專利名稱：甲狀旁腺激素類似物和甲狀旁腺激素相關(guān)肽合成和治療骨質(zhì)疏松癥的用途的制作方法
背景技術(shù)：
a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新穎的甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關(guān)肽的類似物、它們的固相合成和重組技術(shù)、以及它們在哺乳動物中增加骨質(zhì)的用途。b)相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的描述骨質(zhì)疏松癥是最常見的代謝性骨疾病形式，而且可以認為是骨喪失(骨質(zhì)減少)的有癥狀的、斷裂階段。盡管骨質(zhì)疏松癥可以繼發(fā)于許多原發(fā)性疾病出現(xiàn)，但是90％的病例是自發(fā)性的。絕經(jīng)后的婦女尤其容易得自發(fā)性的骨質(zhì)疏松癥(絕經(jīng)后或I型骨質(zhì)疏松癥)。另一個自發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)病組是高齡人(男性或女性)(老年性或II型骨質(zhì)疏松癥)。已發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥與下列情況有關(guān)使用皮質(zhì)類固醇、制動術(shù)或長期臥床休息、酗酒、糖尿病、對性腺有毒性的(go-nadotoxic)的化療、血催乳素過多、神經(jīng)性厭食癥、原發(fā)性和繼發(fā)性閉經(jīng)、和卵巢切除。
在各種形式的骨質(zhì)疏松癥中，經(jīng)常發(fā)生骨折，這是骨喪失達到機械性衰竭點所造成的結(jié)果。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的特征是腕部和脊柱的骨折，而股骨頸的骨折似乎是老年性骨質(zhì)疏松癥的主要特征。
骨質(zhì)疏松癥中骨喪失的機制認為是涉及骨骼自我更新過程的失調(diào)。該更新過程被稱為骨重塑過程。該過程在一系列的各種活性袋中進行。這些袋似乎是作為骨吸收部位自發(fā)性地位于骨質(zhì)中和一定的骨表面上。破骨細胞(骨溶解或吸收細胞)負責吸收一般恒定大小部分的骨質(zhì)。該吸收過程之后是出現(xiàn)成骨細胞(骨形成細胞)，然后由新的骨質(zhì)重新填滿破骨細胞留下的孔隙。
在健康的成年人中，破骨細胞和成骨細胞的形成速度是使骨形成和骨吸收的過程處于平衡狀態(tài)。然而，在骨質(zhì)疏松癥中由于骨重塑過程的不平衡導(dǎo)致骨喪失的速度快于骨形成速度。盡管在大多數(shù)人中隨年齡增大都可能存在某種程度的失衡，但是在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥或在卵巢切除后這種失衡嚴重得多，而且出現(xiàn)的年齡更小。
已經(jīng)有許多治療骨質(zhì)疏松癥方面的嘗試以減慢進一步的骨喪失或者更合乎需要地使骨質(zhì)有凈增長。某些藥劑，如雌激素和二磷酸鹽，可以減緩骨質(zhì)疏松癥中骨質(zhì)的進一步喪失。由于骨吸收和骨形成的時期不同，所以減緩骨喪失的藥劑似乎可以增加骨質(zhì)(約3—7％)。但是，這種表觀增長受時間的限制，不是漸進的，而且是由于“重塑空間”的減少而造成的。此外，因為骨吸收和形成之間緊密相關(guān)，阻止骨吸收的治療最終也會阻止骨形成。
已有人提出，用甲狀旁腺激素(PTH)治療可以促進骨周轉(zhuǎn)并導(dǎo)致正鈣平衡。但是，人體臨床試驗表明，小梁骨的任何增加被皮層骨(cortical bone)的減少所抵銷，因此沒有總骨質(zhì)的凈增長。
Hefti，et al.在Clinical Science 62，389—396(1982)中報道，給于正常的和患骨質(zhì)疏松癥的成年雌性大鼠每天皮下劑量的bPTH(1—84)或hPTH(1—34)可以增加全身的鈣質(zhì)和各種骨的灰重。
Liu，et al.在J.Bone Miner.Res.610，1071—1080(1991)中指出，成年雌性大鼠切除卵巢后會誘發(fā)近脛骨干骺端小梁骨喪失47％，同時伴有成骨細胞和小梁破骨細胞數(shù)目的明顯增加。每天皮下注射hPTH(1—34)能夠完全逆轉(zhuǎn)小梁骨的喪失從而導(dǎo)致小梁骨的數(shù)量超過模擬操作的對照組。成骨細胞的數(shù)目增加而破骨細胞的數(shù)目下降。
Hock et al.在J.Bone Min.Res.71，65—71(1992)中報道，對健康雄性大鼠每天皮下注射hPTH(1—34)12天，導(dǎo)致小梁和皮層骨鈣質(zhì)和干重的增加?？偣琴|(zhì)、小梁骨體積、小梁厚度和數(shù)目以及成骨細胞表面都增加了。
哺乳動物甲狀旁腺激素，如人的(hPTH)、牛的(bPTH)和豬的(pTTH)，是具有84個氨基酸殘基的單一多肽鏈，分子量約為9500。生物活性于N—末端部分有關(guān)，其中殘基(1—34)明顯是所需的最小長度。
人PTH的N-末端片段與牛和豬的激素的N-末端片段的不同之處分別只有3個和2個氨基酸殘基Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu1 510 15Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Phe(SEQ ID NOI)；bPTH(1-34)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Ash Leu Gly Lys His Leu1 510 15Ser Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Phe(SEQ ID NO2)；pPTH(1-34)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu1 510 15Ser Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Phe(SEQ ID NO3)。
PTH的主要功能是引發(fā)適應(yīng)性的變化，以維持胞外液中Ca2+的恒定濃度。PTH作用于腎臟，增加腎小管對尿中Ca2+的重吸收，并且刺激25-羥膽骨化醇轉(zhuǎn)變成1，25-二羥膽骨化醇。該化合物負責Ca2+的小腸吸收。一個顯著效果是促進骨中Ca2+的移動。PTH作用于骨時，增加Ca2+和磷酸鹽的吸收。PTH刺激破骨細胞的骨吸收速度，增加間質(zhì)細胞向破骨細胞的分化速度，以及延長破骨細胞的半衰期。由于PTH的延長作用，骨形成的成骨細胞的數(shù)目也增加；因此，提高了骨周轉(zhuǎn)和重塑的速度。但是，各個成骨細胞的活性似乎低于正常細胞。
Rosenblatt，et al.在U.S.專利No.4,423,037,4,968,669和5,001,223中公開了通過缺失N-末端(1—6)氨基酸和選擇性地置換Phe7，Met8，18，和Glyl2而獲得的PTH拮抗劑。據(jù)報道，Tyr34-NH2可以增加這些化合物的活性和穩(wěn)定性。
甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrp)，一種140多個氨基酸的蛋白質(zhì)及其片段可模擬PTH的主要生物功能。PTHrp可以通過許多人和動物的腫瘤以及其他組織合成，它可在惡性高鈣血癥中發(fā)揮作用。hPTHrp(1—34)的序列如下Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu20 25 30Ile His Thr Ala(SEQ ID NO4)hPTH和hPTHrp之間的序列同源性主要局限于13個N-末端殘基，其中8個是相同的；在hPTH的受體結(jié)合區(qū)域(25—34)中10個氨基酸中只有1個氨基酸在hPTHrp中是保守的。構(gòu)象相似性可能是具有共同活性的原因。Cohen，et al.在J.Biol.Chem.2663，1997—2004(1991)中指出，PTH(1—34)和PTHrp(1—34)的大部分序列，尤其是區(qū)域(5—18)和(2l—34)，呈現(xiàn)α-螺旋構(gòu)象。同時他還指出，該構(gòu)象是否普遍存在于生理條件下羧基端還有疑問。這種二級結(jié)構(gòu)對于脂類相互作用、受體相互作用和/或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。
我們已經(jīng)合成了PTH和PTHrp的類似物以便開發(fā)出改良的、用于包括患骨質(zhì)疏松癥的哺乳動物中恢復(fù)骨質(zhì)的治療劑。
發(fā)明概述本發(fā)明提供甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的合成多肽類似物及其鹽，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(hy-drophilic amino acids，Haa)和親脂氨基酸(1ipophilic amino acids，Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa當該序列類型的具體闡述性例子插入PTH，PTHrp，以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物時，獲得的多肽是有效的骨重塑劑。
一方面，本發(fā)明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的類似物或其鹽，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)的序列選自a)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Xaa5Leu xaa7Xaa8Xaa9Xaa10其中1 510Xaa1和Xaa4各自獨立地為Glu，Glu(OCH3)，His，或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa5是Lys或His；Xaa7和Xaa10各自獨立地為Leu或Ile；Xaa8是Ala，Arg，或Glu；和Xaa9是Lys或Glu(SEQ ID NO26)；b)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Arg Leu Leu Xaa8Arg Leu其中1 510Xaa1和Xaa4各自獨立地為Glu，Glu(OCH3)，His，或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa8是Glu，Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是分子量為100—10,000的聚(乙二醇甲基醚)殘基(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)1 510d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 510e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)1 510另一方面，本發(fā)明提供具有下式結(jié)構(gòu)的PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的類似物或其鹽Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu His Xaa10Xaa11Gly Xaa13Ser Ile Gln Xaa17Leu Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37Xaa38Term，其中Xaa1缺失或是Ala；Xaa2缺失或是Val；Xaa3缺失或是Ser；Xaa4缺失或是Glu或Glu(OCH3)；Xaa5缺失或是His或Ala；Xaa6缺失或是Gln；Xaa7缺失或是Leu；Xaal0和Xaa17各自獨立地為Asp或Asp(OCH3)；Xaa11是Lys，Arg，或Leu；Xaa13是Lys，Arg，Tyr，Cys，Leu，Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素基))，Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-4-乙?；?，或Lys(二氫肉桂酰基)；Xaa20是Arg或Leu；Xaa19和Xaa21各自獨立地為Lys，Ala，或Arg；Xaa22-31選自(SEQ ID NOS26，27，28，29，或30)；Xaa32是His，Pro，或Lys；Xaa33缺失，或是Pro，Thr，Glu，或Ala；Xaa34缺失，或是Pro，Arg，Met，Ala，hSer，hSer內(nèi)酯，Tyr，Leu，或1，4-二氨基丁酰內(nèi)酰胺；Xaa35缺失或是Pro，Glu，Ser，Ala，或Gly；Xaa36缺失或是Ala，Arg，或Ile；Xaa37缺失或是Arg，Trp，或3-(-2-萘基)-L-Ala；Xaa38缺失或是Ala或hSer或Xaa38—42是Thr Arg Ser Ala Trp；和Term是OR或NR2其中每個R各自獨立地為H，(C1—C4)烷基或苯基(C1—C4)烷基；及其藥學(xué)上可接受的鹽。
另一方面，本發(fā)明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的類似物或其鹽，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)序列選自a)Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu xaa Lys Leu其中1 510Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO26)；b)G1u Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu其中1 510Xaa29是Glu，Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是分子量為100—10,000的聚(乙二醇甲基醚)殘基(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；1 510d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 510e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)1 510還提供了用于預(yù)防或治療骨質(zhì)減少狀況的藥物組合物，它包括與藥學(xué)上可接受的載體以及骨質(zhì)增加有效量的甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的多肽類似物及其鹽，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(Haa)和親脂氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa.
還提供了制備藥物組合物的方法，它包括將上述化合物與藥學(xué)上可接受的載體相混合。
另外，本發(fā)明還提供了用于治療哺乳動物骨質(zhì)減少狀況的方法，該方法包括向需要的哺乳動物施用骨質(zhì)增加有效量的PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的多肽類似物或其鹽，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(Haa)和親脂氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa更具體地，本發(fā)明提供了用于治療哺乳動物骨質(zhì)減少狀況的方法，該方法包括向需要的哺乳動物施用骨質(zhì)增加有效量的PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的多肽類似物或其鹽，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)序列選自SEQ ID NO26，27，28，29，和30。
本發(fā)明還包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的多肽類似物，或多肽類似物的鹽的固相合成方法，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(Haa)和親脂氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa，該方法包括按次序?qū)⒈槐Ｗo的氨基酸偶連于合適的樹脂載體，去除側(cè)鏈和Nα-保護基團，以及將多肽從樹脂上分開。
本發(fā)明還包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的多肽類似物或其鹽的固相合成方法，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)序列選自SEQ ID NO26，27，28，29，和30。該方法包括按次序?qū)⒈槐Ｗo的氨基酸偶連于合適的樹脂載體，去除側(cè)鏈和Nα-保護基團，以及將多肽從樹脂上分開。
還包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的多肽類似物或其鹽的的重組合成方法，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(Haa)和親脂氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa本發(fā)明還包括用于重組合成這種多肽類似物的DNA序列、載體和質(zhì)粒。具體地，本發(fā)明提供了用于重組合成PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的多肽類似物或其鹽的DNA序列、載體和質(zhì)粒，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)序列選自SEQ ID NO26，27，28，29，和30。
附圖簡述

圖1為編碼本發(fā)明的PTHrp(1—34)類似物的合成基因的DNA序列和限制性酶切位點(hPTH PCR擴增圖)。
圖2概括了整合有PTHrp(1—34)類似物基因的質(zhì)粒的制備(Trp LE 18 hPTHrp(1—34)1構(gòu)建圖)。
圖3概括了整合有兩個拷貝PTHrp(1—34)類似物基因的質(zhì)粒的制備(Trp LE 18 hPTHrp(1—34)2構(gòu)建圖)。
圖4概括了整合有4個拷貝PTHrp(1—34)類似物基因的質(zhì)粒的制備(Trp LE 18 hPTHrp(1—34)4構(gòu)建圖)。
發(fā)明詳述縮寫和定義對于各種常見核苷酸堿基和氨基酸的單字符和三字符縮寫按Pure Appl.Chem.31，639—645(1972)和40，277—290(1974)中所建議的而且符合37 CFR§1.822(55FR 18245，1990年5月1日)和PCT規(guī)則(WIPO Standard ST.23Recommendation forthe Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequences inPatent Applications and in Published Patent Documents)。單字符和三字符縮寫如下氨基酸縮寫氨基酸 三字符 單字符丙氨酸Ala A精氨酸Arg R門冬酰胺 Asn N門冬氨酸 Asp DAsn＋Asp Asx B半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸Glu EGln＋Glu Glx Z甘氨酸Gly G
組氨酸 HisH異亮氨酸 IleI亮氨酸 LeuL賴氨酸 LysK甲硫氨酸 MetM苯丙氨酸 PheF脯氨酸 ProP絲氨酸 SerS蘇氨酸 ThrT色氨酸 TrpW酪氨酸 TyrY纈氨酸 ValV縮寫代表L-氨基酸，除非另外用D-或D，L-標明。某些天然和非天然氨基酸如甘氨酸是非手性的。所有肽序列的表示方法都是N-端氨基酸位于左邊和C-端氨基酸位于右邊。
此處所用的其他氨基酸和化合物的縮寫如下hSer 高絲氨酸hSerlac高絲氨酸內(nèi)酯Nle亮氨酸PEG2 二乙二醇甲基醚的殘基，又稱甲氧基二(乙烯氧基)，CH3O(CH2CH2O)2—，(分子量＝119)PEG5000聚(乙二醇甲基醚)的殘基，又稱甲氧基聚(乙烯氧基)，CH3O(CH2CH2O)110-，(平均分子量＝5000)PEGX 聚(乙二醇甲基醚)的殘基，CH3O(CH2CH2O)n-，n＝2—225，(平均分子量＝100—10,000)
“親水氨基酸(Haa)”指除了形成肽鍵所需的基團之外，具有至少一個親水官能團的氨基酸，例如精氨酸、門冬酰胺、門冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、及其同系物。
“親脂氨基酸(Laa)”指不帶電荷的、脂族或芳族氨基酸，例如異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、及其同系物。
在本發(fā)明中，丙氨酸被歸為“兩性氨基酸”，即它既可以用作親水氨基酸也可以用作親脂氨基酸。
“PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物”指具有小于在PTH或PTHrp發(fā)現(xiàn)的全長的氨基酸對應(yīng)序列、但是能夠引發(fā)類似的生理應(yīng)答的多肽。截短的PTH或PTHrp不必與PTH或PTHrp完全同源才能引發(fā)類似的生理應(yīng)答。PTH(1—34)和PTHrp(1—34)是該組別中的優(yōu)選例子但不排除其他例子。
“兩親性α-螺旋”指氨基酸采取α-螺旋構(gòu)型的某些多肽所表現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)，其中沿著螺旋的長軸具有相對的極性和非極性面。在感興趣的多肽中存在α-螺旋結(jié)構(gòu)的可能性在某種程度上可以通過構(gòu)建具有合適螺距的“Schiffer-Edmundson輪”(M.Schiffer和A.B.Edmundson，Biophys.J.7，121(1967))，和觀察親水和親脂殘基是否分開位于與螺旋外切的圓柱體的相對面而進行探測?；蛘?，也可通過獲得的經(jīng)驗證據(jù)例如園二色性或X射線衍射數(shù)據(jù)表明在給定的多肽中存在α-螺旋區(qū)域。理想的α-螺旋每圈具有3.6個氨基酸，其中相鄰側(cè)鏈分開100度。Eisenberg et al.在Nature 299371—374(1982)和Proc.Nat.Acad.Sci.USA81140—144(1984)中將疏水性數(shù)值和螺旋結(jié)合，以定量確定兩親性螺旋的概念。平均疏水矩被定義為構(gòu)成螺旋的各組成氨基酸疏水性的矢量和。Eisen-berg(1984)將下列氨基酸的疏水性作為“一致性”的標度Ile 0.73；Phe 0.61；Val 0.54；Leu 0.53；Trp 0.37；Met 0.26；Ala 0.25；Gly 0.16；Cys 0.04；Tyr 0.02；Pro -0.07； Thr -0.18； Ser -0.26； His -0.40； Glu -0.62；Asn -0.64； Gln -0.69； Asp -0.72； Lys -1.10； Arg -1.76。
對于每圈具有3.6個殘基(即側(cè)鏈間隔100弧度＝(360°/3.6))的理想α-螺旋的疏水矩μH，可以用下式進行計算μH＝[(ΣHNsinδ(N－1))2＋(∑HNcosδ(N－1))2]1/2，其中，HN是Nth氨基酸的疏水性值，而和為在頻率δ＝100°的序列中N個氨基酸的和。疏水矩可以用μH除以N而獲得的商<μH>表示為每個殘基的平均疏水矩。在100°±20°范圍內(nèi)<μH>值為約0.20或更大就表示存在兩親性螺旋。對于hPTHrp(22—31)和hPTH(22—31)，100°的<μH>值分別為0.19和0.37。
Cornett，et al.，在J.Mol.Biol.，195659—685(1987)中進一步擴展了兩親性α-螺旋的研究，引入了作為兩親性預(yù)報因子的“兩親性指數(shù)”。他們得出結(jié)論，約有一半所有已知的α-螺旋是兩親性的，而且主要頻率為97.5°而不是100°，每圈的殘基數(shù)目更接近3.7而不是3.6。盡管這種精確程度在科學(xué)上是令人感興趣的，但是Eisenberg等人的基本方法已經(jīng)足夠用于確定給定的序列是否是兩親性的，尤其當人們從頭開始設(shè)計序列以形成兩親性α-螺旋時。
取代的兩親性α-螺旋氨基酸序列可以不與天然存在的多肽的給定片段序列同源，但是在生理狀態(tài)下應(yīng)具有類似的二級結(jié)構(gòu)，即具有相對的極性和非極性面的α-螺旋。用其他序列置換天然存在的氨基酸序列對于改變的母體多肽的生理活性、穩(wěn)定性或其他性能可能產(chǎn)生有利的影響。在J.L.Krstenansky，et al.，F(xiàn)EBS Letters 2422，409—413(1989)，和J.P.Segrest，et al.ProteinsStructure，F(xiàn)unction，和Genetics 8103—117(1990)等中有設(shè)計和選擇這種序列方面的指導(dǎo)。
本發(fā)明的10個氨基酸的兩親性α-螺旋具有下式Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa其中，Haa選自如上所述親水氨基酸，而Laa選自上述親脂氨基酸。假定理想的α-螺旋，殘基1，4，5，8，和9分布于螺旋的一個面(A)上，相互之間約140°之內(nèi)，而殘基2，3，6，7，和10則占據(jù)螺旋的另一面(B)的140°。較佳地，位于同一面的所有殘基都是相同極性的，而位于另一面的所有殘基都是相反極性的，即如果A面都是親水性的，那么B面都是親脂性的，反之亦然。熟練技術(shù)人員知道，盡管本發(fā)明的螺旋是用Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa表示的，但是相反序列Laa(Haa Haa Laa Laa)2Haa也符合殘基分布標準，因此是本發(fā)明的螺旋的另一種等同的描述方式。
丙氨酸可以取代親水氨基酸或親脂氨基酸，因為丙氨酸可以毫無困難地位于兩親性α-螺旋的任何一面，盡管Ala10不能形成兩親性α-螺旋。一般情況下，不使用脯氨酸、半胱氨酸和酪氨酸；在序列中它們的存在和其他隨機錯誤是可以容忍的，例如在親脂面存在親水殘基，只要片段中的其余氨基酸基本上符合親水-親脂面的劃分。用于確定某一序列是否具有足夠的兩親性從而可成為本發(fā)明的序列的簡便方法是如上所述計算其平均疏水矩。如果在100°±20°范圍中每個殘基的平均矩峰值超過約0.20，那么該序列會形成兩親性螺旋即為本發(fā)明的序列。
例如，對于SEQ ID NO26，Xaa＝Glu，100°處每個殘基的平均疏水矩的計算如下A.A.HNδ(N－1) Hsinδ(N－1)Hcosδ(N－1)E -.620 0 -.62L .53 100 .52 -.17L .53 200 -.18 -.50E -.62300 .34 -.31K -1.1400 -.70 -.85L .53 500 .34 -.41L .53 600 -.46 -.27E -.62700 .21 -.58K -1.1800 -1.08 -.19L .53 900 0 -.53∑＝0.81 ∑＝-4.43μH＝[(0.81)2＋(-4.43)2]1/2＝4.50<μH>＝4.50/10＝0.45對于該序列，平均疏水矩的峰值出現(xiàn)在92°，其值為0.48。
將此概念應(yīng)用于甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關(guān)肽時，可以假設(shè)區(qū)域(7—16)和(22—31)中的一個區(qū)域或兩個區(qū)域是具有α-螺旋二級結(jié)構(gòu)的，并且可以用具有類似結(jié)構(gòu)傾向的非同源序列置換而不會喪失生物活性或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的性能。優(yōu)選例子一方面，本發(fā)明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的類似物或其鹽，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)序列選自a)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Xaa5Leu Xaa7Xaa8Xaa9xaa10其中1 510Xaa1和Xaa4各自獨立地為Glu，Glu(OCH3)，His，或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa5是Lys或His；Xaa7和Xaa10各自獨立地為Leu或Ile；Xaa8是Ala，Arg，或Glu；和Xaa9是Lys或Glu(SEQ ID NO26)；b)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Arg Leu Leu Xaa8Arg Leu其中1 510Xaa1和Xaa4各自獨立地為Glu，Glu(OCH3)，His，或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa8是Glu，Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是分子量為100—10,000的聚(乙二醇甲基醚)殘基(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；1 510d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 510e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)1 510另一方面，本發(fā)明提供具有下式結(jié)構(gòu)的PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的類似物或其鹽Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu His Xaa10Xaa11Gly Xaa13Ser Ile Gln Xaa17Leu Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37Xaa38Term，其中Xaa1缺失或是Ala；Xaa2缺失或是Val；Xaa3缺失或是Ser；Xaa4缺失或是Glu或Glu(OCH3)；Xaa5缺失或是His或Ala；
Xaa6缺失或是Gln；Xaa7缺失或是Leu；Xaa10和Xaa17各自獨立地為Asp或Asp(OCH3)；Xaa11是Lys，Arg，或Leu；Xaa13是Lys，Arg，Tyr，Cys，Leu，Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素基))，Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-4-乙?；?，或Lys(二氫肉桂?；?；Xaa20是Arg或Leu；Xaa19和Xaa21各自獨立地為Lys，Ala，或Arg；Xaa22-31選自(SEQ ID NOS26，27，28，29，或30)；Xaa32是His，Pro，或Lys；Xaa33缺失，或是Pro，Thr，Glu，或Ala；Xaa34缺失，或是Pro，Arg，Met，Ala，hSer，hSer內(nèi)酯，Tyr，Leu，或1，4-二氨基丁酰內(nèi)酰胺；Xaa35缺失或是Pro，Glu，Ser，Ala，或Gly；Xaa36缺失或是Ala，Arg，或Ile；Xaa37缺失或是Arg，Trp，或3-(-2-萘基)-L-Ala；Xaa38缺失或是Ala或hSer或Xaa38-42是Thr Arg Ser Ala Trp；和Term是OR或NR2其中各R各自獨立地為H，(C1—C4)烷基或苯基(C1—C4)烷基；及其藥學(xué)上可接受的鹽。
另一方面，本發(fā)明包括如式(I)所示的、具有生理活性的hPTHrp(1—34)短同系物的多肽類似物Ala Val Ser Glu Xaa5Gln Leu Leu His Asp Xaa11Gly Xaa13Ser IleGln Asp Leu Xaa19Arg Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Term，其中
Xaa5是His或Ala；Xaa11和Xaa13各自獨立地為Lys，Arg，或Leu；Xaa19和Xaa21各自獨立地為Ala或Arg；Xaa22-31選自a)Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu xaa Lys Leu其中1 510Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO26)；b)Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu其中1 510Xaa是Glu，Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是分子量為100—10,000的聚(乙二醇甲基醚)殘基(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；1 510d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 510e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)；1 510Xaa32是His或Lys；Xaa33是Thr，Glu，或Ala；Xaa34是Ala，hSer，Tyr，或Leu；和Term是Gly Arg Arg，內(nèi)酯，OH或NR2，其中各R是H或(C1—C4)烷基；及其藥學(xué)上可接受的鹽(式I)。
本發(fā)明的另一個具體方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO26)的式(I)多肽，這些多肽在100°的<μH>超過0.45。本發(fā)明的一個更具體方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO26)、Xaa11和Xaa13都是Lys、和Xaa19和Xaa21都是Arg的式(I)多肽。
代表性的多肽包括，但并不限于
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO5)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO6)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO7)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSer NH2(SEQ ID NO8)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSerlac(SEQ ID NO9)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH(SEQ ID NO10)；和35Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
20 25 30Leu Lys Glu Leu NH2(SEQ ID NO11)。
本發(fā)明的又一個方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO26)、Xaa11和Xaa13都是Lys、以及Xaa19和Xaa21中一個為Arg而另一個為Ala的式(I)多肽。該亞類的代表性的多肽包括，但并不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO12)和Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO13)本發(fā)明的另一個具體方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO26)、Xaa11和Xaa13中一個為Leu而另一個為Lys、和Xaa19和Xaa21都是Arg的式(I)多肽。該亞類的代表性的多肽包括，但并不限于Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Ala Leu OH(SEQ ID NO14)本發(fā)明的另一個具體方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO27)的式(I)多肽，這些多肽在100°的<μH>超過0.50。本發(fā)明的進一步方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO27)、Xaa11和Xaa13都是Lys或都是Arg、和Xaa19和Xaa21都是Arg的式(I)多肽。該亞類代表性的多肽包括，但并不限于
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO15)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO16)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NOl7)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu20 25Lys(COCH2PEG2) Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO18)和30Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu20 25Lys(COCH2PEG5000) Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NOl9)30本發(fā)明的另一個具體方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO28)的式(I)多肽，這些多肽在100°的<μH>約為0.25。該亞類代表性的多肽包括，但并不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO；20)本發(fā)明的另一個具體方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO29)的式(I)多肽，這些多肽在100°的<μH>約為0.28。該亞類代表性的多肽包括，但并不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO21)本發(fā)明的另一個具體方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO30)的式(I)多肽，這些多肽在100°的<μH>約為0.29。該亞類代表性的多肽包括，但并不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO22)本發(fā)明的又一個方面包括如式(II)所示的、具有生理活性的bPTH(1—34)短同系物的多肽類似物Xaa1Val Ser Glu Ile Gln Xaa7Xaa8His Asn Leu Gly Lys His LeuXaa16Ser Xaa18Xaa19Arg Xaa21Xaa22-31His Asn Xaa34Term，其中Xaa1是Ser或Ala；Xaa7是Leu或Phe；Xaa8是Met或Nle；Xaa16是Asn或Ser；
Xaa18是Leu，Met，或Nle；Xaa19是Glu或Arg；Xaa21是Val或Arg；Xaa22-31選自(SEQ ID NO26，27，28，29，和30)；Xaa34是Phe或Tyr；Term是OH或NR2，其中每個R是H或(C1—C4)烷基；及其藥學(xué)上可接受的鹽(式II)。代表性的多肽包括，但并不限于Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu1 510 15Ser Ser Nle Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO23)和Ala Val Ser Glu lle Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu1 510 15Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO24)在本發(fā)明的又一方面，驚奇地發(fā)現(xiàn)，少于34個氨基酸的PTH和PTHrp的同系物和類似物也是有效的骨重塑劑。這些化合物具有下列通式Ala Val Ser Glu Xaa5Gln Leu Leu His Asp Xaa11Gly Xaa13Ser IleGln Asp Leu Xaa19Arg Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Term，代表性的多肽包括，但并不限于化合物41AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEKLHP-NH2(SEQ ID NO55)物理數(shù)據(jù)m.p.142.8—166.1℃[α]D25—53.80(c0.38，H2O)
FAB(C173H295N55O9)[M＋H]+3929AAAAsx2.0(2)Glx5.7(6)Serl.8(2)His3.0(3)Gly1.1(1)Ala0.9(1)Arg2.8(3)Val1.2(1)Ile0.9(1)Leu7.4(8)Lys4.4(4)Pro0.9(1)化合物42AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2(SEQ ID NO56)物理數(shù)據(jù)m.p.161.0—177.0℃[α]D25—61.97(c0.19，H2O)FAB(C167H88N52O48)[M＋H]+3792.0AAAAsx2.2(2)Glx5.9(6)Ser1.9(2)His2.1(2)Gly1.1(1)Ala1.0(1)Arg3.0(3)Val1.1(1)Ile1.0(1)Leu7.9(8)Lys4.3(4)Pro0.9(1)熟練技術(shù)人員知道，可以合成大量多肽類似物的改變形式。這些改變形式具有此處所述的類似物的有用性能，只要將在100°±20°范圍內(nèi)每個殘基的平均疏水矩大于約0.20的氨基酸序列插入位置(22—31)。多肽的經(jīng)典合成本發(fā)明的多肽可以用例如下列方法合成J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.，PierceChemical Co.，Rockford，Illinois(1984)和J.Meienhofer，Hor-monal Proteins and Peptides，Vol.2，Academic Press，NewYork，(1973)等的固相合成以及E.Schroder和K.Lubke，ThePeptides，Vol.l，Academic Press，New York，(1965)等的溶液合成。
一般，這些方法涉及向合成中的肽鏈依次添加被保護的氨基酸。通常，第一個氨基酸的氨基或羧基以及所有反應(yīng)性的側(cè)鏈都被保護。接著將保護的氨基酸連于惰性固體載體，或者用于溶液，然后在適合形成酰胺鍵的條件下加入被適當保護的序列中的下一個氨基酸。在所有所需的氨基酸都以適當?shù)男蛄邢噙B之后，除去保護基團和固體載體從而得到粗多肽。該多肽經(jīng)脫鹽和純化(最好是通過色譜法)，從而獲得最終產(chǎn)品。
一種制備小于約40個氨基酸的、具有生理活性的短多肽的優(yōu)選方法是固相多肽合成。在該方法中，α-氨基酸(Nα)官能團和任何反應(yīng)性的側(cè)鏈都用酸敏或堿敏(acid-or base-sensitive)基團保護。保護基團在形成肽鍵的條件下應(yīng)是穩(wěn)定的，同時又能被毫無困難地除去而不影響已形成的多肽鏈。合適的α-氨基保護基團包括，但并不限于叔-丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基(Cbz)、鄰-氯芐氧基羰基、二苯基異丙氧基羰基、叔-戊氧基羰基(Amoc)、異冰片氧基(isoborny-loxy)羰基、α，α-二甲基-3、5-二甲氧基芐氧基-羰基、鄰-硝基苯基亞磺?；?nitrophenylsulfenyl)、2-氰基-叔-丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等，優(yōu)選叔-丁氧基羰基(Boc)。合適的側(cè)鏈保護基團包括，但并不限于乙?；?、芐基(Bzl)、芐氧基甲基(Bom)、鄰-溴芐氧基羰基、叔-丁基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、2-氯芐基(Cl-z)、2，6-二氯芐基、環(huán)己基、環(huán)戊基、異丙基、新戊?；?、四氫吡喃-2-基、甲苯磺?；?Tos)、三甲基甲硅烷基、和三苯甲基。
在固相合成中，C-末端氨基酸被首先連于合適的樹脂載體。合適的樹脂載體是那些對逐步的縮合反應(yīng)和去保護反應(yīng)中的試劑和反應(yīng)條件呈惰性、而且不溶于所用介質(zhì)?？缮藤彽臉渲睦影ㄓ没钚曰鶊F改性的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂，例如氯甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、羥甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)等。優(yōu)選芐基化的、羥甲基化的苯基乙酰胺甲基(PAM)樹脂。當化合物的C末端為酰胺時，優(yōu)選的樹脂是對-甲基二苯甲基氨基-共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂。
可以通過在乙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等中作為銨鹽、銫鹽、三乙基銨鹽、1，5-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一碳-5-烯，四甲基銨鹽或類似鹽(最好是位于DMF中的銫鹽)的Nα保護的氨基酸，優(yōu)選Boc-氨基酸，與樹脂在高溫如約40—60℃，較佳為約50℃下反應(yīng)約12—72小時，較佳約48小時，而將其連于PAM樹脂。
可以在如二氯甲烷或二甲基甲酰胺，較佳為二氯甲烷之類的溶劑中，通過如N，N′-二異丙基碳化二亞胺(DIC)/1-羥基苯并三唑(HOBt)介導(dǎo)的偶連反應(yīng)，在約10—50℃，較佳為約25℃，反應(yīng)約2—24小時，較佳為約2小時而將Nα-Boc-氨基酸連于二苯甲基胺樹脂。
隨后的受保護氨基酸的連續(xù)偶連可以用本領(lǐng)域熟知的方法進行，典型地是通過自動肽合成儀。在用三乙胺或類似的堿中和之后，較佳地是加入約1.5—2.5倍摩爾過量的每種保護氨基酸，并且偶連反應(yīng)是在惰性的、非水性的、極性溶劑如二氯甲烷、DMF或其化合物(優(yōu)選二氯甲烷)中于室溫下進行。代表性的偶連劑是N，N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、N，N＇-二異丙基碳化二亞胺(DIC)或其他碳化二亞胺，它們可以單獨使用或者在1-羥基苯并三唑(HOBt)、O-?；?、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧代三(吡咯烷基)-鏻(PyBop)、N-羥基琥珀酰亞胺、其他N-羥基酰亞胺或肟存在下使用。也可以使用受保護的氨基酸的活性酯(例如對-硝基苯基，五氟苯基等)或?qū)ΨQ的酸酐。
在固相合成的最后，將全保護的肽從樹脂上除去。當與樹脂載體相連的鍵是芐酯類型時，對于具有烷基酰胺C-末端的肽，可以用烷基胺或氟代烷基胺進行氨解反應(yīng)而達到裂解；對于具有未取代的酰胺C-末端的肽，可以用例如氨/甲醇或氨/乙醇進行氨解反應(yīng)而達到裂解，這些反應(yīng)可以在約-10℃和50℃之間，較佳為約25℃下進行約12—24小時，較佳為約18℃。具有羥基C-末端的肽可以用HF裂解切斷或用其他強酸性去保護方式或者通過皂化反應(yīng)而裂解?；蛘撸梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)酯化從樹脂上除去肽，例如用甲醇進行轉(zhuǎn)酯化，然后再通過氨解或皂化而進行。被保護的肽可以通過硅膠色譜法純化。
可以使用下列方法將側(cè)鏈保護基團從肽上去除用例如無水液態(tài)氟化氫在苯甲醚或其他碳鎓離子清除劑存在下處理氨解產(chǎn)物，用氟化氫/吡啶復(fù)合物進行處理，用三(三氟乙?；?硼和三氟乙酸進行處理，用氫氣和碳上的鈀或聚乙烯基吡咯烷酮進行還原，或者用液態(tài)氨中的鈉進行還原，最好是用液態(tài)氟化氫和苯甲醚處理。這些反應(yīng)是在約-10℃和10℃之間，較佳約0℃進行約15分鐘至2小時，較佳為約1.5小時。
對于在二苯甲基胺樹脂上的肽，從樹脂上裂解反應(yīng)和去保護步驟可以用上述的液態(tài)氟化氫和苯甲醚合并為一個步驟。
溶液可以脫鹽(例如用BioRad AG-3_陰離子交換樹脂)，而肽可以用下列方法中一種或幾種進行一系列的色譜步驟而得以純化在弱堿性乙酸鹽形式樹脂上進行離子交換；在非衍生型的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)例如Amberlite_XAD上進行疏水吸附色譜；硅膠吸附色譜；在羧甲基纖維素上進行離子交換色譜；在例如Sephadex_G—25上進行分配色譜；逆流分配；或高效液相色譜(HPLC)，尤其是在辛基-或十八烷基甲硅烷基氧化硅(ODS)鍵合相柱上的反向高效液相色譜。
因此，本發(fā)明另一方面涉及制備多肽及其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，這些方法包括在合適的樹脂載體上依次縮合保護的氨基酸，去除保護基團和樹脂載體，以及純化產(chǎn)物從而獲得PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物、尤其是H(1-34)和PTHrp(1-34)的類似物，其中位于位置(22—31)的氨基酸形成如上所述的兩親性α-螺旋肽序列。
多肽的重組合成另外，本發(fā)明的多肽的制備也可以通過對所需多肽的編碼基因進行克隆和表達。在該方法中，制備含有所需DNA序列的質(zhì)粒，然后將其插入合適的宿主微生物，典型地為細菌如大腸桿菌，或酵母如釀酒酵母。誘導(dǎo)宿主微生物產(chǎn)生多拷貝的質(zhì)粒以及多拷貝的本發(fā)明多肽類似物的編碼cDNA。
首先，設(shè)計選定PTH or PTHrp的合成基因編碼，用簡便的限制性酶切位點來協(xié)助隨后的改變。可以使用Mullis在U.S.專利No.4,683,195 and 4,683,202中所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來擴展序列。
然后分離擴展的合成基因并將其連于合適的質(zhì)粒，例如Trp LE質(zhì)粒，在該質(zhì)粒中可以串聯(lián)式地插入4個拷貝的基因。Trp LE質(zhì)粒的制備在美國專利No.4,738,921以及歐洲專利出版物No.0212532中有描述。Trp LE質(zhì)粒通常比Trp E質(zhì)粒產(chǎn)生8—10多倍的蛋白質(zhì)。然后多拷貝基因可以在合適的宿主中如大腸桿菌或釀酒酵母中進行表達。
在此處使用的具體表達載體是含有下列單元的Trp LE18 Prot(Ile3，Pro5)含有氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制質(zhì)粒起點的pBR322片段(EcoRI-BamHI)；含有trp啟動子和trpE基因的EcoRI-SacII片段；HIV蛋白酶(Ile3，Pro5)基因片段(SacII-HindIII)；bGRF基因片段(HindIII-BamHI)；和來自大腸桿菌rpoc基因的轉(zhuǎn)錄終止子。HIV蛋白酶和bGRF基因片段不是至關(guān)重要的，如果需要可以被其他編碼序列替換。
表達的融合蛋白多聚體在細胞內(nèi)穩(wěn)定的包涵體中積聚，可以通過離心將其與其他細胞蛋白質(zhì)分開。分離的然后蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)變成單體PTH or PTHrp類似物，并且可以用陽離子交換和/或反向HPLC進行純化。
對于熟練的技術(shù)人員而言，其他的克隆、擴展、表達和純化方法是顯而易見的。代表性的方法公開于Maniatis，et al.，MolecularCloning，A LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring HarborLaboratory(1989)中。應(yīng)用和施用本發(fā)明的多肽能用于預(yù)防和治療各種哺乳動物骨質(zhì)喪失癥狀。尤其，已表明本發(fā)明的化合物能用于預(yù)防和作為治療劑治療人的骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)減少。
通常，本發(fā)明的多肽或其鹽的施用量為每天約0.002—1微克/千克體重，較佳為每天約0.04—0.2微克/千克體重。對于一個50千克體重的女性，每天的活性成分劑量為約0.1—50微克，較佳為約2.0—10微克。對于其他的哺乳動物，例如馬、狗、和牛，需要更高的劑量。該劑量可以以常規(guī)的藥物組合物形式，按需要通過單次施用、通過多次施用或者通過控釋形式而供藥從而達到最佳的藥效，其中較佳的是每天注射一次或多次。
確切劑量和組合物以及最佳給藥方案的選擇受許多因素的影響，特別是選定多肽的藥理性質(zhì)、待治療的病癥的性質(zhì)和嚴重程度以及病人的身體狀況和精神敏度(mental acuity)。
代表性的給藥方案包括口服、胃腸外給藥(包括皮下、肌內(nèi)和靜脈注射)、直腸給藥、口腔給藥(包括舌下給藥)、肺部給藥、經(jīng)皮和鼻內(nèi)給藥。
藥學(xué)上可接受的鹽保留了原多肽的有用的生物活性而不產(chǎn)生毒副作用。這種鹽的例子是(a)與無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成鹽；與有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、雙羥萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的鹽；(b)與多價金屬陽離子如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等，或與N，N＇-二芐基乙二胺或乙二胺形成的有機陽離子形成的堿加成鹽；或(c)(a)和(b)的結(jié)合形式如單寧酸鋅鹽等。
本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物，它們含有本發(fā)明的多肽、或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性組份以及藥學(xué)上可接受的、無毒的載體。如上所述，制備的此組合物可以用于胃腸外給藥(皮下、肌內(nèi)和靜脈注射)，尤其是以液態(tài)溶液或混懸液形式；用于口服或口腔給藥，尤其是以片劑或膠囊劑聚形式；用于肺和鼻內(nèi)給藥，尤其是以粉劑、滴鼻劑或氣霧劑形式；以及用于直腸或經(jīng)皮給藥。
組合物可以方便地以單元劑量形式施用，而且可以用制藥領(lǐng)域中任何熟知的方法進行制備，例如在Remington＇s PharmaceuticalSciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA.，(1985)中所述的方法。對于胃腸外給藥的處方，可以含有無菌水或生理鹽水、亞烷基二醇(alkylene glycols)如丙二醇、聚亞烷二醇如聚乙二醇、植物油、氫化萘等作為賦形劑。對于口服給藥，處方可以通過添加膽鹽或?；鈮A增加藥效。用于鼻內(nèi)給藥的制劑可以是固體的并且含有賦形劑例如乳糖或葡聚糖，或者可以是水性或油性溶液以滴鼻劑或計量噴霧劑的形式施用。對于口腔給藥，典型的賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預(yù)膠凝淀粉等。
當為鼻內(nèi)給藥進行配制時，可以通過添加酸性表面活性劑例如谷氨膽酸、膽酸、牛磺膽酸、乙膽酸(ethocholic acid)、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氫膽酸、谷氨脫氧膽酸、環(huán)糊精等增加鼻粘膜吸收，添加量約為0.2—15重量百分比，較佳為約0.5—4重量百分比，最佳為約2重量百分比。
通過含有足夠量有效成分的控釋系統(tǒng)(對于所需釋放時期而言)單次給藥，可以在長時間內(nèi)例如一周至一年中將本發(fā)明的化合物供給服藥者。各種控釋系統(tǒng)例如單層或儲庫型微囊、儲庫型植入劑、滲透泵、囊泡、膠囊、脂質(zhì)體、透皮貼劑，離子電滲器以及其他注射劑型都可以用于該目的。將施用局限于需要活性組份的部位是某些控釋給藥器的另一特征，對于治療某些疾病這是有利的。
一種控釋制劑是將多肽或其鹽分散或包裹于緩慢降解的、無毒的、非抗原性的聚合物如共聚(乳酸/乙醇酸)中，如在Kent，Lewis，Sanders，和Tice的美國專利4,675,189中開創(chuàng)性的工作中所述的那樣。也可以將化合物或更佳其相對不溶的鹽配制入膽固醇或其他脂類基質(zhì)小丸中，或硅塑料基質(zhì)植入劑中。其他的緩釋劑、儲庫型植入劑或可注射制劑是熟練技術(shù)人員所熟知的。參見例如，Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinsoned.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978，和R.W.Baker，Controlled Release of Biologically Active Agents，John Wiley &Sons，New York，1987。
下列的具體實施例是用于闡述本發(fā)明代表性化合物的合成和測試，它們并不用于限制本發(fā)明的范圍。在實施例中，“m.p.”表示熔點，“[α]D25”是在25℃時，在所示溶劑、給定濃度下的旋光度，“FAB”是快原子轟擊質(zhì)譜，和“AAA”是氨基酸分析，其中在測量值后括號中的是預(yù)期值。氨基酸分析在Hewlett-Packard AminoQuant Ana-lyzer上按照制造商建議的方案進行。一級氨基酸用鄰苯二醛進行衍生，二級氨基酸用Fmoc進行衍生。對衍生氨基酸進行熒光檢測定量分析。被保護的氨基酸得自Applied Biosystems Inc.(Foster City，CA)。
實施例I采用固相合成方法，在4-甲基二苯甲基胺樹脂上，用AppliedBiosystems Model 430A肽自動合成儀合成0.5mmol左右的化合物1(SEQ ID NO7)。α-氨基用叔丁基羰基(Boc)保護。側(cè)鏈保護基團如下對Asp，Glu，and Ser用芐基(Bzl)；對Arg用甲苯磺酰基(Tos)；對His用芐氧基甲基(Bom)；對Lys用2-氯芐基(Cl-z)。按Stewart和Young(出處如上)的方法，用N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)/1-羥基苯并三唑(HOBt)將這些氨基酸依次相連。將每個氨基酸偶連之后，用乙酸酐和二異丙基乙胺在N-甲基吡咯烷酮中的混合物使肽乙酰化。用無水HF(25mL)在苯甲醚存在下，在-10℃處理30分鐘和0℃處理60分鐘，從而將合成的肽從樹脂上裂解并且同時脫去側(cè)鏈保護基團。真空蒸去HF之后，用無水醚洗滌殘留物，粗肽用10％乙酸進行萃取。將10％乙酸萃取物凍干，得到900毫克粗產(chǎn)品。用中等壓力的ODS反向柱色譜，采用0.1％TFA中22—45％CH3CN梯度純化肽。產(chǎn)品被洗脫出3個部分，濃縮和凍干后，得到130毫克，純度＞98％的白色固體。
化合物1AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO7)物理數(shù)據(jù)m.p.150-159℃[α]D25-34.88*(c0.16，H2O)FAB(C175H300N56O51)[M＋H]＋4005.5AAAAsp，1.9(2)；Glu，5.6(6)；Ser，1.6(2)；His，2.7(3)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.8(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.3(8)；Lys，4.0(4).
類似地，制備化合物2，5—18，和21—70，并確定這些化合物的特性。其中對于合成末端為羥基的多肽，按需要替換PAM樹脂。
化合物2AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH(SEQ ID NO6)物理數(shù)據(jù)m.p.154—170℃ [α]D25-49.35°(c0.46，H2O)FAB(C175H301N57O50)[M＋H]+4005.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，1.9(2)；Arg，3.0(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8)；Lys，4.2(4).
化合物5AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO15)物理數(shù)據(jù)m.p.147-165℃[α]D25-49.17°(c0.66，H2O)FAB(C175H299N59O52)[M＋H]+4061AAAAsp，2.1(2)；Gly，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，5.0(5)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.7(8)；Lys，1.9(2).
化合物6AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO16)物理數(shù)據(jù)m.p.150-170℃[α]D25-48.65°(c0.54，H2O)FAB(C175H299N63O52)[M＋H]+4118.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.2(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，6.9(7)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8).
化合物7AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO17)物理數(shù)據(jù)m.p.177-182℃[α]D25-46.17°(c0.14，H2O)FAB(C176H304N64O50)[M＋H]+4117AAAAsp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，6.7(7)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Lys，7.7(8)；Lys，0.9(1).
化合物8AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH(SEQ ID NO5)物理數(shù)據(jù)m.p.147-165℃ [α]D25-49.17°(c0.66，H2O)FAB(C176H305N59O49)[M＋H]+4033.0AAAAsp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.8(2)；His，2.7(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.9(4)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.9(8)；Lys，4.0(4).
化合物9AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR-OH(SEQ 1D NO10)物理數(shù)據(jù)m.p.158-160℃[α]D25-44.76°(c0.1，H2O)FAB(C189H326N64O55)[M]+4375.0AAAAsp，2.0(2)；Glu，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，2.3(2)；Thr，1.0(1)；Ala，1.9(2)；Arg，5.0(5)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8)；Lys，4.3(4).
化合物10AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH(SEQ ID NO14)物理數(shù)據(jù)m.p.170-175℃[α]D25-31.59°(c0.54，H2O)FAB(C174H300N52O51)[M＋H]+3936.0AAAAsp，2.0(2)；Glu，6.0(6)；Ser，1.8(2)；His，2.0(2)；Gly，1.2(1)；Ala，3.0(3)；Arg，2.8(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.9(10)；Lys，3.0(3).
化合物11AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH2(SEQ ID NO11)物理數(shù)據(jù)m.p.172-174℃[α]D25-43.29°(c0.2，H2O)FAB(C179H311N55O52)[M＋H]+4065.8
AAAAsp，2.2(2)；Glu，7.7(7)；Ser，1.7(2)；His，2.0(2)；Gly，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.3(9)；Lys，5.1(5).
化合物12AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH2(X＝Nle，SEQ ID NO23)物理數(shù)據(jù)m.p.178℃ [α]D25-36.88°(c0.4，H2O)FAB(C182H295N50O51)[M＋H]+4001.6AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.5(6)；Ser，2.7(3)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Ala，1.0(1)；Arg，1.0(1)；Tyr，0.8(1)；Val，2.0(2)；Phe，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu＋Nle，8.5(7＋2)；Lys，3.1(3).
化合物13AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH2(X＝Nle，SEQ ID NO24)物理數(shù)據(jù)m.p.260℃ [α]D25-37.02°(c0.2，H2O)FAB(C184H304N56O49)[M＋H]+4084AAAAsp，2.1(2)；Glu，5.5(5)；Ser，2.6(3)；His，3.1(3)；Ala，1.0(1)；Gly，1.1(1)；Arg，3.2(3)；Tyr，1.0(1)；Val，1.0(1)；Phe，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.0(9)；Lys，3.0(3).
化合物14AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH2(SEQ ID NO20)物理數(shù)據(jù)m.p.190-225℃ [α]D25-56.58°(c0.36，H2O)FAB(C161H272N54O49)[M＋H]+3747.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，4.9(5)；Ser，1.7(2)；His，2.6(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；
Ala，7.6(7)；Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，6.6(6)；Lys，1.9(2).
化合物15AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO12)物理數(shù)據(jù)m.p.170-180℃ [α]D25-48.19°(c0.2，H2O)FAB(C172H293N53O51)[M＋H]+3919.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.7(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.0(3)；Arg，2.1(2)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.4(4).
化合物16AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO13)物理數(shù)據(jù)m.p.190-195℃ [α]D25-50.50°(c0.4，H2O)FAB(C172H293N53O51)[M＋H]+3919.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.0(6)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.0(3)；Arg，2.1(2)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4).
化合物17AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH2(SEQ ID NO21)物理數(shù)據(jù)m.p.195-204℃ [α]D25-67.11°(c0.3，H2O)FAB(C163H280N54O50)[M＋H]+3796.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，2.9(3)；Ser，6.8(7)；His，3.1(3)；Gly，1.2(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.0(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，2.0(2).
化合物18
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH2(SEQ ID NO22)物理數(shù)據(jù)m.p.200-207℃ [α]D25-60.26°(c0.6，H2O)FAB(C174H284N56O50)[M＋H]+3960.0AAAAsp，2.9(3)，Glu，3.5(4)；Ser，1.4(2)；His，2.6(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，4.0(4)；Arg，3.0(3)；Tyr，0.9(1)；Val，1.9(2)；Phe，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，3.6(4)；Lys，4.1(4).
化合物21AVSEIQFLHNLGKHLSSLRRRELLEKLLEKLHNY-NH2(SEQ ID NO35)物理數(shù)據(jù)m.p.148-155℃ [α]D25-45.97(c0.26，H2O)FAB(C184H304N56O49)[M＋H]+4084AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.0(5)；Ser，2.7(3)；His，3.0(3)；Gly，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.1(3)；Tyr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu 9.3(9)；Lys，3.2(3).
化合物22AVSEIQFLHNLGKHLSSLRRRELLEKLLEKLHNX-NH2(SEQ ID NO36)(X＝高絲氨酸)物理數(shù)據(jù)m.p.69.4-128℃ [α]D25-43.93(c0.15，H2O)FAB(C179H302N56O49)[M＋H]+4022.9AAAAsx，2.0(2)；Glx，4.9(5)；Ser，2.6(3)；His，2.8(3)；Gly，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.0(1)；Phe，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.8(9)；Lys，3.4(3)；化合物23
AVSEIQFLHNKGKHLSSLRRRELLEKLLEKLHNX-NH2(SEQ ID NO37)(X＝高絲氨酸)物理數(shù)據(jù)m.p.87.1-142.1℃[α]D25-52.14(c0.41，H2O)FAB(C179H303N57O49)[M＋H]+4038AAAAsx，2.1(2)；Glx，4.9(5)；Ser，2.7(3)；His，2.8(3)；Gly，1.0(1)；hSer，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.9(8)；Lys，3.7(4).
化合物24AVSEHQLLHDKGKSIQDLKLKELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO38)物理數(shù)據(jù)m.p.175-182℃ [α]D25-49.99(c0.47，H2O)FAB(C175H299N49O51)[M＋H]+3906.5AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.5(6)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.1(9)；Lys，6.5(6).
化合物25AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-NH2(SEQ ID NO39)物理數(shù)據(jù)m.p.136.5-153.5℃ [α]D25-32.57(c0.13，H2O)FAB(C175H300N60O51)[M＋H]+4060.8AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，5.2(5)；Val，1.1(1)；Ile，1.1(1)；Leu，8.4(8)；Lys，2.2(2).
化合物26AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTAP-OH(SEQ ID NO40)物理數(shù)據(jù)m.p.125.8-127.2℃ [α]D25-54.62(c0.23，H2O)FAB(C180H306N60O53)[M＋H]+4158.0AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.8(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，5.1(5)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，2.1(2)；Pro，1.1(1).
化合物27AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTAGRR-OH(SEQ ID NO41)物理數(shù)據(jù)m.p.106-137.3℃ [α]D25-39.55(c0.67，H2O)FAB(C189H326N68O55)[M＋H]+4430.5AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.6(2)；His，2.7(3)；Gly，2.2(2)；Thr，1.0(1)；Ala，1.8(2)；Arg，7.3(7)；Val，0.8(1)；lle，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，2.1(2).
化合物28AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTAGRRX-NH2(SEQ ID NO42)(X＝高絲氨酸)物理數(shù)據(jù)m.p.80℃ [α]D25-48.64(c0.O9，H2O)FAB(C193H334N70O56)[M＋H]+4530.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.1(6)；Ser，1.7(2)；His，3.0(3)；Gly，1.9(2)；hSer，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，7.2(7)；Val，0.8(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.4(8)；Lys，2.1(2).
化合物29AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTY-NH2(SEQ ID NO43)物理數(shù)據(jù)m.p.160-172℃[α]D25-49.85(c0.34，H2O)FAB(C181H304N56O52)[M＋H]+4096.9AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.0(3)；Tyr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.7(8)；Lys，4.4(4).
化合物30AVSEHQLLHDKGYSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO44)物理數(shù)據(jù)m.p.130-171℃[α]D25-40.65(c0.34，H2O)FAB(C178H297N55O52)[M＋H]+4039.4AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，1.8(2)；His，3.4(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，2.9(3)；Tyr，0.8(1)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.9(8)；Lys，3.4(3).
化合物31AVSEHQLLHDKG℃SIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO45)物理數(shù)據(jù)m.p.140-160℃[α]D25-44.48(c0.25，H2O)FAB(C172H293N55O51S1)[M＋H]+3979AAAAsx＋Cys，3.0(2＋1)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，3.0(3)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.5(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.3(3).
化合物32AVSEHQLLHDKGXSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO46)
(X＝Cys(CH2ONH(CH2)2NH(生物素基)))物理數(shù)據(jù)m.p.(未測出) [α]D25(未測出)FAB(C186H316N59O54S2)[M＋H]+4306.6AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.8(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.3(3)；Lys，3.3(3).
化合物33AVSEHQLLHDKGXSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO47)(X＝Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1|苯并吡喃-4-乙?；?)物理數(shù)據(jù)m.p.135-205℃][α]D25-26.92(c0.104，50％HOAc水溶液)FAB(C188H311N57O54)[M＋H]+4233AAAAsx，1.9(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.7(2)；His，3.2(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.2(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.2(8)；Lys，4.5(4).
化合物34AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAG-OH(SEQ ID NO48)物理數(shù)據(jù)m.p.92.1-146.6℃ [α]D25-40.76(c0.34，H2O)FAB(C177Hc302N56O53)[M＋H]+4062.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Gly，2.2(2)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4).
化合物35AVSXHQLLHZKGKSIQZLRRRXLLXKLLXKLHA-OH(SEQ ID NO49)
(X＝Glu(OCH3)；Z＝Asp(OCH3))物理數(shù)據(jù)m.p.(未測出)[α]D25-21.96(c0.132，H2O)FAB(C181H311N55O52)[M＋H]+4089.0AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.8(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.2(4).
化合物36AVSXHQLLHZKGKSIQZLRRRXLLXKLLXKLHA-OCH3(SEQ ID NO50)(X＝Glu(OCH3)；Z＝Asp(OZCH3))物理數(shù)據(jù)m.p.(未測出) [α]D25-46.80(c0.07，H2O)FAB(C182H313N55O52)[M＋H]+4103AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.4(2)；His，3.0(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.1(1)；Ala，1.7(2)；Arg，3.2(3)；Val，0.6(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.1(4).
化合物37AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-OH(SEQ ID NO51)(X＝高絲氨酸)物理數(shù)據(jù)m.p.(未測出) [α]D25(未測出)FAB(C176H301N55O53)[M＋H]+4035.1AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，2.0(2)；His，3.1(3)；Gly，0.8(1)；hSer，0.8(1)；Thr，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.3(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.8(4).
化合物38
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAP-OH(SEQ ID NO52)物理數(shù)據(jù)m.p.152.1-186.5℃ [α]D25-55.91(c0.33，H2O)FAB(C180H306N56O53)[M＋H]+4102.6AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.9(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.7(8)；Lys，4.3(4).
化合物39AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTP-OH(SEQ ID NO53)物理數(shù)據(jù)m.p.120-148.2℃ [α]D25-52.78(c0.47，H2O)FAB(C177H301N55O52)[M＋H]+4031.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，1.8(2)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，2.9(3)；Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.6(3)；Pro，0.9(1).
化合物40AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTP-NH2(SEQ ID NO54)物理數(shù)據(jù)m.p.133.9-155.1℃[α]D25-54.22(c0.37，H2O)FAB(C177H302N56O51)[M＋H]+4030.7AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.9(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，0.9(1)；Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.1(1)；Leu，7.8(8)；Lys，4.2(4)；Pro，0.9(1).
化合物41AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHP-NH2(SEQ ID NO55)物理數(shù)據(jù)m.p.142.8-166.1℃ [α]D25-53.80(c0.38，H2O)FAB(C173H295N55O49)[M＋H]+3929AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Gly，1.1(1)；Ala，0.9(1)；Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.4(8)；Lys，4.4(4)；Pro，0.9(1).
化合物42AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLP-NH2(SEQ ID NO56)物理數(shù)據(jù)m.p.161.0-177.0℃ [α]D25-61.97(c0.19，H2O)FAB(C167H288N52O48)[M＋H]+3792.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.9(2)；His，2.1(2)；Gly，1.1(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.9(8)；Lys，4.3(4)；Pro，0.9(1).
化合物43AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTRSAW-OH(SEQ ID NO57)物理數(shù)據(jù)m.p.181-202℃[α]D25-45.14(c0.19，H2O)FAB(C195H326N62O56)[M＋H]+4435.2AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.8(6)；Ser，2.8(3)；His，2.8(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，3.7(4)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.3(4)；Trp，0.9(1).
化合物44AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO58)物理數(shù)據(jù)m.p.130-132.2℃ [α]D25-46.66(c0.195，H2O)FAB(C216H365N81O62)[M＋H]+5088.8AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.0(6)；Ser，2.7(3)；His，3.0(3)；Gly，2.2(2)；Thr，2.1(2)；Ala，3.0(3)；Arg，10.5(10)；Val，0.9(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Trp，1.0(1).
化合物45AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTAGRRTRSAW-NH2(SEQ ID NO59)物理數(shù)據(jù)m.p.158-174℃ [α]D25-43.57(c0.53，H2O)FAB(C216H366N82O61)[M＋H]+5087.4AAAAsx，1.9(2)；Glx，5.6(6)；Ser，2.6(3)；His，3.3(3)；Gly，2.1(2)；Thr，2.0(2)；Ala，2.9(3)；Arg，10.1(10)；Val，0.9(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.3(8)；Trp1.1(1).
化合物46AVSEHQLLHDRGXSIQDLRRRELLERLLERLHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO60)(X＝Lys(二氫肉桂酰基))物理數(shù)據(jù)m.p.165.4-175.2℃ [α]D25-40.43(c0.20，H2O)FAB(C225H374N80O62)[M＋H]+5191AAAAsx，2.1(2)，Glx，6.3(6)；Ser，2.8(3)；His，3.2(3)；Gly，2.1(2)，Thr，2.0(2)；Ala，3.2(3)；Arg，9.9(9)；Val，1.0(1)，Ile，0.9(1)；Leu，8.6(8)；Lys，1.1(1)；Trp，1.1(1).
化合物47AVSEIQFXHNLGKHLSSXTRSAWLRKKLQDVHNY-NH2(SEQ ID NO61)(X＝正亮氨酸)物理數(shù)據(jù)m.p.140-160℃ [α]D25-56.88(c0.16，H2O)FAB(C180H287N55O58)[M＋H]+3989.8AAAAsx，3.0(3)；Glx，2.9(3)；Ser，3.7(4)；His，2.8(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.0(2)；Tyr，1.0(1)；Val，1.7(2)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu＋Nle 5.8(2＋4)；Lys，3.4(3)；Trp，1.1(1).
化合物48AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTMA-NH2(SEQ ID NO62)物理數(shù)據(jù)m.p.140-210℃[α]D25-47.75(c0.178，H2O)FAB(C180H309N57O52S1)[M＋H]+4135.0AAAAsx，2.3(2)；Glx，6.6(6)；Ser，1.4(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.1(3)；Val，0.9(1)；Met，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.8(8)Lys，4.4(4).
化合物49AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX(SEQ ID NO63)(X＝1，4-二氨基丁內(nèi)酰胺)物理數(shù)據(jù)m.p.161-181℃ [α]D25-48.38(c0.25，H2O)FAB(C176H300N56O51)[M＋H]+4016.8AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.7(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，2.9(3)；Val，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，3.8(4)化合物50AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO64)物理數(shù)據(jù)m.p.136.5-156.8℃ [α]D25-49.89(c0.24，H2O)FAB(C182H300N56O49)[M＋H]+4056.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，5.0(5)；Ser，1.9(2)；His，3.3(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)Ala，2.1(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.0(1)；Phe，2.0(2)；Ile，0.9(1)；Leu，7.2(7)Lys，3.5(4).
化合物51AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLHKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO65)物理數(shù)據(jù)m.p.80.7-141.0℃ [α]D25-55.38(c0.23，H2O)FAB(C176H300N58O49)[M＋H]+4012.8AAAAsx，2.2(2)；Glx，4.9(5)；Ser，1.8(2)；His，4.3(4)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.9(4).
化合物52AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEHLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO66)物理數(shù)據(jù)m.p.134.3-157.9℃ [α]D25-50.72(c0.45，H2O)FAB(C175H295N57O51)[M＋H]+4012.8AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.8(2)；His，4.2(4)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.1(3).
化合物53AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLIAKLHTA-NH2(SEQ ID NO67)物理數(shù)據(jù)m.p.142.7-159.8℃ [α]D25-54.01(c0.21，H2O)FAB(C173H298N56O49)[M＋H]+3946.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，4.9(5)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.1(3)；Arg，3.1(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.9(2)；Leu，7.0(7)；Lys，4.3(4).
化合物54AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEEIHTA-NH2(SEQ ID NO68)物理數(shù)據(jù)m.p.138-185℃ [α]D25-50.17(c0.14，H2O)FAB(C174H295N55O53)[M＋H]+4005AAAAsx，2.2(2)；Glx，7.1(7)；Ser，1.7(2)；His，2.8(3)；G ly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.7(2)；Leu，7.1(7)；Lys，2.7(3).
化合物55AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NHCH2CH3(SEQ ID NO69)(X＝高絲氨酸)物理數(shù)據(jù)
m.p.(未測出) [α]D25(未測出)FAB(C178H306N56O52)[M＋H]+4063.0AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.8(6)；Ser，1.7(2)；His，3.1(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.4(8)；Lys，3.7(4)；hSer，0.9(1).
化合物56AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NHCH2CH2C6H5(SEQ ID NO70)(X＝高絲氨酸)物理數(shù)據(jù)m.p.(未測出) [α]D25(未測出)FAB(C184H310N56O52)[M＋H]+4138.8AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.1(4)；hSer，0.9(1).
化合物57 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO71)物理數(shù)據(jù)m.p.142.5-163.5℃[α]D25-34.31(c0.17，H2O)FAB(C175H298N56O50)[M＋H]+3986.4AAAAsx，1.9(2)；Glx，5.9(6)；Ser.1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.0(3)；Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.0(4).
化合物58AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTRSAW-NH2(SEQ ID NO72)物理數(shù)據(jù)m.p.158-163℃[α]D25-46.06(c0.17，H2O)FAB(C195H327N63O55)[M＋H]+4434.8AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，2.7(3)；His，3.1(3)；Gly，1.0(1)；Ala，1.8(2)；Arg，4.0(4)；Thr，0.9(1)；Val，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.9
(4)；Trp，1.0(1).
化合物59AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTRSAX-OH(SEQ ID NO73)(X＝Nal(2)＝3-(2-萘基)-L-丙氨酸)物理數(shù)據(jù)m.p.156-162℃ [α]D25-44.44(c0.189，H2O)FAB(C197H328N62O55)[M＋H]+4445.6AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.5(6)；Ser，2.8(3)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，4.0(4)；Thr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4)；Nal，1.1(1).
化合物60AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTASAW-OH(SEQ ID NO74)物理數(shù)據(jù)m.p.159-164℃ [α]D25-50.94(c0.29，H2O)FAB(C192H320N60O55)[M＋H]+4349.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，2.7(3)；His，3.2(3)；Gly，1.0(1)；Ala，3.1(3)；Arg，2.8(3)；Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.6(8)；Lys，4.0(4)；Trp，1.0(1).
化合物61AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAEIRA-OH(SEQ ID NO75)物理數(shù)據(jù)m.p.155-210℃ [α]D25-46.15(c0.12，H2O)FAB(C195H334N62O58)[M＋H]+4475.8AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.9(7)；Ser，1.7(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Ala，3.1(3)；Arg，4.0(4)；Thr，0.9(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.9(2)；Leu，8.1(8)；Lys，4.1(4).
化合物62AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAEIR-OH(SEQ ID NO76)物理數(shù)據(jù)
m.p.186-218℃ [α]D25-52.73(c0.265，H2O)FAB(C192H329N61O57)[M＋H]+4404.4AAAAsx，2.0(2)；Glx，6.6(7)；Ser，1.9(2)；His，3.4(3)；Gly，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.8(4)；Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.7(2)；Leu，7.9(8)；Lys，4.0(4).
化合物63AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAEI-OH(SEQ ID NO77)物理數(shù)據(jù)m.p.169-205℃ [α]D25-50.78(c0.51，H2O)FAB(C186H317N57O56)[M＋H]+4248.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.8(7)；Ser，1.8(2)；His，3.3(3)；Gly，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.0(3)；Thr，1.0(1)；Val，1.0(1)；Ile，1.8(2)；Leu，7.8(8)；Lys，3.6(4).
化合物64AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAE-OH(SEQ ID NO78)物理數(shù)據(jù)m.p.199-205℃ [α]D25-52.47(c0.41，H2O)FAB(C180H306N56O55)[M＋H]+4135.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，6.6(7)；Ser，1.9(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，2.9(3)；Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，3.8(4).
化合物65AVSEIQFX1HNKGKHLSSX1ERVEWLRKKLQDVHNX2(SEQ ID NO79)(X1＝L-正亮氨酸；X2＝高絲氨酸內(nèi)酯)物理數(shù)據(jù)m.p.166-176℃ [α]D25-52.22(c0.25，H2O)FAB(C180H288N54O50)[M＋H]+4008.6AAAAsx，3.1(3)；Glx，4.8(5)；Ser，2.9(3)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Ala，1.1(1)；Arg，2.0(2)；Val，2.7(3)；Phe，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu＋Nle5.9(4＋2)；Lys，2.8(3).
化合物66
SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO80)物理數(shù)據(jù)m.p.134.2℃ [α]D25-48.12(c0.36，H2O)FAB(C167H286N54O49)[M＋H]+3834.4AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.0(1)；Arg，2.8(3)；Ile，0.9(1)；Leu，7.4(8)；Lys，4.3(4).
化合物67LLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO81)物理數(shù)據(jù)m.p.128.5-184.5℃[α]D25-6.53(c0.69，MeOH)FAB(C148H259N47O41)[M＋H]+3353AAAAsx，2.0(2)；Glx，4.1(4)；Ser，0.9(1)；His，2.1(2)；G ly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，4.2(4).
化合物68LHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO82)物理數(shù)據(jù)m.p.165-210℃[α]D25-36.05(c0.12，H2O)FAB(C142H248N46O40)[M＋H]+3239.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，3.9(4)；Ser，0.9(1)；His，1.9(2)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，2.9(3)；Ile，0.9(1)；Leu，6.8(7)；Lys，4.2(4).
化合物69SEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO83)物理數(shù)據(jù)m.p.150-210℃[α]D25-18.0(c0.64，H2O)FAB(C208H351N79O60)[M＋H]+4918.6AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.2(6)；Ser，2.8(3)；His，3.1(3)；Gly，2.2(2)；Thr，2.2(2)；Ala，2.2(2)；Arg，10.4(10)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Trp，1.1(1).
化合物70
LLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO84)物理數(shù)據(jù)m.p.150-210℃[α]D25-41.70(c0.36，H2O)FAB(C189H324N72O52)[M＋H]+4437.14AAAAsx，2.1(2)；Glx，4.1(4)；Ser，1.9(2)；His，2.0(2)；Gly，2.1(2)；Thr，2.0(2)Ala，2.1(2)；Arg，9.7(10)；Ile，0.9(1)；Leu，7.4(8).
實施例II按照實施例I的步驟制備和純化[Met34，Ala35]化合物1，AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEK-LLEKLHTMA-NH2，(SEQ ID NO25)。并用如下方法將該多肽轉(zhuǎn)變成高絲氨酸內(nèi)酯。將純化的肽(160毫克)溶解于44％甲酸(4毫升)中。將該溶液于0℃與預(yù)先混合的、溴化氰(700毫克)和苯酚(1.6毫克)在44％甲酸(4毫升)的溶液合并。溶液在0℃攪拌2小時，然后在室溫下攪拌2小時。產(chǎn)物的形成用HPLC(Vydac_C—18，300埃，4.6×250mm，流速L2mL/min，0.1％TFA中梯度為25—45％乙腈，10分鐘)監(jiān)測。反應(yīng)在4小時內(nèi)完成。一半樣品被濃縮并且用制備性RP-HPLC(Vydac_C—18，0.1％TFA中梯度為25-45％乙腈)。收集高絲氨酸內(nèi)酯肽部分并凍干，得到28毫克純度＞95％的白色固體，即化合物4。
化合物4AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX(X＝hSerlac，SEQ ID NO9)物理數(shù)據(jù)m.p.138—142℃ [α]D25—50.66°(c0.1，H2O)FAB(C176H299N55O52)[M＋H]+4017.61AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Thr，1.1(1)；Ala，1.1(1)；Arg，2.7(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，3.8(4)；Gly 1.09(1)；hSer，1.09(1).
實施例III為了制備高絲氨酸酰胺，濃縮粗高絲氨酸內(nèi)酯(hSerlac)類似物化合物4，然后用25毫升飽和NH3的甲醇溶液處理。溶液在0℃攪拌2小時，然后在室溫下攪拌16小時。反應(yīng)用HPLC(Vydac_C—18，300埃，4.6×250mm，流速1.2mL/min，0.1％TFA中梯度為20—45％乙腈)監(jiān)測，并且在18小時內(nèi)完成。溶液濃縮并用制備性RP-HPLC(Vydac_C—18，0.1％TFA中梯度為20—45％乙腈)純化。收集高絲氨酸酰胺肽部分并凍干，得到30毫克純度＞98％的白色固體，即化合物3。
化合物3AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NH2(X＝hSer，SEQ ID NO8)物理數(shù)據(jù)m.p.138—142℃ [α]D25-45.97°(c0.25，H2O)FAB(C176H302N56O52)[M＋H]+4033.9AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.6(2)；His，2.8(3)；Gly，0.97(1)；hSer，0.97(1)；Thi，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，2.9(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.6(8)；Lys，3.9(4).
實施例IV按照實施例I的方法，制備0.35mmol左右的被保護的肽—樹脂BocAVS(Bzl)E(OBz)H(Bom)QLLHD(OBzl)R(Ts)GR(Ts)S(Bzl)IQD(OBz)-LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLE(OBzl)R(Ts)LLK(Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAM。所有的Nα基團用叔丁氧基羰基(Boc)保護；側(cè)鏈保護基團已標出。在合成結(jié)束之后，用50毫升20％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)在室溫下處理肽樹脂30分鐘，從而除去賴氨酸上的芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護基團。隨后依次用DMF，MeOH，和CH2Cl2洗滌樹脂，并干燥，得到1.6克部分保護的肽。于20毫升DMF中，在0.16g(0.3mmol)六氟磷酸苯并三唑基-三(吡咯烷基)磷鎓鹽和0.067g(0.525mmol)二異丙基乙胺(DIEA)存在下，用0.44克(0.3mmol)甲氧基二(乙烯氧基)乙酸[PEG(2)CH2COOH]使0.8g(0.175mmol)部分保護的肽在賴氨酸處進行乙?；磻?yīng)5小時。5小時后，過濾樹脂，然后依次用DMF，MeOH和CH2Cl2洗滌。重復(fù)乙?；襟E兩次，直至在樹脂上獲得陰性茚三酮結(jié)果。將最終的肽從樹脂上裂解，并且如實施例I那樣移去側(cè)鏈保護基團和進行純化。獲得100毫克化合物19。
化合物19 物理數(shù)據(jù)m.p.145-195℃ [α]D25-44.60°(c0.2，H2O)FAB(C183H316N64O54)[M＋H]+4276.2AAAAsp，2.1(2)；Glu，5.0(5)；Ser，1.6(2)；His，2.9(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.9(2)；Arg，7.1(7)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，0.9(1).
實施例V按實施例IV那樣合成、切取和純化肽，除了使用2-甲氧基聚(乙烯氧基)乙酸[PEG(5000)CH2CO2H]作為乙?；瘎?。用0.8g(0.175mmol)部分保護的肽獲得300毫克純化合物20。
化合物20 物理數(shù)據(jù)m.p.105℃ [α]D25-22.95°(c0.11，50％HOAc水溶液)AAAAsp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.6(2)；His，2.6(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.1(1)；Arg，7.3(7)；Val，0.8(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.3(8)；Lys，1.1(1)；Ala，1.8(2).
實施例VI合成hPTHrp(1—34)類似物基因設(shè)計編碼hPTHrp(1—34)類似物化合物4(SEQ ID NO9)的合成基因，它具有如圖1所示的核苷酸序列和限制性酶切位點。必需寡核苷酸用DNA合成儀(Milligen/Biosearch)，并采用Sinha，etal.，Nucleic Acid Research12，4539—4557(1984)的氨基磷酸酯(phosphoramidite)法制備。去保護后，粗寡核苷酸在制備性15％聚丙烯酰胺凝膠上通過凝膠電泳而純化。用UV照射確定寡核苷酸的位置，然后將其從凝膠中切取出來，在Waters c18 Sep-pak_柱上脫鹽，接著凍干。
通過聚合酶鏈反應(yīng)的擴增反應(yīng)是在Perkin-Elmer Cetus熱循環(huán)儀上進行，條件為94℃1分鐘，50℃2分鐘和72℃3分鐘，共25個循環(huán)，其中使用包括Taq聚合酶在內(nèi)的″GeneAmp″DNA擴增試劑盒(Perkin-Elmer Cetus)。
制備兩種重迭的寡核苷酸，即88聚物(2微克)的PTH3和反義的、90聚物(2微克)的PTH4作為hPTHrp(1—34)類似物基因的模板DNA序列。PTH3，(SEQ ID NO31)CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGC ATG GCT GTT TCT GAA CAT CAG 45
Met Ala Val Ser Glu His Gln1 5CTG CTT CAT GAC AAA GGT AAA TCG ATT CAA GAT CTG AGA CGT C88Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg10 15 20PTH4 (SEQ ID NO32)CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATCTAGA CAT AGT ATG CAG CTT TTC 46Met Thr His Leu Lys Glu30AAG CAG TTT CTC CAG CAG CTC GCG ACG TCT CAG ATC TTG AAT 88Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Arg Arg Arg Leu Asp Gln Ile25 20 15CG 90，采用兩側(cè)引物PTHPCRICCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG(SEQ ID NO33)和PTHPCR2CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC(SEQ IDNO34)，通過PCR擴增整個基因。擴增的DNA在4％NuSieve_瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳純化。從凝膠中切取含有合成的約150堿基的hPTHrp(1—34)類似物基因的條帶，用Elu—Quik_玻璃凝膠DNA萃取法(Schleicher & Schuell，Keene，NH)分離出約200ng DNA。
實施例VIIhPTHrp(1—34)1類似物基因的分子克隆為了亞克隆實施例VI的hPTHrp(1—34)類似物基因，分離200 ng擴增的DNA，然后用限制性內(nèi)切酶HinD III和Sac II進行酶切。如圖2所示，DNA被連于2微克的用HinD III和Sac II酶切過的TrpLE18 Prot(Ile3，Pro5)質(zhì)粒。
產(chǎn)生的質(zhì)粒TrpLE18 hPTHrp(1—34)1含有單拷貝的hPTHrp(1—34)類似物基因，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入活性大腸桿菌HB101細胞(CLONTECH，Palo Alto，CA)。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR分析以證實插入情況。選擇轉(zhuǎn)化細胞克隆，在200微升水中煮沸5分鐘；用位于插入件兩側(cè)的兩個引物對2微升樣品進行PCR。然后在1％瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物以確定存在單拷貝的hPTHrp(1—34)基因插入件。然后在DNA自動測序儀(Applied Biosystems Model 373A，F(xiàn)oster City，CA)上，使用供應(yīng)商的Dye Deoxy Terminator測序試劑盒，通過DNA測序而證實TrpLE18 hPTHrp(1—34)1構(gòu)建物。
實施例VIII構(gòu)建含有多拷貝hPTHrp(1—34)類似物基因的Trp LE18載體在hPTHrp(1—34)類似物基因序列的開頭和末端附近具有唯一的NheI和XbaI限制性位點?？梢允褂眠@兩個識別不同序列但產(chǎn)生相同單鏈粘性末端的位點在Trp LE18載體構(gòu)建多拷貝hPTHrp(1—34)基因。
在圖3中概括了構(gòu)建串聯(lián)式排列的多重hPTHrp(1—34)序列的方案。在各反應(yīng)中，用Ban HI＋NheI和XbaI＋BanHI消化5微克含有單拷貝基因的Trp LE18 hPTHrp(1—34)1質(zhì)粒。從各消化物中，分離出約300ng含有hPTHrp(1—34)類似物基因的片段。混合兩種片段并連接，從而形成Trp LE18 hPTHrp(1—34)2質(zhì)粒。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化活性大腸桿菌HB101細胞。利用轉(zhuǎn)化的PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上的大小來確定存在兩個拷貝的hPTHrp(1—34)基因插入件。然后通過DNA測序確認含有兩個拷貝基因的Tr-pLE18 hPTHrp(1—34)2。兩個hPTHrp(1—34)基因的正確融合會在接頭處消除NheI和XbaI位點。這使得XbaI和NheI在串聯(lián)式排列的基因兩側(cè)仍是唯一的。
通過重復(fù)該程序，構(gòu)建含有4個拷貝hPTHrp(1—34)基因的最終質(zhì)粒Trp LE18 hPTHrp(1—34)4，如圖4所示。通過DNA序列分析發(fā)現(xiàn)Trp LE18 hPTHrp(1—34)4序列是正確的。
實施例IXTrp LE18 hPTHrp(1—34)4的表達和純化誘導(dǎo)Trp LE18 hPTHrp(1—34)4將含有50微克/毫升氨芐青霉素和100微克/毫升色氨酸的50毫升LB培養(yǎng)基起始培養(yǎng)物(J.H.Miller，Experiments in Molecu-lar Genetics，″p.431(1972)，在此引用作為參考)用含有Trp LE18hPTHrp(1—34)4質(zhì)粒的大腸桿菌細胞進行接種，然后在37℃劇烈搖動生長過夜，至A550為約6。將2升用于生產(chǎn)的LB培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃，然后用20毫升起始培養(yǎng)物進行接種，得到的A550為約0.06。然后培養(yǎng)物在劇烈搖動下生長至A550為約0.6—0.8，加入2毫升含10mg/mL吲哚丙烯酸(IAA)的溶液。繼續(xù)在通氣良好的條件下生長16小時直至終A550為約6(典型地，為4—10)。通過離心濃縮細胞，然后再懸浮于500mL 50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1mM EDTA緩沖液中(Tris緩沖液)。
懸浮液用Heat Systems-Ultrasonics，Inc.的220F型超聲波儀(裝有3/4″揚聲器)，在50％滿負荷(為了避免過熱)下進行超聲波處理。
為了確定誘導(dǎo)的程度，用SDS-PAGE分析整個細胞。觀察到從TrpLE 18 hPTHrp(1—34)4構(gòu)建物衍生而得的基因產(chǎn)物為預(yù)計約17,000道爾頓分子量的主條帶。該條帶對應(yīng)于約10％的細胞總蛋白質(zhì)。
分離融合蛋白在約3600×g下離心細胞I裂解液15分鐘，使Trp LE18hPTHrp(1—34)4融合蛋白沉積；棄去上清液。將沉積物重新懸浮于100毫升Tris緩沖液中(典型地為40—80 A550/mL)
實施例X融合蛋白的加工和高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1—34)肽的純化用CNBr將位于hPTHrp(1—34)多聚體融合蛋白一側(cè)的甲硫氨酸切下，釋放出所需的高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1—34)多肽，然后按下列方法進行純化。用CNBr處理融合蛋白將洗滌過的TrpLE 18 hPTHrp(1—34)4融合蛋白沉積物通過輕輕地攪拌重新懸浮于60mL 70％甲酸中(約20mg/mL總蛋白；典型地將來自1000 A500單位細胞的原料溶于3毫升中)。加入數(shù)滴辛醇，用N2吹洗溶液20分鐘，然后加入5.5g CNBr。接著，于25℃反應(yīng)6小時，將等體積的5050MeOHH2O與樣品混合，隨后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而除去。重復(fù)該過程2—4次，使甲酸和CNBr基本上被去除。然后蒸發(fā)樣品至干燥，重新溶解于200毫升水中，凍干儲存。高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1—34)的純化將CNBr裂解的上清液在有所改變的50mM KH2PO4pH6.5中透析24小時。在透析中，pH維持在6.5。透析后，高速離心除去沉淀物。上清液通過Gelman 0.45μ過濾裝置(Acrodisc4184)澄清化。陽離子交換色譜最初的純化通過在Bio—Gel TSK-SP-5PW HPLC柱(21.5×150mm)上的陽離子交換色譜而完成。對應(yīng)于流速為8mL/min和約12毫克高純度高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1—34)肽產(chǎn)量的色譜條件如下1.用50mM KH2PO4，pH6.5平衡柱2.裝10mL澄清的上清液(約1.5升培養(yǎng)液或2.4g包涵體)。
3.用含有50mM NaCl的50mM KH2PO4，pH6.5洗滌柱直至基線穩(wěn)定4.用含有90mM NaCl的50mM KH2PO4，pH6.5洗脫柱。收集餾分約45分鐘。
5.用C18 HPLC分析90mM NaCl-餾分中高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1—34)含量，然后收集儲存。反向HPLC色譜用反相Poros R/H4.6×100mm柱(Perseptive Biosystems，Cambridge，MA)進行最后的純化步驟。該色譜條件如下流動相A0.1％三氟乙酸(TFA)/水B0.1％三氟乙酸(TFA)/CH3CN時間 流速 ％B0min 4ml/min 155.0min 4ml/min 405.2min 4ml/min 1006.8min 4ml/min 1007.0min 4ml/min 15高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1—34)，化合物4的保留時間約為2.943分鐘。純化的肽用質(zhì)譜法測定純度為約98％。
實施例XI在切除卵巢的大鼠上，大體按照Gunness-Hey和Hock，Metab.Bone Dis.5177181(1984)的方法評估本發(fā)明的化合物對骨質(zhì)的作用。
使成年Sprague-Dawley雌性大鼠適應(yīng)環(huán)境，按重量分組(n＝9，10 or 12)，然后進行兩側(cè)卵巢切除(OVX)或模擬手術(shù)。在手術(shù)后17天給藥，持續(xù)20天。每天用2％鼠血清/鹽水介質(zhì)皮下施用測試化合物。
20天后，殺死鼠，取出右股骨。將股骨切成兩半，遠端的一半股骨(DHF)進一步通過鉆出小梁而分成小梁骨(TB)和皮骨(CB)。萃取出鈣，通過Calcette鈣分析儀進行測定，以平均骨鈣表示，單位為mg/DHF/100g體重。
使用兩樣t-檢驗來比較OVX和模擬組。用單向ANOVA比較OVX組，隨后用Fisher的LSD多重比較法將各組與介質(zhì)進行比較。
卵巢切除會導(dǎo)致嚴重的總骨質(zhì)喪失，主要是小梁骨的骨質(zhì)喪失。與模擬手術(shù)的對照組相比，總骨鈣質(zhì)低47—54％。
通過統(tǒng)計表明，80微克/kg/bPTH(1—34)和hPTHrp(1—34)能夠使處理過的OVX鼠的總骨鈣質(zhì)明顯增加，分別為53—95％和18—40％；但是皮骨鈣質(zhì)沒有明顯增加。
本發(fā)明的化合物，按80微克/kg/天給藥時，會增加總骨鈣質(zhì)約66—138％，增加小梁骨鈣質(zhì)87—128％。對于未處理的OVX對照組，皮骨鈣質(zhì)、小梁厚度和骨體積也明顯增加。
在該分析中，測試了下列化合物化合物 n小梁骨鈣質(zhì) 總骨鈣質(zhì)編號 (測試數(shù)目#) (％增加，OVX) (％增加，OVX)化合物1 6101—128％ 88—138％化合物2 387—102％ 66—114％化合物4 3 — 88—114％在類似的研究中，按40微克/kg/天給切除卵巢的大鼠給藥5，10和20，得到下列結(jié)果化合物 n給藥天數(shù) 總骨鈣質(zhì)編號 (測試數(shù)目#)(d) (％增加，OVX)化合物1 3 20d 73—109％化合物4 5 20d 79—105％化合物4 1 10d 79％化合物4911Od93％化合物4 15d 55％化合物4215d 60％實施例XII毒性在上面的實施例XI中，對于本發(fā)明的化合物沒有觀察到毒性作用。
權(quán)利要求
1.一種甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的合成多肽類似物，或其鹽，其特征在于，氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(Haa)和親脂氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，或其鹽，其特征在于，氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)的序列選自a)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Xaa5Leu Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10其中1 510Xaa1和Xaa4各自獨立地為Glu，Glu(OCH3)，His，或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa5是Lys或His；Xaa7和Xaa10各自獨立地為Leu或Ile；Xaa8是Ala，Arg，或Glu；和Xaa9是Lys或Glu(SEQ ID NO26)；b)xaa1Xaa2Leu Xaa4Arg Leu Leu Xaa8Arg Leu其中1 510Xaa1和Xaa4各自獨立地為Glu，Glu(OCH3)，His，或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa8是Glu，Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是分子量為100—1O,000的聚(乙二醇甲基醚)殘基(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；1 510d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 510e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)1 510
3.如權(quán)利要求2所述的多肽及其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，它具有下式Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu His Xaa10Xaa11Gly Xaa13Ser Ile Gln Xaa17Leu Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37Xaa38Term，其中Xaa1缺失或是Ala；Xaa2缺失或是Val；Xaa3缺失或是Ser；Xaa4缺失或是Glu或Glu(OCH3)；Xaa5缺失或是His或Ala；Xaa6缺失或是Gln；Xaa7缺失或是Leu；Xaa10和Xaa17各自獨立地為Asp或Asp(OCH3)；Xaa11是Lys，Arg，或Leu；Xaa13是Lys，Arg，Tyr，Cys，Leu，Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素基))，Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-4-乙?；?，或Lys(二氫肉桂?；?；Xaa20是Arg或Leu；Xaa19和Xaa21各自獨立地為Lys，Ala，或Arg；Xaa22-31選自(SEQ ID NOS26，27，28，29，或30)；Xaa32是His，Pro，或Lys；Xaa33缺失，或是Pro，Thr，Glu，或Ala；Xaa34缺失，或是Pro，Arg，Met，Ala，hSer，hSer內(nèi)酯，Tyr，Leu，或1，4-二氨基丁酰內(nèi)酰胺；Xaa35缺失或是Pro，Glu，Ser，Ala，或Gly；Xaa36缺失或是Ala，Arg，或Ile；Xaa37缺失或是Arg，Trp，或3-(-2-萘基)-L-Ala；Xaa38缺失或是Ala或hSer或Xaa38—42是Thr Arg Ser Ala Trp；和Term是OR或NR2其中每個R各自獨立地為H，(C1—C4)烷基或苯基(C1—C4)烷基。
4.如權(quán)利要求3所述的多肽，其特征在于，Xaa22-31是(SEQ IDNO26)，和其中Xaa11和Xaa13都是Lys；Xaa19和Xaa21都是Arg。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO7)；
6.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu Pro NH2(SEQ ID NO56)
7.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr 1，4-二氨基丁酰內(nèi)酰胺(SEQ ID NO63)
8.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 510 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSerlac (SEQ ID NO9)
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有骨質(zhì)增加有效量的如權(quán)利要求1所述的多肽或其鹽與藥學(xué)上可接受的載體混合物。
10.一種治療哺乳動物骨質(zhì)減少狀況的方法，其特征在于，該方法包括給施用對象施用骨質(zhì)增加有效量的甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的合成多肽類似物，或其鹽，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(Haa)和親脂氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，被治療的癥狀是骨質(zhì)疏松癥。
12.一種PTH、PTHrp或PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的多肽類似物，或其鹽的固相合成方法，其中氨基酸殘基(22—31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22—31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(Haa)和親脂氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa，該方法包括按次序?qū)⒈槐Ｗo的氨基酸偶連于合適的樹脂載體，去除側(cè)鏈和Nα-保護基團，以及將多肽從樹脂載體上裂解。
13.一種如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，其特征在于，它用于制備治療哺乳動物骨質(zhì)減少狀況、尤其治療骨質(zhì)疏松癥的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和類似物的合成多肽類似物，及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中氨基酸殘基(22-31)形成兩親性α-螺旋，該殘基(22-31)選自按下列序列排列的親水氨基酸(Haa)和親脂氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)它們能用于預(yù)防和治療哺乳動物的骨質(zhì)疏松癥。還提供了生產(chǎn)該多肽的固相合成方法和重組方法。
文檔編號C07K14/435GK1127000SQ94192745
公開日1996年7月17日 申請日期1994年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月13日
發(fā)明者J·L·克爾斯特納斯基, J·J·內(nèi)斯特，Jr·T·L·侯, B·H·維克里, C·T·貝奇 申請人:森德克斯(美國)股份有限公司