專利名稱：作為多巴胺受體的配體的新的稠合異喹啉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多巴胺受體的新配體。更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及任意取代的四氫-1H-萘并〔1，2，3-de〕異喹啉化合物和它們?cè)谥委熍c多巴胺相關(guān)的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能障礙的藥物配方中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
與發(fā)明概述多巴胺，一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，與許多神經(jīng)病學(xué)的病癥有關(guān)。例如曾經(jīng)假設(shè)對(duì)多巴胺受體亞型的過(guò)多刺激與精神分裂癥有關(guān)。另外，普遍認(rèn)為在中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)多或不足功能的多巴胺能活性可以導(dǎo)致高血壓，發(fā)作性睡眠，和其它行為的，神經(jīng)病學(xué)的，生理的和運(yùn)動(dòng)的障礙，包括帕金森氏病，一種慢性、進(jìn)行性的以不能控制隨意運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)為特征的疾病。
基于藥理學(xué)的和功能的證據(jù)，傳統(tǒng)上將多巴胺受體分為兩族(D1和D2)之一。D1受體優(yōu)先識(shí)別苯基四氫苯并氮雜類并導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶的刺激，而D2受體識(shí)別丙基芐基酮類和苯甲酰胺類并且負(fù)(negatively)(或完全不)偶聯(lián)到腺苷酸環(huán)化酶。目前已知存在有多巴胺受體的一些亞型并且至少有五種基因編碼的多巴胺受體亞型D1、D2、D3、D4和D5。然而傳統(tǒng)的分類方法仍有用，如D1-類組包括D1(D1A)和D5(D1B)受體，而D2-類組包括D2，D3和D4受體。
對(duì)多巴胺受體表現(xiàn)出親和性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物通常不僅由它們的受體選擇性，還由它們的激動(dòng)劑(受體刺激)或拮抗劑(受體阻斷)活性來(lái)分類的。雖然和多巴胺與不同受體亞型間的相互作用相關(guān)的生理活性并未完全了解，但已經(jīng)知道配體顯示出對(duì)一種特定的受體亞型的選擇性將產(chǎn)生或多或少可預(yù)期的神經(jīng)藥物結(jié)果。選擇性多巴胺受體拮抗劑和激動(dòng)劑化合物的獲得將使設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以增加對(duì)D1受體多重功能作用的了解成為可能，并且導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)各種中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)病癥的新的治療法。
起初，對(duì)多巴胺受體的研究集中于D2族，然而多巴胺D1受體在神經(jīng)系統(tǒng)功能中的關(guān)鍵作用最近已變得明顯。對(duì)選擇性D1受體的配體的先前工作主要集中在來(lái)自單一化學(xué)種類的分子，苯基四氫苯并氮雜類，如拮抗劑SCH 23390(1)
一些苯基四氫苯并氮雜已被發(fā)現(xiàn)為D1受體激動(dòng)劑；然而，從這一種類衍生的激動(dòng)劑(包括例如SKF 38393(+)-2)通常缺少完全的內(nèi)在效能。即使是SKF 82958，據(jù)稱是一種完全激動(dòng)劑，最近表明在降低的受體貯量的標(biāo)本中并不具有完全的內(nèi)在效能。而完全效能的和部分效能的激動(dòng)劑之間的區(qū)別對(duì)醫(yī)藥研究團(tuán)體是重要的，這是因?yàn)檫@些化合物對(duì)復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)的事態(tài)有著不同的影響。例如，dihydrexidine和完全激動(dòng)劑A-77636，在MPTP-處理的猴模型中有特別的抗-帕金森氏病的效果，而都分激動(dòng)劑卻沒(méi)有明顯的活性。更新的數(shù)據(jù)表明完全和部分激動(dòng)劑在其它的復(fù)雜神經(jīng)功能中的影響也有不同。
因此，研究者致力于設(shè)計(jì)的配體是完全激動(dòng)劑，它具有完全的內(nèi)在效能。一個(gè)這樣的化合物是dihydrexidine(3)，如下式的六氫苯并〔a〕菲啶
dihydrexidine(3)的結(jié)構(gòu)與其它D1激動(dòng)劑不同，因?yàn)楦郊拥沫h(huán)系是被栓住的，這使得分子相對(duì)剛性。dihydrexidine(3)的分子模型研究表明，該化合物具有有限數(shù)目的低能量構(gòu)象，在所有的這些構(gòu)象中芳香環(huán)處于相對(duì)共平面的排列。最近對(duì)dihydrexidine(3)活性對(duì)映體的構(gòu)型的闡明與從該模型的預(yù)言相符合的。
不同于其它的高親合力，高度內(nèi)在活性的D1激動(dòng)劑如3位取代的氨基甲基異苯并二氫吡喃類，dihydrexidine(3)提供了半剛性模板來(lái)發(fā)展多巴胺配體模型。該模型的重要特征包括存在有一個(gè)反向β-苯基多巴胺部分，在堿性氮原子上有平伏鍵指向的孤電子對(duì)，和與兒茶酚環(huán)近于共平面的下垂的苯環(huán)。以dihydrexidine為基礎(chǔ)的模型有反向β-苯基多巴胺部分，而具有多巴胺作用的苯基四氫苯并氮雜類有順向的β-苯基多巴胺構(gòu)象。以dihydrexidine為基礎(chǔ)的模型已作為設(shè)計(jì)其它的D1受體激動(dòng)劑的基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)并合成具有高度內(nèi)在活性的D1受體激動(dòng)劑，對(duì)醫(yī)藥研究團(tuán)體是重要，因?yàn)橥耆?dòng)劑對(duì)治療復(fù)雜中樞神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)的事態(tài)以及涉及外周多巴胺受體的狀況有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。例如，本發(fā)明的組合物作為降低血壓的試劑有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一類如下通式的新的多巴胺受體激動(dòng)劑
和其可藥用的鹽，和該化合物的藥物配方。本發(fā)明化合物可用于治療，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與多巴胺相關(guān)的機(jī)能障礙以及涉及外周多巴胺受體的病情的患者，表現(xiàn)為明顯的神經(jīng)病學(xué)的、心理學(xué)的、生理的、或行為的病癥。附圖簡(jiǎn)述

圖1描述反應(yīng)流程圖1的化學(xué)反應(yīng)步驟，將O-甲基苯甲酸乙酯轉(zhuǎn)變成2-甲基-2，3-二氫-4(1H)-異喹諾酮。試劑a)NBS，過(guò)氧化苯甲酰，CCl4，回流；b)肌氨酸乙酯HCl，K2CO3，丙酮；c)NaOEt，EtOH，回流，ii.HCl，回流。
圖2描述反應(yīng)流程圖2的化學(xué)反應(yīng)步驟，將2，3-二甲氧基-N，N′-二乙基苯甲酰胺轉(zhuǎn)變至dinapsoline試劑a)i.仲丁基鋰，TMEDA，Et2O，-78℃，ii.化合物7，iii.TsOH，甲苯，回流；b)i.1-氯乙基氯甲酸酯，(CH2Cl)2，ii.CH3OH；c)TsCl，Et3N；d)H2/pd-C，HOAc；e)BH3-THF；f)濃H2SO4，-40℃至-5℃；g)Na-Hg，CH3OH，Na2HPO4；h)BBr3，CH2Cl2。
圖3是dinapsoline(三角形)，(+)-dihydrexidine(正方形)和(+)-SCH23390(實(shí)心圓)對(duì)紋狀體D1受體親和力的圖示。大鼠紋狀體D1受體用[3H]SCH 23390(1)標(biāo)記，加入未標(biāo)記的dinapsoline，(+)-dihydrexidine或(+)-SCH 23390以測(cè)定每個(gè)化合物對(duì)D1受體的特異結(jié)合。
圖4是dinapsoline(4)，(+)-dihydrexidine〔(+)-3〕和(+)-SKF 38393〔(+)-2〕在大鼠紋狀體勻漿中相對(duì)于多巴胺刺激cAMP聚積的能力的圖示。
圖5是dinapsoline(4)，(+)-dihydrexidine〔(+)-3〕和(+)-SKF 38393〔(+)-2〕在C-6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(表達(dá)主要D1A受體)中相對(duì)于多巴胺刺激cAMP聚積的能力的圖示。
圖6是dinapsoline(三角形)，(+)-dihydrexidine(正方形)和(+)-SCH23390(實(shí)心圓)對(duì)紋狀體D2是受體親和力的圖示。大鼠紋狀體D2受體用〔3H〕SCH 23390標(biāo)記，加入未標(biāo)記的dinapsoline，(+)-dihydrexidine或(+)-SCH 23390以測(cè)定每個(gè)化合物對(duì)D2受體的特異結(jié)合。發(fā)明詳述這里提供按本發(fā)明的通式(I)的化合物
和其可供藥用的鹽，其中R和R5是氫或C1-C4的烷基；R1是氫，C1-C4的烷基或苯氧基保護(hù)基團(tuán)；X是氫，鹵素或式-OR6的基團(tuán)，其中R6為氫，C1-C4烷基或苯氧基保護(hù)基團(tuán)，并且R2，R3和R4是獨(dú)立地選自包括氫，C1-C4烷基，苯基，鹵素，或-OR1的基團(tuán)，其中R1如上述定義，并且當(dāng)X是式-OR6的基團(tuán)時(shí)，基團(tuán)R1和R6可以一起形成式-CH2-的基團(tuán)。
這里使用的用語(yǔ)“C1-C4烷基”指的是分支的或直鏈的烷烴基團(tuán)，包括一個(gè)至四個(gè)碳原子，包括，但并不局限于，甲基，乙基，丙基，異丙基，亞丁基，叔丁基和環(huán)丙基甲基。
用語(yǔ)“可供藥用的鹽”指的是用有機(jī)或無(wú)機(jī)酸形成的那些鹽，而這些鹽對(duì)人或低等動(dòng)物無(wú)不希望的毒性，刺激性，過(guò)敏性反應(yīng)等。與具有胺官能團(tuán)的生物活性化合物適于形成可供藥用的鹽的酸是本領(lǐng)域中眾所周知的。這些鹽可以依照常規(guī)方法在本發(fā)明化合物的最后分離和純化中就地制備，或通過(guò)用適宜成鹽的酸與以游離堿形式分離的化合物反應(yīng)加以制備。
這里使用的用語(yǔ)“苯氧基保護(hù)基團(tuán)”指的是酚的氧上的取代基，它在合成中防止不希望的反應(yīng)和降解并且以后可以除去而不影響分子中其它的官能團(tuán)。這樣的保護(hù)基團(tuán)和它們應(yīng)用和除去的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。它們包括醚類，例如環(huán)丙基甲基，環(huán)己基，烯丙基醚等；烷氧烷基醚例如甲氧基甲基或甲氧基乙氧基甲基醚等；烷硫基烷基醚或甲硫基甲基醚；四氫吡喃基醚；芳基烷基醚例如芐基，鄰-硝基芐基，對(duì)甲氧基芐基，9-蒽基甲基，4-吡啶甲基醚等；三烷基硅醚例如三甲基硅烷基，三乙基硅烷基，叔丁基二甲基硅烷基，叔丁基二苯基硅烷基醚等；烷基和芳基酯例如乙酸酯，丙酸酯，正丁酸酯，異丁酸酯，三甲基乙酸酯，苯甲酸酯等；碳酸酯例如甲基，乙基，2，2，2-三氯乙基，2-三甲基硅烷基乙基，芐基等的酯；和氨基甲酸酯例如甲基，異丁基，苯基，芐基，二甲基等的酯。
這里使用的用語(yǔ)“C1-C4烷氧基”指的是分支的或直鏈烷基基團(tuán)，包括一個(gè)至四個(gè)碳原子通過(guò)一個(gè)氧原子結(jié)合，它包括但并不局限于，甲氧基，乙氧基，丙氧基和叔丁氧基。
此外，按照本發(fā)明的其它實(shí)施方案，本發(fā)明化合物可在常規(guī)的藥物劑型中配制，并用于治療患有多巴胺相關(guān)的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的患者的方法中。本發(fā)明化合物的有效劑量取決于許多因素，包括治療的適應(yīng)癥，給藥途經(jīng)，和病人的總的狀況。對(duì)于口服給藥，例如，本發(fā)明化合物的有效劑量預(yù)期范圍從約0.1至約50mg/kg，更典型的是約0.5至約25mg/kg。腸胃外的有效劑量范圍從約0.01至約5mg/kg體重。通常，本發(fā)明化合物所用的治療程序包括每天以多次劑量或單一劑量施用從約1mg至約500mg的本發(fā)明的化合物。
用于口服給藥的液體劑型可以包括可供藥用的乳劑，微乳劑，溶液劑，懸浮劑，和糖漿劑。包含有在本領(lǐng)域中經(jīng)常使用的惰性稀釋劑，例如水。這樣的組合物也可以包括輔料如潤(rùn)濕劑，乳化和懸浮劑，甜味，和調(diào)味劑。本發(fā)明的化合物的可注射制劑可利用本領(lǐng)域認(rèn)可的產(chǎn)品來(lái)配制，這是通過(guò)將效劑量的化合物分散或溶解在可供腸胃外用的稀釋劑例如水，或更優(yōu)選為等滲的氯化鈉水溶液中加以配制。腸胃外配方可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的微過(guò)濾技術(shù)滅菌。
本發(fā)明的化合物亦可配制成固體劑型供口服給藥，如膠囊，片劑，粉劑，丸劑等。典型的是將活性化合物與惰性稀釋劑或載體例如糖或淀粉和其它合適于劑型的賦形劑相混合。因此片劑的配方將包括可接受的潤(rùn)滑劑，粘合劑和/或崩解劑。粉劑組合物任選地包括將本發(fā)明的一種活性化合物和，例如，淀粉或糖載體填入至明膠膠囊中供口服給藥。本發(fā)明的化合物的其它劑型可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)配制成適用于特定給藥方式的劑型。
按本發(fā)明提供的一種化合物是(±)-8，9-二羥基-2，3，7，11b-四氫-1H-萘并〔1，2，3-de〕異喹啉，在此后命名為“dinapsoline”。Dinapsoline是依照?qǐng)D1和2中一般描述的過(guò)程，從2-甲基-2，3-二氫-4(1H)-異喹諾酮合成的。在過(guò)氧化苯甲酰存在下，用NBS側(cè)鏈溴化O-甲苯甲酸乙酯(5a)生成化合物5b。用化合物5b烷基化肌氨酸乙酯得到化合物6，在迪克曼(Dieckmann)縮合后并隨之酸性水解脫羧得到化合物7。
如反應(yīng)流程圖2(圖2)所示，用仲丁基鋰/TMEDA在乙醚中于-78℃對(duì)鄰位鋰代2，3-二甲氧基-N，N′-二乙基苯甲酰胺(8)并將該鋰化物與化合物7縮合，隨之與對(duì)甲苯磺酸一起回流得到螺內(nèi)酯9，中等產(chǎn)率。用1-氯乙基氯甲酸酯對(duì)9N-去甲基化，隨之甲醇解中間體，得到化合物10，再用對(duì)甲苯磺酰氯和三乙基胺處理得到化合物11。
曾試圖合成化合物11，即，直接通過(guò)用鋰化的化合物8在THF或乙醚中與2-對(duì)甲苯磺?；?2，3-二氫-4(1H)-異喹諾酮縮合，隨之用酸內(nèi)酯化，僅得到極少量(＜5％)的化合物11。在堿性反應(yīng)條件下2-對(duì)-甲苯磺?；?2，3-二氫-4(1H)-異喹諾酮的烯醇化是對(duì)低收率的一個(gè)明顯的解釋。
在10％鈀/碳存在下，在冰醋酸中氫解化合物11得到化合物12，用乙硼烷還原得到中間體化合物13。用濃硫酸在低溫下環(huán)化化合物13得到化合物14。用Na/Hg在磷酸氫二鈉緩沖的甲醇中對(duì)化合物14進(jìn)行N-去甲苯磺?；玫交衔?5。最后，用三溴化硼處理化合物15使甲基醚斷裂得到dinapsoline(4)，為其氫溴酸鹽。
對(duì)(+)-反式-10，11-二羥基-5，6，6a，7，8，12b-六氫苯并〔a〕菲啶〔(+)-dihydrexidine〕和dinapsoline的11bR對(duì)映體〔它與(+)-dihydrexidine在其12bS手性中心同手性〕，比較了它們的低能量構(gòu)象的空間填充表示(Space-filling representations)。兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)特征是顯而易見(jiàn)的。第一，dihydrexidine(3)中由C(7)-C(8)亞乙基橋所給出的立體位阻被去除了。第二，下垂的苯基環(huán)與兒茶酚環(huán)的平面的角度略有改變。這是最明顯的，從正面看，在dihydrexidine(3)芳香氫H(1)的位置突出于兒茶酚環(huán)之上。然而，在dinapsoline中，這個(gè)位置被用于通過(guò)亞甲基單位將下垂的苯基環(huán)與兒茶酚環(huán)相栓??；這迫使下垂的苯基環(huán)相對(duì)于dihydrexidine(3)，向順時(shí)針?lè)矫媾まD(zhuǎn)，當(dāng)從上方觀察時(shí)。氨基也在相似的位置，給予雜環(huán)一定的構(gòu)象柔韌性。另外，兩個(gè)分子均可在平伏鍵方向存在一個(gè)N-H矢量，這是藥效基團(tuán)的特征，據(jù)信對(duì)D1受體激動(dòng)劑是重要的。同那些觀察相一致，這兩個(gè)分子的藥理性質(zhì)是相似的。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)定dinapsoline在D1受體上的結(jié)合。對(duì)大鼠紋狀體的D1受體，發(fā)現(xiàn)dinapsoline有著同dihydrexidine(3)幾乎一致的親合力(Ki＝5.9nM)。另外，使用非標(biāo)記的SCH 23390(1)作為競(jìng)爭(zhēng)劑的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明dinapsoline以高親合力競(jìng)爭(zhēng)，具有淺的(shallow)競(jìng)爭(zhēng)曲線(nH＝0.66)，表明為激動(dòng)劑性質(zhì)(見(jiàn)圖3)。在體外實(shí)驗(yàn)中通過(guò)測(cè)量dinapsoline在大鼠紋狀體和C-6-mD1細(xì)胞(見(jiàn)下面所示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))中dinapsoline增加了cAMP生成的能力，證實(shí)了dinapsoline在D1受體上的激動(dòng)劑性質(zhì)。在大鼠紋狀體和C-6-mD1細(xì)胞中，dinapsoline具有完全激動(dòng)劑活性，通過(guò)D1受體在刺激cAMP合成中其EC50約為30nM。
因此藥理數(shù)據(jù)確認(rèn)dinapsoline對(duì)〔3H〕SCH 23390標(biāo)記的多巴胺D1受體有高的親合力，而這幾乎與(+)-反式-10，11-二羥基-5，6，6a，7，8，12b-六氫苯并〔a〕菲啶(dihyrexidine)相等。另外(±)-8，9-二羥基-2，3，7，11b-四氫-1H-萘并〔1，2，3-de〕-異喹啉〔dinapsoline〕，在大鼠紋狀體的膜和克隆表達(dá)的主要的D1A受體中相對(duì)于多巴胺是完全的激動(dòng)劑，并同dihydrexidine(3)相似但不象部分激動(dòng)劑(+)-SKF38393(見(jiàn)圖4與圖5(+)-SKF38393＝(+)-2；(±)-反式-10，11-二羥基-5，6，6a，7，8，12b-六氫苯并〔a〕菲啶＝(±)-3，和(±)-8，9-二羥基-2，3，7，11b-四氫-1H-萘并〔1，2，3-de〕異喹啉＝4)。
基于下面的D1藥效基團(tuán)的模型，可以預(yù)期外消旋體dinapsoline(和其取代的類似物)的親合性和內(nèi)在活性都只存在于其對(duì)映體之一11bR的絕對(duì)構(gòu)型中(和它的同手性類似物)。使用本領(lǐng)域認(rèn)可的分離技術(shù)拆分外消旋體，預(yù)期得到dinapsoline的一個(gè)異構(gòu)體，它有著約兩倍于消旋體表現(xiàn)出的D1親合性，這樣使得它對(duì)D1受體的親合性類似于(+)-反式-10，11-二羥基-5，6，6a，7，8，12b-六氫苯并〔a〕菲啶。
如圖3和表1所示，dinapsoline要比dihydrxidine對(duì)D2-類受體有更強(qiáng)的親合性。首次合成dihydrxidine時(shí)，預(yù)期它可能對(duì)D1受體比對(duì)D2-類受體有相當(dāng)?shù)倪x擇性。然而，測(cè)定dihydrexidine只有約10倍的D1∶D2的選擇性。此外，dihydrexidine在有預(yù)期的多巴胺激動(dòng)劑活性的同時(shí)，也具有不尋常的性質(zhì)，在這里稱為“功能的選擇性”。具體地說(shuō)，在大鼠(在體內(nèi)或在體外)中，dihydrexidine作為激動(dòng)劑作用于位于突觸后的D2-類受體，但是作為拮抗劑作用于位于突觸前的D2-類受體。之所以如此據(jù)信是由于位于突觸后的配體-受體-G蛋白復(fù)合體與突觸前的有所不同，如測(cè)定存在于給定的細(xì)胞環(huán)境中的特異G蛋白所示。
已經(jīng)指出，dihydrexidine的這些D2性質(zhì)存在于同樣的對(duì)映體(即，6aR，12bS)中，它是在D1受體上高度親合的完全激動(dòng)劑。以此為基礎(chǔ)，期望dinapsoline的D1和D2性質(zhì)也都存在于同手性對(duì)映體中。dinapsoline的光學(xué)異構(gòu)體，和合適的類似物，構(gòu)成重要的工具以研究“功能的選擇性”這一現(xiàn)象。
以前已有報(bào)道，在帕金森氏疾病的MPTP模型中，dihydrexidine的抗帕金森氏病的效果，并且預(yù)期dinapsoline將表現(xiàn)出相似的效果。因此，dinapsoline和其衍生物對(duì)帕金森氏病和在多巴胺受體的紊亂可治療的情況中它們有著潛在的臨床效用價(jià)值。此外，亦有報(bào)道，對(duì)dihydrexidine的適當(dāng)修飾將產(chǎn)生一些類似物它們可以多巴胺受體族特異的亞群為靶目標(biāo)。對(duì)dinapsoline同樣的策略應(yīng)產(chǎn)生具有新的受體亞型選擇性和/或功能化特征的化合物。
在以下所述的試驗(yàn)方法中，熔點(diǎn)用Thomas Hoover熔點(diǎn)儀測(cè)定并且未校正。1H NMR譜是用Varian VXR 500S(500MHz)NMR儀記錄的并且報(bào)導(dǎo)的化學(xué)位移是相對(duì)于TMS的δ值(ppm)。IR譜是以KBr壓片或液膜用Perkin Elmer 1600系列FTIR分光計(jì)記錄的?；瘜W(xué)電離質(zhì)譜(CIMS)用Finnigan 4000四極質(zhì)譜儀記錄。高分辨CI譜在Kratos MS50質(zhì)譜儀上記錄。無(wú)素分析數(shù)據(jù)獲得自普渡大學(xué)的微量分析實(shí)驗(yàn)室，WestLafayette，IN。
THF在使用前，臨時(shí)于氮?dú)庵袕亩酵?鈉蒸餾而得；1，2-二氯乙烷在使用前從五氧化二磷中蒸餾得到。
實(shí)例12-甲基-2，3-二氫-4(1H)-異喹諾酮的制備2-溴甲基苯甲酸乙酯(5b)。
將O-甲基苯甲酸乙酯(41.2g，0.25mole)的四氯化碳(200mL)溶液在0℃下逐滴加入攪拌著的過(guò)氧化苯甲酰(100mg)，四氯化碳(200mL)和NBS(44.5g，0.25mole)的混合物中。在氮?dú)庀录訜峄亓骰旌衔?.5小時(shí)，放置過(guò)夜使冷至室溫。過(guò)濾除去沉淀的琥珀酰亞胺并用四氯化碳洗滌濾餅。將合并的濾液相繼用2N NaOH(100mL)，和水(2×100mL)洗滌，并用無(wú)水MgSO4干燥溶液，過(guò)濾(硅藻土)，真空蒸發(fā)得到油狀產(chǎn)品。高真空下干燥過(guò)夜得到化合物5b的粗品60.5g(99％)；產(chǎn)品的1HNMR表明存有約15％未反應(yīng)的起始原料。因?yàn)樵摶旌衔镉蒙V法或真空蒸餾法不易分離，所以沒(méi)有進(jìn)一步分離即用于下一步驟。1H NMR(CDCl3)δ1.43(t，J＝7Hz，3H，CH2CH3)，4.41(q，J＝7Hz，2H，CH2CH3)，4.96(s，1H，CH2Br)，7.24(m，1H，ArH)，7.38(m，1H，ArH)，7.48(m，2H，ArH)。
N-(2-乙氧羰基)肌氨酸乙酯(6)。
于室溫和氮?dú)庀?，向肌氨酸乙酯鹽酸(32.2g，0.21mole)，碳酸鉀(325目；86.9g，0.63mole)，和丙酮(800mL)的混合物中，加入化合物5b(60.7g；獲得自0.25mole的O-甲基苯甲酸乙酯；85％轉(zhuǎn)化至化合物6；計(jì)算為0.21mol)的丙酮(100mL)溶液。將該混合物攪拌回流2小時(shí)并隨之置于室溫20小時(shí)。過(guò)濾(硅藻土)除去固體并用丙酮洗滌殘留物。合并濾液并在減壓下蒸發(fā)，得到油狀物。將油狀物溶于250mL 3N HCl中并用乙醚洗滌。用NaHCO3水溶液堿化水層，并用乙醚(3×250mL)萃取。蒸發(fā)乙醚溶液得到油狀物，真空蒸餾給出45.33g(77％)的化合物6bp140-142℃(0.5mm Hg)[bp182-183℃(10mm Hg)]；1H NMR(CDCl3)δ1.24(t，3H，J＝7.1Hz，CH3)，1.36(t，3H，J＝7.1Hz，CH3)，2.35(s，3H，NCH3)，3.27(s，2H，CH2Ar)，4.00(s，2H，NCH2)，4.14(q，2H，J＝7.1Hz，CH2CH3)，4.32(q，2H，J＝7.1Hz，CH2CH3)，7.28(t，1H，J＝7.4Hz，ArH)，7.42(t，1H，J＝7.6Hz，ArH)，7.52(d，1H，J＝7.8Hz，ArH)，7.74(d，1H，J＝7.7Hz，ArH).
2-甲基-2，3-二氫-4(H)異喹諾酮(7)。
將新切的鈉(10.9g，0.47克原子〕在氮?dú)庵屑尤胫翢o(wú)水乙醇(110mL)中并將反應(yīng)混合物加熱至回流。金屬鈉消失后，向反應(yīng)混合物中緩慢加入化合物6(35.9g，0.128mole)在干燥甲苯(160mL)的溶液。然后加熱回流并將乙醇通過(guò)迪安-斯達(dá)克榻分水器共沸分離。冷卻后，溶劑在減壓下蒸發(fā)。將剩余的黃色半固體殘留物溶解于水(5mL)，95％乙醇(60mL)，和濃鹽酸(240mL)的混合物中，并加熱回流26小時(shí)。冷卻后，混合物在真空下濃縮并用固體NaHCO3小心地堿化。將堿性溶液用乙醚萃取，干燥(MgSO4)，并蒸發(fā)至油狀物，蒸餾后者得到化合物7(17.11g，83％)bp130-132℃(5mm Hg)(bp 81-83℃(0.4mm Hg)；mp(HCl)250℃]；IR(neat)1694(C＝O)cm-1；1H NMR(CDCl3)δ2.48(s，3H，CH3)，3.31(s，2H，CH2)，3.74(s，2H，CH2)，7.22(d，1H，J＝7.7Hz，ArH)，7.34(t，1H，J＝7.9Hz，ArH)，7.50(t，1H，J＝7.5Hz，ArH)，8.02(d，1H，J＝7.9Hz，ArH).8，9-二羥基-2，3，7，11b-四氫-1H-萘并-(1，2，3-de)異喹啉的合成于-78℃在氮?dú)庀?，?，3-二甲氧基-N，N’一二乙基苯甲酰氨(化合物8)(14.94g，63mmol)的乙醚(1400mL)溶液中通過(guò)橡膠隔膜經(jīng)注射器順序逐滴加入，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TMEDA，9.45mL，63mmol)，仲丁基鋰(53.3ml，69mmol，1.3M的己烷溶液〕。1小時(shí)后，加入新蒸餾的化合物7(10.1g，62.7mmol)至多相的混合物中。移去冷卻浴并使反應(yīng)混合物經(jīng)9小時(shí)溫至室溫。然后加入飽和的NH4Cl溶液(400mL)并攪拌混合物15分鐘。分離乙醚層并將水層用二氯甲烷(4×100mL)萃取。合并有機(jī)層，干燥(MgSO4)，蒸發(fā)至棕色油狀物。溶解該油狀物于甲苯(500mL)中，和3.0g的對(duì)甲苯磺酸一起加熱回流8小時(shí)，冷卻，并在真空下濃縮。將殘留物溶于二氯甲烷中，用稀的NaHCO3水溶液和水分別洗滌，然后干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)得到膠狀殘留物。與乙酸乙酯-己烷(50∶50)研制后，沉淀出固體。從乙酸乙酯-己烷重結(jié)晶得到12.75g(63％)的化合物9(2′，3′-二氫-4，5-二甲氧基-2′-甲基螺[異苯并呋喃-1(3H)-4′(1′H)異喹啉]-3-酮)mp 193-194℃；IR(KBr)1752cm-1(C＝O)；1H NMR(CDCl3)δ2.47(s，3H，NCH3)，2.88(d，1H，J＝11.6Hz)，3.02(d，1H，J＝11.7Hz)，3.76(d，1H，J＝15.0Hz)，3.79(d，1H，J＝15.1Hz)，3.90(s，3H，OCH3)，4.17(s，3H，OCH3)，6.83(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.03(d，1H，J＝8.2Hz，ArH)，7.11(m 3H，ArH)，7.22(m，1H，ArH)；MS(CI)m/z 326(100)；元素分析(C19H19NO4)C，H，N.
2′，3′-二氫-4，5-二甲氧基-螺[異苯并呋喃-1(3H)，4′(1′H)異喹啉]-3-酮(10)。
將1-氯-乙基氯甲酸酯(5.1ml，46.3mmol)于0℃在氮?dú)庀?，逐滴加入至化合?(6.21g，19.2mmol)在100mL的1，2-二氯乙烷的懸浮液中。在0℃下攪拌混合物15分鐘，然后加熱回流8小時(shí)。冷卻混合物，在減壓下濃縮。向該混合物中加入75mL的甲醇并將反應(yīng)加熱回流過(guò)夜。冷卻后，減壓蒸發(fā)溶劑得到化合物10的鹽酸鹽，近定量產(chǎn)率。產(chǎn)品有足夠純度用于下一步驟而不必進(jìn)一步純化mp(HCl)220-222℃mp(base)208-210℃；IR(CH2Cl2，base)1754cm-1(C＝O)；1H NMR(CDCl3，base)δ3.18(d，1H，J＝13.5Hz)，3.30(d，1H，J＝13.5Hz)，3.84(s，3H，OCH3)，3.96(s，3H，OCH3)，4.02(s，2H，CH2N)，6.67(d，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.12(m，2H，ArH)，7.19(d，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.26(t，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.41(d，1H，J＝8.5Hz，ArH)；MS(CI)m/z 312(100)；HRCIMS Calculated for C18H17NO4312.1236；Found312.1198；元素分析(C18H17NO4)H，N；C理論值69.44；實(shí)測(cè)值68.01.
2′，3′-二氫-4，5-二甲氧基-2′-對(duì)甲苯磺酰基螺[異苯并呋喃-1(3H)，4′(1′H)異喹啉]-3-酮(11)。
將7mL的三乙基胺，于0℃在氮?dú)庀?，逐滴加入至?duì)甲苯磺酰氯(3.6g，18.9mmole)，化合物10(以HCl鹽形式，得自19.2mmol的化合物9)和氯仿(10mL)的混合物中。滴加完畢后，移去冰浴并將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后用100mL冷的0.1N HCl水溶液酸化，用二氯甲烷(2×100mL)萃取，并干燥(MgSO4)有機(jī)萃取液，過(guò)濾，在真空下蒸發(fā)得到粘性液體，在0℃將其與乙酸乙酯-己烷研制得到固體。自乙酸乙酯-己烷重結(jié)晶得到8.74g(97％，自化合物9計(jì)算)的化合物11mp208-210℃；IR(KBr)1767cm-1(C＝O)；1H NMR(CDCl3)δ2.43(s，1H，CH3)，3.22(d，1H，J＝11Hz)，3.88(d，1H，J＝11Hz)，3.90(s，3H，OCH3)，3.96(d，1H，J＝15Hz)，4.17(s，3H，OCH3)，4.81(d，1H，J＝15Hz)，6.97(d，1H，J＝7.7Hz，ArH)，7.16(m，3H，ArH)，7.26(m，1H，ArH)，7.38(d，2H，J＝8Hz，ArH)，7.72(d，2H，J＝8Hz，ArH)；MS(CI)m/z 466(100)；元素分析(C25H23NO6S)C，H，N.
3，4-二甲氧基-6-[(2-對(duì)甲苯磺?；?1，2，3，4-四氫異喹啉)-4-基]苯甲酸(12)。
將化合物11(2.56g，5.51mmol)在冰乙酸(250mL)，中的溶液與10％鈀/活性碳(6.30g)于Parr氫化器上在室溫下以50磅/平方英寸震搖48小時(shí)過(guò)濾除去催化劑，蒸發(fā)溶劑得到2.55g(99％)的化合物12，它有足夠純度進(jìn)行下一步驟。分析用樣品用乙醇-水重結(jié)晶mp182-184℃；IR(KBr)1717cm-1(COOH)；1H NMR(DMSO-d6)δ2.35(s，3H，CH3)，3.12(m，1H)，3.51(dd，1H，J＝5，11.5Hz)，3.71(s，6H，OCH3)，4.10(m，1H，Ar2CH)，4.23(s，2H，ArCH2N)，6.52(d，1H，J＝7.5Hz，ArH)，6.78(d，1H，J＝7.5Hz，ArH)，6.90(m，1H，ArH)，7.07(t，1H，J＝8Hz，ArH)，7.14(t，1H，J＝6.5Hz，ArH)，7.20(d，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.38(d，2H，J＝8Hz，ArH)，7.63(d，2H，J＝8.5Hz，ArH)；MS(CI)m/z 468(16)，450(63)，296(100)；HRCIMS理論值for C25H25NO6S468.1481；實(shí)測(cè)值468.1467；元素分析(C25H25NO6S)C，H，N.2-N-對(duì)甲苯磺?；?4-(2-羥甲基-3，4-二甲氧基苯基)-1，2，3，4-四氫異喹啉(13)。
在0℃于氮?dú)庀?，向化合?2(1.4g，2.99mmol)在干燥四氫呋喃的溶液中，加入1.0M甲硼烷-四氫呋喃(8mL)。加入完成后將混合物回流攪拌過(guò)夜。加入另外的乙硼烷(4mL)并繼續(xù)攪拌30分鐘。冷卻和減壓蒸發(fā)后，小心地加入甲醇(30mL)，并于低壓下除去溶劑。重復(fù)該步驟三次以保證中間體甲硼烷復(fù)合物的甲醇解。蒸發(fā)溶劑給出1.10g(81％)的化合物13粗品。分析用樣品是通過(guò)閃黃色譜(硅膠，EtOAc/己烷)，隨之從乙酸乙酯/己烷重結(jié)晶純化的mp162-164℃；1H NMR(CDCl3)δ2.38(s，3H，CH3)，3.18(dd，1H，J＝7.5，11.9Hz)，3.67(dd，1H，J＝4.5，11.8Hz)，3.81(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，4.27(d，1H，J＝15Hz)，4.40 d，1H，J＝15Hz)，4.57(t，1H，J＝6Hz，CHAr2)，4.71(s，2H，CH2OH)，6.58(d，1H，J＝8.5Hz，ArH)，6.74(d，1H，J＝8.6Hz，ArH)，6.84(d，1H，J＝7.7Hz，ArH)，7.08(t，2H，J＝7.6Hz，ArH)，7.14(t，1H，J＝6.6Hz，ArH)，7.27(d，2H，J＝8Hz，ArH)，7.65(d，2H，J＝8Hz，ArH)；MS(CI)m/z 454(2.57)，436(100)；元素分析(C25H27NO5S)C，H，N.
8，9-二甲氧基-2-對(duì)甲苯磺?；?2，3，7，11b-四氫-1H-萘(1，2，3-de)異喹啉(14)。
于-40℃在氮?dú)庀拢趧×业貦C(jī)械攪拌下，將粉狀化合物13(427mg，0.98mmol)分批加入至50mL冷的濃硫酸中。加完后，將反應(yīng)混合物2小時(shí)內(nèi)溫?zé)嶂?5℃，然后傾入至碎冰(450g)中并攪拌1小時(shí)。產(chǎn)品用二氯甲烷(2×150mL)萃取，水(2×150mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)，得到油狀物，在0℃用乙醚研制得到化合物14(353mg，82％〕，為白色固體，未進(jìn)一步純化即用于下一步驟。分析用樣品是通過(guò)用50％乙酸乙酯-己烷為洗脫劑進(jìn)行離心旋轉(zhuǎn)色譜，隨之從EtOAc/己烷中重結(jié)晶來(lái)制備的mp 204-206℃；1H NMR(CDCl3)δ2.40(s，3H，CH3)，2.80(m，1H，H-1a)，3.50(dd，1H，J＝4.5，17.5Hz，H-1b)，3.70(dd，1H，J＝7，14Hz，H-3a)，3.828(s，3H，OCH3)，3.832(s，3H，OCH3)，3.9(m，1H，H-11b)，4.31(d，1H，J＝17.6Hz，H-7a)，4.74(ddd，1H，J＝1.7，6.0，11.2Hz，H-7b)，4.76(d，1H，J＝14.8Hz，H-3b)，6.77(d，1H，J＝8.3Hz，ArH)，6.87(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，6.94(d，1H，J＝7.6Hz，ArH)，7.13(t，1H，J＝7.5Hz，Ar-H-5)，7.18(d，1H，J＝7.2Hz，ArH)，7.33(d，2H，J＝8.1Hz，ArH)，7.78(d，2H，J＝8.2Hz，ArH)；MS(CI)m/z 436(55)，198(86157(100)；HRCIMS理論值for C25H25NO4S436.1583；實(shí)測(cè)值436.1570；元素分析(C25H25NO4S)C，H，N.
8，9-二甲氧基-2，3，7，11b-四氫-1H-萘(1，2，3，-de)異喹啉(15)。
在氮?dú)庵杏谑覝叵?，攪拌化合?4(440mg，1.01mmol)，干燥甲醇(10mL)和磷酸氫二鈉(574mg，4.04mmol)的混合物。向該混合物中分三批加入6.20g的6％Na-Hg并將反應(yīng)加熱回流2小時(shí)。冷卻后，加入水(200mL)并用乙醚(3×200mL)萃取混合物。合并乙醚層，干燥(MgSO4)，過(guò)濾(硅藻土)，并蒸發(fā)給出油狀物，在真空下固化。旋轉(zhuǎn)色譜處理后，得到142mg(50％)的化合物15，為油狀物。該油狀物暴露于空氣中很快變深并立即在下一步驟中使用。小部分的油用乙醚HCl處理并且將化合物15的鹽酸鹽從乙醇-乙醚中重結(jié)晶
mp(HCl salt)190℃(dec)；1H NMR(CDCl3，base)δ3.13(dd，1H，J＝10.8，12Hz，H-1a)，3.50(dd，1H，J＝3.4，17.4Hz，H-1b)，3.70(m，1H，H-11b)，3.839(s，3H，OCH3)，3.842(s，3H，OCH3)，4.03(dd，1H，J＝6，12Hz，H-7a)，4.08(s，2H，H-3)，4.33(d，1H，J＝17.4Hz，H-7b)，6.78(d，1H，J＝8.24Hz，ArH)，6.92(m，3H，ArH)，7.11(t，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.18(d，1H，J＝7.5Hz，ArH)；MS(CI)m/z 282(100)；HRCIMS理論值for C18H19NO2282.1494；實(shí)測(cè)值282.1497.
8，9-二羥基-2，3，7，11b-四氫-1H-萘(1，2，3-de)異喹啉(4)。
在-78℃下向化合物15(25mg，0.089mmole)的二氯甲烷(5mL)溶液中加入三溴化硼(0.04ml，0.106g，0.42mmol)。在-78℃于氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)后，移去冷卻浴并將反應(yīng)混合物在室溫靜置5小時(shí)。然后冷卻至-78℃并小心地加入甲醇(2mL)。室溫下攪拌15分鐘后，減壓蒸發(fā)溶劑。加入更多的甲醇并將該過(guò)程重復(fù)三次。將所得灰色固體從乙醇-乙酸乙酯中重結(jié)晶，得到總量為12mg(41％)的化合物4的氫溴酸鹽mp258℃(dec)；1H NMR(HBr salt，CD3OD)δ3.43(t，1H，J＝12Hz，H-1a)，3.48(dd，1H，J＝3.5，18Hz，H-1b)，4.04(m，1H，H-11b)，4.38(dd，2H，J＝5.5，12Hz，H-7)，4.44(s，2H，H-3)，6.58(d，1H，J＝8.5Hz，ArH)，6.71(d，1H，J＝8.5Hz，ArH)，7.11(d，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.25(t，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.32，d，1H，J＝7.5Hz，ArH)；MS(CI)m/z254(100)； HRCIMS理論值for C16H15NO2254.1181；實(shí)測(cè)值254.1192.
Dinapsoline的藥理方法成年雄性Sprague Dawley大鼠(200-250g)得自Charles River養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室(Raleigh，NC)或Harlan實(shí)驗(yàn)室(Indianapolis IN)。斷頭處死大鼠，將整個(gè)腦取出并在冰冷的鹽水中短時(shí)間冷卻。在解剖砧板(block)幫助下將腦薄切片，并將中央紋狀體從合有這一區(qū)域主要部分的兩個(gè)冠狀部分切下。立即用干冰冷凍組織并于-70℃保存直到實(shí)驗(yàn)?zāi)且惶臁＜?xì)胞培育。表達(dá)恒河猴D1A受體(C-6-mD1A)；Machida等1992)的C-6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞是在含有4,500mg/L葡萄糖，L-谷氨酰胺，5％胎牛血清和600ng/mL G418或2μg/mL嘌呤霉素的DMEM-H培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的。細(xì)胞于37℃用5％CO2在濕潤(rùn)的孵育箱中保持。
膜制備。
細(xì)胞在75cm3的燒瓶中生長(zhǎng)至融合。用10mL冰冷的低滲緩沖劑(HOB)(5mM Hepes，2.5mM MgCl2，1mM EDTA；pH7.4)將細(xì)胞于4℃清洗并溶解10分鐘。使用Baxter(Mc Gaw Park，IL)的無(wú)菌細(xì)胞刮器將細(xì)胞從燒瓶中刮下。用5mL的HOB最后漂洗燒瓶。自各燒瓶回收的細(xì)胞懸浮液的最終體積約14mL。然后合并從幾個(gè)瓶中刮到的膜。均漿化(10次撞擊)合并的細(xì)胞懸浮液，每次14mL，使用15mL的Wheaton Teflon-玻璃勻漿器。合并細(xì)胞勻漿并于4℃在43,000xg(Sorvall RC-5B/SS-34，Du Pont，Wilmington，DE)旋轉(zhuǎn)20分鐘。去除上清液，對(duì)每個(gè)原來(lái)的瓶子的勻漿化了的細(xì)胞，將沉淀再懸浮(10次沖擊)于1mL的冰冷的HOB中。于4℃在43,000xg將該勻漿液重新旋轉(zhuǎn)20分鐘。移出上清液并將最終沉淀物于冰冷貯存的緩沖液(50mM Hepes，6mM MgCl2，1mM EDTA；pH7.4)中再懸浮(10次撞擊)，得到終濃度為約2.0mg蛋白/mL。于-80℃在微量離心管中保存等分的最終勻漿。在它們用于腺苷酸環(huán)化酶測(cè)定之前；各膜制品的蛋白水平用適用于微量板讀數(shù)器Molecular Devices；MenloPark，(A)的BCA蛋白分析試劑(Pierce，Rockfbrd，IL)，定量測(cè)定。
多巴胺受體結(jié)合檢驗(yàn)。
在8mL冰冷的含4.0mM MgCl2(pH7.4)的50nM HEPES緩沖液中將冰凍的大鼠紋狀體通過(guò)7次人工撞擊在Wheaton Teflon-玻璃勻漿器中勻漿化。組織在27,000xg下離心10分鐘，棄去上清液，將沉淀物勻化(5次撞擊)并在冰冷的緩沖液中重懸浮并再次離心。最終沉淀物以2.0mg濕重/mL的濃度懸浮。加入至各測(cè)定管中的組織的量為1.0mg，在最終的1.0mL的測(cè)定體積中。D1受體用[3H]SCH 233390 0.30nM)標(biāo)記；D2受體用[3H]螺哌隆(0.07nM)標(biāo)記；加入未標(biāo)記的酮色林(50nM)以摭蔽結(jié)合至5-HT2的位置?？偨Y(jié)合定義為在無(wú)任何競(jìng)爭(zhēng)性藥物的存在下的放射配體結(jié)合。非特異結(jié)合是通過(guò)分別加入未標(biāo)記的SCH 23390(1μM)或未標(biāo)記的氯丙嗪(1μM)，對(duì)D1和D2受體結(jié)合試驗(yàn)來(lái)加以測(cè)定的。作為內(nèi)標(biāo)，每個(gè)試驗(yàn)包括有六個(gè)濃度的未標(biāo)記的SCH23390(D1結(jié)合)或氯丙嗪(D2結(jié)合)的競(jìng)爭(zhēng)曲線。每個(gè)藥物濃度進(jìn)行三次測(cè)定。在37℃將測(cè)試管孵育15分鐘，并且結(jié)合是通過(guò)于Skatron 12井細(xì)胞收獲器(skatron，Inc.，Sterling，VA)用玻璃纖維過(guò)濾墊(skatronno.7034)在冰冷的緩沖液中過(guò)濾加以測(cè)定的。使濾瓶干燥并加入1.0mL的Optiphase HI-SAF II閃爍流體。放射活性是在LKB Wallac 1219RackBeta流體閃爍計(jì)數(shù)器(Wallac，Gaithersburg，MD)上測(cè)定的。通過(guò)用BCA蛋白分析試劑(Pierce Rockford，IL)測(cè)定組織蛋白水平。
放射受體檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析。
分別分析來(lái)自各測(cè)定的結(jié)合數(shù)據(jù)。通過(guò)將在每個(gè)競(jìng)爭(zhēng)劑濃度下的平均dpm表示為總結(jié)合的百分率將數(shù)據(jù)歸一化。然后對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析，這是通過(guò)應(yīng)用曲線一擬合程序Inplot(Graphpad Inc.SanFrancisco，CA)或EBDA和LIGAND軟件，并經(jīng)McPherson修改以適用于IBM-PC，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行S形曲線計(jì)算，對(duì)每個(gè)曲線產(chǎn)生K0.5值和Hill系數(shù)(nH)對(duì)偏差的分析表明擬合的很好，對(duì)本實(shí)驗(yàn)的所有曲線，r值大于0.99。
大鼠紋狀體中腺苷酸環(huán)化酶的活性。
通過(guò)從其它標(biāo)記的核苷酸分離cAMP，使用Schulz和Mailman的自動(dòng)HPLC方法測(cè)定腺苷酸環(huán)化酶活性。簡(jiǎn)言之，將來(lái)自大鼠紋狀體的組織在wheaton-Teflon玻璃勻漿器中用8次手動(dòng)撞擊，在含有2mM EGTA(50mL/g組織)的5mM HEPES緩沖劑(pH7.5)中使之勻漿化。在加入并混合50mL/g的含有2mM EGTA的50mM HEPES緩沖劑之后，加入20μL該組織勻漿的等分樣品至制備好的反應(yīng)混合物(最終體積為100μL)，該混合物含有0.5mM ATP，0.5mM異丁基甲基黃嘌呤，〔32P〕ATP(0.5μCi)1mM cAMP，2mM MgCl2，100mM HEPES緩沖劑，2μM GTP，0-100μM多巴胺，DHX或SKF38393，10mM磷酸肌酸和5U肌酸磷酸激酶。對(duì)各藥物濃度進(jìn)行三次測(cè)定。
反應(yīng)在30℃進(jìn)行15分鐘并通過(guò)加入100μL的3％十二烷基硫酸鹽(SDS)終止。通過(guò)加入各300μL的4.5％ZnSO4和10％Ba(OH)2，沉淀蛋白質(zhì)及許多非環(huán)核苷酸。離心(10,000xg 8-9分鐘)樣品，將上層清液注入HPLC系統(tǒng)(Waters Z-模件(module)或RCM 8×10模件，配置C18，10微米柱)。流動(dòng)相為有23％甲醇的150mM乙酸鈉(pH5.0)用UV檢測(cè)器(254nM檢測(cè))將未標(biāo)記的cAMP定量加入至樣品中作為內(nèi)標(biāo)。每份中的放射活性是通過(guò)直通型放射檢測(cè)器(InusSystems，Tampa，F(xiàn)L)，用Cerenkov記數(shù)器加以測(cè)定的。樣品回收是基于用UV測(cè)量總的未標(biāo)記cAMP的峰面積，通過(guò)用PE Nelson(Cupertino，CA)型900數(shù)據(jù)收集模件和TurboChrom軟件定量的。使用BCA蛋白分析試劑(Pierce，Rockford，IL)測(cè)定組織蛋白水平。
在C-6mD1∧細(xì)胞中腺苷酸環(huán)化酶的測(cè)定。
解凍冷凍的膜并加入至含有制備好的反應(yīng)混合物和選擇藥物的檢驗(yàn)管中。該混合物含有100nM Hepes，(pH7.4)，100mM NaCl，4mMMgCl2，2mM EDTA，500μM異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)，0.01％抗壞血酸，10μM帕吉林，2mM ATP，5μM GTP，20mM磷酸肌酸，5單位的肌酸磷酸激酶(CPK)，1μM普萘洛爾。
最終反應(yīng)體積為100μL。
基礎(chǔ)的cAMP活性是通過(guò)在無(wú)藥物加入的反應(yīng)混合物中孵育組織來(lái)測(cè)定的。兩次測(cè)定檢驗(yàn)管并且，于30℃孵育15分鐘后，通過(guò)加入500μl0.1N HCl以停止反應(yīng)。將檢驗(yàn)管略加振搖，然后在BHG HermLe Z230M微量離心儀中在15,000xg旋轉(zhuǎn)5分鐘以沉淀顆粒。
cAMP的放射免疫測(cè)定(RIA)。
各樣品中cAMP的濃度由乙酰化的cAMP的RIA測(cè)定，后者來(lái)自前述的修飾。cAMP的碘化通過(guò)Patel和Linden報(bào)道的方法進(jìn)行。試驗(yàn)緩沖劑是有0.1％疊氮化鈉的50mM乙酸鈉(pH4.75)。cAMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線是在緩沖劑中于濃度2至500fmol/檢驗(yàn)管制備的。為提高靈敏度，用10μl2∶1的三乙胺∶乙酸酐的溶液乙酰化所有的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品。樣品測(cè)定兩次。各檢驗(yàn)管(總體積300μL)包含25μL的各樣品，75μL緩沖劑，100μL初級(jí)抗體(綿羊，抗-cAMP，1∶100,000用含1％BSA的緩沖劑稀釋)和100μL的〔125I〕-cAMP(50,000dpm/100μL的緩沖劑)。旋轉(zhuǎn)檢驗(yàn)管并在0℃過(guò)夜約18小時(shí)保存。通過(guò)加入25μL的BioMag兔，抗-山羊IgG(Advanced Magnetics，Cambridge MA)，并隨之旋轉(zhuǎn)并在4℃孵育1小時(shí)，將抗體-結(jié)合的放射活性分離。向這些樣品加入1mL的12％聚乙二醇/50mM乙酸鈉緩沖劑(pH6.75)并將檢驗(yàn)管在1700xg離心10分鐘。吸出上清液并用LKB Wallac gamma計(jì)數(shù)器(Gaithersburg，MD)測(cè)定沉淀顆粒中的放射性活度。
對(duì)腺苷酸環(huán)化酶研究的數(shù)據(jù)分析。
各樣品的數(shù)據(jù)起初以pmol/mg/分鐘cAMP表示。從各藥物條件下產(chǎn)生的cAMP總量減去cAMP的基線值。各藥物的數(shù)據(jù)是用相對(duì)于由100μMDA產(chǎn)生的刺激來(lái)表示。結(jié)果在大鼠紋狀體勻漿中，dinapsoline對(duì)D1受體的結(jié)合和功能效果。如圖3所示，dinapsoline在大鼠紋狀體勻漿中的D1受體上以高親合性競(jìng)爭(zhēng)，與完全D1激動(dòng)劑dihydrexidine相同的親合性。dinapsoline和dihydrexidine兩者與原型D1拮抗劑SCH 23390(1)相比，它們的競(jìng)爭(zhēng)曲線有更淺的斜率。
表1概述了(+)-3和(±)-4對(duì)大鼠腦中的多巴胺受體的親合性。在大鼠紋狀體的勻漿中進(jìn)行對(duì)多巴胺受體放射配體結(jié)合研究，在50nM未標(biāo)記的酮色林(D2位置)的存在下，使用0.3nM3H-SCH23390(D1位置)和0.07nM3H-螺哌隆。用非線性回歸分析競(jìng)爭(zhēng)曲線以測(cè)定K0.5和Hillslope(nH)的估計(jì)值。數(shù)據(jù)表示來(lái)自各試驗(yàn)化合物的三個(gè)獨(dú)立分析的平均和標(biāo)準(zhǔn)誤差。表1。(+)-3和(±)-4在大鼠腦中的多巴胺受體的親合性的摘要。
D1結(jié)合D2結(jié)合化合物 K0.5(nM) nH K0.5(nM) nH(±)-45.93±0.45 0.66±0.01 31.3±4.4 0.71±0.03(+)-3 4.59±0.28 0.65±0.01 43.2±3.2 0.72±0.04(+)-2 17±4 0.75±0.08 Not Tested --------(+)-1 0.30±0.01 1.05±0.01 Not Tested --------氯丙嗪沒(méi)有試驗(yàn)-------- 0.92±0.12 0.93±0.01
試驗(yàn)化合物〔(+)-SKF 38393＝(+)-2；(±)-反式-10，11-二羥基-5，6，6a，7，8，12b-六氫苯并〔a〕菲啶＝(±)-3；和(±)-8，9-二羥基-2，3，7，11b-四氫-1H-萘并〔1，2，3-de〕異喹啉＝4〕刺激cAMP聚積的能力在大鼠紋狀體的勻漿中加以檢測(cè)。包括高親合性的完全激動(dòng)劑(±)-3和部分激動(dòng)劑(+)-2以作比較。這些試驗(yàn)的數(shù)據(jù)示于圖4中，平均±SEM得自至少三個(gè)試驗(yàn)。dinapsoline和dihydrexidine兩者的飽和濃度(10μM)導(dǎo)致在cAMP合成上同樣程度的增加(dinapsoline為95.8％±4.7和dihydrexidine為91.3％±4.6)，這和多巴胺(100μM)濃度的最大作用一樣。相反地，部分激動(dòng)劑(+)-2導(dǎo)致小于50％刺激(40.7±7.0對(duì)SKF 38393)。這些作用被D1拮抗劑SCH 23390所阻滯。
在C-6神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(C-6-mD1細(xì)胞)上表達(dá)的克隆的靈長(zhǎng)類D1A受體上亦測(cè)試了dinapsoline的功能性效能。如圖5所示，化合物dinapsoline在此制備物中也表現(xiàn)出完全效能，EC50約為30nM(數(shù)據(jù)代表了重復(fù)進(jìn)行兩次試驗(yàn)的平均值)。(+)-反式-10，11-二羥基-5，6，6a，7，8，12b-六氫苯并〔a〕菲啶(dihydrexidine)在此制備物中也表現(xiàn)出完全效能，然而(+)-2僅為部分效能。
在D2受體的結(jié)合。研究了dinapsoline在大鼠紋狀體勻漿中的D2受體競(jìng)爭(zhēng)的能力。如圖6和表1所示，dinapsoline對(duì)大鼠紋狀體勻漿中的D2-類似受體的親合力(K0.5＝31nM)實(shí)際上高于dihydrexidine對(duì)D2-類似受體的親合力(K0.5＝50nM)。在圖6中也可看出，dinapsoline和dihydrexidine兩者的競(jìng)爭(zhēng)曲線的斜率都比原型的D2拮抗劑氯丙嗪的要淺。
使用相同的在實(shí)例1中所述通用方法，如表II中所列實(shí)例2-48的化合物，是通過(guò)使用相應(yīng)于反應(yīng)式1和2(圖1和2)中描述的起始化合物合成的，但用適當(dāng)?shù)墓δ芑右匀〈?，以提供合適的取代類型，如每個(gè)實(shí)例中所示的稠合的萘并異喹啉產(chǎn)物上所描述的。因此，例如，化合物5a(反應(yīng)式1)的3，4和/或5取代類似物分別提供在式I上相應(yīng)的取代基R4，R3和R2。在反應(yīng)式I的步驟b中用N-甲基丙氨酸酯或N-甲基纈氨酸酯代替肌氨酸酯將提供相應(yīng)的式I的化合物，其中R5分別地是甲基和異丙基。用其它的2和3取代的苯甲酰胺(反應(yīng)式2中化合物8的類似物)提供在式1中C8和C9相應(yīng)的取代類型。實(shí)例序號(hào)R R1R2R3R4R5X2 H HCH3H HHOH3 H HHCH3HHOH4 H HHH CH3HOH5 H HC6H5H HHOH6 CH3HCH3H HHOH7 C3H7HHCH3HHOH8 H HC2H5H HHOH9 H HHC2H5HHOH10H HHCH3CH3HBr11C3H7HCH3CH3HHOH12C2H5HHCH3CH3HBr13CH3HHH C2H5HOH14C2H9HHOH HHOH15H HCH3OH HHOH16H HHF HHOH17H HOH H HHBr18H HBr H HHOH19H CH3HBr HHOCH320H CH3HH Br HOCH321H CH3CH3Br HHOCH322CH3HFH HHOH23CH3HHF HHOH24CH3HHH FHOH實(shí)例序號(hào) R R1R2R3R4R5X25C3H6HH OH HH F26C2H5HCH3OH HH F27C2H5HCH3O HCH3H F28C3H7HH CH3OHH Cl29C3H7HH CH3CH3OH Cl30C3H7HC2H5O HHH OH31C3H3HH HOH H OH32C4H9HCH3HHH OH33C4H9HH OH CH3H OH34C4H9HOHCl-HH OH35C4H9HOHCl HH OH36C4H9HH CH3HH I37HHH HHH H38HHCH3HHH H39HHH CH3HH H40HHH HCH3H H41HHH HHCH3OH42HHH HHCH2(CH3)2OH43HHH HHCH3H44HHH HHCH2(CH3)2H45HHCH3HHCH3OH46HHH CH3HCH3OH47HHH HCH3CH3OH48HHH HHCH2CH3OH
前述的實(shí)例為本發(fā)明的闡明但并不意于將本發(fā)明局限在已公開(kāi)的化合物。對(duì)所舉化合物的變更和修飾，對(duì)熟悉本領(lǐng)域工作者是明顯的，也在如下述權(quán)利要求中所詳述的本發(fā)明的范圍和本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)。
權(quán)利要求
1.下式的化合物
及其可供藥用的鹽，其中R和R5是氫或C1-C4烷基；R1是氫，C1-C4烷基或苯氧基保護(hù)基團(tuán)；X是氫，鹵素或式-OR6的基團(tuán)，其中R6是氫，C1-C4烷基或苯氧基保護(hù)基團(tuán)，此外，當(dāng)X是式-OR6的基團(tuán)時(shí)，R1和R6可以一起形成式-CH2-的基團(tuán)；和R2，R3和R4獨(dú)立地選自包括氫，C1-C4烷基，苯基，鹵素，或-OR1基團(tuán)，其中R1如上述定義。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中X是羥基和R1是氫。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R和R5是氫。
4.權(quán)利要求2的化合物，其中R和R5是氫。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中R2，R3，R4和R5分別是氫。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中X和R1是氫。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中R5是氫。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中R5是C1-C4烷基。
9.治療對(duì)中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)有與多巴胺相關(guān)的機(jī)能障礙的患者的方法，該機(jī)能障礙表現(xiàn)為明顯的神經(jīng)病學(xué)的，心理的，生理的，或行為的病癥，該方法包括將有效量的下式化合物及其可供藥用的鹽給藥于患者的步驟以降低所述癥狀，
其中R和R5是氫或C1-C4烷基；R1是氫，C1-C4烷基或苯氧基保護(hù)基團(tuán)；X是氫，鹵素或式-OR6的基團(tuán)，其中R6是氫，C1-C4烷基或苯氧基保護(hù)基團(tuán)，此外，當(dāng)X是式-OR6基團(tuán)時(shí)，基團(tuán)R1和R6可以一起形成式-CH2-的基團(tuán)；R2，R3和R4獨(dú)立地選自包括氫，C1-C4烷基，苯基，鹵素，或OR1基團(tuán)，其中R1如上述定義。
10.治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的與多巴胺相關(guān)的機(jī)能障礙的藥物組合物，該組合物包含有治療有效量的下式的化合物及其可供藥用的鹽，和可供藥用的載體，
其中R和R5是氫或C1-C4烷基；R1是氫，C1-C4烷基或苯氧基保護(hù)基團(tuán)；X是氫，鹵素或式-OR6的基團(tuán)，其中R6是氫，C1-C4烷基或苯氧基保護(hù)基團(tuán)，此外，當(dāng)X是式-OR6基團(tuán)時(shí)，基團(tuán)R1和R6可一起形成式-CH2-基團(tuán)；R2，R3和R4獨(dú)立選自包括氫，C1-C4烷基，苯基，鹵素，或OR1基團(tuán)，其中R1如上述定義。
全文摘要
本發(fā)明涉及右式的新的多巴胺受體的配體,這些化合物的藥物配方,和使用這些化合物治療患有中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)與多巴胺相關(guān)的機(jī)能障礙的患者的方法。
文檔編號(hào)C07D491/056GK1199338SQ9619747
公開(kāi)日1998年11月18日 申請(qǐng)日期1996年8月16日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月18日
發(fā)明者D·E·尼科爾斯, R·邁爾曼, D·勾思 申請(qǐng)人:普渡研究基金會(huì), 北卡羅來(lái)納-查佩爾山大學(xué)