專利名稱：用作配體的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作配體的肽，制備該肽的方法，以及該肽作為免疫球蛋白配體的應用。
更特別的是，本發(fā)明涉及能與免疫球蛋白不變區(qū)部分本身以非共價結(jié)合的肽。
免疫球蛋白，即所謂的抗體，在診斷和治療領(lǐng)域是非常重要的。實際上，在第一種情況下，免疫球蛋白被廣泛地用作對生物液體中的化合物進行定性和定量的試劑，而在第二種情況下，免疫球蛋白被用作能將其本身與生物分子相結(jié)合的藥劑，其中所述的生物分子存在于體現(xiàn)治療重要性的生理過程中，考慮到上述重要性，從產(chǎn)業(yè)角度出發(fā)，免疫球蛋白的生產(chǎn)尤其是它們的純化是非常重要的。
可從動物血清中或從適合的細胞系培養(yǎng)物中獲得免疫球蛋白。
通過常規(guī)色譜法進行免疫球蛋白的純化，如離子交換或凝膠過濾，或優(yōu)選使用親和色譜法，親和色譜法采用的柱子由固定化A蛋白制備，A蛋白得自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，其本身能特異性地與免疫球蛋白的不變區(qū)部分結(jié)合[Siodahl，J.Eur.J.，Biochem 78471-490(1977)]。但是，當大規(guī)模使用A蛋白時就會受許多限制，這是因為它的提取來源需要精心的控制和仔細的純化，以使采用所述蛋白而純化的產(chǎn)品免受污染。此外，A蛋白對于變性條件和在用來除去生物雜質(zhì)如病毒或核酸片斷的試劑存在下不是很穩(wěn)定的。最終使得A蛋白的生產(chǎn)成本非常高并限制其大規(guī)模用于純化。
因此，考慮到識別免疫球蛋白不變區(qū)部分的能力，仍非常需要具有極類似于A蛋白的合成配體，但其生產(chǎn)成本低。并且，由于是通過合成而得，不會含生物雜質(zhì)。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)含精氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的氨基酸殘基的肽具有這些性質(zhì)。
特別的是，已發(fā)現(xiàn)含下面序列的肽具有上述性質(zhì)-HN-X1-Thr-X2-CO- (S)其中X1是具有L或D構(gòu)型的精氨酸或酪氨酸的氨基酸殘基，X2是具有L或D構(gòu)型的酪氨酸或精氨酸的氨基酸殘基，Thr是具有L或D構(gòu)型的蘇氨酸的氨基酸殘基，但條件是，當X2為酪氨酸時，X1為精氨酸，且當X2為精氨酸時，X1為酪氨酸。
優(yōu)選的是，序列(S)中至少一個氨基酸殘基具有D構(gòu)型。
更為優(yōu)選的是，序列(S)中有兩個或三個氨基酸殘基全部為D構(gòu)型。
因此本發(fā)明的第一個目的是提供式(I)的肽(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R(I)其中X1和X2彼此不同，其為L或D構(gòu)型的精氨酸或酪氨酸的氨基酸殘基，其中蘇氨酸和酪氨酸的羥基及精氨酸的胍部分可分別用肽化學中保護羥基和胍部分的常規(guī)化合物進行保護，n是1、2、3或4，和當n為2、3或4時，R為適于形成二聚物、三聚物或四聚物的基團，而當n為1時，R是OH，單一的氨基酸殘基或含多至7個氨基酸殘基的肽鏈。
本文所用的術(shù)語＂二聚物＂、＂三聚物＂和＂四聚物＂是指含2、3或4個序列(S)的肽。
適于形成二聚物(n＝2)的基團的典型例子為賴氨酸殘基。適于形成三聚物(n＝3)的基團的典型例子是式為Lys-Lys的二肽賴氨酰-賴氨酸。適于形成四聚物(n＝4)的基團的典型例子是式為Lys-Lys(ε-Lys)的支鏈三肽。
四聚物式(I)的典型例子具有下式(H2N-X1-Thr-X2-CO)4-Lys2-Lys-Gly-OH(A)其中X1和X2具有上述的意義，且其中蘇氨酸和酪氨酸的羥基及精氨酸的胍部分可分別用肽化學中保護羥基和胍部分的常規(guī)化合物進行保護。
肽合成中用于保護羥基的許多保護基報道于文獻(G.A.Grant，Synthetic peptidesa user′s guide，F(xiàn)reeman，N.Y.，1992)中。
所說保護基的典型例子有叔丁基(tBu)(La Joie，G.Crivici，A.Adamson，J.G.＂Synthesis＂ 571-572(1990))和芐基(Yojima＂Tetrahedrion＂)44805-819(1988))。
由文獻(Grant，G.A.Synthetic peptidesA user′sguide，F(xiàn)reeman，N.Y.，1992)也已知許多用于保護精氨酸的胍部分的基團。
所述保護基的典型例子有2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基(Mtr)(Ramage &Green，＂Tetrahedron Letters，28，2287(1987)；Fujino等＂ChemPlarm，Bull.，29，2825(1981)。
如此被保護的式(I)化合物的典型例子為實施例1(d)的化合物Boc-D-Arg(Pbf)-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe和實施例2的化合物(H2N-Arg(Pmc)-Thr(OtBu)-Tyr(OtBi)-CO)4Lys2-Lys-Gly-OH。
當n為1和R為含1至7個氨基酸殘基的肽時，含于該序列中所有氨基酸彼此可以不同或相同，并具有L或D構(gòu)型。優(yōu)選為D構(gòu)型，而且，優(yōu)選為簡單和廉價的氨基酸。
n等于1的R的具體例子為Gly或Ala，Gly-Gly，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala，Gly-Gly-Gly，Ala-Ala-Ala，Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Ala-Gly-Ala-Gly，Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala。
按常規(guī)的液相肽制備和固相肽制備技術(shù)可容易地制備式(I)的肽。
固相法的制備優(yōu)選通過自動合成儀來進行。合適的自動合成儀的典型例子為Applied，Biosystems(Foster City，CA，USA)的431A型合成儀。優(yōu)選的是，根據(jù)生產(chǎn)者建議的合成方法進行制備，所述方法通常是基于文獻(Atherton & Sheppard，1989，SolidPhasePeptide SynthesisA practical approach，IRLPress，Oxford)中描述的熟知方法。
本發(fā)明的第三個目的是在所述免疫球蛋白或免疫球蛋白的混合物的分離過程中使用式(I)化合物與至少一種免疫球蛋白形成復合物。
由于與式(I)化合物的非共價結(jié)合能形成復合物的免疫球蛋白的例子有小鼠IgG、大鼠IgG、雞IgY、山羊IgG、牛IgG、人IgG、人IgA和其它物種的IgA，人IgM和其它物種的IgM。
一例典型的分離和純化免疫球蛋白的方法包括(i)在親和色譜載體上固定化本身能與至少一種免疫球蛋白非共價結(jié)合的化合物，(ii)將所說的親和色譜載體裝入一色譜柱中，(iii)用一種能促進免疫球蛋白和固定化化合物間相互作用的緩沖液來平衡所述的柱子，(iv)在所述柱上裝載含至少一種免疫球蛋白的液體，(v)用至少一種能洗脫雜質(zhì)而不影響免疫球蛋白和固定化化合物間相互作用的液體來洗滌所述的柱子，(vi)用解離洗脫液洗脫預先吸附于柱子上的所述的免疫球蛋白，該方法特征在于，本身能與至少一種免疫球蛋白非共價結(jié)合的化合物為式(I)化合物，其中X1、X2、n和R意義同上。
按常規(guī)方法進行步驟(i)至(vi)。
優(yōu)選的是，用于親和色譜的載體用環(huán)氧化物基團預活化，以便與肽和蛋白直接偶聯(lián)。典型的合適載體的例子是Pharmacia(瑞典)的活化的CH SepharoseTM4B樹脂，樹脂Protein-PakTM(Waters，美國)，樹脂EupergitTMC30N(Rohm & Haas，德國)或BioRad(美國)的Affi-GelTM。
步驟(i)優(yōu)選于pH8.5至9.0的弱堿緩沖液中進行。
步驟(iii)優(yōu)選使用中性緩沖液，如pH65的25mM Bis-Tris溶液，或pH7.0的50mM磷酸鹽緩沖液。
步驟(v)優(yōu)選使用弱離子強度的中性緩沖液，例如pH6.5的25mM的Bis-Tris溶液。
用于步驟(vi)的解離洗脫液的例子包括酸性或堿性水溶液。典型的例子包括pH2.5的乙酸水溶液或pH9.0的碳酸氫鈉水溶液。
此分離和純化方法廣泛地描述于文獻[Narayanan，S.R.，＂Preparative affinity Chromatography of proteins＂J.Chromatogr，658237-258(1994)，及其中引用的參考文獻；Lowe，C.R.，＂Laboratory technique in Biochemistry and MolecularBiology＂，Work and Burdon，Vol.7，part 2，Elsevier，N.Holland，Amsterdam；Ey et al.Immunochemistry，15429(1978)]中。
按所熟知的ELISA法，本發(fā)明化合物也可用于免疫球蛋白的定性或定量測定中。
根據(jù)ELISA法的一例典型的免疫球蛋白或免疫球蛋白混合物的定量測定的方法包括(1)在用于ELISA測定的微滴板上固定化本身能與至少一種免疫球蛋白非共價結(jié)合的化合物，(2)在所述微滴板上將要測定的含免疫球蛋白或多種免疫球蛋白的試樣進行溫育，(3)洗滌所述的微滴板，(4)檢測如此形成的固定化化合物/免疫球蛋白復合物，該方法特征在于，本身能與至少一種免疫球蛋白非共價結(jié)合的化合物是式(I)化合物，其中X1、X2、n和R具有上述意義。
根據(jù)ELISA法進行的免疫球蛋白的分析測定廣泛描述于文獻(＂Immunochemistry in Practice＂，Johnstone & Thorpe，(1987)，Blackwell，Oxford，UK)中。
優(yōu)選的是，步驟1在一塑料微滴板上進行，如有96孔的PVC微滴板，孔中充滿了pH9.0的0.1M的碳酸氫鈉溶液及含有不同量的配體(0-50μg/孔)。溫育24小時之后，除去過量溶液，并用磷酸鹽緩沖液洗滌微滴板，用3％牛血清白蛋白溶液填充孔以消除非特異作用的位點。
步驟2中，以磷酸鹽緩沖液洗滌微滴板，并以含免疫球蛋白，優(yōu)選用生物素衍生的免疫球蛋白的溶液裝填小孔。然后將微滴板于20-37℃下溫育4-18小時。
步驟3中優(yōu)選用磷酸鹽緩沖液進行洗滌。
向每孔中加入與過氧化物酶結(jié)合的抗生物素蛋白溶液來完成步驟4。溫育2小時后，洗滌微滴板，優(yōu)選再使用磷酸鹽緩沖液洗滌。然后加入鄰苯二胺溶液并用合適的ELISA讀數(shù)器檢測顏色形成。
下面的實施例及附圖會更清楚地得到本發(fā)明的這些及更進一步的特征，其中

圖1表示了從精制血清中純化兔免疫球蛋白，其是在由固定化式(H-L-Arg-L-Thr-L-Tgr)4-Lys2-Lys-Gly-OH化合物制備的柱子上使用親和色譜法；圖2表示由純化兔免疫球蛋白得到的各部分的聚丙烯酰胺凝膠上的電泳分析，其中純化是用不同緩沖液和不同量的血清使用式(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-)4-Lys2-Lys-Gly-OH化合物進行的。
使用來自Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)-431A型自動肽合成儀，軟件版本為1.1，根據(jù)生產(chǎn)商建議的合成方法及文獻(Atherton and Sheppard，1988，Solid Phase peptidesynthesisA practical approach，IRL Press，Oxford)中公知和廣為報道的方法學為基礎，進行式(I)化合物的固相合成。
下面的實施例中，＂Cat.No＂表示目錄編號。
在不以任何方式限制本發(fā)明的情況下，下面實施例用于更好地說明本發(fā)明。
實施例1溶液制備式(I)的肽(X1＝Arg，X2＝Tyr，n＝1，R＝OH)，其中氨基酸具有D構(gòu)型合成起始于被保護的二肽Z-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe的制備，隨后首先脫去N末端的Z保護基，將二肽與保護的精氨酸氨基酸偶聯(lián)得到衍生的Boc-O-Arg(Pbf)-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe，將其完全脫保護后得到式(I)的肽。a)H-D-Tyr(tBu)-OMe(M.W.251 amu)的制備向冷卻至-15℃的H-D-Tyr(tBu)-OH(3.55g，15mmol，BachemFeinchemilalien，cat.No.F2170)的CH3OH(100ml)懸浮液中加入3.54g SOCl2(30mmol，Aldrich，cat.No.23046-4)。室溫下振搖2小時，90℃下振搖2小時后，蒸發(fā)除去溶劑，殘留物經(jīng)KOH干燥一夜。由此得到4.21g鹽酸鹽粗產(chǎn)物(14.7mmol)。收率98％。b)Z-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe(M.W.541 amu)的制備向7.21g(10mmol) Z-D-Thr(tBU)-OH[DCHA(BachemFeinchemikalien，Cat，No C-1480)]和1.65ml(16.2mmol)N-甲基嗎啉(NMM，Sigma，cat.No M-7889)的75ml無水N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，振搖情況下在-10℃下滴加稀釋于9ml CHCl3中的2.12ml(16.2mmol)氯甲酸異丁酯(IBCF，Sigma，cat，No I-3253)。20分鐘后，滴加溶于75ml NMP的4.21g(14.7mmol)-H-D-Tyr(tBU)-OMe.HCl和1.75ml NMM溶液。然后進一步加入NMM(約3ml)以達到pH為7.5至8.0。
反應混合物于振搖條件下0℃保持2小時及室溫下保持一夜。
將沉淀的鹽過濾，通過在硅膠上快速色譜法來濃縮溶液，使用乙酸乙酯-己烷混合物作為洗脫液。得到所需產(chǎn)物(4.03g；7.45mmol)，其為純油狀物(TLC)。c)H-D-Thr(tBU)-D-Tyr(tBu)-OMe(M.W.407amu)的制備4.03g Z-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe(7.45mmol)溶于250ml甲醇中。加入850mg 10％Pd/活性炭(Fluka，cat.No.75990)后，室溫振搖條件下在溶液中吹入氫氣流4小時。通過TLC來監(jiān)測加氫反應。過濾除去催化劑及蒸發(fā)濾液之后，得到2.88g(7.08mmol，收率95％)的H-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe，其為純油狀物(TLC)。d)Boc-D-Arg(Pbf)-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe(C.M.W.916amu)的制備含有0.85ml(7.79mmol)NMM的75ml無水NMP中的3.73g(7.08mmol) Boc-D-Arg(Pbf)-OH(Bachem Feinchemikalien，cat.No.A-3750)的清澈溶液，在振搖條件下冷卻至-10℃。然后，滴加稀釋于6ml CHCl3中的1.02ml(7.79mmol)IBCF。30分鐘后，在20分鐘內(nèi)滴加75ml CHCl3中的2.88g(7.08mmol)H-L-Thr(tBu)-L-Tyr(tBu)-OMe溶液。該反應混合物于0℃下保持2小時，并于室溫下保持一夜。真空蒸發(fā)除去溶劑、并在硅膠柱上通過快速色譜法，使用乙酸乙酯-己烷混合物作為洗脫液來純化粗物質(zhì)。如此得到5.58g(6.08mmol，收率86％)的Boc-D-Arg(Pbf)-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe，其為純油狀物(TLC和RP-HPLC)。e)H-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-OH(M.W.438amu)的制備用具有下表組分的100ml混合物處理所述油狀物。
表1
真空蒸發(fā)三氟乙酸使溶液濃縮至約10ml，并加入150ml冷乙醚沉淀粗制的肽物質(zhì)。除去沉淀劑后，接著用100ml冷乙醚進行洗滌以更好地溶解清除劑。將全部肽物質(zhì)溶于50ml H2O/CH3CN/TFA 50/50/0.1中，然后冷凍干燥。
由此回收到1.89g三肽H-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-OH，相當于4.32mmol，收率71％。對5μg等份試樣產(chǎn)物進行RP-HPLC分析表明其純度為97％。
通過相似方法制備另外的下列化合物H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-OHH-L-Tyr-L-Thr-L-Arg-OHH-D-Tyr-D-Thr-D-Arg-OH下列表A列出了制備收率、最終純度及由質(zhì)譜測定的實驗觀測分子量。
表A
實施例2固相制備式(I)的肽(X1＝Arg，X2＝Tyr，n＝4，R＝Lys-Lys(εLys)-Gly)，其中氨基酸具有L構(gòu)型使用來自APPLIED BIOSYSTEMS Mod431A型自動肽合成儀，根據(jù)Fmoc/HOBt/DCC方法學(konig.W.，和Geiger，R.，1970，Chem.Ber.103，788-798)和生產(chǎn)者(APPLIED BIOSYSTEM，USA)建議的方案，在固相中進行肽的制備。
以0.1mmol規(guī)模進行肽的制備，制備起始于用于肽合成的用甘氨酸(Chlorotrichlichloridric NOVOBIOCHEM Cat No.04-12-2800，0.1mmol)預先衍生的酸不穩(wěn)定樹脂(所述甘氨酸的N-末端氨基用Fmoc基團保護)，在室溫攪拌條件下使用3.0ml哌啶(在N-甲基-2-吡咯烷酮中濃度為20％(ABI Cat.No.400629))于第一個合成循環(huán)中處理來脫保護。
然后室溫振搖情況下用2.5ml N-甲基-2-吡咯烷酮(Merek Cat.No 806072)洗滌脫保護的樹脂5次進行9分鐘。
然后，連接氨基酸Fmoc-L(Fmoc)(Novabiochem Cat.No.-4-12-1085)酸，其是通過與羥基苯并三唑(HOBt，APPLIEDbIOSYSTEMS，Cat.No.400662)和二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC，APPLIED BIOSYSTEMS，Cat.No.400663)溶液一起溫育預先轉(zhuǎn)化成相應的苯并三唑化合物活性酯。除去α-和ε位置上的Fmoc保護基后，進行Fmoc-Lys(Fmoc)(NOVABIOCHEMCat.No.04-12-1085)的第二次偶聯(lián)以形成中心四聚物核R。然后連接Fmoc-Tyr(tBu)-OH(BACHEM FEINCHEMIKALIENCat.No.NB-1225)酸，其是通過與羥基苯并三唑(HOBt，APPLIEDBIOSYSTEMS，Cat.No400662)和二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC，APPLIED BIOSYSTEMS，Cat.No 400663)溶液一起溫育預先轉(zhuǎn)化成相應的苯并三唑化合物活性酯。
將樹脂/活化氨基酸懸浮液振搖51分鐘，在偶聯(lián)酪氨酸殘基過程中完成蘇氨酸殘基的活化。通過與羥基苯并三唑(HOBt，APPLIED BIOSYSTEMS，Cat.No.400662)和二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC，APPLIED BIOSYTEMS，Cat.No 400663)溶液一起溫育，1mmol的Fmoc-Thr(tBu) -OH(BachemFEINCHEMIKALIEN Cat No B-1245)被轉(zhuǎn)化為相應的苯并三唑化合物活性酯。
偶聯(lián)酪氨酸結(jié)束時，用N-甲基-吡咯烷酮(NMP)充分洗滌樹脂。用3ml 20％哌啶的NMP溶液處理除去Fmoc基。用NMP洗幾次后，將預先活化的氨基酸蘇氨酸轉(zhuǎn)移在樹脂上。偶聯(lián)反應持續(xù)51分鐘，并在此過程中第3個氨基酸精氨酸被活化。使用衍生的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(BACHEM FEINCHEMIKALIENCat.No B-2375)。活化方法與有關(guān)蘇氨酸活化所述的方法相同。
蘇氨酸乙酰化及隨后用哌啶除去Fmoc基后，活化的精氨酸被轉(zhuǎn)移在樹脂上以進行偶聯(lián)反應。進行所需的洗滌次數(shù)除去過量的氨基酸及在精氨酸殘基上脫保護Fmoc基后，先用NMP充分洗滌樹脂，然后用二氯甲烷(DCM)洗滌，最后，樹脂通過氬氣流干燥?；厥盏玫?15.8mg樹脂。
用比例為80∶10∶10V/V的乙酸(Merek Cat.No 63)，二氯甲烷(Merck Cat.No 6050)和乙醇(Merck Cat No 8006)的混合物處理樹脂，制備出完全被保護的式為(H2N-Arg(Pmc)-Thr(OtBu)-Tyr(OtBu)-CO)4-Lys2-Lys-Gly-OH的四聚物。
這種處理使肽從樹脂上除去，而不除去氨基酸側(cè)鏈保護基。
另一種方法是，用10ml三氟乙酸和具有實施例1表1中組成的清除劑混合物處理樹脂，得到式為(H2N-Arg-Thr-Tyr-CO)4-Lys2-Lys-Gly-OH的完全脫保護的四聚物。
通過真空下蒸發(fā)三氟乙酸使溶液濃縮至約1ml。加入30ml冷乙醚來沉淀粗制肽物質(zhì)。除去沉淀劑后，用30ml冷乙醚進行第二次洗滌以進一步溶解清除劑。溶于5ml H2O/CH3CN/TFA50/50/0.1的所有肽物質(zhì)被冷凍干燥。
回收得到103.8mg的三肽四聚物(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr)4-Lys2-Lys-COOH。5μg等份試樣產(chǎn)物的RP-HPLC分析表明純度近于97％。
用相似方法制備示于表B中的另外的化合物。
表 B
實施例3在活化的CH-Sepharose 4B上固定化實施例1和2的肽，通過親和色譜法從血清中純化免疫球蛋白式(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr)4-Lys2-Lys-Gly-OH(5mg)的肽溶解于5ml 0.1M pH9.0的碳酸氫鈉緩沖液中，然后將其加入1.2g活化樹脂CH-Sepharose 4B(Pharmacia，Uppsala，Sweden，Cat.No.17-0490-01)中，該活化樹脂CH-Sepharose 4B為用于親和色譜法的色譜載體，其已被預活化以便直接偶聯(lián)肽和蛋白。振搖該懸浮液24小時，并通過在不同時間取等分試樣的反應混合物及隨后對其進行RP-HPLC分析來監(jiān)測偶聯(lián)水平。
24小時后，與樹脂共價連接得到約90％的初始肽，用50ml1MpH9.0的TRIS溶液洗滌該衍生的樹脂，然后將其裝入玻璃柱(100×6.6mm I.D.)中。
用相似方法制備本發(fā)明其它化合物，所得固定化收率示于表C中。
表C
為純化免疫球蛋白，以1ml/分鐘的流速，用25mM BIS-TRISpH6.5緩沖液(SIGMA，Cat.B9754)來平衡柱子，同時在280nm下監(jiān)測洗脫液。然后將1ml粗制兔血清(SIGMA Cat.No.R9133)裝載于柱子上，在柱空隙容積中洗脫出非保留物質(zhì)后，將洗脫液改為0.1M乙酸。
收集如此處理的物質(zhì)，并于聚丙烯酰胺凝膠上進行電脈分析。
通過親和色譜法從粗制血清中純化兔免疫球蛋白示于圖1中，而收集部分的電泳分析示于圖2中。正如電泳分析所清楚表明的，柱子能夠保持來自粗制血清的免疫球蛋白部分，而在柱空隙容積中不能保持和洗脫出白蛋白。此外，圖2中也表示了相應的各種兔免疫球蛋白的純化試樣的電泳分析，這些純化試樣是在用不同緩沖液即0.1M pH5.7的乙酸銨(A)，0.1M pH7.0的磷酸鈉(B)，或0.1M pH8.5的磷酸鈉(C)平衡親和柱之后而得到的。正如以0.1M乙酸處理而解吸的部分的電泳分析所清楚顯示的，在這三種情況下從雜質(zhì)中得到了最佳純度的免疫球蛋白。
此外，該柱子顯示出顯著的純化能力，使免疫球蛋白能從0.5ml(E)，1ml(F)和1.5ml(G)血清中純化。該柱子的選擇性高于那些具有固定化A蛋白的柱子。事實上，在具有同樣尺寸的固定化A蛋白柱上純化相同血清，所得到的純化部分總含有微量的白蛋白。檢測時的單體及多聚體肽以及用L或D構(gòu)型的氨基酸制備的其類似物的純化能力均是相似的，并且純化能力不依賴于所用的親和色譜載體的類型。實際上，用其它載體如Protein-Pak(Waters，USA)，Eupergit C30N(Sigma，USA)，和Affi-Gel(Bio-Rad，USA)所得結(jié)果相似。
使用固定化式(I)的肽制備的柱子從小鼠、大鼠、山羊、綿羊、馬、人及牛血清中分離IgG，以及從粗來源中分離雞IgY、人IgA和人IgM均會得到相似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.式(I)的肽(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R(I)其中X1和X2彼此不同，其為L或D構(gòu)型的精氨酸或酪氨酸的氨基酸殘基，其中蘇氨酸和酪氨酸的羥基及精氨酸的胍部分可分別由肽化學中常規(guī)使用的用于保護羥基和胍部分的化合物來保護，n是1、2、3或4，和當n是2、3或4時，R是適于形成二聚物、三聚物或四聚物的基團，而當n為1時，R是OH、單一的氨基酸殘基，或含多至7個氨基酸殘基的肽鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于n是1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其特征在于R是OH。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于n是4。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的肽，其特征在于R是式Lys-Lys(ε-Lys)-的支鏈三肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的肽，其特征在于R是式Lys-Lys(ε-Lys)-Gly的支鏈四肽。
7.根據(jù)1至6的任一權(quán)利要求的肽，其特征在于至少一個氨基酸具有D構(gòu)型。
8.根據(jù)1至7的任一權(quán)利要求的用作免疫球蛋白配體的式(I)肽。
9.一種分離和純化免疫球蛋白的方法，其包括(i)在親和色譜載體上固定化本身能與至少一種免疫球蛋白非共價結(jié)合的化合物，(ii)將所說親和色譜載體裝入一色譜柱中，(iii)用一種能促進免疫球蛋白和固定化化合物間相互作用的緩沖液來平衡所述的柱子，(iv)用含至少一種免疫球蛋白的液體裝載所述的柱子，(v)用至少一種能洗脫雜質(zhì)而不影響免疫球蛋白和固定化化合物間相互作用的液體來洗滌所述的柱子，(vi)用解離洗脫液洗脫預先吸附于柱上的所述免疫球蛋白，其特征在于本身能與至少一種免疫球蛋白非共價結(jié)合的化合物是根據(jù)1至7的任一權(quán)利要求的式(I)化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于親和色譜的載體用環(huán)氧基預活化以便直接與肽和蛋白偶聯(lián)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于親和色譜的載體是活化的CH Sepharose 4BTM樹脂。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于親和色譜的載體是樹脂Protein-PakTM。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于步驟(i)是在堿性緩沖溶液存在下進行的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于pH為8.5至9。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于用于步驟(iii)中的緩沖溶液為中性且具有弱離子強度。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于pH為6.5至7。
17.根據(jù)9至16的任一權(quán)利要求的方法，其特征在于用于步驟(V)中的洗滌液體是緩沖溶液。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于pH為6.5。
19.根據(jù)9至18的任一權(quán)利要求的方法，其特征在于是用酸或堿性溶液進行步驟(vi)的洗脫。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于使用的是pH2.5的乙酸水溶液，pH3的0.1M甘氨酸水溶液，或pH9的碳酸氫鈉溶液。
21.一種用于制備根據(jù)1至7的任一權(quán)利要求的式(I)肽的方法，其特征在于按溶液或固相法進行反應。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于使用合適的自動合成儀進行固相制備。
23.根據(jù)ELISA法的用于檢測免疫球蛋白或免疫球蛋白混合物的方法，其包括(i)在用于ELISA測定的微滴板上固定化本身能與至少一種免疫球蛋白非共價結(jié)合的化合物，(ii)在所述微滴板上將要測定的含免疫球蛋白或多種免疫球蛋白的試樣進行溫育，(iii)洗滌所述的微滴板，(iv)檢測如此形成的固定化化合物/免疫球蛋白復合物，其特征在于本身能與至少一種免疫球蛋白非共價結(jié)合的化合物是根據(jù)1至7的任一權(quán)利要求的式(I)化合物。
全文摘要
一種式(I)的肽(H
文檔編號C07K16/00GK1145369SQ9611099
公開日1997年3月19日 申請日期1996年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月21日
發(fā)明者G·法希納, A·沃爾多利瓦, M·魯沃 申請人:泰克諾根公司