專利名稱：一種胸腺五肽液相合成法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胸腺五肽的合成方法，特別是液相法合成，并可適用于大規(guī)模生產(chǎn)胸腺五肽的方法。
背景技術(shù)：
胸腺五肽為胸腺激素—胸腺生成素II的生物活性中心，是由胸腺生成素II第32-36位氨基酸殘基構(gòu)成，在體內(nèi)和體外均具有全部胸腺生成素II的生理和藥理活性。而且胸腺五肽現(xiàn)已是臨床藥物。
現(xiàn)階段胸腺肽的生產(chǎn)技術(shù)可分為兩類。其中一類是采用生物技術(shù)生產(chǎn)，如中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)02117757.0所公開的，用新鮮的胸腺漿液加入pH2.0-4.0的緩沖溶液，以抑制酶活性，在10℃以下用超聲波勻質(zhì)機(jī)或超細(xì)技術(shù)對(duì)新鮮的胸腺組織進(jìn)行處理，破碎細(xì)胞，再經(jīng)冷凍離心和超濾，再對(duì)所得粗制品用納濾技術(shù)制取胸腺肽生產(chǎn)技術(shù)；或者是采用克隆技術(shù)以及采用復(fù)合的克隆技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，如中國(guó)發(fā)明專利96105293.7所公開的技術(shù)。另一類技術(shù)是采用合成方法生產(chǎn)胸腺肽，如美國(guó)專利US005218089所公開的液相合成技術(shù)，或者在有關(guān)資料中披露的多肽固相合成工藝?，F(xiàn)有技術(shù)中以生物技術(shù)制造胸腺五肽一方面技術(shù)較為復(fù)雜，技術(shù)也不成熟，而且受到原料等因素的制約，另一方面由于原料的原因還可能會(huì)造成制品的污染；現(xiàn)有的液相合成生產(chǎn)技術(shù)需使用一些較為昂貴的試劑，而且工藝控制也較為困難；現(xiàn)有技術(shù)中更多采用的是固相合成技術(shù)，但固相合成技術(shù)的生產(chǎn)規(guī)模較小，合成工藝過程中所用的溶劑耗費(fèi)量較大，在合成工藝中需要多肽自動(dòng)合成儀、高效液相色譜儀等大型的儀器設(shè)備，除此以外，固相合成時(shí)還存在產(chǎn)率偏低和反應(yīng)產(chǎn)物純化周期過長(zhǎng)的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的液相合成胸腺五肽的技術(shù)，這一技術(shù)可以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，在合成工藝中可使用價(jià)格較為低廉的試劑，合成產(chǎn)率較高，而且在整個(gè)工藝中不需要大量昂貴的儀器。特別是本發(fā)明的合成技術(shù)可以作為一種大規(guī)模生產(chǎn)所采用的技術(shù)。
本發(fā)明是先將酪氨酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸反應(yīng)，然后將產(chǎn)物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Val-Tyr(OBzl)。再用N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應(yīng)液，再在反應(yīng)液中加入Val-Tyr(OBzl)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)。再將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應(yīng)液，在該反應(yīng)液中加入Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)。再將Z-硝基精氨酸與Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)以及2-羥基苯并二氮唑溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下再加入二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行反應(yīng)，所得反應(yīng)清液經(jīng)洗滌后在甲醇中重結(jié)晶，分離出結(jié)晶體Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)。最后將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的保護(hù)基脫去得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
在本發(fā)明中是采用將相應(yīng)產(chǎn)物溶于適量三氟乙酸中反應(yīng)脫去其上的N-叔丁氧羰基，再依次用堿溶液中和鹽溶液洗滌后用無水硫酸鈉干燥，然后再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行減壓濃縮。
本發(fā)明中酪氨酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸和反應(yīng)是將酪氨酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸溶于二氯甲烷中，再在冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行反應(yīng)。
在本發(fā)明中N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應(yīng)液是先將N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸溶于適量(以溶質(zhì)完全溶解為度，以下相同)的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺反應(yīng)得到的。
本發(fā)明中N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應(yīng)液是將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶于適量的二氯甲烷N-N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺和2-羥基苯并二氮唑反應(yīng)得到。
采用本發(fā)明的方法得到Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)后可用以下述的任一種方法脫去其上的保護(hù)基將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于甲醇中，加入鈀碳進(jìn)行催化氫化，再加入乙醚，析出晶體后用高效液相色譜純化，獲得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH；或者，將Z-Arr(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)適量的1∶1∶1的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚混合液中，再通入等容量的無水氟化氫反應(yīng)，然后再用乙醚進(jìn)行洗滌，再加入適量的乙酸水溶液，再加入乙醚，析出晶體后用高效液相色譜純化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)1、生產(chǎn)成本相對(duì)較低，以固相合成胸腺五肽為例，其實(shí)際產(chǎn)率僅為理論產(chǎn)率的50％，而本發(fā)明的產(chǎn)率大于理論產(chǎn)率的80％；2、在整個(gè)的生產(chǎn)工藝中所用的試劑價(jià)格相對(duì)較低；3、在整個(gè)的生產(chǎn)過程中所主要采用的是玻璃設(shè)備，而不象現(xiàn)有技術(shù)中需依賴大型設(shè)備，因此其生產(chǎn)費(fèi)用較低；4、生產(chǎn)工藝較為簡(jiǎn)單，反應(yīng)過程易于控制，生產(chǎn)工藝的可重復(fù)性強(qiáng)；5、綜合生產(chǎn)周期較短，進(jìn)一步減小生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率；6、合成規(guī)?？纱蠓忍岣?，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
以下提供本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例先將L-酪氨酸(L-Tyr-OH，100克)與對(duì)甲苯磺酸(TOS，100克)溶于苯(600ml)中，再加入苯甲醇(300ml)，回流反應(yīng)3～5小時(shí)，進(jìn)行冷卻，再加入石油醚或乙醚(1000ml)，攪拌析晶，再在回流下溶于乙醇(300ml)中，冷卻結(jié)晶，濾出固體物得純化的酪氨酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽Tyr(OBzl)·TOS(244克)，再將其與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸反應(yīng)，然后將產(chǎn)物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Val-Tyr(OBzl)。
將N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸(Boc-Val-OH，117克)與酪氨酸芐酯Val-Tyr(OBzl)溶于二氯甲烷(700ml)中，在冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺(112克)，反應(yīng)過夜。抽濾得到淺黃色清液，再依次用弱酸溶液，如檸檬酸等，弱堿溶液及鹽溶液洗滌后，再用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理后，減壓濃縮反應(yīng)液，得到白色固體。將這些白色固體物濾出后再放入石油醚-乙酸乙酯體系(900ml∶200ml)中進(jìn)行重結(jié)晶，得到Boc-Val-Tyr(OBzl)(242克)。
將上述所得產(chǎn)物Boc-Val-Tyr(OBzl)(206克)溶于適量的三氟乙酸中(210ml)，反應(yīng)3～5小時(shí)，然后再用堿溶液中和，用鹽溶液洗滌后，用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，再進(jìn)行減壓濃縮，得到產(chǎn)物Val-Tyr(OBzl)(155克)。
將N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸(Boc-Asp(OBzl)-OH，135克)溶于適量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺(80克)和2-羥基苯并二氮唑(70克)，反應(yīng)過夜，制得N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應(yīng)液。
將Val-Tyr(OBzl)(155克)加入N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應(yīng)液中，反應(yīng)過夜。抽濾反應(yīng)液得清液，依次用弱酸溶液，弱堿溶液及鹽溶液洗滌后，再用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，減壓濃縮反應(yīng)液，得到白色固體。將這些白色固體物濾出后再放入石油醚-乙酸乙酯體系(550ml∶180ml)中進(jìn)行重結(jié)晶，得到Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(226克)。
將由上所得反應(yīng)產(chǎn)物Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)溶于適量的三氟乙酸中(95ml)，反應(yīng)3～5小時(shí)，然后再用堿溶液中和，用鹽溶液洗滌后，用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，再進(jìn)行減壓濃縮，得到產(chǎn)物Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(103克)。
將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸(Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，75克)溶于適量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺(37克)和2-羥基苯并二氮唑(30克)，反應(yīng)過夜，制得N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應(yīng)液。
將Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(103克)加入N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應(yīng)液，反應(yīng)過夜，抽濾反應(yīng)液得清液，依次用弱酸溶液，弱堿溶液及鹽溶液洗滌后，再用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，將濾液低溫靜置，直至析出白色固體，將固體分離出后再置入乙酸乙酯體系中進(jìn)行重結(jié)晶，得到產(chǎn)物Boc-Lys(2-Cl-Z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(161克)。
將以上所得產(chǎn)物Boc-Lys(2-Cl-Z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(161克)溶于適量的三氟乙酸中(70ml)，反應(yīng)約3小時(shí)，然后再用堿溶液中和，用鹽溶液洗滌后，用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，再進(jìn)行減壓濃縮，得到產(chǎn)物L(fēng)ys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(80克)。
將Z-硝基精氨酸(Z-Arg(NO2)，29克)與Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(60克)以及2-羥基苯并二氮唑(14克)溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，在冰浴下再加入二環(huán)己基碳二亞胺(18克)，反應(yīng)過夜，抽濾反應(yīng)液得清液，依次用弱酸溶液，弱堿溶液及鹽溶液洗滌后，再用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，將濾液室溫靜置，直至析出白色固體，將固體分離出后再置入甲醇體系中進(jìn)行重結(jié)晶，得到產(chǎn)物Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(75克)。
將由上所得產(chǎn)物Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的各保護(hù)基，即(NO2)、(2-Cl-z)和(OBzl)脫去，就可得到胸腺五肽Z-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。本發(fā)明中提供兩種最為有效的脫去保護(hù)基的方法第一種方法將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(120克)溶于適量的甲醇中，加入鈀碳，進(jìn)行催化氫化，再加入乙醚，析出白色晶體后濾出，再用高效液相色譜進(jìn)行純化后得到純度大于99％的胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(65克)。
第二種方法將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(120克)溶于適量的的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚(100ml∶100ml∶100ml)混合液中，再通入等容量的無水氟化氫(300ml)，反應(yīng)30分鐘。抽干氟化氫，再用乙醚分3次進(jìn)行洗滌(每次用200ml乙醚)后，再在體系中加入20ml的乙酸水溶液(濃度為10％)，再加入乙醚(600ml)，析出晶體后濾出，再用高效液相色譜純化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(67克)。
需說明的是在實(shí)際的生產(chǎn)過程中也可直接用商品化的酪氨酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽制品。
權(quán)利要求
1.一種胸腺五肽液相合成法，其特征是(a) 將酪氨酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽，與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸反應(yīng)，然后將產(chǎn)物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Val-Tyr(OBzl)(b) 由N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應(yīng)液，再在反應(yīng)液中加入由a所得產(chǎn)物反應(yīng)，反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)，(c) 將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應(yīng)液，再在反應(yīng)液中加入由b所得產(chǎn)物Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)，(d) 將Z-硝基精氨酸與由c所得產(chǎn)物L(fēng)ys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)以及2-羥基苯并二氮唑溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下再加入二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行反應(yīng)，所得反應(yīng)清液經(jīng)洗滌后在甲醇中重結(jié)晶，分離出結(jié)晶體Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)，(e) 將由d所得結(jié)晶體Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的保護(hù)基脫去得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是脫去N-叔丁氧羰基的反應(yīng)是采用將相應(yīng)產(chǎn)物溶于適量三氟乙酸中進(jìn)行反應(yīng)，然后再依次用堿溶液中和鹽溶液洗滌后用無水硫酸鈉干燥，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行減壓濃縮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是酪氨酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸的反應(yīng)是將酪氨酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸溶于二氯甲烷中，再在冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應(yīng)液是將N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸溶于適量的二氯甲烷-N和N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺反應(yīng)得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應(yīng)液是將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶于適量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二環(huán)己基碳二亞胺和2-羥基苯并二氮唑反應(yīng)得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的任一胸腺五肽液相合成法，其特征是將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于甲醇中，加入鈀碳進(jìn)行催化氫化，再加入乙醚，等析成晶體后用高效液相色譜純化，獲得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的任一胸腺五肽液相合成法，其特征是將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于適量的1∶1∶1的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚混合液中，再通入等容量的無水氟化氫反應(yīng)，然后再用乙醚進(jìn)行洗滌，再加入適量的乙酸水溶液和乙醚，析出晶體后用高效液相色譜純化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
全文摘要
本發(fā)明涉及胸腺五肽的合成方法。本發(fā)明是在酪氨酸芐酯上依次接上纈氨酸、天冬氨酸、賴氨酸和精氨酸，最后將產(chǎn)物Z－Arg(NO
文檔編號(hào)C07K1/02GK1513872SQ0313435
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月10日
發(fā)明者王銳, 魏潔, 趙倩予, 楊頂建, 張立臣, 許兆青, 王 銳 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)