專利名稱：單磷?；|(zhì)a的水性免疫佐劑組合物的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請是1997年4月1日提交的共同未決的專利申請序號08/831,073的繼續(xù)部分申請。
背景技術(shù)：
化合物單磷?；|(zhì)A(MLA)和3-O-脫酰基單磷?；|(zhì)A(3D-MLA)是減毒的細菌脂多糖(LPS)的脂質(zhì)A衍生物。LPS和脂質(zhì)A是在給予這些化合物的病人中誘導(dǎo)體液抗體反應(yīng)和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的有力的免疫刺激劑。然而，脂質(zhì)A和LPS也可表現(xiàn)出毒性副作用如引起發(fā)熱和局部Shwarzman反應(yīng)。MLA和3D-MLA是已得到修飾以減輕LPS毒性的脂質(zhì)A樣分子。
象脂質(zhì)A，MLA和3D-MLA分子具有一個上面帶有長鏈脂肪酸的糖主鏈。主鏈包括糖甙鍵連接的兩個六碳糖環(huán)。MLA和3D-MLA在4位磷酸化。5-8個長鏈脂肪酸(12-14碳)結(jié)合在糖主鏈上使MLA和3D-MLA成為強疏水分子，不易溶于水。
減毒的脂質(zhì)A衍生物(ALD)MLA和3D-MLA用作感染性疾病的預(yù)防疫苗和治療癌性腫瘤和慢性感染的治療性疫苗中的免疫佐劑。大多數(shù)疫苗中所含的抗原制品經(jīng)常是水溶性蛋白的復(fù)雜的混合物使得不溶于水的佐劑難以配制在水性疫苗制劑中。因此，在加入抗原制品水前，MLA和3D-MLA必須先與溶劑混合。然而，溶劑的存在可能使疫苗制劑進一步復(fù)雜化，并且，在某些情況下降低其成分的有效性。另外，溶劑可能刺激粘膜表面或者在注射位點引起炎癥。含有非干擾性的共同溶劑的MLA或3D-MLA的簡單制劑可獲得來自疫苗組合物中的佐劑和抗原的最大好處，本發(fā)明滿足了這一需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及減毒的脂質(zhì)A衍生物(ALD)和表面活性劑的水性制劑及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明，有用的減毒脂質(zhì)A的衍生物包括單磷酰基脂質(zhì)A(MLA)和3-O-脫?；膯瘟柞；|(zhì)A(3D-MLA)。MLA的水性制劑(MLA/AF)或3D-MLA的水性制劑(3D-MLA/AF)，改變了對用于疫苗制備的不良溶劑或共同溶劑系統(tǒng)的需要。本發(fā)明提供ALD和表面活性劑的穩(wěn)定水性組合物，當(dāng)與抗原一起施用于小鼠時，加強動物對該抗原的細胞和體液免疫應(yīng)答。令人吃驚地，當(dāng)鼻內(nèi)給藥時，本發(fā)明的水性制劑誘發(fā)免疫動物中高水平的血清和粘膜分泌的IgA。要求專利保護的水性組合物的實施方案包括約4∶1的MLA或3D-MLA與表面活性劑的摩爾比并具有約50-70nm的顆粒大小。1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)是優(yōu)選的表面活性劑。
本發(fā)明公開了制備水性組合物的方法。在一種實施方案中，溶解ALD和表面活性劑并在乙醇中均勻地混合。乙醇揮發(fā)后留下一層薄膜。將水加到薄膜上。通過超聲處理使ALD和表面活性劑懸浮于水中。超聲處理懸浮液直至澄清。給予要求專利保護的組合物和抗原的動物表現(xiàn)出對此抗原的加強的體液和細胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明還公開和要求專利保護應(yīng)用組合物增強這些應(yīng)答的方法。
附圖簡述

圖1a-d表示給予3-O-脫?；鶈瘟柞；|(zhì)A的水性配方(3D-MLA/AF)中的破傷風(fēng)類毒素(TT)抗原★或鹽水中破傷風(fēng)類毒素抗原◆的小鼠的抗體效價。圖1a表示給予破傷風(fēng)類毒素抗原的小鼠的總IgG抗體效價。圖1b表示給予破傷風(fēng)類毒素抗原的小鼠的IgG2a抗體效價。圖1c表示給予破傷風(fēng)類毒素抗原的小鼠的IgG2b的抗體效價，圖1d表示動物的IgG1抗體效價。
圖2表示用純化的蛋白衍生物免疫的小鼠的T-細胞增殖反應(yīng)。表示了在初次接種后14天給予3D-MLA/AF中的破傷風(fēng)類毒素小鼠和正常對照組小鼠的增殖反應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及減毒的脂質(zhì)A衍生物(ALD)的水性佐劑制劑。將ALD和表面活性劑以約4∶1的摩爾比懸浮于水中并且通過超聲處理使懸浮中顆粒大小約為50-70nm。
根據(jù)本發(fā)明，減毒的脂質(zhì)A衍生物可配制成水性復(fù)合物以提供有力的佐劑。減毒的脂質(zhì)A衍生物是表現(xiàn)脂質(zhì)A有利的免疫刺激性質(zhì)但較少表現(xiàn)出該化合物的不良副作用的脂質(zhì)A樣化合物。例如，單磷?；|(zhì)A(MLA)和3-O-脫酰基的單磷?；|(zhì)A(3D-MLA)是強力的免疫刺激物但比脂質(zhì)A毒性小得多的ALD。MLA和3D-MLA可用于本發(fā)明的組合物中，這是已知的并不需在此詳細描述。見例如，于1984年3月13日授予的轉(zhuǎn)讓給Ribi ImmunoChem Research，Inc.的美國專利序號4,436,727公開了單磷?；|(zhì)A及其制備。也是轉(zhuǎn)讓給Ribi ImmunoChem Research，Inc.的美國專利號4,912,094和Myers等的再審查證書BI4,912,094包括3-O-脫酰基的單磷?；|(zhì)A及其制備。涉及MLA和3D-MLA的每一這些專利的公開內(nèi)容在此引入作為參考。
不探究引入作為參考的以前專利的細節(jié)，在此所用的單磷?；|(zhì)A(MLA)來源于脂質(zhì)A，大腸桿菌脂多糖的一種成分，是強力但高度毒性的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑。Edgar Ribi和他的同事實現(xiàn)了起初稱為精制去毒內(nèi)毒素的單磷酰基脂質(zhì)A(MLA)的生產(chǎn)。通過在中等強度無機酸溶液(如0.1 HCl)中回流從革蘭氏陰性細菌無庚糖突變體獲得的內(nèi)毒素提取物(LPS或脂質(zhì)A)約30分鐘來生產(chǎn)MLA。這種處理導(dǎo)致還原末端葡萄糖胺的位置1處磷酸部分的丟失。
同時，這種處理中，從非還原葡萄糖胺的位置6去除核心糖。結(jié)果產(chǎn)物(MLA)表現(xiàn)出明顯減輕的正常與內(nèi)毒素起始物質(zhì)相關(guān)的內(nèi)毒素活性如熱原性、局部Shwarzman反應(yīng)性和如雞胚50％致死量分析(CELD50)中測定的毒性。然而，出予預(yù)料地保留了脂質(zhì)A和LPS作為免疫調(diào)節(jié)劑的功能。
另外一種可能用于本發(fā)明實施的減毒脂質(zhì)A衍生物稱為3-O-脫酰基的單磷酰基脂質(zhì)A(3D-MLA)。已知3D-MLA如美國專利序號4,912,094，再審查證書B1 4,912,094(′094專利)中所述的，并且與MLA不同，因為它是在不對其它基團造成不利影響的條件下，從MLA分子選擇性去除在位置3與還原末端葡萄糖胺相連的酯的β-羥基肉豆蔻基?；鶜埢?。3-O-脫酰基的單磷?；|(zhì)A可從RiBiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Montana 59840獲得。
MLA和3D-MLA分子是多種帶有不同脂肪酸鏈長度的脂肪酸取代形式即十七碳酰基、十六碳酰基和十五碳?；鹊膹?fù)合物或混合物。因此，本發(fā)明包括MLA和3D-MLA的多種形式。而且本發(fā)明包括合成或半合成方法產(chǎn)生的化合物的混合物形式和單獨化合物。--094專利中描述的脂質(zhì)A的主鏈與從明尼蘇達沙門氏菌R595通過十七碳?；|(zhì)A3-脫?；饔毛@得的產(chǎn)物相一致。此公開內(nèi)容中包括其它脂肪酸取代類型；基本特征是該物質(zhì)是3-O-脫?；摹?br> 用于本發(fā)明的修飾的3D-MLA的制備是通過在導(dǎo)致脂質(zhì)A主鏈的位置3單個脂肪酸丟失的條件下將MLA進行堿水解。在堿性介質(zhì)中，位置3的β-羥基肉豆蔻基脂肪酸異常地不穩(wěn)定。僅需溫和的堿處理就可使脂質(zhì)A完全達到3-脫酰基。其它脂質(zhì)A的酯鍵需要在水解發(fā)生前某種更強烈的條件以致于在不明顯影響分子的其它部分的情況下選擇性地使位置3的部分脫酰基。目前不清楚位置3的酯連接的β-羥基肉豆蔻基脂肪酸對堿性介質(zhì)的異常敏感性的原因。
盡管已知堿性水解方法，選擇除了水解在位置3的β-羥基肉豆蔻基的酯鍵以外不引起進一步水解的條件是重要的。通常水解可在水性或有機介質(zhì)中進行。后一種情況下，溶劑包括甲醇(乙醇)、二甲基亞砜(DMSO)。二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿、二氯甲烷等以及它們的混合物。也可聯(lián)合應(yīng)用水和一種或多種上而提取的有機溶劑。
堿性基質(zhì)可選自多種氫氧化物、碳酸鹽、磷酸鹽和胺。舉例的堿包括無機堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等，有機堿如烷基胺，并且包括但不局限于二乙胺、三乙胺等。
在水性介質(zhì)中pH值典型地在約10-14之間，pH值約12-13.5是優(yōu)選的范圍。典型地，水解反應(yīng)在約20℃-80℃的溫度下進行，優(yōu)選在約50-60℃下反應(yīng)約10-30分鐘。例如，水解可在室溫(22℃-25℃)下3％三乙胺水溶液中進行48小時。選擇水解溫度和時間的唯一要求是使脫酰基作用發(fā)生以便僅在位置3去除β-羥基肉豆蔻基。
實踐中，已發(fā)現(xiàn)特別有利的水解方法，包括將脂質(zhì)A或單磷?；|(zhì)A溶解于氯仿∶甲醇2∶1(v/v)中，用含有0.5M Na2CO3的水性緩沖液在pH10.5飽和此溶液，然后在45℃-50℃真空機或吸氣器(約100mHg)下迅速蒸發(fā)溶劑。得到的物質(zhì)在位置3選擇性地脫?；?。這一過程也可用上面所列的任一種無機堿進行。在某些情況下，在用水性緩沖液飽和之前向有機溶液中加入相轉(zhuǎn)移催化劑如四丁基溴化銨是可取的。
制備本發(fā)明的組合物中，一般地，將減毒的脂質(zhì)A衍生物(ALD)與每種溶解于溶劑中的表面活性劑相混合。溶劑揮發(fā)后留下一薄膜。在薄膜上加水并且在加熱得到的懸浮液的同時進行超聲處理直至澄清。最終懸浮液具有約40-150nm并且優(yōu)選地約50-70nm的顆粒大小。
ALD與表面活性劑以約10份ALD比約1到5份表面活性劑的摩爾比相混合。優(yōu)選地，成分以約4份ALD比1份表面活性劑的摩爾比相混合。根據(jù)本發(fā)明有用的表面活性劑包括但不限于膽汁鹽、天然磷脂和鞘脂。在要求專利保護的組合物中膽汁鹽如甘氨脫氧膽酸鹽和脫氧膽酸鹽可用作表面活性劑。其它合適的表面活性劑包括鞘脂如鞘磷脂和鞘氨醇及磷脂如卵磷脂、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、L-α-磷脂酰乙醇胺和1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿或它們的混合物。優(yōu)選的實施方案中，磷脂1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)是表面活性劑。DPPC用于人是可接受的并且當(dāng)制劑是鼻內(nèi)給藥時尤其有效。
將ALD和表面活性劑溶解于溶劑是并徹底混合。根據(jù)本發(fā)明有用的水性或有機溶劑包括氯仿、醇(如乙醇)、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等及它們的混合物。
將溶劑從ALD和表面活性劑的混合物蒸發(fā)掉并留下一層薄膜。將水加到薄膜上并在加熱得到的懸浮液的同時進行超聲處理直至澄清。優(yōu)選在水浴超聲波儀中對懸浮液進行超聲處理。水浴溫度可為40℃-80℃，優(yōu)選地約60℃。懸浮液可超聲處理5分鐘至約1小時直至澄清。超聲處理的時間可隨懸浮液的體積和濃度不同而不同但可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。最終懸浮液中顆粒大小約40-150nm并優(yōu)選地約50-70nm。
將有效量的本發(fā)明組合物與抗原施用于恒溫動物以增強動物對該抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的組合物加強了動物對抗原的體液免疫應(yīng)答以及細胞免疫應(yīng)答。所給予的激發(fā)期望的應(yīng)答的抗原的量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定并且將隨所給的抗原類型，給藥途徑和免疫時間表的不同而不同。兩次免疫分別21天皮下給小鼠1μg破傷風(fēng)類毒素及要求專利保護的組合物激發(fā)對該抗原的體液免疫應(yīng)答。當(dāng)鼻內(nèi)給藥時，本發(fā)明的組合物和抗原刺激細胞毒性T-淋巴細胞的產(chǎn)生。在0天和21天鼻內(nèi)給予要求專利保護的組合物中的乙型肝炎表面抗原(2.5μg)刺激了免疫的動物體內(nèi)細胞毒性T-淋巴細胞的產(chǎn)生。而且，當(dāng)鼻內(nèi)給藥時，本發(fā)明的組合物在激發(fā)免疫動物的IgA反應(yīng)中特別有效。給予0.5-12.5μg的3-O-脫酰基單磷?；|(zhì)A的水性制劑中的破傷風(fēng)類毒素的小鼠表現(xiàn)出對該抗原增高的IgA效價。本發(fā)明的組合物的有效量是可刺激或增強免疫應(yīng)答的量。例如，申請專利的組合物的有效量可含有1到約250μg減毒脂質(zhì)A衍生物并且以典型的70kg成年病人為基礎(chǔ)的給藥優(yōu)選地約25-50μg。
提供下面的實施例以進一步說明但不限制本發(fā)明的組合物和方法。應(yīng)理解的是在此提供的小鼠模型是恒溫動物的代表并且與其它恒溫動物的情況包括人合理地相關(guān)。除非另有說明，所有百分比是重量百分比且所有溶劑混合物比例為體積比。實施例1-減毒的脂質(zhì)A衍生物的水性制劑的制備根據(jù)本發(fā)明，注射用水中含有1000μg/ml來自明尼蘇達沙門氏菌R595的減毒的脂質(zhì)A形式的3D-MLA(RiBi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Montana 59840)和118μg/ml的1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)的3-O-脫?；鶈瘟柞；|(zhì)A(3D-MLA/AF)的水性制劑的制備如下將DPPC溶解于乙醇使其濃度為4mg/ml并旋轉(zhuǎn)使其澄清。將2.7mlDPPC溶液加到含有100mg凍干的3D-MLA的小瓶中并輕輕旋動以濕潤3D-MLA。輕輕向小瓶中吹入過濾的氮氣以去除乙醇。向小瓶中加入注射用水(91.7ml)，然將小瓶塞好，封口并懸浮于Labline 9303水浴超聲波儀中。60℃超聲處理懸浮液10分鐘直至澄清。用來自Malvern Instruments的PSC 1000 Spectrometer測定得到的水性制劑中含有70nm的顆粒并用0.2μm濾器過濾除菌。實施例2-抗體反應(yīng)的刺激作用用本發(fā)明水性制劑中的破傷風(fēng)類毒素(TT)免疫的小鼠產(chǎn)生破傷風(fēng)類毒素特異抗體。免疫之后用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定小鼠血清中TT特異的總IgG效價和IgG同種型(2a，2b，1)的效價。
用含有0.1μg破傷風(fēng)類毒素(TT)+50μg 3D-MLA/AF或0.1μg TT與鹽水的一定劑量的疫苗免疫雌性ICR小鼠。按實施例1制備3D-MLA/AF。在第0天和第21天皮下注射疫苗。第二次免疫后第14天收集血清并用標(biāo)準ELISA技術(shù)測定以報導(dǎo)破傷風(fēng)類毒素特異性抗體IgG1、IgG2a和IgG2b同種型以及總IgG的相對量。
圖1表示由3D-MLA/AF產(chǎn)生的破傷風(fēng)類毒素特異抗體效價。當(dāng)與破傷風(fēng)類毒素抗原一起施用時，3D-MLA/AF刺激免疫動物的IgG抗體產(chǎn)生并且尤其活躍地刺激IgG2a產(chǎn)生。實施例3-細胞增殖的刺激作用當(dāng)脾細胞用該抗原處理時，通過用本發(fā)明的佐劑組合物和純化的蛋白衍生物(PPD)(結(jié)核)菌素免疫誘導(dǎo)的小鼠表現(xiàn)出體外增殖反應(yīng)。
通過用一定劑量的含有50μg PPD+50μGg3D-MLA/AF的疫苗皮下注射免疫雌性BALB/c小鼠。按實施例1制備3D-MLA/AF。免疫后14天收集脾細胞并作為增殖測定中淋巴細胞的來源。在微量滴定孔中，脾細胞以106個細胞/ml密度在含有0.1、1或10μg PPD/ml的培養(yǎng)液中培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)的最后24小時向培養(yǎng)物中加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶。在玻璃纖維濾紙上收集細胞并測定氚的摻入。刺激指數(shù)由用PPD刺激的細胞的每分鐘計數(shù)(CPM)除以單純培養(yǎng)液中的培養(yǎng)細胞的CPM而定。得到的數(shù)據(jù)見圖2。實施例4-細胞毒性T-淋巴細胞反應(yīng)的刺激作用用細胞毒性測定法檢測給予本發(fā)明的水性佐劑組合物和蛋白抗原之后的細胞毒性T-淋巴細胞反應(yīng)的誘導(dǎo)。用配制在3D-MLA/AF中的25μg卵白蛋白(OVA)皮下注射(腹股溝)給多組C57/BL/6小鼠進行首次免疫。如實施例1制備3D-MLA/AF。注射體積為200μl。21天后每實驗組的3只小鼠被殺檢并且摘取脾臟，制成單細胞懸浮液并計數(shù)。
將來自實驗組的脾細胞(3-4ml培養(yǎng)液中75×106個細胞)置于25cm2T-培養(yǎng)瓶中。然后，將1.0ml的5×106/ml的輻射的(20,000拉德)E.G7(OVA)細胞加入培養(yǎng)瓶中。使體積達到10ml。將培養(yǎng)瓶直立于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。第4天從培養(yǎng)瓶中取出存活細胞，洗一次，重懸于5.0ml中并且計數(shù)。將復(fù)原的效應(yīng)細胞的濃度調(diào)節(jié)為5×106活細胞/ml并且用100μl/孔的培養(yǎng)液作為稀釋劑在96孔圓底培養(yǎng)板(Corning 25850)的孔中將100μl體積連續(xù)稀釋三次。然后，將1×105細胞/ml的100μl體積的51Cr標(biāo)記的(見下面)靶細胞〔E.G7(OVA)-卵白蛋白基因轉(zhuǎn)染的EL-4細胞系〕加到孔中。自發(fā)釋放(SR)孔含有100μl靶細胞和100μl培養(yǎng)液。最大釋放(MR)孔含有100μl靶細胞和100μl去污劑(2％Tween 20)。效應(yīng)細胞/靶細胞(E/T)比為50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1。400×g離心培養(yǎng)板并在37℃、5％CO2下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)之后，用Skatron上清收集系統(tǒng)收集上清液。
按下面用51Cr(鉻酸鈉)標(biāo)記靶細胞即E.G7(OVA)。在15ml的圓錐形試管中將總體積為1.0ml的5×106靶細胞和250μCi51Cr混和。細胞懸浮液在37℃水浴中培養(yǎng)90分鐘，并每隔15分鐘輕輕混合。培養(yǎng)之后，通過離心并用15ml培養(yǎng)液傾析洗標(biāo)記的細胞3次。第三次離心之后將細胞重懸于10ml新鮮培養(yǎng)液中并將其置于室溫中30分鐘，然后離心。最終細胞重懸于培養(yǎng)液中，密度為1×105細胞/ml。細胞毒性測定的結(jié)果見表1。
表1
*磷酸緩沖鹽水實施例5-水性ALD制劑鼻內(nèi)給藥的抗體反應(yīng)的刺激鼻內(nèi)給予3D-MLA/AF中的破傷風(fēng)類毒素(TT)的小鼠產(chǎn)生的血清和糞便提取物中都可檢測到IgA效價。而且，鼻內(nèi)給予本發(fā)明的水性制劑和TT產(chǎn)生IgG同種型IgG2a和IgG2b的高效價。
鼻內(nèi)給多組ICR小鼠磷酸緩沖鹽水(PBS)中的或與25μg 3D-MLA/AF混合的0.5、2.5、10或12.5μg破傷風(fēng)類毒素。小鼠在0天首次接觸抗原，在第10天取血(d10P1°)，在第14天加強免疫，第24天取血(d10P2°)，在第28天加強，在第38天取血(d10P3°)。用ELISA測定每次取血的混合血清的IgG和IgA特異的抗-破傷風(fēng)類毒素抗體。在第22天(d7P2°)檢查糞便提取液。免疫的小鼠的血清IgG和IgA效價見于表2-5中所示。
表2
>*n＝4表3表2中來自d10P3°取血的血清IgG同種型分析
<p>表4
*給予10μg破傷風(fēng)類毒素表5表4中d10P3°取血的血清IgG同種型分析
實施例6-通過水性ALD制劑的鼻內(nèi)給藥刺激對乙型肝炎表面抗原的免疫反應(yīng)鼻內(nèi)給予小鼠本發(fā)明的組合物中的乙型肝炎表面抗原(HBSAG)產(chǎn)生對該抗原的血清IgG和IgA效價。在陰道洗液中檢測分泌的IgA并用細胞毒性測定檢測細胞毒性T-淋巴細胞反應(yīng)的誘導(dǎo)。
鼻內(nèi)用20μl的2.5μg HBsAg+10μg 3D-MLA/AF對多組Balb/C小鼠進行初次免疫(1°)。按實施例1制備3D-MLA/AF。21天后鼻內(nèi)給小鼠20μl的7.5μg HBsAg+10μg 3D-MLA/AF進行第二次免疫(2°)。第二次免疫之后第28天用與第二次免疫相同的組合物進行第三次免疫(3°)。第二次免疫之后16天(d16，2°之后)及第三次免疫之后第8天(d8，3°之后)進行測定以檢測細胞毒性T-淋巴細胞活性。在第二次免疫之后第22天(d22，2°之后)和第三次免疫之后第21天(d21，3°之后)評估血清和粘膜抗體效價。所有的測定按本領(lǐng)域標(biāo)準方法進行并且在前面實施例2和4中有描述。此實驗的結(jié)果見表6-8。
表6<
>表7<
>用2.5μg HBsAg+10μg 3D-MLA/AF鼻內(nèi)免疫多組Balb/C小鼠并在21天后用7.5μg HBsAg+10μg 3D-MLA/AF鼻內(nèi)給藥加強免疫。加強免疫之后第10天收集陰道樣品。
表8
本發(fā)明組合物中的HBsAg的鼻內(nèi)給藥刺激對該抗原的體液和細胞免疫應(yīng)答。用配制在3D-MLA/AF的抗原鼻內(nèi)免疫誘導(dǎo)細胞毒性T-淋巴細胞反應(yīng)和抗原特異性體液和粘膜免疫應(yīng)答。實施例7-通過水性ALD制劑的鼻內(nèi)給藥產(chǎn)生對流感的保護性免疫反應(yīng)。
用含有配制在本發(fā)明組合物中的血凝素抗原的FLUSHIELD流感疫苗鼻內(nèi)免疫小鼠產(chǎn)生在陰道洗液中重新發(fā)現(xiàn)的IgG和IgA。免疫的小鼠也100％得到保護免受以后的流感攻擊。
鼻內(nèi)用含有0.3μg血凝素抗原(HA)+10μg 3D-MLA/AF的FLUSHIELD流感疫苗(Wyeth-Lederle)以21天的時間間隔免疫ICR小鼠3次。按實施例1制備3D-MLA/AF。在最后一次免疫之后14天收集陰道洗液。最后一次免疫之后第35天用10LD50(半數(shù)致死量)的傳染性流感A/HK/68攻擊小鼠并監(jiān)測死亡率。
表9
實施例8-單磷?；|(zhì)A的組合物單磷?；|(zhì)A可配制成本發(fā)明的水性組合物中并可以與實施例1-7中相同的量給藥以產(chǎn)生相似的結(jié)果。
應(yīng)理解前面所述的實施例僅僅是本發(fā)明的說明?？蓪M合物和/或所用的方法進行某些修飾并且仍可達到本發(fā)明的目的。這些修飾可包括在要求專利保護的本發(fā)明范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種水性佐劑組合物包含減毒的脂質(zhì)A衍生物和一種或多種表面活性劑。
2.權(quán)利要求1的水性佐劑組合物，其中所述減毒的脂質(zhì)A衍生物選自單磷?；|(zhì)A或3-O-脫?；膯瘟柞；|(zhì)A。
3.權(quán)利要求1的水性佐劑組合物，其中所述減毒的脂質(zhì)A衍生物是單磷?；|(zhì)A。
4.權(quán)利要求1的水性佐劑組合物，其中所述減毒的脂質(zhì)A衍生物是3-O-脫酰基的單磷?；|(zhì)A。
5.權(quán)利要求1的水性佐劑組合物，其中所述的表面活性劑選自甘氨脫氧膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、鞘磷脂、鞘氨醇、卵磷脂、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、L-α-磷脂酰乙醇胺和1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿或它們的混合物。
6.權(quán)利要求1的水性佐劑組合物，其中所述的表面活性劑是1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿。
7.權(quán)利要求1的水性佐劑組合物，其中減毒的脂質(zhì)A衍生物與表面活性劑的摩爾比是從約10∶1到約10∶5。
8.權(quán)利要求1的水性佐劑組合物，其中減毒的脂質(zhì)A衍生物與表面活性劑的摩爾比約為4∶1。
9.制備水性佐劑組合物的方法，包括步驟a.將一種或多種表面活性劑溶解于溶劑中；b.混合溶解的表面活性劑和減毒的脂質(zhì)A衍生物以獲得減毒的脂質(zhì)A衍生物和表面活性劑的混合物；c.從表面活性劑和減毒的脂質(zhì)A衍生物的混合物中蒸發(fā)掉溶劑；d.將水加入蒸發(fā)后的混合物以獲得懸浮液；并且e.對步驟d的懸浮液加熱并超聲處理直至澄清。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述減毒的脂質(zhì)A衍生物選自單磷?；|(zhì)A和3-O-脫?；膯瘟柞；|(zhì)A。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述減毒的脂質(zhì)A衍生物是單磷?；|(zhì)A。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述減毒的脂質(zhì)A衍生物是3-O-脫酰基的單磷?；|(zhì)A。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述的表面活性劑選自甘氨脫氧膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、鞘磷脂、鞘氨醇、卵磷脂、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、L-α-磷脂酰乙醇胺和1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿或它們的混合物。
14.權(quán)利要求9的方法，其中所述的表面活性劑是1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿。
15.權(quán)利要求9的方法，其中減毒的脂質(zhì)A衍生物與表面活性劑的摩爾比是從約10∶1到約10∶5。
16.權(quán)利要求9的方法，其中減毒的脂質(zhì)A衍生物與表面活性劑的摩爾比約為4∶1。
17.權(quán)利要求9的方法，其中所述的溶劑選自氯仿、醇、二甲基亞砜和二甲基甲酰胺或它們的混合物。
18.權(quán)利要求9的方法，其中所述溶劑是乙醇。
19.權(quán)利要求9的方法，其中所述懸浮液加熱到約60°-約80°。
20.權(quán)利要求9的方法，其中所述懸浮液加熱到約60℃。
21.權(quán)利要求9的方法，其中對所述懸浮液超聲處理約5-60分鐘。
22.權(quán)利要求9的方法，其中對所述懸浮液超聲處理約10分鐘。
23.一種增強恒溫動物對能夠激發(fā)動物免疫應(yīng)答的蛋白抗原的免疫應(yīng)答的方法，此方法包括給予該動物一種或多種蛋白抗原和有效量的含有減毒的脂質(zhì)A衍生物和一種或多種表面活性劑的水性佐劑組合物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述減毒的脂質(zhì)A衍生物選自單磷酰基脂質(zhì)A和3-O-脫?；膯瘟柞；|(zhì)A。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述水性佐劑組合物是鼻內(nèi)給藥。
26.一種刺激恒溫動物對能夠激發(fā)動物免疫應(yīng)答的蛋白抗原的血清和粘膜分泌型IgA反應(yīng)的方法，此方法包括給予動物一種或多種蛋白抗原和有效量的含有減毒的脂質(zhì)A衍生物和一種或多種表面活性劑的水性佐劑組合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述減毒的脂質(zhì)A衍生物選自單磷?；|(zhì)A和3-O-脫?；膯瘟柞；|(zhì)A。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述水性佐劑組合物是鼻內(nèi)給藥。
全文摘要
含有減毒的脂質(zhì)A衍生物和表面活性劑的水性佐劑組合物增強恒溫動物對蛋白抗原的免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明有用的減毒的脂質(zhì)A衍生物包括單磷?；|(zhì)A和3－O－脫?；膯瘟柞；|(zhì)A。表面活性劑和表面活性劑的混合物溶解于溶劑中。1,2－二棕櫚酰基－sn－甘油－3－磷酸膽堿是優(yōu)選的表面活性劑。將溶解的表面活性劑加入減毒的脂質(zhì)A衍生物中以獲得混合物?；旌衔镏袦p毒的脂質(zhì)A衍生物與表面活性劑的摩爾比約為4∶1。蒸發(fā)掉溶劑并將水加到所得的薄膜上。在60℃水浴中對懸浮液超聲處理直至變得澄清。給予這種佐劑制劑的動物表現(xiàn)出對所給抗原增強的抗體反應(yīng)并表現(xiàn)出增強的淋巴細胞增生和細胞毒性T－淋巴細胞反應(yīng)。水性佐劑組合物和抗原的鼻內(nèi)給藥刺激血清和粘膜分泌的IgA的產(chǎn)生。
文檔編號C07H13/06GK1259052SQ98804685
公開日2000年7月5日 申請日期1998年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月1日
發(fā)明者R·T·克萊恩 申請人:科里克薩有限公司