專利名稱：合成甲狀旁腺素類似物和甲狀旁腺素相關(guān)肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于合成在治療骨質(zhì)疏松上有用的某些新的甲狀旁腺素類似物和甲狀旁腺素相關(guān)肽的方法。
骨質(zhì)疏松是最普通的代謝性骨疾病形式，可被認(rèn)為是骨喪失(骨質(zhì)減少)的有癥狀的骨折階段。雖然骨質(zhì)疏松可以繼發(fā)于許多以下所述的疾病，但總共90％的病例顯得是自發(fā)性的。經(jīng)絕后的婦女特別具有患自發(fā)性骨質(zhì)疏松(經(jīng)絕后骨質(zhì)疏松或I型骨質(zhì)疏松)的危險(xiǎn)性。另一個(gè)自發(fā)性骨質(zhì)疏松高風(fēng)險(xiǎn)人群是男女性年老者(老年性骨質(zhì)疏松或II型骨質(zhì)疏松)。骨質(zhì)疏松也與皮質(zhì)甾類使用、固定或長期臥床休息、酒精中毒、糖尿病、性腺毒性化療、血促性腺激素過多、神經(jīng)性食欲不振、原發(fā)性和繼發(fā)性經(jīng)閉以及卵巢切除有關(guān)。
在骨質(zhì)疏松的各種形式中，骨折經(jīng)常發(fā)生，其是達(dá)到機(jī)械性喪失點(diǎn)的骨喪失的結(jié)果。經(jīng)絕后的骨質(zhì)疏松以手腕和脊柱骨折為特征，而股頸項(xiàng)骨折似乎是老年性骨質(zhì)疏松的明顯特征。
骨質(zhì)疏松骨喪失的機(jī)制被認(rèn)為牽涉到骨骼自我更新過程的不平衡。這一過程被稱為骨改造(remodeling)。其發(fā)生于一系列分散的活性容器(pockets)中。這些容器作為骨吸收點(diǎn)自發(fā)地出現(xiàn)在給定的骨表面上的骨基質(zhì)內(nèi)。破骨細(xì)胞(骨溶解或吸收細(xì)胞)在一般恒定大小的骨部分的吸收中起作用。這一吸收過程之后出現(xiàn)成骨細(xì)胞(骨形成細(xì)胞)，然后其用新的骨再充填由破骨細(xì)胞留下的空穴。
在健康成年受試者中，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞所形成的速率是使骨形成和骨吸收平衡的速率。然而，在骨質(zhì)疏松中，在骨改造過程中產(chǎn)生的不平衡導(dǎo)致骨喪失，其速率快于骨形成的速率。盡管這種不平衡以某種程度出現(xiàn)在大多數(shù)年老的個(gè)體中，但在經(jīng)絕后的骨質(zhì)疏松中或卵巢切除術(shù)后其更嚴(yán)重并出現(xiàn)在年輕個(gè)體中。
Adachi等在關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕癥研討(226，375-84(1993年6月))中報(bào)道，盡管有關(guān)皮質(zhì)甾類誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的病理生理學(xué)有很多沖突的數(shù)據(jù)，人們通常認(rèn)為存在骨形成的相對(duì)降低和骨吸收的相對(duì)增加。骨喪失以及所形成的骨折和骨質(zhì)疏松常常是皮質(zhì)甾類治療的結(jié)果。有證據(jù)顯示在皮質(zhì)甾類治療的頭6至12個(gè)月之內(nèi)迅速發(fā)生骨喪失；骨喪失速率和皮質(zhì)甾類劑量之間也顯示出一種密切關(guān)系。人類對(duì)皮質(zhì)甾類的作用同樣地敏感。估計(jì)骨折和骨質(zhì)疏松的發(fā)生率在30％到50％之間。
已有治療骨質(zhì)疏松的許多嘗試，這些嘗試的目的是減慢進(jìn)一步的骨喪失或者更好地是產(chǎn)生骨質(zhì)(bone mass)的凈增加。某些藥劑(如雌激素和二膦酸酯(bisphosphonates))在骨質(zhì)疏松中表現(xiàn)出減慢進(jìn)一步的喪失。由于骨吸收和形成的不同的時(shí)期，減慢骨喪失的藥劑顯示出增加骨質(zhì)(以3至7％數(shù)量級(jí))。然而，這個(gè)明顯的增加在時(shí)間上是有限的，不是進(jìn)行性的，并且是因?yàn)椤甯脑炜臻g″的減少。此外，由于吸收和形成之間的密切聯(lián)系，阻止骨吸收的治療也最終阻止骨形成。
已有人提出，以甲狀旁腺素(PTH)治療將導(dǎo)致增加的骨更新和陽性鈣平衡。然而，人類臨床試驗(yàn)曾顯示任何柱骨上的增加由皮骨上的減少補(bǔ)償，這樣在總骨上沒有凈增加。
Hefti等在臨床科學(xué)(1982)62，389-396中，曾報(bào)道在正常的和骨質(zhì)疏松成年雌性大鼠中，bPTH(1-84)或hPTH(1-34)的每日皮下用藥增加整體鈣和個(gè)體骨的灰分重量。
Liu等在骨礦化研究雜志(J.Bone Miner.Res.)6，10，1071-1080(1991)已注意到，成年雌性大鼠的卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)最接近的脛骨干骺端的柱骨的百分比中的47％喪失，伴隨著成骨細(xì)胞和柱破骨細(xì)胞數(shù)量的明顯增加。每日的皮下注射hPTH(1-34)完全逆轉(zhuǎn)柱骨喪失，并導(dǎo)致柱骨的量超過假操作對(duì)照的量。成骨細(xì)胞的數(shù)量增加，且破骨細(xì)胞的數(shù)量降低。
Hock等在骨礦化研究雜志7，1，65-71(1992)中已報(bào)道，在健康成年雄性大鼠中，12天內(nèi)每日皮下注射hPTH(1-34)增加柱骨和皮骨鈣和干重?？偣琴|(zhì)，柱骨體積，柱厚度和數(shù)量以及成骨細(xì)胞表面增加。
哺乳動(dòng)物的甲狀旁腺激素(例如人(hPTH)，牛(bPTH)，和豬(pPTH))是具有84個(gè)氨基酸殘基的單一多肽鏈，具有大約9500的分子量。其生物學(xué)活性與N-末端部分(具有明顯最低需要的殘基1-34)相關(guān)。
人PTH的N-末端片段與牛和豬激素的N-末端片段的不同僅僅分別為三個(gè)和兩個(gè)氨基酸殘基hPTH(1-34)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu15 10 15Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Phe(SEQ ID NO1)；bPTH(1-34)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu15 1015Ser Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 2530Val His Asn Phe(SEQ ID NO2)；pPTH(1-34)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu15 1015Ser Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Phe(SEQ ID NO3)PTH的主要功能在于引發(fā)適應(yīng)性變化，這些變化用以保持胞外液中Ca2+的恒定濃度。PTH在腎中發(fā)生作用，增加Ca2+從尿中的小管再吸收，并刺激骨化二醇轉(zhuǎn)化成為骨化三醇，后者對(duì)Ca2+從腸的吸收起作用。一種顯著的作用是促進(jìn)Ca2+從骨中的活動(dòng)化。PTH作用在骨上增加Ca2+和磷酸鹽的吸收速率。PTH經(jīng)破骨細(xì)胞刺激骨吸收速率，增加間質(zhì)細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的速率，并延長這些后來的細(xì)胞的半衰期。由于PTH延長的作用，骨形成成骨細(xì)胞的數(shù)量增加；這樣，骨更新和改造的速率得到提高。然而，單獨(dú)的成骨細(xì)胞顯示出比正常活性低的活性。Rosenblatt等在US4,423,037，4,968,669和5,001,223中公開了PTH拮抗劑，其是經(jīng)缺失N-末端(1-6)氨基酸和選擇性取代Phe7、Met8，18和Gly12獲得的。據(jù)報(bào)道Tyr34-NH2增加了這些化合物的活性與穩(wěn)定性。
甲狀旁腺素-相關(guān)肽(PTHrp)(一種140個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì))和其片段產(chǎn)生PTH的主要生物學(xué)活性。PTHrp被用一些人類和動(dòng)物腫瘤與其它組織詳細(xì)地說明，并且可以在惡性血鈣過多中起作用。hPTHrp(1-34)的序列如下Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile15 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu20 25 30Ile His Thr Ala(SEQ ID NO4)hPTH和hPTHrp之間的序列同源性極大地受制于13個(gè)N-末端殘基，其中的8個(gè)是相同的；在hPTHrp中僅hPTH(25-34)受體結(jié)合區(qū)的10個(gè)氨基酸中的1個(gè)是保守的。構(gòu)象類似性可以是構(gòu)成共同活性的基礎(chǔ)。Cohen等在生物化學(xué)雜志266，3，1997-2004(1991)中已提出，在特定的區(qū)域(5-18)和(21-34)中，PTH(1-34)和PTHrp(1-34)的許多序列采取a-螺旋構(gòu)型，但注意到這些構(gòu)型在生理?xiàng)l件下對(duì)羧基末端而言是否盛行存在某些問題。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)類脂相互作用、受體相互作用和/或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來說可能是重要的。
PTH類似物和PTHrp類似物的改進(jìn)的治療性質(zhì)(有關(guān)包括患有骨質(zhì)疏松的那些在內(nèi)的哺乳動(dòng)物受試者中的骨質(zhì)恢復(fù))已在國際專利申請(qǐng)出版物WO94/01460中公開。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種合成甲狀旁腺素(PTH)合成多肽類似物或甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)或其鹽的方法，在所述類似物、相關(guān)肽和其鹽中，選自SEQ ID NOS85、86、26、27、28、29和30的氨基酸殘基22-31形成一個(gè)兩親性α-螺旋，該方法包括a)經(jīng)溶液或固相技術(shù)分別合成所述多肽的前體肽片段；b)使所述片段相互縮合，形成所需的多肽產(chǎn)物；和c)除去氨基酸保護(hù)基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種改進(jìn)的方法，該方法包括a)在樹脂支持物上分別合成所述多肽的前體肽片段；b)從它們各自的樹脂支持物上切下所述多肽的片段；c)依次使所說的片段縮合，形成所需的多肽產(chǎn)物；和d)除去氨基酸保護(hù)基。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從它們各自的樹脂支持物上切下除所述多肽的C-末端片段外的所有部分；c)使所說的片段依次與樹脂結(jié)合的C-末端片段縮合，形成所需的多肽產(chǎn)物；d)除去氨基酸保護(hù)基，并從樹脂支持物上切下所述的多肽產(chǎn)物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的方法用三個(gè)前體肽片段實(shí)施所述片段是N-末端片段、中部片段和C-末端片段。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說的多肽產(chǎn)物是從三個(gè)前體肽片段制備的，所述片段是N-末端片段、中部片段和C-末端片段，其中所說的N-末端片段具有作為其C-末端的Gly，中部片段具有作為其C-末端的Leu，并且C-末端片段具有作為其N-末端的Leu。在另一個(gè)實(shí)施方案，所說的中部肽片段具有C-末端Glu，所說的C-末端片段具有N-末端Leu。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備藥物組合物的方法，特別是提供一種制備用于治療骨質(zhì)疏松(尤其是骨折愈合)的藥物組合物的方法，該方法的特征在于，實(shí)施如上所述的制備PTH或PTHrP類似物的方法，并且將所獲得的PTHrP類似物與一種或多種藥學(xué)上可接受的添加劑混合。
各種普通核苷酸堿基和氨基酸的單字母和三字母縮寫是純粹應(yīng)用化學(xué)31，639-645(1972)和40，277-290(1974)中和IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)所推薦的，并且符合37 CFRξ1.822(55FR18245，1990年5月1日)。所說的單字母和三字母縮寫如下氨基酸 三字母代碼 單字母代碼丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺Asn N天冬氨酸Asp DAsn+Asp Asx B
半胱氨酸Cys C谷氨酰胺Gln Q谷氨酸 Glu EGln+Glu Glx Z甘氨酸 Gly G組氨酸 His H異亮氨酸Ile I亮氨酸 Leu L賴氨酸 Lys K甲硫氨酸Met M苯丙氨酸Phe F脯氨酸 Pro P絲氨酸 Ser S蘇氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y纈氨酸 Val V其它氨基酸 Xaa X除非另外指定為D-或D，L-，以上縮寫代表L-氨基酸。某些氨基酸(天然的和非天然的)是非手性的，例如甘氨酸。所有肽序列以N-末端氨基酸在左邊，C-末端氨基酸在右邊表示。
本文使用的代表其它氨基酸和化合物的縮寫是hSer 高絲氨酸hSerlac 高絲氨酸內(nèi)酯Nle 正亮氨酸″PTH或PTHrp的生理活性截短的類似物″指具有包含比在PTH或PTHrp中發(fā)現(xiàn)的氨基酸的全長補(bǔ)體(full complement)更少的序列，但引發(fā)類似的生理反應(yīng)的多肽。截短的PTH或PTHrp不必與引發(fā)類似生理反應(yīng)的PTH或PTHrp完全同源。PTH(1-34)和PTHrp(1-34)是這一組優(yōu)選的例子，但不是僅有的例子。
″兩親性α-螺旋″指由某些多肽顯示的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在所述肽中氨基酸采取α-螺旋構(gòu)型，其具有沿螺旋長軸取向的相對(duì)的極性和非極性端面(faces)。在興趣多肽中的α-螺旋結(jié)構(gòu)的可能性在某種程度上可由合適節(jié)距(pitch)的“Schiffer-Edmundson wheel”構(gòu)建[M.Schiffer和A.B.Edmundson，生物物理雜志1，121(1967)]并注意到在限制螺旋的圓筒的相反端面上親水和親油殘基的分離探索。另外，經(jīng)驗(yàn)性的證據(jù)(如圓二色性或X光衍射數(shù)據(jù))可以用來指示在給定多肽中α-螺旋區(qū)的存在。一個(gè)理想的α-螺旋每圈具有3.6個(gè)氨基酸殘基，具有由100°弧分隔的鄰近側(cè)鏈。Eisenberg等在自然299，371-374(1982)和美國科學(xué)院學(xué)報(bào)81，140-144(1984)中已組合了疏水性尺度與螺旋圈以量化兩親性環(huán)(helices)的概念。平均疏水因素(moment)被定義為構(gòu)成螺旋的組分氨基酸的疏水性的載體總數(shù)。下列氨基酸的疏水性是由Eisenberg(1984)報(bào)道的作為″共有尺度″的那些Ile 0.73；Phe 0.61；Val 0.54；Leu 0.53；Trp 0.37；Met 0.26；Ala 0.25；Gly 0.16；Cys 0.04；Tyr 0.02；Pro-0.07；Thr-0.18；Ser-0.26；His-0.40；Glu-0.62；Asn-0.64；Gln-0.69；Asp-0.72；Lys-1.10；Arg-1.76。
每圈具有3.6個(gè)殘基(或者側(cè)鏈間100°弧(＝360°/3.6))的理想α-螺旋的疏水因素μH可由下式計(jì)算μH＝[(∑HNSin(N-1))2+(∑HNcos(N-1))2]_，其中HN是N1h氨基酸的疏水性值，總數(shù)用周期性＝100°從序列中的N氨基酸取得。疏水因素可以經(jīng)μH除以N得<μH>用每個(gè)殘基的平均疏水因素表示。在100°±20°時(shí)約0.2或更大的<μH>值提示兩親性螺旋的形成。hPTHrp(22-31)和hPTH(22-31)在100°的值分別為0.19和0.37。
Cornett等在分子生物學(xué)雜志195，659-685(1987)中曾進(jìn)一步通過引入″兩親性指數(shù)″作為兩親性指標(biāo)廣泛研究了兩親性α-環(huán)。他們得出結(jié)論大約一半所有已知的是兩親性α-環(huán)，占優(yōu)勢的頻率是97.5°，而非100°，每圈殘基的數(shù)量更接近3.7而不是3.6。這樣的修正在科學(xué)上是有意義的，Eisenberg等的基本方法足以把一種給定的序列分類為兩親性，特別是當(dāng)人們從頭開始設(shè)計(jì)序列形成兩親性α-螺旋時(shí)。
替換性α-螺旋氨基酸序列可以缺乏與天然產(chǎn)生的多肽的給定的片段之序列的同源性，但產(chǎn)生一個(gè)類似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如，在生理環(huán)境中具有相反極性和非極性端面的α-螺旋。用其它氨基酸序列取代天然產(chǎn)生的氨基酸序列可以有利地影響生理活性、穩(wěn)定性或改變的親本多肽的其它性質(zhì)。J.L.Krstenansky等，F(xiàn)EBS Letters 242，2，409-413(1989)和J.P.Segrest等，蛋白質(zhì)構(gòu)造，功能，和遺傳學(xué)8，103-117(1990)中提供了指導(dǎo)這樣的設(shè)計(jì)和序列選擇的方法。
用于確定一種序列是否是足夠兩親性的本發(fā)明的序列的一種方便的方法是如上所述計(jì)算平均疏水因素。如果在100°±20°時(shí)每個(gè)殘基的峰值平均因素超過約0.20，則該序列將形成兩親性螺旋，并且是本發(fā)明的序列。
例如，SEQ ID NO26(Xaa＝Glu)在100°時(shí)每個(gè)殘基的平均疏水因素計(jì)算如下A.A. HN(N-1)Hsin(N-1) Hcos(N-1)E-.620 0-.62L.53 100 .52 -.17L.53 200 -.18 -.50E-.62300 .34 -.31K-1.1400 -.70 -.85L.53 500 .34 -.41L.53 600 -.46 -.27E-.62700 .21 -.58K-1.1800 -1.08-.19L.53 9000 -.53∑＝0.81 ∑＝-4.43μH＝[(0.81)2+(-4.43)2]-＝4.50<μH>＝4.50/10＝0.45對(duì)這一序列，平均峰值疏水因素出現(xiàn)在92°，具有0.48的值。
一方面，本發(fā)明提供了一種合成PTH，PTHrP，以及PTH和PTHrp生理活性類似物或其鹽(在所述物質(zhì)中，氨基酸殘基22-31形成兩親性α-螺旋)的方法，所說殘基(22-31)的序列選自a)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Xaa5Leu Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10，其中Xaa1和Xaa4分別是Glu、Glu(OCH3)、His或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa5是Lys或His；Xaa7和Xaa10分別是Leu或Ile；Xaa8是Ala，Arg或Glu；和Xaa9是Lys或Glu(SEQ ID NO85)；優(yōu)選地是Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu，其中Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO26)；b)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Arg Leu Leu Xaa8Arg Leu，其中Xaa1和Xaa4分別是Glu、Glu(OCH3)、His或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa8是Glu或Lys(SEQ ID NO86)；優(yōu)選地是Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu，其中Xaa是Glu或Lys(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種具有下式的PTH，PTHrP以及PTH和PTHrP生理活性類似物或其鹽和其藥學(xué)上可接受的鹽的方法Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu His Asp Xaa11Gly Xaa13Ser Ile GlnAsp Leu Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37Xaa38Term，其中Xaa1不存在或者是Ala；Xaa2不存在或者是Val；Xaa3不存在或者是Ser；Xaa4不存在或者是Glu或Glu(OCH3)；Xaa5不存在或者是His或Ala；
Xaa6不存在或者是Gln；Xaa7不存在或者是Leu；Xaa11是Lys、Arg、或Leu；Xaa13是Lys、Arg、Tyr、Cys、Leu、Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素基))、Lys(7-二甲氨基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-4-乙酰基)、或Lys(二氫肉桂酰基)；Xaa20是Arg或Leu；Xaa19和Xaa21分別是Lys、Ala、或Arg；Xaa22-31選自SEQ ID NOS85、86、26、27、28、29或30；Xaa32是His、Pro、或Lys；Xaa33不存在或者是Pro、Thr、Glu或Ala；Xaa34不存在或者是Pro、Arg、Met、Ala、hSer、hSer內(nèi)酯、Tyr或Leu；Xaa35不存在或者是Pro、Glu、Ser、Ala或Gly；Xaa36不存在或者是Ala、Arg或Ile；Xaa37不存在或者是Arg、Trp或3-(-2-萘基)-L-丙氨酸；Xaa38不存在或者是Ala或hSer或者Xaa38-42是Thr Arg Ser Ala Trp；并且Term是OR或NR2，這里各R分別是H、(C1-C4)烷基或苯基(C1-C4)烷基。
另一方面，本發(fā)明包括合成如下式(I)所示的生理活性截短的同系物hPTHrp(1-34)之多肽類似物和它們的藥學(xué)上可接受的鹽的方法Ala Val Ser Glu Xaa5Gln Leu Leu His Asp Xaa11Gly Xaa13Ser Ile GlnAsp Leu Xaa19Arg Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Term，其中Xaa5是His或Ala；Xaa11和Xaa13分別是Lys、Arg或Leu；Xaa19和Xaa21分別是Ala或Arg；Xaa22-31選自a)Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu，其中Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO26)；b)Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu，其中
Xaa是Glu或Lys(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)；Xaa32是His或Lys；Xaa33是Thr、Glu或Ala；Xaa34是Ala、hSer、Tyr或Leu；并且Term是Gly Arg Arg、內(nèi)酯、OH或NR2，這里R是H或(C1-C4)烷基。
本發(fā)明的一個(gè)更特定的方面包括合成其中Xaa22-31是SEQ ID NO26的式(I)的那些多肽，其<μH>在100°時(shí)超過0.45。本發(fā)明的另一個(gè)更特定的方面包括其中Xaa22-31是SEQ ID NO26的那些式(I)的多肽；Xaa11和Xaa13兩者是Lys；并且Xaa19和Xaa21兩者都是Arg?？梢杂帽疚乃_的方法制備的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg LysLeu His Thr Ala OH(SEQ ID NO5)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Thr Ala OH(SEQ ID NO6)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO7)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Thr hSer NH2(SEQ ID NO8)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Thr hSerlac(SEQ ID NO9)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Thr Ala Gly Arg Arg OH(SEQ ID NO10)；和Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu Lys Glu Leu NH2(SEQ ID NO11)。
本發(fā)明的另一方面包括其中Xaa22-31是SEQ ID NO26的式(I)的那些多肽；Xaa11和Xaa13兩者都是Lys；并且Xaa19和Xaa21兩者之一是Arg，另一個(gè)是Ala?？梢杂帽疚乃_的方法制備的這一亞類的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser lleGln Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO12)和Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO13)。
本發(fā)明的另一方面包括其中Xaa22-31是SEQ ID NO26的式(I)的那些多肽；Xaa11和Xaa13兩者之一是Leu，另一個(gè)是Lys；并且Xaa19和Xaa21兩者都是Arg?？梢杂帽疚乃_的方法制備的這一亞類的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Ala Leu OH(SEQ ID NO14)。
另一方面，本發(fā)明包括合成其中Xaa22-31是SEQ ID NO27的式(I)的那些多肽，其<μH>在100°時(shí)超過0.50。本發(fā)明的另一方面包括合成其中Xaa22-31是SEQ ID NO27的那些式(I)的多肽；Xaa11和Xaa13兩者是Lys或者兩者是Arg；并且Xaa19和Xaa21兩者都是Arg?？梢杂帽景l(fā)明的方法制備的這一亞類的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu ArgLeu His Thr Ala OH(SEQ ID NO15)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly ATg Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu ArgLeu His Thr Ala OH(SEQ ID NO16)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys ArgLeu His Thr Ala OH(SEQ ID NO17)；另一方面，本發(fā)明包括合成其中Xaa22-31是SEQ ID NO28的式(I)的那些多肽，其<μH>在100°時(shí)約0.25。可以用本發(fā)明的方法制備的這一亞類的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu AlaLeu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO20)。
另一方面，本發(fā)明包括合成其中Xaa22-31是SEQ ID NO29的式(I)的那些多肽，其<μH>在100°時(shí)約0.28。可以用本發(fā)明的方法制備的這一亞類的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser SerLeu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO21)。
另一方面，本發(fā)明包括合成其中Xaa22-31是SEQ ID NO30的式(I)的那些多肽，其<μH>在100°時(shí)約0.29?？梢杂帽景l(fā)明的方法制備的這一亞類的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser IleGln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu LysLeu His ThrAla NH2(SEQ ID NO22)另一方面，本發(fā)明包括合成如式(II)所示的bPTH(1-34)的生理活性同系物的多肽類似物和其藥學(xué)上可接受的鹽Xaa1Val Ser Glu Ile Gln Xaa7Xaa8His Asn Leu Gly Lys HisLeu Xaa16Ser Xaa18Xaa19Arg Xaa21Xaa22-31His Asn Xaa34Term，其中Xaa1是Ser或Ala；
Xaa7是Leu或Phe；Xaa8是Met或Nle；Xaa16是Asn或Ser；Xaa18是Leu、Met或Nle；Xaa19是Glu或Arg；Xaa21是Val或Arg；Xaa22-31選自SEQ ID NO26、27、28、29和30；Xaa34是Phe或Tyr；Term是OH或NR2，這里各R是H或(C1-C4)烷基。
可以用本發(fā)明的方法合成的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His LeuSer Ser Nle Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu LysLeu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO23)和Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His LeuSer Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu LysL eu Leu Glu LysLeu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO24)。
另一方面，本發(fā)明提供了合成具有少于34個(gè)氨基酸的PTH和PTHrP類似物的方法。這些化合物具有以下通式Ala Val Ser Glu Xaa5Gln Leu Leu His Asp Xaa11Gly Xaa13SerIle Gln Asp Leu Xaa10Arg Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Term，可以用本發(fā)明的方法制備的代表性多肽包括但不限于化合物41AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys2025 30Leu His Pro NH2(SEQ ID NO55)化合物42AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 2530Leu Pro NH2(SEQ ID NO56)技術(shù)人員清楚，所述多肽類似物的許多取代體可被合成，倘若具有在100°±20°時(shí)的大于0.20的平均疏水因素(每個(gè)殘基)的氨基酸序列在位置22-31插入，則所述取代體將具有本文所描述的那些的理想的屬性。
本發(fā)明的多肽片段可以由以下文獻(xiàn)中提出的那些方法合成G.Barany，R.B.肽中的修飾，E.Gross和J.Meienhofer編者，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1979)，Vol.2，pp.1-284；J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽的合成，第二板，Pierce化學(xué)公司，Rockford，Illinois(1984)，和J.Meienhofer，激素蛋白質(zhì)和肽，Vol.2，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1973)(有關(guān)固相合成)，以及E.Schroder和K.Lubke，肽，Vol.1，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1965)(有關(guān)溶液合成)。一般來說，這些方法包括依次添加保護(hù)的氨基酸來增長肽鏈。通常第一氨基酸的氨基或羧基基團(tuán)和任何反應(yīng)性側(cè)鏈基團(tuán)被保護(hù)。然后將這種保護(hù)的氨基酸連接到固體支持物上或者使用在溶液中，也被適當(dāng)保護(hù)的下一個(gè)氨基酸依次在能夠形成酰胺鍵的條件下添加。最后，所需氨基酸被以合適的順序連接，除去保護(hù)基和任何固體支持物，產(chǎn)生粗的多肽。將這種多肽脫鹽和純化，優(yōu)選地是用色譜純化，獲得最終產(chǎn)物。
在本發(fā)明的實(shí)踐中，前體肽片段可以用溶液或固相技術(shù)或者其任何組合制備。例如，可以在溶液中制備一些片段，然后縮合成樹脂結(jié)合的C-末端片段，或者可以經(jīng)固相方法制備各片段，從樹脂上切下，并在溶液中縮合，或者可以采用溶液和固相合成的混合方案。
制備本發(fā)明的具有少于約40個(gè)氨基酸的PTH和PTHrP類似物的一種優(yōu)選的方法涉及固相片段縮合肽合成。按這種方法，最終產(chǎn)物由若干肽前體片段的縮合產(chǎn)生。依技術(shù)人員的愛好，可以使用任何片段的組合。例如34個(gè)氨基酸的產(chǎn)物可以從兩個(gè)17個(gè)氨基酸的肽前體片段，三個(gè)不同長度的前體片段，四個(gè)前體片段等制備。說明性的討論參見P.LLoyd-Williams等，″集合性固相肽合成″，Tetrahedron，49，11065-11133，(1993)。
一般地，α-氨基(Nα)功能基和任何反應(yīng)性側(cè)鏈用酸-或堿-敏感基團(tuán)保護(hù)。所述保護(hù)基應(yīng)該對(duì)肽鍵形成條件穩(wěn)定，而且易于除去并不影響延長的多肽鏈。合適的氨基保護(hù)基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苯氧羰基(Cbz)、O-氯芐氧羰基、二苯基異丙氧羰基、叔戊氧羰基(Amoc)、異冰片氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧芐氧羰基、對(duì)硝基苯基亞氧硫基、2-氰基-叔丁氧羰基，優(yōu)選的是9-芴基(fluorenyl)甲氧羰基(Fmoc)。合適的側(cè)鏈保護(hù)基包括但不限于乙酰基、芐基(Bzl)、芐氧甲基(Bom)、叔丁基、環(huán)己基、鄰溴芐氧羰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯芐基(C1-z)、2，6-二氯芐基、2，4-二硝基苯基、環(huán)戊基、異丙基、新戊酰、四氫吡喃-2-基、甲苯磺?；?Tos)、三甲基甲硅烷基、甲基三苯甲基、磺酰(Mts)、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺?；?Mtr)、2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰(Pmc)和三苯甲基(Trt)。
在固相合成中，C-末端氨基酸是首先連接到合適的樹脂支持物上的。合適的樹脂支持物是對(duì)試劑和逐步縮合和去保護(hù)反應(yīng)的反應(yīng)條件呈惰性并且在所使用的介質(zhì)中不溶性的那些材料。市售的樹脂的例子包括用反應(yīng)性基團(tuán)改性的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂，例如，氯甲基化的共-聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、羥甲化物的共-聚(苯乙烯-二乙烯基苯)和芐化的，羥甲基化的苯基乙酰氨基甲基(PAM)樹脂。為制備酸末端肽，可以使用Wang樹脂。一種優(yōu)選的樹脂是對(duì)甲基二苯甲氨基-共-聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂(MBHA)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，除C-末端片段之外，所有片段都在一種酸敏感的樹脂上制備，所述樹脂例如Sasrin(2-甲氧基4-烷氧基芐醇)或4-羥甲基-3-甲氧苯氧丁酸4-甲基二苯甲胺(HMPB-MBHA)。HMPA-MBHA、HMPB-BHA和HMPA-BHA樹脂也適用于羧基終止(terminated)肽。利用Knorr處理-MBHA樹脂制備C-末端片段。Sieber酰胺樹脂、Rink接頭-MBHA或BHA樹脂、和Ramage接頭-MBHA或BHA樹脂都適用于酰胺終止肽。這些樹脂是市售的，其第一氨基酸已被結(jié)合或者第一氨基酸可以連接到接頭上。HMPB-MBHA和Knorr處理樹脂可以按以下實(shí)施例1，2和3中的描述從MBHA樹脂制備。可以用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行剩下的保護(hù)的氨基酸的后續(xù)連接。最好將各保護(hù)的氨基酸以約1.5到2.5倍摩爾過量引入，連接在惰性、非水、極性溶劑中進(jìn)行，所述溶劑例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)或它們的混合物，優(yōu)選的是在室溫下進(jìn)行。代表性的連接劑是N，N-二環(huán)己基-碳化二亞胺(DCC)、N，N-二異丙基碳化二亞胺(DIC)或其它碳化二亞胺，它們單獨(dú)使用或者在下列物質(zhì)存在下使用1-羥基苯并三唑(HOBt)、O-?；蛩亍⒈讲⑷?1-基-氧三(oxytris)(吡咯烷)磷鎓六氟磷酸鹽(PyBop)、N-羥基琥珀酰亞胺、其它N-羥基酰亞胺或肟。另外，也可以使用保護(hù)的氨基酸活性酯(例如，硝基苯基、五氟苯基等)或?qū)ΨQ的酸酐。后續(xù)Fmoc-保護(hù)的氨基酸的連接用仲胺(例如吡啶)溶液進(jìn)行，以除去Fmoc基。在各連接步驟后經(jīng)Kaiser試驗(yàn)檢查肽樹脂的完全連接。
在固相合成的最后，采用不導(dǎo)致側(cè)鏈保護(hù)基過早去保護(hù)的條件從樹脂上除去完全保護(hù)的肽?？梢越?jīng)皂化或酯交換或溫和的酸性去保護(hù)法(采用例如1％三氟乙酸(TFA))切下所述的肽?？梢杂霉枘z色譜純化保護(hù)的肽。
可以使溶液脫鹽(例如，用BioRad AG-3陰離子交換樹脂)，并用任何或所有下列類型的系列色譜步驟純化所說的肽在未衍生化的(underivatized)共-聚(苯乙烯-二乙烯基苯)(例如AmberliteXAD)上的疏水吸附色譜；硅膠吸附色譜；在羧甲基纖維素上的陽離子交換色譜；分配色譜(例如在SephadexG-25上)；逆流分配；反相高效液相色譜(HPLC)，尤其是陽離子交換和在辛基-或十八基甲硅烷基二氧化硅(ODS)鍵合相填充柱上的反相HPLC。
在一個(gè)多片段合成的實(shí)施方案中，分離中部和N-末端片段并連續(xù)縮合到C-末端片段上。使所述多肽去保護(hù)，并從樹脂上切下，進(jìn)一步純化。純化步驟一般是一系列色譜分離。HPLC分析決定純化方法的順序和選擇。一種典型的順序包括陽離子交換、反相HPLC和反相濃縮柱。對(duì)最終的溶液進(jìn)行冷凍干燥，將藥物產(chǎn)物保存在琥珀色瓶子中。保護(hù)的氨基酸是從Genzyme(劍橋，MA，美國)、Propeptide(普林斯頓，NJ，美國)或Synthetec(Albany，OR，美國)獲得的。
實(shí)施例采用三-片段縮合法制備SEQ ID NO7的多肽，一個(gè)34個(gè)氨基酸的肽，AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RELLEKLLEKLHTA-NH2。N-末端片段是由氨基酸1至12組成的，中部片段是由氨基酸13至23組成的，C-末端片段是由氨基酸24至34組成的。在Vega 296自動(dòng)肽合成儀上經(jīng)固相法制備各片段。自動(dòng)模式用于切下Nα-保護(hù)基和連接后的洗滌。在連接步驟中手工將連接試劑和溶劑添加到反應(yīng)器中。經(jīng)HPLC純化中部和N-末端片段，并連續(xù)縮合到C-末端片段上。使最終的肽去保護(hù)，從樹脂上切下，并純化。實(shí)施例1制備N-末端片段以250毫摩爾規(guī)模在酸敏感樹脂(4-羥甲基-3-甲氧苯氧丁酸4-甲基二苯甲胺(HMPB-MBHA))上制備由氨基酸1至12組成的N-末端片段(AVSEHQLLHDKG)。這一樹脂是按如下方法從MBHA樹脂(Novabiochem)制備的步驟內(nèi)容 時(shí)間(分鐘)重復(fù)1. CH2Cl2/DMF(1/1)洗滌6012. 在CH2Cl2中的10％Et3N 5 23.CH2Cl2/DMF(1/1)5 34. HMPB接頭(1.15當(dāng)量)/ 300@40C 1在CH2Cl2/DMF(1/1)中的PyBOP/DIPEA 500@RT5. CH2Cl2洗滌1.526. DMF洗滌 1.527. CH2Cl2洗滌1.518. i-PrOH洗滌 1.529. CH2Cl2洗滌1.53在至少一次DMF CH2Cl2洗滌后，按以下方案用Fmoc-GlyOH(1.5-2.2當(dāng)量)、DIC(1.5-2.2當(dāng)量)和DMAP(0.05當(dāng)量)在DMF/CH2Cl2(1/1)中于室溫下進(jìn)行第一氨基酸(12Gly)的連接大約15小時(shí)步驟內(nèi)容時(shí)間(分鐘) 重復(fù)1. DMF/CH2Cl2(1/1) 6012. Fmoc-X-OH(2當(dāng)量)/9001在CH2Cl2/DMF(1/1)中的DIC-DMAP(0.05當(dāng)量)3. CH2Cl2洗滌 1.5 24. DMF洗滌 1.525. i-PrOH洗滌 1.526. DMF/CH2Cl2(1/1) 1.5 27. i-PrOH 1.528. CH2Cl2洗滌 1.5 3然后通過重復(fù)步驟3到8洗滌樹脂，采用以下方案加帽步驟 內(nèi)容 時(shí)間(分鐘) 重復(fù)9. DMF 15110. 在DMF/CH2Cl2中的PhCOCl(0.18M)/ 30-1801吡啶(0.36M)11. CH2Cl2洗滌 1.5212. DMF洗滌 1.5213. i-PrOH洗滌 1.5214. DMF/CH2Cl2(1/1)洗滌 1.5115. CH2Cl2洗滌 1.53在后續(xù)結(jié)合循環(huán)中以相反(reverse)順序采用下列保護(hù)的氨基酸將剩下的氨基酸連接到樹脂上aa11 Nα-Fmoc-Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸aa10 Nα-Fmoc-L-天冬氨-β-叔丁基酯aa9 Nα-Fmoc-Nim-三苯甲基-L-組氨酸aa8 Nα-Fmoc-L-亮氨酸aa7 Nα-Fmoc-L-亮氨酸aa6 Nα-Fmoc-Ng-三苯甲基-L-谷氨酰胺aa5 Nα-Fmoc-Nim-三苯甲基-L-組氨酸aa4 Nα-Fmoc-L-谷氨酸-_-叔丁基酯aa3 Nα-Fmoc-O-叔丁基-L-絲氨酸aa2 Nα-Fmoc-L-纈氨酸aa1 Nα-叔丁氧羰基-L-丙氨酸使用1.5至2.2當(dāng)量氨基酸(0.1-0.25M)、HOBt和DIC于室溫下在NMP中進(jìn)行連接。在1.5-3小時(shí)后，添加DMSO，并且使連接反應(yīng)繼續(xù)1.5-3小時(shí)。各連接反應(yīng)包括以下步驟步驟 內(nèi)容 時(shí)間(分鐘) 重復(fù)1. DMF洗滌 2.5-3012.在NMP中的20％哌啶 313.在NMP中的20％哌啶 14 14. DMF洗滌 1.525. CH2Cl2洗滌 1.526. i-PrOH洗滌 1.5-2.52-57. DMF/CH2Cl2(1/1)洗滌 1.52-38. 連接24019. CH2Cl2洗滌 1.5210. DMF洗滌 1.5211. i-PrOH洗滌 1.5212. DMF/CH2Cl2洗滌 1.5213. i-PrOH 1.5114. CH2Cl2洗滌 1.53用Kaiser試驗(yàn)證實(shí)連接反應(yīng)的完成；如果試驗(yàn)是陽性，則重復(fù)步驟8至14，可以用也可以不用PyBOP作為偶合劑。
為了從樹脂切下保護(hù)的肽，于0℃或室溫下在1％TFA(CH2Cl2中)中攪拌樹脂的懸液(4ml/gm樹脂)至多15分鐘。將溶液過濾，并以5％NaHCO3提取。重復(fù)樹脂的TFA處理三次。合并有機(jī)相，并用水、5％NaHSO4和水(再次)洗滌。在硫酸鈉上干燥并蒸發(fā)有機(jī)相。經(jīng)如下HPLC純化剩余物柱Zorbax Pro-10/150 C8，6″X40cm柱溫環(huán)境溫度流速2.2-3.0ml/分鐘·厘米2檢測波長250nm流動(dòng)相0.1％HOAc(pH6-6.2)和三乙胺、CH3CN將保護(hù)的肽上柱(65-70％CH3CN)。增加CH3CN的比例至85％進(jìn)行梯度洗脫。合并各組份，濃縮，經(jīng)CH2Cl2抽取分離產(chǎn)物。用碳酸氫鈉稀溶液和水洗滌有機(jī)相，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。實(shí)施例2制備中部片段以230毫摩爾規(guī)模在酸敏感樹脂(4-羥甲基-3-甲氧苯氧丁酸4-甲基二苯甲胺(HMPB-MBHA))上制備由氨基酸13至23組成的中部片段，KSIQDLRRREL。這一樹脂是按以上實(shí)施例1描述的方法從MBHA樹脂制備的。如所示用Fmoc-L-亮氨酸摻合進(jìn)第一氨基酸(aa24)。用實(shí)施例1的方法在后續(xù)連接循環(huán)中將剩下的氨基酸連接到樹脂上aa23 Nα-Fmoc-L-谷氨酸-_-叔丁基酯aa22 Nα-Fmoc-Ng-4-甲氧基-2，3，6-三甲芐磺?；?L-精氨酸aa21 Nα-Fmoc-Ng-4-甲氧基-2，3，6-三甲芐磺酰基-L-精氨酸aa20 Nα-Fmoc-Ng-4-甲氧基-2，3，6-三甲芐磺酰基-L-精氨酸aa19 Nα-Fmoc-L-亮氨酸aa18 Nα-Fmoc-L-天冬氨酸-β-叔丁基酯aa17 Nα-Fmoc-Ng-三苯甲基-L-谷氨酰胺aa16 Nα-Fmoc-L-異亮氨酸aa15 Nα-Fmoc-O-叔丁基-L-絲氨酸aa14 Nα-Fmoc-Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸按實(shí)施例1的教導(dǎo)從樹脂上以游離酸切下肽，抽提有機(jī)物，干燥并蒸發(fā)。通過溶解到二氯甲烷中，并添加進(jìn)叔丁基甲基醚(t-BuOMe)沉淀剩余物。過濾后，用t-BuOMe洗滌并真空干燥，產(chǎn)物在以上描述的Zorbax柱上經(jīng)HPLC純化，用75％CH3CN無梯度洗脫；檢測波長為267nm。實(shí)施例3制備C-末端片段按以下步驟使用Fmoc-2，4-二甲氧-4′-(羧甲氧)-二苯甲胺接頭在MBHA樹脂上以130mm規(guī)模制備由氨基酸24-34組成的C-末端片段，LEKLLEKLHTA步驟 內(nèi)容 時(shí)間(分鐘) 重復(fù)1. CH2Cl2洗滌 60 12. 在CH2Cl2中的10％DIPEA 523. CH2Cl2534. DMF 535. 在CH2Cl2/DMF(1/1)中的接頭/HOBt/DIC(1.5當(dāng)量) 300-42016. CH2Cl21.5 27. DMF 1.5 28. iPrOH2.529. CH2Cl2/DMF 1.5 210. iPrOH 2.5211. CH2Cl21.5 312. 在DMF/CH2Cl2中的DMF10 113. 在DMF/CH2Cl2中的Ac2O，DIPEA 30-35 114. CH2Cl2洗滌 1.5 215. DMF洗滌1.5216. i-PrOH洗滌1.5217. DMF/CH2Cl2洗滌 1.5 118.CH2Cl2洗滌1.53在后續(xù)結(jié)合循環(huán)中以相反順序采用下列保護(hù)的氨基酸將剩下的氨基酸連接到樹脂上aa34 Nα-Fmoc-L-丙氨酸aa33 Nα-Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸aa32 Nα-Fmoc-Nim-三苯甲基-L-組氨酸aa31 Nα-Fmoc-L-亮氨酸aa30 Nα-Fmoc-Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸aa29 Nα-Fmoc-L-谷氨酸-γ-叔丁基酯aa28 Nα-Fmoc-L-亮氨酸aa27 Nα-Fmoc-L-亮氨酸aa26 Nα-Fmoc-Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸aa25 Nα-Fmoc-L-谷氨酸-γ-叔丁基酯aa24 Nα-Fmoc-L-亮氨酸使用1.5至2.2當(dāng)量氨基酸、HOBt和DIC于室溫下在NMP中進(jìn)行連接1.5-3小時(shí)(對(duì)氨基酸34至36)。對(duì)氨基酸24和2 5，使用3當(dāng)量的氨基酸、HOBt和DIC。1.5-3小時(shí)后，添加20％DMSO，并且使連接反應(yīng)繼續(xù)1.5-3小時(shí)，各連接反應(yīng)涉及以下步驟，包括Fmoc斷裂和連接后洗滌步驟 內(nèi)容 時(shí)間(分鐘)重復(fù)1. DMF洗滌 2.5-3012. 在NMP中的20％哌啶 3 13. 在NMP中的20％哌啶 1414. DMF洗滌 1.5 35. CH2Cl2洗滌 1.5 26. i-PrOH洗滌1.5-2.5 2-67. DMF/CH2Cl2洗滌 1.5 38. 連接 240 19. CH2Cl2洗滌 1.5 210.DMF洗滌 1.5 211.i-PrOH洗滌1.5-2.5 212.DMF/CH2Cl2洗滌 1.5 213.iPrOH洗滌 2.5 214.CH2Cl2洗滌 1.5 3Kaiser試驗(yàn)15.DMF 2.5-15116.Ac2O/DIPEA/ 30-35 1CH2Cl2/DMF17.CH2Cl2洗滌1.5 218.DMF洗滌 1.5 219.i-PrOH洗滌 1.5 220.DMF/CH2Cl2洗滌1.5 121.CH2Cl2洗滌1.5 3用Kaiser試驗(yàn)證實(shí)連接反應(yīng)的完成；如果試驗(yàn)是陽性(_1.5％未偶合)，則重復(fù)步驟8至14，如果試驗(yàn)是陰性，則樹脂被乙酰化。實(shí)施例4縮合三種片段如以上實(shí)施例1，2和3所述制備三種片段。用以上最后描述的實(shí)施例3的方案的步驟1-7除去C-末端片段的保留的Nα-Fmoc基團(tuán)。
將中部片段B(172g，61.8毫摩爾)、HOBt(59.2毫摩爾)、HOAt(3.7毫摩爾)和DIC(61.9毫摩爾)添加到在NMP(900ml)和CH2Cl2中的C-末端片段樹脂(190g，41毫摩爾)上。將混合物在室溫?cái)嚢?2小時(shí)。添加DIPEA(7ml)，并且繼續(xù)攪拌另一天。如實(shí)施例1所述(步驟9至13)洗滌樹脂。Kaiser試驗(yàn)顯示出少于2％的未結(jié)合的剩余物。乙酰化樹脂(實(shí)施例3，步驟14至20)并除去Fmoc基團(tuán)(實(shí)施例3，步驟1至7)。
將鈉鹽形式的N-末端片段A(153g，62.4毫摩爾)、HOBt(59.2毫摩爾)、HOAt(3.7毫摩爾)，PyBOP(62.5毫摩爾)和DIPEA(125.15毫摩爾)添加到在NMP(900ml)和CH2Cl2中的樹脂上。將混合物在室溫?cái)嚢?4小時(shí)。過濾并洗滌(實(shí)施例3，步驟9-13)。Kaiser試驗(yàn)顯示出少于1％的未結(jié)合的剩余物。使樹脂乙?；?實(shí)施例3，步驟14至20)，從反應(yīng)器中除去，并在真空下干燥。
在N2下，將在苯硫基甲烷(152.6ml)和TFA(1L)中的苯酚(60.3g)溶液添加到肽-樹脂(64g)上。將混合物冷卻至-10℃，緩慢添加TMSBr。在一封閉系統(tǒng)中于-10℃下攪拌混合物0.5小時(shí)，于室溫下攪拌1-2小時(shí)。于50℃在真空下將混合物濃縮至一半體積，過濾樹脂，用TFA(250ml)和冰醋酸(250ml)洗滌兩次。通過添加叔丁基甲基醚己烷的3∶1的混合物(6.5L)使濾液沉淀。過濾粗肽，用叔丁基甲基醚、甲苯和叔丁基甲基醚(各2×250ml)洗滌，通過在甲醇(500ml)中溶解并加入到叔丁基甲基醚(7L)中再沉淀。過濾粗產(chǎn)物，以叔丁基甲基醚洗滌，在真空下干燥，產(chǎn)生肽33g。
用合適的樹脂來代替酸終止(terminated)肽，以同樣的方式可以制備下列PTHrP類似物AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH(SEQ ID NO6)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO15)AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO16)AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO17)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH(SEQ ID NO5)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRE LLEKLLEKLHTAGRR-OH(SEQ ID NO10)AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH(SEQ ID NO14)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKE L-NH2(SEQ ID NO11)AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH2(X＝Nle，SEQ ID NO23)AVSE IQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH2(X＝Nle，SEQ ID NO24)AVSEHQL LHD KGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH2(SEQ ID NO20)AVSE HQLLHDKGKSIQDLARRE LLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO12)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO13)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH2(SEQ ID NO21)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH2(SEQ ID NO22)AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH2(SEQ ID NO35)AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO38)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH2(SEQ ID NO39)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-OH(SEQ ID NO40)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH(SEQ ID NO41)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH2(SEQ ID NO43)AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO44)AVSEHQLLHD KGCSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO45)AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO46)(X＝Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素基)))AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO47)(X＝Lys(7-二甲氨基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-4-乙?；?)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG-OH(SEQ ID NO48)AVSX1HQLLHX2KGKSIQX2LRR RX1LLX1KLLX1K LHA-OH(SEQ ID NO49)(X1＝Glu(OCH3)；X2＝Asp(OCH3))AVSX1HQLLHX2KGKSIQX2LRR RX1LLX1KLLX1K LHA-OCH3(SEQ ID NO50)(X1＝Glu(OCH3)；X2＝Asp(OCH3))AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH(SEQ ID NO52)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH(SEQ ID NO53)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLEKLLEK LHTP-NH2(SEQ ID NO54)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEKLHP-NH2(SEQ ID NO55)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2(SEQID NO56)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH(SEQ ID NO57)AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO58)AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH2(SEQ ID NO59)AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO60)(X＝Lys(二氫肉桂?；?)AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH2(SEQ ID NO61)(X＝正亮氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTMA-NH2(SEQ ID NO62)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO64)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLHKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO65)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO66)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH2(SEQ ID NO67)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RELLEKLLEE IHTA-NH2(SEQ ID NO68)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLEKLLEK LHTRSAW-NH2(SEQ ID NO72)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLEKLLEK LHTRSAX-OH(SEQ ID NO73)(X＝Nal(2)＝3-(2-萘基)-L-丙氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH(SEQ ID NO74)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH(SEQ ID NO75)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH(SEQ ID NO76)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH(SEQ ID NO77)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH(SEQ ID NO78)SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO80)LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO81)LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO82)SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO83)LLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO84)按照以上的方法可以制備和純化[Met34，Ala35](SEQ ID NO25)，(AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRE LLEKLLEKLHTMA-NH2，SEQ ID NO25)。按以下所述可以將這一多肽轉(zhuǎn)化成高絲氨酸內(nèi)酯。將純化的肽溶解在44％甲酸中。在0℃將這一溶液與溴化氰(700mg)與苯酚(1.6mg)在44％甲酸中的預(yù)混合溶液混合。于0℃攪拌所述溶液2小時(shí)，于室溫下攪拌2小時(shí)?？梢杂肏PLC(VydacC-18，300A°，4.6×250mm，流速1.2ml/分鐘，在0.1％TFA中的25-45％乙腈梯度洗脫10分鐘)監(jiān)測產(chǎn)物的形成。濃縮樣品，并用制備型RP-HPLC(VydacC-18，在0.1％TFA中的25-45％乙腈梯度洗脫)純化，產(chǎn)生SEQ ID NO9。AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RELLEKLLEKLHTX(X＝hSerlac，SEQ ID NO9)同樣地，可以按照這一方法制備SEQ ID NO79。AVSEIQFX1HN KGKHLSSX1ER VEWLRKKLQD VHNX2(SEQ ID NO79)(X1＝L-正亮氨酸；X2＝高絲氨酸內(nèi)酯)為了制備高絲氨酸酰胺，將粗hSer內(nèi)酯類似物(化合物4)濃縮，用25ml甲醇中飽和的NH3處理。于0℃攪拌所述溶液2小時(shí)，于室溫下攪拌16小時(shí)?？梢杂肏PLC(VydacC-18，300A°，4.6×250mm，流速1.2ml/分鐘，在0.1％TFA中的20-45％乙腈梯度洗脫10分鐘)監(jiān)測反應(yīng)。濃縮溶液，并用制備型RP-HPLC(VydacC-18，在0.1％TFA中的25-45％乙腈梯度洗脫)純化，收集高絲氨酸酰胺肽部分并凍干，產(chǎn)生SEQ ID NO8。AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NH2(X＝hSer，SEQ ID NO8)同樣地，用甲硫氨酸作為C-末端，可以用這一方法制備化合物22、23和28。AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2(SEQ ID NO36)(X＝高絲氨酸)AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2(SEQ ID NO37)(X＝高絲氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH2(SEQ ID NO42)(X＝高絲氨酸)通過在包含過量的相應(yīng)烷基胺的DMF中溶解高絲氨酸內(nèi)酯，類似地從高絲氨酸內(nèi)酯制備高絲氨酸烷基酰胺。在室溫下攪拌幾天后(反應(yīng)可以用分析型HPLC監(jiān)測)，將混合物蒸發(fā)至干，用制備型HPLC純化肽。代表性的高絲氨酸烷基酰胺是化合物55和56。AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH3(SEQ ID NO69)(X＝高絲氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH2C6H5(SEQ ID NO70)(X＝高絲氨酸)以上高絲氨酸內(nèi)酯類似物含水溶液也可以用豬肝臟酯酶(西格馬化學(xué)公司，圣路易斯，MO)處理。可以用分析型HPLC監(jiān)測所述內(nèi)酯向C-末端高絲氨酸的水解。當(dāng)判斷出水解完全時(shí)，可以按如上所述經(jīng)制備型HPLC純化所述的物質(zhì)。AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-OH(SEQ ID NO51)(X＝高絲氨酸)盡管本發(fā)明通過用公開從3個(gè)片段合成34個(gè)氨基酸多肽的方法例證性說明，但其同樣適用于從不同片段合成不同長度的PTH和PTHrP類似物。一般地，谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸和脯氨酸是理想的片段C-末端。在前面的實(shí)施例中，在片段2和3之間的亮氨酸-亮氨酸連接給出了意想不到的高產(chǎn)率。同樣地，亮氨酸-亮氨酸連接可以被從片段1-7、8-23、24-27和28-34制備SEQ ID NO7的多肽所采用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)氨基酸24-27(LEKL)與28-31相同時(shí)，通過溶液或固相技術(shù)可以制備4個(gè)氨基酸的片段，縮合其自身給出片段24-31。此外，可以制備4個(gè)氨基酸的片段23-26(LLEK)并使其自身縮合給出23-30片段。使用易于結(jié)晶的較小片段可以使純化容易進(jìn)行。然而，片段數(shù)量的增加需要更多的片段縮合步驟。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(ii)發(fā)明名稱合成甲狀旁腺素類似物和甲狀旁腺素相關(guān)肽的方法(iii)序列數(shù)86(iv)通訊地址(A)收信人F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道 Grenzacherstrasse 124.
(C)城市 Basle(D)州BS(E)國家 瑞士(F)郵編 CH-4070(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO1Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO2Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO3Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO4Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His2025 30Thr Ala(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO5Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin1 510 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys Leu His20 2530Thr Ala(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Glnl 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 2530Thr Ala(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQID NO8的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注＝″Xaa34＝高絲氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO8Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Xaa(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注＝″Xaa34＝高絲氨酸內(nèi)酯″(xi)序列描述SEQ ID NO9Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Xaa(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(xi)序列描述SEQ ID NO10Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala Gly Arg Arg35(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO11Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu Lys20 25 30Glu Leu(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 2530Thr Ala(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO14Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Ala Leu(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO16Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO17Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置29(D)其它信息/注＝″Xaa29＝賴氨酸-(OCCH2(OCH2CH2)2OCH3)″(xi)序列描述SEQ ID NO18Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置29(D)其它信息/注＝″Xaa29＝賴氨酸-(OCCH2(OCH2CH2)110OCH3″(xi)序列描述SEQ ID NO19Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO20Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO21Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu His2025 30Thr Ala(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO22Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注＝″Xaa8＝正亮氨酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置18(D)其它信息/注＝″Xaa18＝正亮氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO23Ala Val Ser Glu His Gln Phe Xaa His Asp Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Xaa Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Asn Tyr(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征
(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注＝″Xaa8＝正亮氨酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置18(D)其它信息/注＝″Xaa18＝正亮氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO24Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Xaa Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Asn Tyr(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO25Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Met Ala35(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)螺旋狀(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注＝″Xaa8＝谷氨酸或精氨酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞區(qū)(B)位置1..10(D)其它信息/注＝″序列26位于序列5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的22到31位″(xi)序列描述SEQ ID NO26Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu1 510(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)螺旋狀(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注＝″Xaa8＝谷氨酸、賴氨酸或賴氨酸-OCCH2PEGX)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞區(qū)(B)位置1..10(D)其它信息/注＝″序列27位于序列15、16、17、18和19的22到31位″(xi)序列描述SEQ ID NO27Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu1 510(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)螺旋狀(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..10(D)其它信息/注＝″序列28位于序列20的22到31位″(xi)序列描述SEQ ID NO28Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu1 510(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)螺旋狀(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..10(D)其它信息/注＝″序列29位于序列21的22到31位.″(xi)序列描述SEQ ID NO29Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu1 510(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)螺旋狀(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..10(D)其它信息/注＝″序列30位于序列22的22到31位上″(xi)序列描述SEQ ID NO30Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu1 510(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長度88個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO31CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGCATGGCT GTTTCTGAAC ATCAGCTGCT TCATGACAAAGGTAAATCGA TTCAAGATCT GAGACGTC 88(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長度90個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO32CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATCTAGACA TAGTATGCAG CTTTTCAAGC AGTTTCTCCAGCAGCTCGCG ACGTCTCAGA TCTTGAATCG 90(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO33CCTCTAGATC TCCGCGCGCT AGC 23(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO34CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC 24(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO35Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 51015Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Asn Tyr(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注＝″Xaa是高絲氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO36Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 2530Asn Xaa(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注＝″Xaa是高絲氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO37Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Lys Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Asn Xaa(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO38Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Lys Leu Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His2025 30Thr Ala(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征；(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO39Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His2025 30Thr Ala(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO40Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His202530Thr Ala Pro35(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)長度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO41Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His202530Thr Ala Gly Arg Arg35(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)長度38個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置38(D)其它信息/注＝″Xaa是高絲氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO42Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His202530Thr Ala Gly Arg Arg Xaa35(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO43Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Tyr(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO44Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Tyr Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO45Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Cys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注＝″Xaa是Cys(CH-2CONH(CH-2)-2NH(生物素基))″(xi)序列描述SEQ ID NO46Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)
(B)位置13(D)其它信息/注＝″Xaa是Lys(7-二甲氨基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-4-乙?；?(xi)序列描述SEQ ID NO47Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO48Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala Gly35(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注＝″Xaa4是Glu(OCH-3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注＝″Xaa10是Asp(OCH-3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置17(D)其它信息/注＝″Xaa17是Asp(OCH-3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注＝″Xaa22是Glu(OCH3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置25(D)其它信息/注＝″Xaa25是Glu(OCH-3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置29(D)其它信息/注＝″Xaa29是Glu(OCH-3)″(xi)序列描述SEQ ID NO49Ala Val Ser Xaa His Gln Leu Leu His Xaa Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Xaa Leu Arg Arg Arg Xaa Leu Leu Xaa Lys Leu Leu Xaa Lys Leu His202530Ala(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注＝″Xaa4是Glu(OCH-3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注＝″Xaa10是Asp(OCH-3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置17(D)其它信息/注＝″Xaa17是Asp(OCH-3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注＝″Xaa22是Glu(OCB-3)″(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置25(D)其它信息/注＝″Xaa25是Glu(OCH-3)″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置29(D)其它信息/注＝″Xaa29是Glu(OCH-3)″(xi)序列描述SEQ ID NO50Ala Val Ser Xaa His Gln Leu Leu His Xaa Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Xaa Leu Arg Arg Arg Xaa Leu Leu Xaa Lys Leu Leu Xaa Lys Leu His2025 30Ala(2)SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注＝″Xaa是高絲氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO51Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His2025 30Thr Xaa(2)SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO52Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala Pro35(2)SEQ ID NO53的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO53Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Pro(2)SEQ ID NO54的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO54Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Pro(2)SEQ ID NO55的信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO55Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Pro(2)SEQ ID NO56的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO56Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu Pro202530(2)SEQ ID NO57的信息(i)序列特征(A)長度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO57Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His2025 30Thr Arg Ser Ala Trp35(2)SEQ ID NO58的信息(i)序列特征(A)長度42個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO58Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His202530Thr Ala Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp35 40(2)SEQ ID NO59的信息(i)序列特征(A)長度42個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO59Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His202530Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp35 40(2)SEQ ID NO60的信息(i)序列特征(A)長度42個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注＝″Xaa13是Lys(二氫肉桂酰基)″(xi)序列描述SEQ ID NO60Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Xaa Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His202530Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp3540(2)SEQ ID NO61的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注＝″Leu8是正亮氨酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置18(D)其它信息/注＝″Leu18是正亮氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO61Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Leu Thr Arg Ser Ala Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Tyr(2)SEQ ID NO62的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO62Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Met Ala35(2)SEQ ID NO63的信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征；(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置33(D)其它信息/注＝″Xaa是Thr1，4-二氨基丁酰內(nèi)酰胺″(xi)序列描述SEQ ID NO63Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Xaa(2)SEQ ID NO64的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO64Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO65的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO65Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu His Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO66的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO66Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO67的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO67Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Ile Ala Lys Leu His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO68的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO68Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Glu Ile His202530Thr Ala(2)SEQ ID NO69的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注＝″Xaa是高絲氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO69Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Xaa(2)SEQ ID NO70的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注＝″Xaa是高絲氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO70Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Xaa(2)SEQ ID NO71的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩者(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO71Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His2025 30Thr Ala(2)SEQ ID NO72的信息(i)序列特征(A)長度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO72Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Arg Ser Ala Trp35(2)SEQ ID NO73的信息(i)序列特征(A)長度36個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置36
(D)其它信息/注＝″Xaa是Ala3-(2-萘基)-L-丙氨酸″(xi)序列描述SEQ ID NO73Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Arg Ser Xaa35(2)SEQ ID NO74的信息(i)序列特征(A)長度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO74Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala Ser Ala Trp35(2)SEQ ID NO75的信息(i)序列特征(A)長度38個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO75Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 2530Thr Ala Glu Ile Arg Ala35(2)SEQ ID NO76的信息(i)序列特征(A)長度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO76Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 l0 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala Glu Ile Arg35(2)SEQ ID NO77的信息(i)序列特征
(A)長度36個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO77Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala Glu Ile35(2)SEQ ID NO78的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO78Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His202530Thr Ala Glu35(2)SEQ ID NO79的信息(i)序列特征(A)長度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型N-末端(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注＝″Leu8是正亮氨酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置18(D)其它信息/注＝″Leu18是正亮氨酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注＝″Xaa是高絲氨酸內(nèi)酯″(xi)序列描述SEQ ID NO79Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Lys Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Xaa(2)SEQ ID NO80的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(xi)序列描述SEQ ID NO80Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu1 5 10 15Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala20 2530(2)SEQ ID NO81的信息(i)序列特征(A)長度28個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(xi)序列描述SEQ ID NO81Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu1 5 10 15Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala2025(2)SEQ ID NO82的信息(i)序列特征(A)長度27個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(xi)序列描述SEQ ID NO82Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu1 510 15Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala20 25(2)SEQ ID NO83的信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(xi)序列描述SEQ ID NO83Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln Asp Leu1 5 10 15Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His Leu His20 2530Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp35 40(2)SEQ ID NO84的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(xi)序列描述SEQ ID NO84Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu1 5 10 15Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His Ala Gly Arg Arg Thr Arg20 2530Ser Ala Trp35(2)SEQ ID NO85的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)螺旋狀(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置1和4(D)其它信息/注＝″Xaa1和Xaa4＝Glu、Glu(OCH3)、His或Phe″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注＝″Xaa2＝Leu或Phe″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置5
(D)其它信息/注＝″Xaa5＝Lys或His″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置7and10(D)其它信息/注＝″Xaa7和Xaa10＝Leu或Ile″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注＝″Xaa8＝Ala、Arg或Glu″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息/注＝″Xaa9＝Lys或Glu″(xi)序列描述SEQ ID NO85Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10(2)SEQ ID NO86的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)螺旋狀(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(v)片段類型內(nèi)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置1和4(D)其它信息/注＝″Xaa1和Xaa4＝Glu、Glu(OCH3)、His或Phe″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注＝″Xaa2＝Leu或Phe″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注＝Xaa8＝Glu、Lys或Lys(COCH2PEGX)(xi)序列描述SEQ ID NO86Xaa Xaa Leu Xaa Arg Leu Leu Xaa Arg Leu1 5 10
權(quán)利要求
1.一種合成甲狀旁腺素(PTH)合成多肽類似物或甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTIrrP)或其鹽的方法，在所述類似物、相關(guān)肽和其鹽中，選自SEQ ID NOS85、86、26、27、28、29和30的氨基酸殘基22-31形成一個(gè)兩親性α-螺旋，該方法包括a)經(jīng)溶液或固相技術(shù)分別合成所述多肽的前體肽片段；b)使所述片段相互縮合，形成所需的多肽產(chǎn)物；和c)除去氨基酸保護(hù)基。
2.權(quán)利要求1的方法，該方法包括a)在樹脂支持物上分別合成所述多肽的前體肽片段；b)從它們各自的樹脂支持物上切下所述多肽的片段；c)依次使所說的片段縮合，形成所需的多肽產(chǎn)物；和d)除去任何氨基酸保護(hù)基。
3.權(quán)利要求1或2的方法，該方法包括a)在固體樹脂支持物上分別合成所需多肽的前體肽片段；b)從它們各自的樹脂支持物上切下除所需多肽之預(yù)期的最終C-末端的前體肽片段外的所有部分；c)使所說的切下的前體肽片段依次與樹脂結(jié)合的C-末端肽片段縮合，形成所需的多肽產(chǎn)物；d)除去側(cè)鏈保護(hù)基；和e)從樹脂支持物上切下所述的多肽產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1至3之任-所要求的方法，其中所說的多肽產(chǎn)物是從三個(gè)前體肽片段制備的，所述片段是N-末端片段、中部片段和C-末端片段。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說的N-末端片段具有C-末端甘氨酸，中部片段具有C-末端亮氨酸，并且C-末端片段具有N-末端亮氨酸。
6.如權(quán)利要求1至5之任一所要求的方法，其中最終的多肽產(chǎn)物包括具有下式的PTH或PTHrP類似物和其藥學(xué)上可接受的鹽Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu His Asp Xaa11Gly Xaa13Ser Ile GlnAsp Leu Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37Xaa38Term，其中Xaa1不存在或者是Ala；Xaa2不存在或者是Val；Xaa3不存在或者是Ser；Xaa4不存在或者是Glu或Glu(OCH3)；Xaa5不存在或者是His或Ala；Xaa6不存在或者是Gln；Xaa7不存在或者是Leu；Xaa11是Lys、Arg、或Leu；Xaa13是Lys、Arg、Tyr、Cys、Leu、Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素基))、Lys(7-二甲氨基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-4-乙?；?、或Lys(二氫肉桂?；?；Xaa20是Arg或Leu；Xaa19和Xaa21分別是Lys、Ala、或Arg；Xaa22-31選自SEQ ID NOS85、86、26、27、28、29或30；Xaa32是His、Pro、或Lys；Xaa33不存在或者是Pro、Thr、Glu或Ala；Xaa34不存在或者是Pro、Arg、Met、Ala、hSer、hSer內(nèi)酯、Tyr或Leu；Xaa35不存在或者是Pro、Glu、Ser、Ala或Gly；Xaa36不存在或者是Ala、Arg或Ile；Xaa37不存在或者是Arg、Trp或3-(-2-萘基)-L-丙氨酸；Xaa38不存在或者是Ala或hSer或者Xaa38-42是Thr Arg Ser Ala Trp；并且Term是OR或NR2，這里各R分別是H、(C1-C4)烷基或苯基(C1-C4)烷基。
7.權(quán)利要求1至5之任一所要求的方法，其中所說的PTH或PTHrP的多肽類似物包括具有下式的物質(zhì)和其藥學(xué)上可接受的鹽Xaa1Val Ser Glu Ile Gln Xaa7Xaa8His Asn Xaa11Gly Lys His Leu Xaa16Ser Xaa18Xaa19Arg Xaa21Xaa22-31His Asn Xaa34Term，其中Xaa1是Ser或Ala；Xaa7是Leu或Phe；Xaa8是Leu、Met或Nle；Xaa11是Leu或Lys；Xaa16是Asn或Ser；Xaa18是Leu、Met或Nle；Xaa19是Glu、Thr或Arg；Xaa21是Val、Ser或Arg；Xaa22-31選自SEQ ID NOS26、27、28、29或30；Xaa34是Phe、hSer或Tyr；Term是OR或NR2、這里R是H或(C1-C4)烷基。
8.權(quán)利要求1至5之任一所要求的方法，其中所說的PTH或PTHrP類似物選自AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO7)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH(SEQ ID NO6)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO15)AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO16)AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO17)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH(SEQ ID NO5)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR-OH(SEQ ID NO10)AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH(SEQ ID NO14)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH2(SEQ ID NO11)AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH2(X＝Nle，SEQ ID NO23)AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH2(X＝Nle，SEQ ID NO24)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH2(SEQ ID NO20)AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO12)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO13)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH2(SEQ ID NO21)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH2(SEQ ID NO22)AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH2(SEQ ID NO35)AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO38)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH2(SEQ ID NO39)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-OH(SEQ ID NO40)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH(SEQ ID NO41)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH2(SEQ ID NO43)AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO44)AVSEHQLLHD KGCSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO45)AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO46)(X＝Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素基)))AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO47)(X＝Lys(7-二甲氨基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-4-乙?；?)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG-OH(SEQ ID NO48)AVSX1HQLLHX2KGKSIQX2LRR RX1LLX1KLLX1K LHA-OH(SEQ ID NO49)(X1＝Glu(OCH3)；X2＝Asp(OCH3))AVSX1HQLLHX2KGKSIQX2LRR RX1LLX1KLLX1K LHA-OCH3(SEQ ID NO50)(X1＝Glu(OCH3)；X2＝Asp(OCH3))AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH(SEQ ID NO52)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH(SEQ ID NO53)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLEKLLEK LHTP-NH2(SEQ ID NO54)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEKLHP-NH2(SEQ ID NO55)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2(SEQID NO56)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH(SEQ ID NO57)AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO58)AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH2(SEQ ID NO59)AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO60)(X＝Lys(二氫肉桂?；?)AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH2(SEQ ID NO61)(X＝正亮氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTMA-NH2(SEQ ID NO62)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO64)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLHKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO65)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO66)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH2(SEQ ID NO67)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RELLEKLLEE IHTA-NH2(SEQ ID NO68)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLEKLLEK LHTRSAW-NH2(SEQ ID NO72)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLEKLLEK LHTRSAX-OH(SEQ ID NO73)(X＝Nal(2)＝3-(2-萘基)-L-丙氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH(SEQ ID NO74)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH(SEQ ID NO75)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH(SEQ ID NO76)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH(SEQ ID NO77)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH(SEQ ID NO78)SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO80)LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO81)LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO82)SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO83)LLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO84)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RELLEKLLEKLHTX(X＝hSerlac，SEQ ID NO9)AVSEIQFX1HN KGKHLSSX1ER VEWLRKKLQD VHNX2(SEQ ID NO79)(X1＝L-正亮氨酸；X2＝高絲氨酸內(nèi)酯)AVSEHQLLHDKGKSIQDLRR RELLEKLLEKLHTX-NH2(X＝hSer，SEQ ID NO8)AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2(SEQ ID NO36)(X＝高絲氨酸)AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2(SEQ ID NO37)(X＝高絲氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH2(SEQ ID NO42)(X＝高絲氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH3(SEQ ID NO69)(X＝高絲氨酸)AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH2C6H5(SEQ ID NO70)(X＝高絲氨酸)，和AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-OH(SEQ ID NO51)(X＝高絲氨酸)。
9.權(quán)利要求1至5之任一所要求的方法，其中所說的PTH或PTHrP類似物是SEQ ID NO7的多肽AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所說的第一片段包含AVSEHQLLHDKG，所說的第二片段包含KSIQDLRRREL，所說的第三片段包含LEKLLEKLHTA。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所說的第三片段是由LEKL，LEKL和HTA縮合形成的。
12.序列AVSEHQLLHDKG的合成多肽。
13.序列KSIQDLRRREL的合成多肽。
14.序列LEKLLEKLHTA的合成多肽。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所說的第一片段包含AVSEHQLLHDKG，所說的第二片段包含KSIQDLRRRE，所說的第三片段包含LLEKLLEKLHTA。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說的第三片段是由LLEK，LLEK和LHTA縮合形成的。
17.式KSIQDLRRRE的合成多肽。
18.式LLEKLLEKLHTA的合成多肽。
19.如本文以上所描述的發(fā)明。
20.一種制備藥物組合物的方法，其特征在于，實(shí)施如權(quán)利要求1至11和15和16所要求的制備PTH或PTHrP類似物的方法，并且將所獲得的PTHrP類似物與一種或多種藥學(xué)上可接受的添加劑混合。
全文摘要
本發(fā)明提供了合成甲狀旁腺素(PTH)類似物和甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)的片段縮合方法,在所述的類似物和相關(guān)肽中,氨基酸殘基22—31形成一個(gè)合成的兩親性α－螺旋。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1174845SQ97115468
公開日1998年3月4日 申請(qǐng)日期1997年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月30日
發(fā)明者H·阿澤諾 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司