾濃度比，將不同密度的A20．2．J細(xì)胞與A771726(5μM)一起溫育。在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣并且測(cè)定DHO濃度(表10)。由于DHO的濃度與被提取細(xì)胞的數(shù)量直接相關(guān)(參見(jiàn)表9)，對(duì)于隨后的試驗(yàn)，將DHO的濃度以μg／ml外推至10×106個(gè)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)在1×106個(gè)細(xì)胞／ml的密度下DHO濃度線性增加最好。利用此細(xì)胞密度，研究與A771726一起溫育的細(xì)胞中胞內(nèi)DHO水平隨時(shí)間的升高。在溫育1小時(shí)后，可以測(cè)量出可檢測(cè)量的DHO，這不依賴(lài)于藥物的濃度(表11)。記錄到有線性增加，在6小時(shí)后測(cè)定到DHO的最大量(表11)。經(jīng)過(guò)此時(shí)間段后觀察到出現(xiàn)飽和狀態(tài)，DHO不再升高。表10細(xì)胞密度和胞內(nèi)DHO濃度隨時(shí)間的增加<tablesid="table12"num="015"><table>溫育時(shí)間(小時(shí))1DHO的濃度(μg／ml)平均值+SD1×106細(xì)胞／ml2×106細(xì)胞／ml3×106細(xì)胞／ml6．25±0．425．47±0．105．63±0．19433．06±2．2626．36±0．4219．39±1．87760．07±0．0142．31±1．0728．79±0．34</table></tables>將不同量的A20．2．J細(xì)胞與A771726(5μM)一起溫育如上長(zhǎng)的時(shí)間，并且測(cè)定各樣品點(diǎn)的胞內(nèi)DHO濃度(*所有值外推至10×106細(xì)胞)(n=2)。表11胞內(nèi)L-DHO濃度隨時(shí)間的增加<tablesid="table13"num="016"><table>溫育時(shí)間(小時(shí))0DHO的濃度(μg／ml)平均值±SDA771726(5μM)A771726(10μM)A771726(25μM)2．73±0．102．73±0．102．73±0．0819．20±0．098．5±0．3915．05±0．26224．03±1．1520．74±1．4326．06±0．20459．48±0．7258．65±2．0650．21±1．54787．54±1．5882．65±4．50114．89±3．61</table></tables>將1百萬(wàn)A20．2．J細(xì)胞與不同濃度的A771726一起溫育并且在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定其胞內(nèi)DHO濃度。數(shù)據(jù)表示為外推至10百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞時(shí)的μg／mlDHO±SD(0-4小時(shí)=n=2，7小時(shí)=n=4)。A20．2．J腫瘤細(xì)胞與A771726一起溫育時(shí)，由于DHO-DH被抑制而導(dǎo)致L-DHO迅速累積。胞內(nèi)L-DHO的濃度與細(xì)胞數(shù)目相關(guān)，并隨時(shí)間而變化。因此L-DHO的監(jiān)測(cè)是A771726在患者體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性的替代標(biāo)志。實(shí)施例3動(dòng)物體重為160-200g的雄性Wistar-Lewis大鼠(MollegaardBreadingCenterLtd．Ejby，DK)。佐劑關(guān)節(jié)炎將0．1ml弗氏佐劑(6mg恥垢分枝桿菌懸浮在1ml白色重石蠟油中)(Merck，Darmstadt)注射到Wistar-lewis大鼠尾根部，以誘發(fā)該疾病。病理癥狀一般在疾病誘發(fā)后10-14天出現(xiàn)。藥物處理將藥物懸浮在1％的羧甲基纖維素(COMC)中。給健康大鼠(n=18)和佐劑致病(n=18)大鼠(患病第9天)口服給藥10mg／kg的N-4-(三氟甲基苯基)-5-甲基異噁唑-4-甲酰胺(此后稱(chēng)作來(lái)氟米物(Leflunomide))，每天2次(730和1330)，共5天；即時(shí)間點(diǎn)0小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、48小時(shí)、54小時(shí)、72小時(shí)、78小時(shí)、96小時(shí)(參見(jiàn)表12)。在時(shí)間點(diǎn)0小時(shí)時(shí)，處死患病和未患病組各3只動(dòng)物，用于測(cè)定基線水平。另外取3只健康和3只患病的動(dòng)物用安慰劑(單獨(dú)的COMC)處理5天。取樣在各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)從每組中取3只動(dòng)物處死。在3小時(shí)、7小時(shí)、27小時(shí)、51小時(shí)、75小時(shí)和99小時(shí)取血清和脾細(xì)胞(參見(jiàn)表12)。除了7小時(shí)時(shí)的數(shù)值以外，其它樣本均是在末次給藥后3小時(shí)時(shí)采集。7小時(shí)的數(shù)值是在第二次給藥后1小時(shí)采集樣本得到的。在0小時(shí)(n=3)和99小時(shí)(n=3)的時(shí)間點(diǎn)自安慰劑處理動(dòng)物取樣。表12來(lái)氟米物的給藥和組織取樣時(shí)間<tablesid="table14"num="017"><table>小時(shí)03672427304851547275789699藥物(p．o．)取樣↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑</table></tables>樣本的制備-將通過(guò)心臟穿刺收集的血液在4℃下儲(chǔ)存30分鐘，隨后在3000rpm下離心10分鐘。分離血清并儲(chǔ)存在-20℃的Eppendorf管中(3)。在HPLC分析前，將冷凍血清融化，為了除去蛋白質(zhì)，將200μl血清加入到Microcon濾器(10型，編號(hào)42407，Amicon)中并在13000rpm下離心30分鐘。-取出脾臟(n=3)并且合并用于L-DHO分析。將通過(guò)撥挑分離的細(xì)胞(穿過(guò)不銹鋼濾過(guò)器)用0．17MNH4Cl處理，以溶解紅細(xì)胞。每組制備50百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞的等分樣本，置于離心管中，棄去上清液。在持續(xù)混合下，向細(xì)胞團(tuán)中加入500μl的1．2MHClO4溶液以溶解細(xì)胞，離心2分鐘。將全部酸性細(xì)胞溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到玻璃瓶中，加入500μl氯仿并用渦旋混合器混合2分鐘。通過(guò)離心沉淀出細(xì)胞脂質(zhì)(10分鐘，1502×g和10℃)。將上清液置于2ml的管中并儲(chǔ)存在-20℃下。按照下列方法測(cè)定A771726的血清濃度將血清樣本升至室溫并用渦旋混合器充分混合。將血清吸移(200μl)至Eppendorf管中并加入內(nèi)標(biāo)(A771726，2μg于400μl乙腈中)。隨后將該管在渦旋混合器中混合并在2500rpm下離心10分鐘(室溫下)。為進(jìn)行HPLC分析，將上清液(400μl)轉(zhuǎn)移到瓶?jī)?nèi)，加入水(400μl)且混合。將HPLC條件設(shè)定如下硬件由TSPP2000泵、TSPAS1000自動(dòng)進(jìn)樣器、TSPSP4270積分儀和TSPUV100UV檢測(cè)器組成。檢測(cè)是在292nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行。流動(dòng)相由650ml甲醇(CHROMASOLV)、2．42g溴化四丁基銨和350ml0．05ml醋酸銨組成。流速為0．5ml／分鐘，試驗(yàn)采用CHROMPACKSpherisorbODS-210cm柱，并且?guī)в?cm的反相(R2)保護(hù)柱。將100μl液體注射至柱內(nèi)，洗脫時(shí)間為7分鐘。HPLC對(duì)L-DHO濃度的測(cè)定按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行層析分離。將電導(dǎo)檢測(cè)器的范圍設(shè)定在10μS；分析是在室溫下進(jìn)行。流動(dòng)相由100mMNaOH(A)和水(B)組成。用該體系得到以下梯度血清<tablesid="table15"num="018"><table>時(shí)間(分鐘)A(％)B(％)01992．51991423771860402460402619945199</table></tables>脾細(xì)胞<tablesid="table16"num="019"><table>時(shí)間(分鐘)A(％)B(％)01992．519914892228922860403260403419949199</table></tables>流速為1ml／分鐘在來(lái)氟米物口服給藥后，健康和患病大鼠的細(xì)胞(表13)和血清(表14)L-DHO濃度均升高。這種升高與在這些動(dòng)物中測(cè)出的A771726血清濃度相關(guān)(表15)。首先，在口服給藥后3小時(shí)，A771726的濃度在佐劑致病大鼠中達(dá)到約26μg／ml，在未致病大鼠中達(dá)到31μg／ml。這些數(shù)值在第二次給藥后1小時(shí)(7小時(shí))達(dá)到高峰，但在試驗(yàn)期間對(duì)于患病和未患病大鼠來(lái)說(shuō)該值都降低至7-12μg／ml。患病動(dòng)物經(jīng)51小時(shí)達(dá)到這些濃度，而未患病大鼠在27小時(shí)后已經(jīng)達(dá)到(表15)。A771726的血清濃度與佐劑致病和未致病大鼠血清中的L-DHO濃度相關(guān)。與在試驗(yàn)期間穩(wěn)定在約5μg／ml的L-DHO血清濃度相反，L-DHO在脾細(xì)胞中的含量在99小時(shí)之后降低至檢測(cè)限(1．5μg／ml)以下。表13從用來(lái)氟米物處理的大鼠中取出的脾細(xì)胞[50×106細(xì)胞]中的L-DHO濃度<tablesid="table17"num="020"><table>佐劑致病大鼠未致病大鼠時(shí)間[小時(shí)]單值平均值[μg／ml]SD[μg／ml]SD[％]單值平均值[mg／ml]SDμg／ml]SD[％]0(安慰劑)＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．35．814．605．210．6011．525．096．315．700．6110．70713．0011．2212．110．897．3516．7714．8715.820．956．012716．2816．8416．560．281．698．6910．259．470．788．24513．631．843．973．800．174．472．342．090．2511．96752．581．922．712．650．062．262．242．080．167．6999＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．安慰劑(99)＜D．L．＜D．L．＜D．L＜D．L．＜D．L．＜D．L．</table></tables>用來(lái)氟米物或安慰劑處理動(dòng)物，取出脾(n=3)并按照上述方法合并。將合并的脾細(xì)胞一式二份進(jìn)行分析。DL=檢測(cè)限(1．5μg／ml)表14來(lái)氟米物處理大鼠的血清中的L-DHO濃度<tablesid="table18"num="021"><table>佐劑致病大鼠未致病大鼠時(shí)間[小時(shí)]大鼠單值平均值[μg／ml]SD[μg／ml]SD[％]單值平均值[μg／ml]SD[μg／ml]SD[％]0(安慰劑)123＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．＜D．L．31237．859．668．058．520．9911．7011．9210．8810．6011．130．676．30712319．5517．0016．0617．541．8110．3020．2918．1417．5418．661．457．802712319．7315．9513．6716．453．0618．608．228．428．648．430．212．50511233．063．683．063．270．3611．004．874．774．024．550．4610．20751235．384．455．605．140．6111．904．604．174．234．330．235．40991235．484．894．685．020．418．305．676．644．955．750．8514．80安慰劑(99)123＜D．L＜D．L＜D．L＜D．L．＜D．L＜D．L＜D．LD．L</table></tables>用來(lái)氟米物或安慰劑處理動(dòng)物并且按照上述方法取血，制備和分析。分別測(cè)定各動(dòng)物的L-DHO血清濃度。DL=檢測(cè)限(1．5μg／ml)表15來(lái)氟米物處理大鼠的血清中的A771726濃度<tablesid="table19"num="022"><table>佐劑致病大鼠未致病大鼠時(shí)間[小時(shí)]大鼠單值平均值[μg／ml]SD[μg／ml]SD[％]單值平均值[μg／ml]SD[μg／ml]SD[％]0(安慰劑)1230．00．00．00．00．00．00．00．00．00．0312326．827．225．026．331．174．4532．030．629．630．71．213．92712344．145．237．642．34．119．7147．749．446．547．91．463．042712321．322．015．919．73．3416．9210．29．98．89．60．747．65511239．110．28．29．21．0010．937．88．75．87．41．4819．97751239．07．313．39．93．0931．346．79．48．28．11．3516．709912312．011．912．612．20．383．1114．611．412．212．71．6713．08安慰劑(99)1230．00．00．00．00．00．00．00．00．00．0</table></tables>用來(lái)氟米物或安慰劑處理動(dòng)物并且按照上述方法取血，制備和分析。分別測(cè)定各動(dòng)物的A771726血清濃度?？诜o藥的來(lái)氟米物在體內(nèi)很快轉(zhuǎn)化為A771726。A771726是來(lái)氟米物的活性代謝產(chǎn)物(US5679709)。在來(lái)氟米物給藥的佐劑致病大鼠或未致病大鼠中，L-DHO在其血清和脾細(xì)胞中迅速累積。L-DHO的濃度與A771726的血清濃度相關(guān)，由此證實(shí)該分子在體內(nèi)能有效抑制DHO-DH。在人體臨床研究中，L-DHO的監(jiān)測(cè)是患者中來(lái)氟米物免疫調(diào)節(jié)作用的替代標(biāo)志。權(quán)利要求1．一種通過(guò)層析法獲得L-二氫乳清酸的方法，該方法包括下述步驟a)獲得含有耐壓陰離子交換材料的柱子；b)將含有L-二氫乳清酸的樣本溶液加樣至該柱中；c)進(jìn)行層析；d)用含有堿水混合物的洗脫劑來(lái)洗脫L-二氫乳清酸；該方法是在約1．1MPa-約40MPa的壓力下進(jìn)行的。2．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述堿是氫氧化鈉。3．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述耐壓陰離子交換材料是被鏈烷醇季銨改性的二乙烯基苯／乙基乙烯基苯聚合物、與二乙烯基苯交聯(lián)的聚乙烯基芐銨聚合物或者其混合物。4．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述壓力約為4．1MPa-約5．5MPa。5．如權(quán)利要求1所述的方法，其中堿水混合物的洗脫表現(xiàn)為堿濃度的時(shí)間梯度，優(yōu)選線性過(guò)程。6．如上述權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中L-二氫乳清酸是通過(guò)電導(dǎo)檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)。7．如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法在診斷分析中的應(yīng)用。8．如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法在測(cè)定二氫乳清酸脫氫酶抑制劑中的應(yīng)用。9．如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中二氫乳清酸脫氫酶抑制劑是N-4(三氟甲基苯基)-5-甲基異噁唑-4-甲酰胺、布喹那、N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羥基庚-2-烯-6-炔-甲酰胺、2-氰基-3-環(huán)丙基-3-羥基丙烯酸-(4-氰基苯基)-酰胺和／或N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羥基丁烯酰胺。10．L-二氫乳清酸的測(cè)定在二氫乳清酸脫氫酶抑制劑活性檢測(cè)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過(guò)在陰離子交換材料上、于堿水混合物中、約1.1MPa至約40MPa壓力下進(jìn)行層析得到L－二氫乳清酸的方法。該方法可以用來(lái)研究N－4(三氟甲基苯基)－5－甲基異噁唑－4－甲酰胺、N－4(三氟甲基苯基)－2－氰基－3－羥基丁烯酰胺及類(lèi)似化合物的體內(nèi)和體外活性。文檔編號(hào)C07D239/557GK1281550SQ98812046公開(kāi)日2001年1月24日申請(qǐng)日期1998年12月8日優(yōu)先權(quán)日1997年12月11日發(fā)明者U·米爾伯特,R·巴特萊特,E·魯斯,C·福達(dá)里申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物德國(guó)有限公司