專利名稱：：細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體來說，屬于人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并涉及影響細(xì)胞生長和增殖的一些新物質(zhì)。本發(fā)明還涉及這些物質(zhì)在預(yù)防或治療疾病方面的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種診斷疾病的方法，或者對易患某種疾病或具有患某種疾病的誘因的個體進(jìn)行普查的方法。術(shù)語匯編為了使本文敘述簡練，將使用幾個新造的術(shù)語。其中的某些術(shù)語和在本文范圍內(nèi)它們應(yīng)當(dāng)被理解的方式如下面所述“細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子(GR)”-影響細(xì)胞生長或增殖的物質(zhì)。GR對生長或增殖的作用可能是促進(jìn)細(xì)胞的生長或增殖，或者是抑制細(xì)胞的生長或增殖。“內(nèi)源性GR(EGR)”-由體內(nèi)細(xì)胞分泌或釋放出的物質(zhì)，它能影響體內(nèi)同種細(xì)胞或者其它細(xì)胞的生長或增殖。“抑制細(xì)胞GR/EGR”-具有停止或明顯減慢細(xì)胞生長或增殖作用的GR/EGR，基本上對細(xì)胞沒有任何破壞作用。抑制細(xì)胞EGR典型地通過在細(xì)胞周期的一個階段阻止細(xì)胞周期而起作用?！暗头肿恿?EGR(LMW-EGR)”-分子量小于大約3000道爾頓的EGR?！凹∪庖蜃?MF)”-由肌細(xì)胞分泌或釋放的LMW-EGR?！鞍籽?xì)胞因子(WBF)”-由白血細(xì)胞分泌或釋放的LMW-EGR?！霸醇?xì)胞”-分泌或釋放EGR的細(xì)胞?！鞍屑?xì)胞”-受EGR作用的細(xì)胞。“條件培養(yǎng)基(CM)”-由于源細(xì)胞在其中生長而條件化的培養(yǎng)基。CM因此含有源細(xì)胞分泌的EGR?！凹〖?xì)胞CM”和“白血細(xì)胞CM”-分別由于肌細(xì)胞和白血細(xì)胞在其中生長而條件化的培養(yǎng)基。肌細(xì)胞CM和白血細(xì)胞CM分別含有MF和WBF。上述術(shù)語還應(yīng)該參照下文來解釋和理解。發(fā)明背景大量研究工作涉及到被稱為“細(xì)胞因子”(cytokines)的EGR的發(fā)現(xiàn)、表征、生物檢測和臨床開發(fā)工作。至今發(fā)現(xiàn)的所有細(xì)胞因子都是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，具有幾千道爾頓至幾萬道爾頓的分子量范圍。細(xì)胞因子雖然各具有不同的來源和靶細(xì)胞，并具有不同活性模式，但都具有蛋白質(zhì)類物質(zhì)的共同特性。已有報道表明，在實(shí)驗(yàn)動物中，運(yùn)動可顯著地抑制腫瘤的生長和發(fā)展(S.A.Hoffman等，1962，癌癥研究，22597-599；V.E.Baracos，1989，生理病理化學(xué)雜志，67864-870)A.Szent-Gyorgyi等(1963，科學(xué)，1401391-1392)曾報導(dǎo)，在包括胸腺、主動脈、肌肉和腱等幾種組織的提取物中，含有二種物質(zhì)，一種促進(jìn)小鼠腹水瘤的生長(被他們稱為“促細(xì)胞素”)，另一種抑制其生長(被他們稱為“抑細(xì)胞素”)。抑細(xì)胞素被描述為小分子量物質(zhì)，相對不穩(wěn)定，在室溫下大約一周內(nèi)就分解了。而且，根據(jù)其分離的方式，這種物質(zhì)看來是親脂性的。T.Namba等(1968，英國實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，49294-301)也描述了肌細(xì)胞提取物對腹水瘤細(xì)胞的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)肌肉提取物的抑制活性是可以通過硅膜透析的。加熱提取物會影響這種抑制活性，盡管對透析液加熱后沒有發(fā)現(xiàn)任何作用。E.Watta等(美國專利4,708,948)公開了一種抑制腫瘤生長的大分子量多肽，也是可以從肌肉組織得到的。M.Djaldetti等(美國專利5,242,692)公開了一種來自肌細(xì)胞的，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖的因子。這種因子是從肌細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中被分離出的，它具有通過凝膠電泳測定的在25,000-30,000道爾頓范圍內(nèi)的表觀分子量。發(fā)明概述本發(fā)明基于一些由肌細(xì)胞或者白血細(xì)胞分泌、釋放或產(chǎn)生的新物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物活性，而基本上不影響正常的，非腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，還發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)對抑制被激活的免疫細(xì)胞的增殖是有效的。據(jù)此，一方面，本發(fā)明提供了一種基本上被純化的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它是(a)LMW-EGR，一種具有下列特征的物質(zhì)i.它是由肌細(xì)胞，特別是肌細(xì)胞或白血細(xì)胞產(chǎn)生、分泌或釋放的，ii其分子量小于大約3000道爾頓，iii.不是蛋白質(zhì)，iv.可溶于水，v.對熱穩(wěn)定，vi.有抑制細(xì)胞增殖的生物活性，特別是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或抑制被激活的淋巴細(xì)胞的增殖；或者(b)一種(a)類物質(zhì)的衍生物，也具有抑制細(xì)胞增殖的生物活性。另一方面，本發(fā)明提供了這種物質(zhì)在預(yù)防和治療疾病方面的應(yīng)用。據(jù)此，提供了用于預(yù)防疾病或功能紊亂的方法，包括對需要治療的對象施用有效量的該GR。賦予GR抑制增殖的活性方式之后，典型地在一段時間內(nèi)對患者定期施用GR。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，本發(fā)明提供了一種含有一定量該GR的組合物。該組合物可以是一種含有治療有效量的GR和藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。這種藥物組合物可以用于預(yù)防疾病或失調(diào)，或者用于治療疾病或失調(diào)。該組合物還可以是非處方組合物，例如作為neutraceutical組合物，食品添加劑，保健食品制劑等等。最后，本發(fā)明的這一方面還提供了所述GR在制備這些組合物中的應(yīng)用。特別優(yōu)選的是用所述GR治療或預(yù)防癌癥，或者在治療或預(yù)防由于免疫系統(tǒng)活動過度而引起的各種病癥的范圍內(nèi)，抑制(消除或降低)被激活淋巴細(xì)胞的活性，例如用于克服器官排斥作用，治療自身免疫疾病等等。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了用于診斷癌癥，或檢查個體癌癥狀況的方法，或者用于對易發(fā)生癌癥或具有癌癥誘因的個體進(jìn)行普查的方法，這種方法包從所述個體的體液中，或從所述個體的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中，測定所說的LMW-EGR的含量。本發(fā)明的另一方面是以適當(dāng)?shù)臈l件培養(yǎng)基中的活性級分的純化為基礎(chǔ)，制備本發(fā)明的GR的方法。發(fā)明描述新的低分子量EGR的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的基礎(chǔ)。術(shù)語“低分子量”應(yīng)當(dāng)被理解為，當(dāng)通過超濾法測定時，分子量小于大約3000道爾頓，特別是小于大約2000道爾頓，而優(yōu)選的是小于大約500道爾頓的。技術(shù)人員知道，這些分子量都是大致的，不能看作是精確的數(shù)值。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的LMW-EGR是非蛋白質(zhì)類物質(zhì)，即它們既不是蛋白質(zhì)，也不是肽，也不是具有在其生物活性中起作用的蛋白質(zhì)或肽基元的其它物質(zhì)。(本發(fā)明的研究結(jié)果不能排除如下可能性這種LMW-EGR可以以同蛋白質(zhì)或肽結(jié)合或絡(luò)合的形式存在，但在LMW-EGR作為生長調(diào)節(jié)劑的活性中，其中的蛋白質(zhì)或肽基元不起任何作用，或僅有有限的作用)。根據(jù)本發(fā)明，至令為止，LMW-EGR是從肌細(xì)胞的CM和從白血細(xì)胞的CM中得到的。但是據(jù)信，根據(jù)本發(fā)明，LMW-EGR也可以從其它來源得到。因此本發(fā)明不局限于MF和WBF。相反地，以本發(fā)明的研究結(jié)果作為基礎(chǔ)，并通過應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)和已有的有關(guān)這種物質(zhì)的知識，技術(shù)人員將不難發(fā)現(xiàn)其它的LMW-EGR，這些也應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。已發(fā)現(xiàn)MF和WBF是腫瘤特異性的抑制細(xì)胞的EGR。它們在特異性地抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖中，具有同等的生物活性，而對正常細(xì)胞、非腫瘤細(xì)胞都沒有任何顯著的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)MF和WBF都是腫瘤非特異性的(即能有效地抑制各種腫瘤細(xì)胞的生長和增殖)，以及種非特異性的(對來自各種動物物種的腫瘤細(xì)胞，都顯示有抑制生長和增殖的活性)。換句話說，MF和WBF在抑制癌細(xì)胞生長和增殖中，具有廣譜性。并且，本發(fā)明的研究結(jié)果還意味著，從一種動物，特別是從哺乳動物得到的MF或WBF，可以用于另一種動物，特別是哺乳動物的癌癥治療。應(yīng)該指出的是，雖然發(fā)現(xiàn)MF和WBF是細(xì)胞抑制因子，但發(fā)現(xiàn)它們對細(xì)胞也可能有某種破壞性作用，特別是在長時間暴露之后。例如，在長時間暴露于MF或WBF，以及它們的衍生物之后，靶腫瘤細(xì)胞最后可能由于例如細(xì)胞凋亡而死亡。除了抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖的活性之外，還發(fā)現(xiàn)MF和WBF對抑制淋巴細(xì)胞的增殖有活性，證據(jù)是它們能夠抑制淋巴細(xì)胞對分裂素的反應(yīng)，并能抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，表明本發(fā)明的GR可能具有免疫抑制活性。雖然，一旦從一種動物分離出LMW-EGR，就可能從另一種動物找到同源的LMW-EGR。例如，到目前為止，本發(fā)明得到的MF都是來自大鼠和人的器官。毫無疑問，從其它動物，特別是哺乳動物，也可能得到同源的MF。與此相類似，至今本發(fā)明得到的WBF來自人的器官。毫無疑問，從其它動物，特別是哺乳動物，也可能得到同源的WBF。本發(fā)明也應(yīng)包括這些類似物。本發(fā)明的GR在影響細(xì)胞的生長和增殖時，可能是單分子狀態(tài)，也可能是以累加或協(xié)同方式共同作用的一組分子，或者是具有這種活性的分子復(fù)合物。一旦被分離出，就可能通過如化學(xué)修飾法制備LMW-EGR的衍生物，這種衍生物將具有類似于LMW-EGR的生物活性，對于具有與LMW-EGR類似生物活性的衍生物或者這種LMW-EGR的相似物，可能過運(yùn)用與鑒定LMW-EGR相同的生物測定法來鑒定。例如，對于具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖活性的MF和WBF，通過測定合成的衍生物或來自其它動物的經(jīng)分級分離的CM，就可以發(fā)現(xiàn)有活性的衍生物和類似物，視情況而定，可以測定它們對在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長或增殖的抑制活性，或者測定抑制MLR的能力。技術(shù)人員無疑能在各種情況下選擇適當(dāng)?shù)纳餃y定法。該衍生物可以是具有與這種LMW-EGR有類似分子結(jié)構(gòu)的分子，但其中的一個或多個化學(xué)基團(tuán)已經(jīng)被另一種基團(tuán)取代；也可以是該LMW-EGR的還原或氧化產(chǎn)物，等等。通過對需要的患者給予治療有效量的GR，本發(fā)明的GR可用于各種治療目的?？赡鼙挥糜谠揋R的一個優(yōu)選的治療指標(biāo)是對癌癥的治療和預(yù)防。在用于治療時，可用GR對有癌癥病史的患者給藥，如為了抑制癌癥復(fù)發(fā)。這種治療將是在以清除或消滅癌癥為目的的初始治療，如化療、放療或手術(shù)切除之后，繼續(xù)進(jìn)行的一種典型的跟蹤治療措施。為了預(yù)防，可對未患癌癥的人，或尚未診斷有癌癥的人，特別是對那些易患癌癥，或具有癌癥誘因的高危險個體，給予這種GR。高危險個體可能是那些具有患癌癥遺傳傾向的人，例如被診斷出具有各種已知與癌癥有關(guān)的基因中的一個基因的人，具有家族性癌癥史的人，以及那些由于暴露于各種環(huán)境因素，如輻射，暴露于致癌劑等，而處于高危險致癌狀態(tài)的人，等等。如果給予的GR具有抑制靶細(xì)胞增殖的生物活性，而不是立即破壞靶細(xì)胞，那么這種GR可典型地長時間定期給藥。但是，如前面已經(jīng)指出，有可能由于長時間生長受抑制，腫瘤細(xì)胞將最終死亡，因此，在一段時間之后將可以停止治療。該GR的另一個優(yōu)選的治療指標(biāo)是抑制免疫系統(tǒng)成分的活性。實(shí)例是治療自身免疫性疾病；在移植治療中的運(yùn)用，即在移植之后，用于避免器官或組織排斥作用，等等。用各種動物模型對本發(fā)明的GR進(jìn)行了測定，包括通過皮下、肌肉或腹膜內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞而引起腫瘤的原發(fā)性腫瘤動物模型，以及通過靜脈內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞而引起腫瘤的轉(zhuǎn)移性腫瘤動物模型。發(fā)現(xiàn)對于這二種動物模型，GR都能有效地抑制腫瘤發(fā)展。并發(fā)現(xiàn)不論通過非胃腸道給藥還是口服給藥，GR都能有效地抑制腫瘤發(fā)展。眾所周知，口服給藥比非胃腸道給藥具有更高的生理耐受性，因此，用于治療或預(yù)防癌癥，特別是涉及需要長時間定期給予GR的治療或預(yù)防方案時，口服給藥途徑是優(yōu)選的?？梢詫R配制成藥物組合物，其包含有效量的GR和能與該GR配伍，生理上可接受的載體。因?yàn)樵揋R可溶于水，因此生理上可接受的載體，對于非胃腸道給藥可以是生理鹽水，對于口服給藥可以是適于食用的水溶液。此外，對于口服給藥，GR可配制成各種劑型，如膠囊、片劑等。并且，GR還可以被冷凍干燥，在臨用前與載體或稀釋劑混合。在此使用的術(shù)語“有效量”，應(yīng)該被理解為足以達(dá)到預(yù)期作用的量。例如，在用于治療癌癥的情況下，有效量是在第一治療方案中，足以抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖的GR量，可以通過例如發(fā)病率降低，或癌癥轉(zhuǎn)移數(shù)量減少，或者與癌癥相關(guān)的死亡率降低來證明。在用于預(yù)防癌癥的情況下，有效量是在第一預(yù)防給藥方式中，足以抑制原發(fā)性癌性生長發(fā)生的GR量。除了可將GR配制成藥物組合物外，本發(fā)明的GR還可以配制成其它類型的組合物，例如食品添加組合物，neutraceutical組合物，非處方“保健品”等等。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，癌癥病人的白血細(xì)胞，與正常、健康人的白血細(xì)胞相比較，LMW-EGR分泌量低很多。因此，通過測定人體液中(如血清、尿等)，或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中(如人的肌細(xì)胞或白血細(xì)胞)LMW-EGR的含量，就可以診斷人的癌癥，并可得到人體癌癥狀況的指標(biāo)。此外，測定體液或上述上清液中LMW-EGR的含量，還可以作為對易患癌癥或具有患癌癥誘因的人進(jìn)行普查的基礎(chǔ)。對LMW-EGR含量的測定，可通過生物學(xué)測定法進(jìn)行，包括測定體液或上清液，或者其適當(dāng)?shù)姆蛛x級分，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。除了這種生物學(xué)測定法之外，技術(shù)人員通常都知道，對LMW-EGR的存在還可以通過各種分析法來測定，包括基于運(yùn)用LMW-EGR特異性抗體的各種免疫學(xué)測定法，基于運(yùn)用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑，如生色試劑的測定方法，還包括光譜測定法或基于輻射吸收的如光吸收測定法，以及各種層析技術(shù)等。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于純化生物來源的本發(fā)明GR的方法。這方面的方法包括(a)使細(xì)胞在一定條件下生長，該條件使得細(xì)胞能產(chǎn)生、并向其周圍的培養(yǎng)基中分泌或釋放細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子；(b)收集該細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液；(c)將含有分子量大于約3000道爾頓的物質(zhì)的上清液級分，與含有分子量小于約3000道爾頓的物質(zhì)的上清液級分分開，選取后者。對在步驟(c)中被選取的級分，可通過各種純化技術(shù)作進(jìn)一步純化，特別是層析技術(shù)，如高壓液相色譜技術(shù)(HPLC)。在下面，將通過根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的一些實(shí)驗(yàn)，以及必要的參考附圖，對本發(fā)明進(jìn)行闡述。在這些實(shí)驗(yàn)中，證明MF和WBF在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中都具有活性。還描述了對MF的純化和鑒定方法。技術(shù)人員無疑將會理解到，這種闡述不應(yīng)該被看作是對本發(fā)明范圍的限定，而應(yīng)該看作是對在所附的權(quán)利要求中限定的本發(fā)明全部范圍的示例。技術(shù)人員根據(jù)以上和下面的敘述，無疑將能夠在其全部要求保護(hù)的范圍內(nèi)，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。附圖簡述在附圖中圖1-9顯示包含在肌細(xì)胞CM或白血細(xì)胞CM濾液中的MF或WBF的作用，濾膜的截止分子量為3000道爾頓(這種濾出液在此被分別稱為“3000道爾頓MF超濾液”和“3000道爾頓WBF超濾液”)。圖中，細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，與3000道爾頓MF濾液共同溫育，濾液作了幾次稀釋(“1”-未稀釋，“2”-2倍稀釋，依此類推)。在所有實(shí)驗(yàn)中，都以非條件培養(yǎng)基作為對照。圖1-4、6、8和9，以及圖7的部分，是通過3H-胸苷的摻入來測定對細(xì)胞的穿透作用，縱坐標(biāo)顯示放射活性計(jì)數(shù)。圖5和圖7的一部分，是通過細(xì)胞計(jì)數(shù)來測定對細(xì)胞增殖的作用，縱坐標(biāo)顯示細(xì)胞數(shù)量。圖1顯示從新生大鼠橫紋肌細(xì)胞初始培養(yǎng)物得到的2000道爾頓MF超濾液，對兩個腫瘤細(xì)胞系增殖的影響鼠黑素瘤細(xì)胞系B16(圖1A)，人腺癌細(xì)胞系HTB-38(圖1B)。在此圖中，3000道爾頓MF超濾液的活性與原始條件培養(yǎng)基(“原始CM”)的活性進(jìn)行了比較。圖2顯示從新生大鼠橫紋肌細(xì)胞初始培養(yǎng)物得到的3000道爾頓MF超濾液，對兩種正常的非腫瘤細(xì)胞的作用大鼠成纖維細(xì)胞(圖2A)，鼠骨髓細(xì)胞(圖2B)。圖3顯示從大鼠橫紋肌細(xì)胞L-8系得到的3000道爾頓MF超濾液，對兩個腫瘤細(xì)胞系增殖的影響B(tài)16(圖3A)，甲基膽蒽誘發(fā)的鼠肺肉瘤細(xì)胞系MCA-105(圖3B)。圖4顯示從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液，對兩類正常細(xì)胞的作用鼠骨髓細(xì)胞和大鼠成纖維細(xì)胞初始培養(yǎng)物。圖5顯示從新生大鼠橫紋肌細(xì)胞初始培養(yǎng)物得到的3000道爾頓MF超濾液，對大鼠淋巴瘤系Nb2-11C細(xì)胞增殖的影響，是通過細(xì)胞計(jì)數(shù)測定的。測定中先使細(xì)胞同步生長在G0/G1相，再加入3000道爾頓超濾液、初始CM或?qū)φ张囵B(yǎng)基，然后加入hGH刺激生長。圖6顯示從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液，對幾個腫瘤細(xì)胞系增殖的影響。每個結(jié)果是以相應(yīng)實(shí)驗(yàn)中對照的百分?jǐn)?shù)表示。圖7顯示從人成肌細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液的作用。B-16和K562細(xì)胞的增殖是通過3H-胸苷摻入法來測定，NBT細(xì)胞的增殖是通過細(xì)胞計(jì)數(shù)來測定。圖8顯示從人淋巴細(xì)胞得到的3000道爾頓WBF超濾液，對鼠和人腫瘤細(xì)胞增殖的影響。增殖以對照的百分?jǐn)?shù)表示。圖9顯示從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液，影響淋巴細(xì)胞對PHA的反應(yīng)，以及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。圖10是顯示二只暴露腹膜的有代表性的小鼠的照片，其中通過腹膜內(nèi)注射2×105MCA-105細(xì)胞誘發(fā)了一個腫瘤。在注入細(xì)胞之后，對右邊的小鼠通過每天2次腹膜內(nèi)注射0.5ml含MF的級分進(jìn)行治療，該級分是從洗脫制備型反相(RP)C18高壓液相色譜(HPLC)柱而得到的(該級分在以下本文中被稱為“MF-SP”(見7.6.2))，左邊的小鼠注射對照的RPMI培養(yǎng)基。圖11是顯示二只暴露腹膜的有代表性的小鼠的照片，其中通過腹膜內(nèi)注射5×105B-16黑素瘤細(xì)胞誘發(fā)了一個腫瘤。右邊是治療小鼠的照片，對小鼠每天腹膜內(nèi)注射一次從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液1ml，左邊是對照小鼠的照片，對小鼠每天腹膜內(nèi)注射一次對照PBS培養(yǎng)基。圖12是顯示暴露腹膜的有代表性的小鼠的照片，小鼠腹膜內(nèi)注射了2.5×105MCA-105細(xì)胞。圖12A顯示的是治療組小鼠，用從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液，每天口服(P.O.)給藥1ml(從接種腫瘤細(xì)胞的當(dāng)天開始給藥)。圖12B顯示的是對照組小鼠，同樣口服對照RPMI培養(yǎng)基。圖13是顯示小鼠離體肺的照片，小鼠靜脈內(nèi)注射了5×106B-16黑素瘤細(xì)胞。上排是對照組的肺，對動物每天口服給予1ml對照的PBS溶液。下排是實(shí)驗(yàn)組的肺，對動物每天口服給予1ml從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF濾液。圖14顯示來自癌癥病人和健康人血中白血細(xì)胞上清液的3000道爾頓超濾液，對抑制三個腫瘤細(xì)胞系(B-16，SK和K-562)增殖的作用圖14a顯示給予3000道爾頓超濾液之后，與對照相比較，此三個細(xì)胞系的增殖；以及圖14b顯示以抑制作用百分?jǐn)?shù)表示的散布結(jié)果(抑制是增殖的倒數(shù)-100％增殖是0％抑制，依此類推，(大于100％增殖的結(jié)果也被記作“0％”))。圖15顯示通過RP-HPLC柱再次層析含MF的溶液，得到的220nm洗脫分布圖(再次層析是用與首次層析相同的柱子，以同樣的方式進(jìn)行的層析)。圖16-21顯示從不同的HPLC柱洗脫的不同級分抑制Nb2細(xì)胞增殖的活性，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)測定。這些圖的橫坐標(biāo)顯示試管號(關(guān)于流速和每管的體積見下文)，縱坐標(biāo)顯示與空白(未加任何溶液到Nb2細(xì)胞的生長培養(yǎng)基時生長的細(xì)胞，作為100％)相比較的相對細(xì)胞數(shù)目。圖16和17顯示各洗脫液級分抑制NB2細(xì)胞增殖的活性，此洗脫液級分是來自制備型RP-HPLC(C-18)柱的二次不同的層析。裝柱液是從L-8細(xì)胞(在PBS中)得到的3000道爾頓MF超濾液，或者是對照PBS液。在圖16中，含MF的溶液-空心圓(○)，對照PBS液-實(shí)心圓(●)。圖17中，含MF的溶液-實(shí)心三角()，對照PBS液-實(shí)心圓(●)。圖18顯示從分析型RP-HPLC(C-18)柱洗脫的各個級分，對NB2細(xì)胞增殖的抑制活性。裝入這種柱子的溶液由圖16中的級分5和6的混合液組成。MF溶液-實(shí)心圓(●)，對照-空心圓(○)。圖19顯示從Superdex柱洗脫的各級分抑制Nb2細(xì)胞增殖的活性。裝柱液是來自圖17洗脫液的混合液，由管9-10的250ml液，管10-11的520ml液和660ml級分11-12組成。圖20顯示從分析型RP-HPLC柱洗脫的各級分抑制Nb2細(xì)胞增殖的活性。裝柱液是圖17中管6-12的混合液。MF溶液-實(shí)心方塊(■)，對照為PBS液-空心圓(○)。圖21顯示從體積排阻(SE)柱洗脫的各級分抑制Nb2細(xì)胞增殖的活性。裝柱液是與圖17中顯示的，從制備型RP-HPLC柱洗脫的不同級分級分“A”，管6-8-空心圓(○)；級分B，管8-10-實(shí)心圓(●)；級分C，管10-12-空心三角()；以及級分D，管12-14-實(shí)心三角()。圖22顯示從Superdex柱洗脫的各級分抑制Nb2細(xì)胞增殖的活性。裝柱液是由來自圖21的洗脫液各級分組成，如下所示圖22A顯示如下裝柱液的結(jié)果級分C的管28-30-空心圓(○)；級分C的管22-23-實(shí)心圓(●)；級分B的管29-33-空心三角()，和圖22B顯示如下裝柱液的結(jié)果級分C的管31-32-實(shí)心圓(●)，級分C的管23-26-空心圓(○)；級分B的管29-33-空心三角()。圖23顯示從分析型RP-HPLC柱洗脫的級分，抑制Nb2細(xì)胞增殖的活性分布圖。裝柱液是由來自制備型RP-HPLC柱的活性級分(以18％-28％乙腈洗脫的)組成。圖24顯示從體積排阻柱洗脫的級分，抑制Nb2細(xì)胞增殖的活性分布圖。裝柱液是來自圖23中顯示的等分試樣級分13-17。圖25顯示從親水性相互作用(CHO)柱洗脫的各級分，抑制Nb2細(xì)胞增殖的活性分布圖。裝柱液是來自圖24中顯示的等分試樣級分27-30的混合液。圖26顯示從體積排阻柱得到的活性級分的核磁共振掃描圖(在27-32分鐘之間洗脫的級分)。發(fā)明詳述下文中，在論述從肌細(xì)胞CM和白血細(xì)胞CM得到的活性級分的活性時，將常常涉及到“MF”或“WBF”。應(yīng)該理解，這兩種CM可能包含不只一種具有下述活性的因子。實(shí)際上，據(jù)本發(fā)明得到的HPLC分級分離的結(jié)果，其中某些如下面所示，就可能按這種方式來解釋(雖然也可能有其它的解釋)。因此，例如肌細(xì)胞CM中就可能包含不只一種具有腫瘤生長抑制作用的因子。這樣，例如當(dāng)有時引用“該MF”等時，不應(yīng)該認(rèn)為此肌細(xì)胞CM只含有單一的LMW-EGR，因?yàn)榧〖?xì)胞CM實(shí)際上可能含有不只一種所有可被稱為“MF”的物質(zhì)。1.條件培養(yǎng)基1.1MFMF是從三種類型肌細(xì)胞制備物的條件培養(yǎng)基中得到的1.1.1新生大鼠肌肉初級培養(yǎng)物將取自出生24-48小時新生大鼠后腿的肌肉分離，切成小塊。用0.25％trypsinversan液作胰酶消化處理后，將細(xì)胞預(yù)鋪在組織培養(yǎng)皿中，除去成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞。對細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于營養(yǎng)豐富的Dulbeco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。5天后，培養(yǎng)物中包含有收縮狀態(tài)的肌細(xì)胞。然后棄去培養(yǎng)基，加入RPMI或PBS培養(yǎng)基。將細(xì)胞在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，在PBS中培養(yǎng)8小時或24小時。然后收集上清液，離心，在進(jìn)一步處理之前一直保存在-20℃的冰箱內(nèi)。1.1.2大鼠肌細(xì)胞系(L-8)L-8系(從美國典型培養(yǎng)物保藏中心-ATCC得到，保藏號CRL1769)是新生大鼠骨髓肌成肌細(xì)胞系，它包含有能在不添加生長因子的條件下增殖的未分化成肌細(xì)胞。將L-8細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，使之在含有4％葡萄糖的RPMI培養(yǎng)基中生長(這種培養(yǎng)基此后將被稱為“RPMI”)。3天后分離出培養(yǎng)物，棄去上清液，并以RPMI或磷酸鹽緩沖液(PBS)代替，接著再培養(yǎng)24小時，然后收集上清液，如果不立即作進(jìn)一步處理，則在冰箱內(nèi)保存于-20℃。1.1.3人成肌細(xì)胞將從人的活檢組織得到的人成肌細(xì)胞，在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，直至達(dá)到細(xì)胞連生匯合(見美國專利5,130,441)。除去培養(yǎng)基，并以DMEM或PBS液代替，然后將細(xì)胞在此溶液中再培養(yǎng)24小時。收集上清液，并通過離心從中分離出細(xì)胞。1.2WBFWBF是從單核細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中得到的。單核細(xì)胞可按如下方法從靜脈血中分離出用肝素處理過的注射器，從人供血者抽取靜脈血20ml。以PBS將此肝素化的血作1∶1稀釋，使之在15mlFicoll-HypaqueTM(Pharmacia，Sweden)或者HistopaqueTM(Sigma，St.Louis，U.S.A.)上分層，并以400×g的速度離心30分鐘。收集含單核細(xì)胞的介面層，并用PBS洗3次。將單核細(xì)胞在PBS中制成2×106/ml的懸液，在含有5％CO2，95％空氣的濕環(huán)境中，37℃溫育48小時。然后將細(xì)胞懸液離心，收集上清液。2.超濾用具有500，2000，3000和10000道爾頓截止分子量的濾器(CentriconTM，Amicon，U.S.A.)，對從以上來源的CM進(jìn)行超濾。發(fā)現(xiàn)在通過具有10000，3000，2000道爾頓截止分子量的膜過濾的超濾液中，以及在通過具有500道爾頓截止分子量的膜過濾的超濾液中，存在MF，以下將要進(jìn)一步說明。WBF可被超濾通過具有3000道爾頓截止分子量的膜，并發(fā)現(xiàn)超濾液中含有WBF。通過具有500，2000等截止分子量濾器的肌細(xì)胞CM超濾液，在此將被稱為“500道爾頓MF超濾液”，“2000道爾頓MF超濾液”，等等，通過具有3000道爾頓截止分子量濾器的淋巴細(xì)胞CM超濾液，在此將被稱為“3000道爾頓WBF超濾液”。3.MF的WBF在體外對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。3.1方法3.1.1細(xì)胞系在此體外測定中，測定了MF或WBF對幾個腫瘤細(xì)胞系和幾種非腫瘤細(xì)胞的作用。如下是被測定的細(xì)胞(a)腫瘤細(xì)胞系HT-29，是從人克隆(ATCC，保藏號HTB-38)產(chǎn)生的腺癌細(xì)胞；MCA-105，是甲基膽蒽誘生的鼠肺肉瘤細(xì)胞系；B16-F1，是鼠黑素瘤細(xì)胞系；SK-28，是人黑素瘤細(xì)胞系；K-562，是人白血病細(xì)胞系；DA3細(xì)胞，是乳房癌細(xì)胞系；MCF-7，是乳癌細(xì)胞系；Nb2-11C，是激素依賴性大鼠淋巴瘤細(xì)胞系(即這些細(xì)胞的生長需要添加生長激素)(Gertler等，1985內(nèi)分泌學(xué)，1161636-1644)Nb2-SP，是催乳激素非依賴性大鼠淋巴細(xì)胞系；(b)非腫瘤細(xì)胞鼠骨髓細(xì)胞，初始大鼠成纖維細(xì)胞，IM-9，是人淋巴細(xì)胞系。3.1.23H-胸苷摻入測定將待測細(xì)胞(測定3H-胸苷摻入的細(xì)胞)接種于96孔板，起始細(xì)胞濃度為1×104個細(xì)胞/孔。每個孔內(nèi)已含有RPMI和待測溶液的混合物，它可以是條件培養(yǎng)基(在RPMI或PBS中的肌細(xì)胞CM或白血細(xì)胞CM)，分級分離的CM，對照RPMI或PBS(即非條件化的)，或者是分級分離的對照RPMI或PBS。將從每種待測溶液得到的結(jié)果，與其相應(yīng)的對照進(jìn)行比較(例如，在PBS中的分級分離待測溶液與分級分離加PBS相比較，等等)。在37℃溫育42小時之后，向每個微孔內(nèi)加入10μC3H胸苷，加入這種放射性標(biāo)記物后再溫育6小時。然后用液體閃爍計(jì)數(shù)器測定3H-胸苷的摻入量。3.1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)測定使Nb2-11C大鼠淋巴瘤細(xì)胞系的細(xì)胞同步生長，并按迄今所述的方法進(jìn)行培養(yǎng)(Gertler等，1985，內(nèi)分泌學(xué)，1161636-1644)，不同的是，細(xì)胞是培養(yǎng)在加有5％胎牛血清的RMPI中。使Nb2-11C細(xì)胞同步化在G0/G1時相，并按以前所述的方法，對其自身增殖進(jìn)行監(jiān)控(Gertler等，同上)。簡言之，先將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至添加有馬血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。然后將細(xì)胞稀釋成大約3×105個細(xì)胞/ml，并分配到24孔板的許多孔中，0.5ml/孔。再加入相當(dāng)于0.5ml量的待測溶液，并通過加入hGH啟動細(xì)胞自身增殖，hGH的最終濃度為2mg/ml。細(xì)胞在37℃，在含有5％CO2的空氣中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時后，用Coulter計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行2次。按類似的方法對Nb2-SP和IM-9細(xì)胞系的細(xì)胞進(jìn)行測定。3.2結(jié)果3.2.1MF圖1和2顯示從新生大鼠橫紋肌細(xì)胞初級培養(yǎng)物得到的3000道爾頓MF超濾液的測定結(jié)果，圖3和4顯示從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液的測定結(jié)果。每個圖中，橫坐標(biāo)的數(shù)字代表稀釋度的倒數(shù)(“1”-未稀釋，“2”-2倍稀釋，等等)，縱坐標(biāo)顯示放射活性(每分鐘計(jì)數(shù)-CPM)，對照(每個圖左邊的直框柱)是以非條件培養(yǎng)基，按與CM同樣的方法測定的結(jié)果。如圖1和3所示，從大鼠橫紋肌細(xì)胞(圖1)或從L-8橫紋肌細(xì)胞系(圖3)得到的MF能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而對正常細(xì)胞沒有這種抑制作用(分別見圖2和圖4)。并且還可以看到，MF可過濾通過具有3000道爾頓截止分子量的膜，在超濾液中，保留有存在于初始CM中的抗增殖活性的事實(shí)證實(shí)了這點(diǎn)。從圖1和3還可以進(jìn)一步看到，MF的作用隨稀釋度增加而降低，進(jìn)一步表明，這種作用是通過超濾液中的特異性因子所介導(dǎo)的。圖5顯示從L-8細(xì)胞系得到的初始CM，以及其3000道爾頓MF超濾液的活性，二者都以不同的稀釋度進(jìn)行測定?？梢钥吹?，初始CM表現(xiàn)出其超濾液中保留的抗增殖活性。并且此作用隨著稀釋度增加而降低，再次表明這是一種特異性因子介導(dǎo)的活性。圖6也顯示了從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液(未稀釋)的作用(結(jié)果以對照的百分?jǐn)?shù)表示，每次實(shí)驗(yàn)中對照被規(guī)定為100％)?？梢钥吹剑琈F對抑制所有被測定的腫瘤細(xì)胞系的增殖都有活性。圖7顯示從人成肌細(xì)胞得到的3000道爾頓超濾液，具有抑制3個細(xì)胞系增殖的活性(結(jié)果以對照的百分?jǐn)?shù)表示)。B-16和K562細(xì)胞系的增殖是通過檢測3H-胸苷摻入來測定的，Nb2細(xì)胞系的增殖是借助于細(xì)胞計(jì)數(shù)來測定的?？梢姡祟悂碓吹腗F，對所有被測定的腫瘤細(xì)胞系的增殖都有抑制活性。在另一個實(shí)驗(yàn)中，將被發(fā)現(xiàn)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的制備型RP-HPLC柱分離級分(圖15中的級分5和6)混合在一起，在45℃下蒸發(fā)干燥，然后溶于5ml水中，轉(zhuǎn)移到試管內(nèi)，再次進(jìn)行真空干燥，最后溶于2ml水中，并作滅菌處理。以此劑量對這些級分進(jìn)行測定，測定它們對三個不同的細(xì)胞系抑制增殖的能力Nb2-11C，nb2-SP和IM-9。結(jié)果顯示在如下表I中(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)作增殖測定)表I</tables>可見，MF能抑制激素依賴性Nb2-11C腫瘤細(xì)胞系及激素非依賴性Nb2-SP腫瘤細(xì)胞系的增殖。與此相對比，MF對非腫瘤細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞系IM-9，基本上沒有作用。圖8顯示3000道爾頓WBF超濾液對鼠和人細(xì)胞系增殖的影響。在此再次可見，WBF可以抑制所有被測定的鼠源和人源腫瘤細(xì)胞系的增殖。4.MF和WBF對淋巴細(xì)胞PHA應(yīng)答以及對MLR的體外抑制作用。當(dāng)把來自兩個個體的淋巴細(xì)胞一起培養(yǎng)時，每個個體的HLA抗原將引起導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖的細(xì)胞反應(yīng)(這種增殖與兩個個體HLA抗原的差異有直接的關(guān)系)。為了顯示W(wǎng)BF或MF對這種反應(yīng)的影響，將來自兩個供體的1×106個細(xì)胞/ml的單核細(xì)胞(細(xì)胞制備法如上1.2下所述)溫育在含10％FCS的PBS中，并對細(xì)胞加入不同稀釋度的3000道爾頓MF或WBF超濾液。將此培養(yǎng)物在含5％CO2，95％空氣的濕潤環(huán)境中，37℃溫育5天。在溫育過程的最后6小時，對每個孔加入1μCi3H-胸苷。收獲細(xì)胞后用LKB液體閃爍計(jì)數(shù)器(LKB，Piscataway，NJ，U.S.A.)測定細(xì)胞對3H-胸苷的摻入量。PHA(植物血凝集素)是一種與淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面糖類結(jié)合的促細(xì)胞分裂劑，它能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成胚泡細(xì)胞形式，并進(jìn)行細(xì)胞增殖。為了顯示MF或WBF對此PHA誘導(dǎo)反應(yīng)的影響，將單核細(xì)胞以106個細(xì)胞/ml的濃度接種于96孔板，其每個孔已加有含10％胎牛血清(IsraelIndustries，Bet-ha-Emek，Israel)和1μg/mlPHA(WellcomeLaboratories，U.K.)的RPMI0.2ml。在一些孔中，0.2mlRPMI是由一半天然RPMI和一半以RPMI配制的L-8細(xì)胞的3000道爾頓MF超濾液組成。此培養(yǎng)物在CO2恒溫箱內(nèi)溫育4天，在溫育期的最后對細(xì)胞加入1μCi3[H]-胸苷，再溫育24小時，用Dyatech細(xì)胞收集器收獲細(xì)胞，用LKB閃爍儀計(jì)數(shù)放射活性。圖9顯示MF在抑制淋巴細(xì)胞對PHA反應(yīng)中的作用，以及MF對MLR的影響(顯示的是1∶1稀釋的結(jié)果，以對照的百分?jǐn)?shù)表示)。用WBF試驗(yàn)也得到性質(zhì)類似的結(jié)果。并且MF和WBF的作用都與稀釋度成比例(作用隨稀釋度增加而降低)(結(jié)果未顯示出)。5.體內(nèi)研究5.1通過腹膜內(nèi)接種誘發(fā)腫瘤(MCA105)，用MF腹膜內(nèi)注射治療對30只C57BL6/J小鼠腹膜內(nèi)注射(i.p.)2.5×105個MCA-105細(xì)胞。再通過每日2次腹膜內(nèi)注射在下面(7.5.2.節(jié))被稱為“MF-SP”的RP-HPLC級分0.5ml，對小鼠進(jìn)行治療。在第33天將小鼠活殺，對其腫瘤病灶進(jìn)行評估。圖10中描繪出了有代表性的結(jié)果，顯示出兩只開放腹膜的動物，其中圖10A中顯示的是用MF-SP級分治療的動物，而圖10B中顯示的是用對照RPMI培養(yǎng)基治療的動物?？梢钥闯觯趯φ談游镏锌捎^察到一個非常大的腫瘤生長物(圖10B中箭頭所指)，而在MF治療的動物，只能觀察到非常小的，難以發(fā)覺的腫瘤病灶(圖10A中箭頭所指的一個)。5.2通過腹膜內(nèi)接種誘發(fā)腫瘤(B-16黑素瘤)，用腹膜內(nèi)注射MF進(jìn)行治療。對40只C57BL6/J小鼠腹膜內(nèi)注射(i.p.)5×105個B-16黑素瘤細(xì)胞。其中20只小鼠用作對照，每日腹膜內(nèi)注射1次PBS溶液。另20只小鼠每日注射1ml從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液進(jìn)行治療。第15天將小鼠活殺，對動物腹膜上腫瘤生長的情況進(jìn)行檢測。圖11中顯示了取自各實(shí)驗(yàn)組的兩只代表性小鼠的開放腹膜，可以看到，在來自對照組的動物中，能發(fā)現(xiàn)大量腫瘤病灶，而在治療組的動物中僅有少量非常小的腫瘤病灶。5.3通過腹膜內(nèi)接種誘發(fā)腫瘤(MCA-105)，以MF通過腹膜內(nèi)和口服給藥進(jìn)行治療對30只C57BL6/J小鼠腹膜內(nèi)注射2.5×105個MCA-105細(xì)胞。其中10只小鼠通過每日口服(p.o.)給予1ml從L-8肌細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液進(jìn)行治療，10只小鼠通過每日腹膜內(nèi)注射相同的溶液進(jìn)行治療，另10只小鼠作為對照組，每日以口服RPMI培養(yǎng)基來治療。第30天將小鼠活殺，暴露其腹膜，觀測其中腫瘤生長的情況。圖12顯示了取自各組的兩只代表性小鼠(圖12A-MF治療的小鼠，圖12B-對照小鼠)。從圖l2A可見，在受MF治療的動物的腹膜中，沒有任何腫瘤生長的跡象，而在對照組動物的腹膜中，顯示有大的腫瘤病灶。在此實(shí)驗(yàn)中，90％的對照組小鼠出現(xiàn)了腫瘤病灶，而對于以MF腹膜內(nèi)注射，或口服給藥治療的小鼠，僅有40％出現(xiàn)了腫瘤病灶。5.4通過肌內(nèi)接種(DA3乳癌)誘發(fā)腫瘤以MF通過腹膜內(nèi)和口服給藥進(jìn)行治療對30只BALB/C小鼠的腿肌內(nèi)(i.m.)注射1×106個DA3細(xì)胞。其中10只小鼠用作對照，每日通過腹膜內(nèi)注射PBS進(jìn)行治療；10只小鼠通過每日腹膜內(nèi)注射1ml從L-8肌細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液(在PBS中制備的)進(jìn)行治療，而另10只小鼠以同樣量的MF溶液，通過口服給藥(1ml)進(jìn)行治療。小鼠腿中形成了大腫瘤，三周后將小鼠活殺，可發(fā)現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移病灶，對肺中的轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行計(jì)數(shù)。對照組轉(zhuǎn)移病灶計(jì)數(shù)為23.4±6，與之相比，腹膜內(nèi)注射治療組為6.2±1.3，口服治療組為2.2±0.6。5.5通過靜脈內(nèi)接種(B-16黑素瘤)誘發(fā)腫瘤，用MF通過口服給藥進(jìn)行治療對30只C57BL/6J小鼠靜脈內(nèi)注射5×105個B-16黑素瘤細(xì)胞。其中20小鼠從腫瘤接種的當(dāng)日開始，以1ml從L-8細(xì)胞得到的3000道爾頓MF超濾液，通過每日口服給藥進(jìn)行治療，另10只小鼠作為對照，僅以PBS口服給藥。第18天活殺小鼠，在小鼠肺中可看到形成的黑色腫瘤病灶。在圖13中可看到兩組動物有代表性的肺(上排-對照，下排-MF治療)?？梢?，盡管在對照組的肺中存在很多黑色轉(zhuǎn)移病灶，但在實(shí)驗(yàn)治療組僅能看到少量小病灶。6.健康個體和癌癥病人白血細(xì)胞分泌WBF的程度從23名健康個體的靜脈血(樣品是從血庫獲得的)和33名住院癌癥病人的靜脈血分裂出單核細(xì)胞。方法如在1.2中所述。從2×106/ml單核細(xì)胞的培養(yǎng)物中收集上清液，然后通過具有3000道爾頓截止分子量的濾器進(jìn)行超過濾，并收集上清液，如在2中所述。測定此超濾液對來自3個癌細(xì)胞系的癌細(xì)胞抑制其生長的能力B-16鼠黑素瘤細(xì)胞，SK人黑素瘤細(xì)胞和K-562人白血病細(xì)胞系。結(jié)果顯示在圖14中。如在圖14A中所見，雖然來自健康人單核細(xì)胞的超濾液顯示了對增殖明顯的抑制作用，使被測定細(xì)胞系的增殖小于50％，但來自癌癥病人的超濾液對增殖僅有非常小的，很不顯著的抑制作用。如在圖14B中可以進(jìn)一步看到，這二個組之間絕對沒有任何重疊部分。這些結(jié)果表明，與健康人淋巴細(xì)胞分泌WBF的水平相比較，癌癥病人單核細(xì)胞分泌水平是相當(dāng)?shù)偷?。因此，這些結(jié)果表明了測定本發(fā)明LMW-EGR含量的診斷價值。此外，高水平WBF也具有重要的治療作用。7.MF的表征7.1生物測定按以下將要詳述的方法，將肌細(xì)胞CM分級分離，并用上述的細(xì)胞系對各個級分進(jìn)行測定。通過上述的3H-胸苷攝入或細(xì)胞計(jì)數(shù)法，測定每個級分對細(xì)胞生長的影響。7.2對MF的假定的蛋白質(zhì)性質(zhì)的檢測為了確定MF是否是蛋白類物質(zhì)，對肌細(xì)胞CM(從大鼠肌細(xì)胞初級培養(yǎng)物得到的)作了一系列處理試驗(yàn)，包括對蛋白水解酶的敏感性，冷凍干燥過程中的穩(wěn)定性，以及在不同溫度下溫育的影響。在這些處理之后，通過用原來的培養(yǎng)基稀釋，將CM恢復(fù)到原來的鹽和蛋白質(zhì)濃度，或者如果被稀釋，在評價結(jié)果時應(yīng)該考慮到蛋白質(zhì)濃度的稀釋倍數(shù)。所用的測定方法是3H-胸苷攝入測定法。7.2.1蛋白水解酶的作用用兩個蛋白水解酶制劑，胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶(pronase)進(jìn)行測定。為了測定胰蛋白酶的作用，采用了兩種方法(i)在37℃將含MF的溶液與胰蛋白酶(0.5-2μg/ml)共同溫育4小時，然后通過加入大約2倍摩爾過量的大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)，終止胰蛋白酶的活性。用非條件化(無-MF)培養(yǎng)基作為對照；(ii)在37℃將含有MF的溶液與胰蛋白酶(0.5-2μg/ml)共同溫育1-4小時，或者在室溫下溫育過夜，溫育之后，在對氨基苯甲脒瓊脂糖柱上除去胰蛋白酶。以無MF的培養(yǎng)基作為對照。另一些僅用胰蛋白酶的對照測定顯示，在以這種柱-碳酸氫鹽緩沖液為層析條件時，沒有任何胰蛋白酶活性從該柱被洗脫出。為了測定鏈霉蛋白酶的作用，通過使之與固相化在瓊脂糖Sepharose凝膠上的鏈霉蛋白酶相接觸來處理肌細(xì)胞CM。在此也是用無MF的培養(yǎng)基作對照。結(jié)果顯示在如下表II中(數(shù)字表示與非條件化對照培養(yǎng)基相比較的抑制百分比)表II</tables>(a)上述胰蛋白酶方法(I)(b)上述胰蛋白酶方法(ii)(c)“-”＝未測定以上結(jié)果證明，用胰蛋白酶通過兩種方法處理，以及用鏈霉蛋白酶處理，對MF的腫瘤生長抑制活性，都沒有任何顯著的影響。7.2.2冷凍干燥將預(yù)先未作透析處理的肌細(xì)胞CM進(jìn)行冷凍干燥，然后將冷凍干燥物再溶解于水中，恢復(fù)到原來的體積。在這種處理之后，MF抑制腫瘤生長的活性沒有任何顯著的損失，這表明MF對冷凍干燥處理是穩(wěn)定的。7.2.3加熱處理將肌細(xì)胞CM(預(yù)先從大鼠肌細(xì)胞培養(yǎng)物中得到的)，在4-100℃的溫度范圍內(nèi)處理不同的時間。處理之后，用MCA細(xì)胞和HTB細(xì)胞對樣品進(jìn)行測定。結(jié)果顯示在如下表III中(數(shù)字表示在溫度處理之后MF抑制能力的改變(以％表示))。表III“-”＝在這種條件下未測定在另一些實(shí)驗(yàn)測定中，對條件培養(yǎng)基的3000道爾頓超濾液作加熱煮沸處理，沒有引起這種低分子量級分對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性有任何損失。上述結(jié)果表明，在所有被測定的溫度下，包括在100℃煮沸，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力都沒有降低。7.2.4小結(jié)在所測定的條件下，未見MF對抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力有任何降低，這顯然表明MF不是蛋白質(zhì)。相反，結(jié)果顯示，在某些處理之后抑制活性增加了，對于這一點(diǎn)可根據(jù)如下事實(shí)來解釋含有MF的培養(yǎng)基中包含有行使與MF相反作用的蛋白質(zhì)成分，而這蛋白質(zhì)成分在處理中被破壞了。7.3.MF的大小在具有10,2和0.5KD截止分子量的Amicon膜上，通過超過濾對含有MF的CM進(jìn)行了分級分離(對每次膜過濾的殘留物，用至少1倍量另加的PBS處理后作再次過濾)。在用10KD和2KD膜的情況下，在開始的兩個濾液中，基本上得到了全部抑制活性(90％以上)，用0.5KD膜時，在這種濾液中得到了大約80％的活性，某些活性(20％)存留在第二個殘留物中。每種情況均用HTB38和MCA細(xì)胞進(jìn)行抑制活性測定。通過具有12KD和3KD截止分子量的膜，對含有MF的CM進(jìn)行透析顯示，活性組分可通過這兩種膜透析出。上述結(jié)果表明，MF的分子量大約為500道爾頓或者更小些。7.4用RP-HPLC鑒定MF(從大鼠肌細(xì)胞初級培養(yǎng)物中得到的)將10KD膜的過濾液，在C-18反相(RP)柱(4×250mm)上進(jìn)行層析。在上柱加樣之前，通過在0.1％三氟乙酸(TFA)液中稀釋，使濾液恢復(fù)到原來的濃度，加樣后以5-35％乙腈梯度液進(jìn)行層析展開(預(yù)先已通過測定確認(rèn)，這二種成分均對MF的抑制活性沒有影響)。以HTB-38細(xì)胞測定表明，活性成分在0.1％TFA中的15％乙腈中被洗脫出。然后將此活性級分以乙腈梯度液，在同樣的柱上進(jìn)行再次層析，則部分被純化的MF在如上相同的位置被洗脫出(保留時間約21分鐘)。在如頭兩次層析相同的條件下，對此最后的級分進(jìn)行了第三次RP層析展開。發(fā)現(xiàn)一個單獨(dú)的抑制峰，它與洗脫分布圖中220nm吸收峰位置相符，可見圖15。7.5MF的大量純化(從大鼠肌細(xì)胞初級培養(yǎng)物中得到的MF)7.5.1.實(shí)驗(yàn)方案將大鼠肌細(xì)胞CM在Amicon10KD膜上進(jìn)行超濾。再在與制備性HPLC柱相連接的C-18反相(RP)柱(47×300mm)上，對此10KD濾液進(jìn)行層析。用HTB-38細(xì)胞對各級分作細(xì)胞增殖測定，并將具有活性的級分在另一C18RP柱(分析型4×250mm)上作再次層析，用同上述的方法對活性級分進(jìn)行鑒定。7.5.2.純化的MF級分的活性在7.5.1.節(jié)最后步驟中得到的物質(zhì)被稱為“MF-P”，而在第一RP柱之后得到的物質(zhì)被稱為“MF-SP”(這個級分也是在5.1節(jié)中測定的)。初始條件培養(yǎng)基(CM)的活性，MF-P和MF-SP級分的活性，以及超濾殘留物(R)的活性，均被顯示在如下表IV中(活性是以u/ml表示把在增殖測定中，引起50％抑制的物質(zhì)量，定義為1u)表IV(a)＝用HTB-38細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分別在兩組不同的測定中進(jìn)行。“-”＝未測定可見，所有被測定的級分，對被測定細(xì)胞系的增殖都有抑制活性。這也包括R級分，該活性因子可能是在美國專利5,242,692中公開的腫瘤增殖抑制劑。7.6.通過HPLC表征從L-8細(xì)胞系得到的MF在7.6.1.-7.6.5節(jié)中表明了一些代表性HPLC結(jié)果。在7.6.1.節(jié)中，給出了一個純化MF的示范性方法。7.6.1.反相(RP)HPLC通過RP-HPLC柱(C-18)，對在PBS中的160ml3000道爾頓MF超濾液(以PBS溫育肌細(xì)胞8小時后得到的)進(jìn)行層析。洗脫液是在B-pureTM(Barnstead，Dubuque，Iowa)裝置中制備的HPLC級的水，以及HPLC級的乙腈(G.T.Baker，U.S.A.)的梯度液。洗脫液的梯度是在0％乙腈到60％乙腈之間，時間超過30分鐘。流速是100ml/分鐘。每兩分鐘收集一個級分(每個級分200ml)。從每個得到的HPLC級分中取20ml，在濃縮離心機(jī)中蒸發(fā)至干，然后將干燥的各級分懸浮于100μl水中，再蒸發(fā)干，然后再溶解于2mlpBS中，最后，從每個級分取0.2ml加入含測定細(xì)胞的微孔中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)測定法，測定各級分的增殖抑制活性。圖16和17顯示出在兩次不同的層析中各級分的活性。兩種情況下的結(jié)果都表明存在特異性抑制成分，這種抑制成分，在圖16中是在級分5和6中被洗脫出，在圖17中是在級分8-12中被洗脫出。將圖16中的級分5和6合并，在45℃蒸發(fā)干，然后溶解于5ml水中，轉(zhuǎn)移至試管中，在真空中再次干燥，再溶解于2ml水中，并滅菌。將1ml這些濃縮的級分，在分析型RP-HPLC(C-18)柱中層析，以100％水至60％乙腈作梯度展開液，時間20分鐘，流速1ml/min。每分鐘收集1個級分(每個級分1ml)，然后干燥，溶解于0.4ml含有5％HS的RPMI中，并滅菌處理，取0.15ml加入到包含細(xì)胞的每個孔中(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定活性)。用類似的方法，將PBS液通過HPLC進(jìn)行分級分離，并測定活性，用作對照。各洗脫級分的活性顯示在圖18中。這些結(jié)果表明，在級分15中存在特異性抑制成分。7.6.2以Superdex柱進(jìn)行HPLC將圖17的活性級分分成2個收集的級分第一級分稱為“FR1”，是由合并第6-8管的1200ml，第8-9管的550ml，第9-10管的300ml的第10-11管的30ml得到的；第二級分稱為“FR2”，是由第9-10管的250ml，第9-11管的520ml，和第11-12管的600ml合并而成。分別使FR1和FR2干燥，再溶解于10ml蒸餾水中。由于離心后得到了不溶解的沉淀，將這些沉淀分別用10mlPBS(對于FR1)和5mlPBS(對于FR2)進(jìn)一步提取。即使第二次提取之后，仍殘留有相當(dāng)多的沉淀。結(jié)果表明，絕大部分活性存在于FR1中，F(xiàn)R2僅有FR1活性的大約15-20％。與FR1相比較，不溶性沉淀的PBS提取物只存在大約4％的活性。將2mlFR2干燥，再溶于0.4ml水中。取0.2ml對以PBS平衡的Superdex柱加樣。用PBS作展開液，以1ml/min的流速進(jìn)行柱層析，收集1ml的級分。在分離開始后的0.3分鐘開始收集。將收集的洗脫級分滅菌，取0.2ml加至每個細(xì)胞培養(yǎng)孔。從Superdex柱洗脫出的各級分的抑制作用如圖19中所示。在級分18-22可見特異性抑制作用。收集組分18-22，在同樣的柱上，以同樣的條件進(jìn)行再次層析。再次層析的結(jié)果表明，在這些級分中可能存在由兩個或多個活性成分組成的混合物(“MFs”)。用FR1也得到了類似的洗脫分布圖，雖然結(jié)果似乎表明，F(xiàn)R1中MF的含量與FR2相比較，濃度大約要高出10倍以上。7.6.3SuperdexHPLC后的分析型RP-HPLC將級分FR1和FR2混合，取1ml小份對分析型RP-HPLC(C-18)柱加樣。收集1ml的級分，干燥后再溶于0.4ml含5％HS的RPMI中，取0.5ml該溶液，加入含有細(xì)胞的每個孔中。結(jié)果顯示在圖20中?？梢?，在第16管有一個尖銳的活性峰。此外，在第4管也有較低的抑制活性。這些結(jié)果表明，在肌細(xì)胞CM中，可能存在不只一個腫瘤增殖抑制劑。7.6.4體積排阻(SE)HPLC將從制備型RP-HPLC得到的級分6-8(“A”)，8-10(“B”)，10-12(“C”)和12-14(“D”)，在含有以聚羥基乙基天冬酰胺(PolyHYDROXYETHYL-ATM，由PolyLC制造)包被的硅膠顆粒的柱上進(jìn)行層析分離。展開液是一種等濃度(即不具有梯度)溶液，是50μM的甲酸水溶液。收集0.5ml的級分，干燥后再溶解于0.8mlPBS中。然后每個級分取0.15ml加到每個含細(xì)胞的培養(yǎng)孔中。層析結(jié)果可在圖21中看到。結(jié)果表明，在級分6-8中，除了在第32管可能有微弱的活性外，其它都沒有活性。在級分B中，在第29-37管可見到非常清楚和寬的活性峰。在級分C中，存在兩個清楚的活性峰，一個在第21-23管，另一個在第28-31管。最后，在級分D在第21-22管似乎存在一個單獨(dú)的活性峰。7.6.5SE-HPLC后的SuperdexHPLC將從SE柱洗脫的活性級分合并在一起，在高真空下，在濃縮離心機(jī)(HetovacTMVR-l，由Heto，Denmark制造)中干燥，再溶解于0.4mlPBS中，然后取0.2ml樣品在以PBS平衡的Superdex柱上進(jìn)行層析分離。收集1ml的級分，將0.2ml加到每個含細(xì)胞的培養(yǎng)孔中。如圖22A中可見，級分B和SE-HPLC第29-33管，在從Superdex柱洗脫的第21-24管中顯示抑制活性。該活性分布圖可能表明，有可能存在不只一個活性成分，或者該活性成分是以幾種形式存在的。圖22B顯示在17-21分鐘洗脫的一個特異性抑制峰。7.6.6親水性相互作用HPLC將來自顯示在后面圖25中的體積排阻HPLC等分試樣級分27-32合并在一起，干燥后再溶于0.2ml水中。取兩份0.085ml的溶液加樣注入親水性相互作用(CHO)HPLC柱(polyGLYCOPLEXTM，由poly-LC制造)中。然后用70％乙腈水溶液進(jìn)行柱層析展開，流速1ml/min，收集1ml的級分，干燥后溶于0.6mlPBS中，然后每個級分取0.1ml加入96孔板的每一個孔中，在此鹽水中進(jìn)行計(jì)數(shù)測定(見3.1.3節(jié))。在圖23中可見來自該柱的洗脫液的活性分布情況?？煽吹?，在CHO等分試樣中，發(fā)現(xiàn)最高的特異性抑制作用在級分2-8中，雖然在級分10還可見到一個次級抑制峰。在級分21-30，還可以觀察到以一個寬峰顯示的某些微弱活性。8.MF的純化8.1方法建立了一個純化MF的方法，由如下步驟組成(a)制備條件培養(yǎng)基由在PBS中的L-8細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基，如在1.1.2節(jié)中所述。(b)超濾通過具有3000道爾頓截止分子量的膜，對條件培養(yǎng)基進(jìn)行超濾，如第2節(jié)中所述。(c)制備型RP-HPLC然后將3000道爾頓的超濾液，在制備型RP-HPLC，C-18柱上進(jìn)行層析。典型的步驟是先用HPLC級的水洗柱20分鐘，然后以200ml3000道爾頓的超濾液在柱上加樣，并用水繼續(xù)再洗10分鐘。接著用乙腈液對柱展開30分鐘以上展開水溶液的梯度在0％乙腈到60％乙腈之間。展開液的流速大約為100ml/min?；钚约壏衷诖蠹s8-14分鐘之間從柱中被洗脫出。然后將活性級分合并在一起，再在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RotovapTM，Büchi，Switzerland)中將此合并的級分濃縮，接著進(jìn)行濃縮離心。(d)分析型RP-HPLC將合并、濃縮和干燥的級分再溶解于5ml水中，再真空干燥，再溶解于2ml水中。然后取1ml這種濃縮的級分，在分析型RP-HPLC，C-18柱中進(jìn)行層析，展開液是乙腈∶水溶液梯度在0％乙腈至60％乙腈之間，展開20分鐘，流速1ml/min。對柱加樣后用水洗5分鐘，水洗之后用乙腈梯度液對柱進(jìn)行展開?；钚约壏衷?2-19分鐘之間從柱中被洗脫出。然后通過濃縮離心將活性級分濃縮、干燥。(e)體積排阻層析將干燥的級分與甲酸混合，取200ml這種溶液，如7.6.4所述對體積排阻柱加樣，展開液和層析條件也同7.6.4所述。27-32分鐘之后活性級分開始被洗脫出。應(yīng)該說明的是，不同的柱，即使是具有與上述柱類似規(guī)格的柱，以及洗脫條件輕微的改變，都可能產(chǎn)生不同的洗脫分布，因而活性級分有可能在與上述報告不同的保留時間之后被洗脫出。但是，如上所述，通過測定每個級分的抑制活性，技術(shù)人員將有可能沒有任何太大的困難地確定和分離含有本發(fā)明GR的純化級分。8.2純化結(jié)果圖24顯示從分析型RP-HPLC洗脫的級分的抑制活性分布，以及從體積排阻HPLC(圖25)洗脫的級分活性，純化步驟如上8.1節(jié)中所述。9.核磁共振(NMR)分析-MF的可能的低聚糖特性將在圖25中所顯示的，從體積排阻柱中洗脫的活性級分干燥，然后再溶解于甲醇中(經(jīng)過干燥，然后在甲醇中溶解的三次連續(xù)的循環(huán))。再將此甲醇提取物蒸發(fā)干燥，此制備物再溶解于0.5mlDeutero甲醇中。再將該甲醇提取后的殘留物溶解于0.5mlDeutero水中。NMR譜顯示在圖26中?？梢钥吹?，水級分的NMR掃描顯示出一個可能是無意義的峰，而甲醇提取物的NMR掃描，在3-4ppm范圍內(nèi)顯示出幾個峰。這些峰是C-OH基團(tuán)質(zhì)子所特有的，是低聚糖的特征。這些結(jié)果暗示，MF可能是低聚糖。10.白血細(xì)胞CM的3000道爾頓超濾液及其分級分離級分的活性測定從白血細(xì)胞CM得到的3000道爾頓超濾液的活性，并與來自L-8CM的3000道爾頓超濾液的活性相比較。結(jié)果顯示在如下表V中表V將從白血細(xì)胞CM得到的3000道爾頓超濾液200ml，如上所述(見7，6.6.節(jié))通過制備型RP-HPLC進(jìn)行分離。收集200ml的級分。將10ml(200ml中的)等分試樣干燥，再溶解于0.6mlPBS中。取其中0.1ml加入每個細(xì)胞培養(yǎng)孔。為了比較，將來自L-8CM的3000道爾頓超濾液也按相同方法進(jìn)行分級分離。結(jié)果顯示在如下表VI中表VI</tables>(1)白血細(xì)胞CM的3000道爾頓超濾液(2)L-8細(xì)胞CM的3000道爾頓超濾液可以看到，兩個等分試樣都在級分4-6顯示出抑制活性峰。權(quán)利要求1.一種基本上純化的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子(GR)，它是(a)LMW-EGR，一種具有下列特征的物質(zhì)i.它是由肌細(xì)胞或者白血細(xì)胞產(chǎn)生、分泌或釋放的，ii.其分子量小于大約3000道爾頓，iii.不是蛋白質(zhì)，iv.可溶于水，v.對熱穩(wěn)定，vi.具有抑制細(xì)胞增殖的生物活性；或(b)具有抑制細(xì)胞增殖生物活性的(a)中物質(zhì)的衍生物。2.權(quán)利要求1的GR，其中LMW-EGR是由肌細(xì)胞或者白血細(xì)胞產(chǎn)生、分泌或釋放的。3.權(quán)利要求1的GR，其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，或抑制被激活的淋巴細(xì)胞增殖的生物活性。4.權(quán)利要求1的GR，其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物活性，但基本上不影響非腫瘤細(xì)胞的增殖。5.權(quán)利要求4的GR，其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物活性，但基本上不影響骨髓細(xì)胞的增殖。6.權(quán)利要求4的GR，其具有抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖的生物活性，但基本上不影響非腫瘤淋巴細(xì)胞的增殖。7.權(quán)利要求1的GR，其中LMW-EGR可從由于肌細(xì)胞或者白血細(xì)胞在其中生長而條件化的培養(yǎng)基中得到。8.權(quán)利要求1的GR，其具有低于大約2000道爾頓的分子量。9.權(quán)利要求8的GR，其具有大約500道爾頓或低于大約500道爾頓的分子量。10.權(quán)利要求1的GR，其中LMW-EGR是由命名為L-8的大鼠肌細(xì)胞系分泌或釋放的，該細(xì)胞系保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號CRL1769。11.一種治療或預(yù)防疾病或功能紊亂的方法，其包括對患者施用有效量的權(quán)利要求1的GR。12.權(quán)利要求11的方法，其中的疾病或功能紊亂是癌癥。13.權(quán)利要求11的方法，其被用于治療其中免疫系統(tǒng)被敏化的病癥。14.權(quán)利要求11的方法，其中GR是對患者口服給藥的。15.一種含有權(quán)利要求1的GR的組合物。16.權(quán)利要求15的組合物，它是一種含有治療有效量的權(quán)利要求1的GR，以及藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。17.權(quán)利要求16的組合物，其被用于口服給藥。18.一種用于診斷個體的癌癥狀況，或用于確定個體發(fā)生癌癥的危險性的方法，其包括(a)取得一種檢測液，該檢測液是個體的體液，或是從該個體取得的細(xì)胞的培養(yǎng)物的上清液，(b)測定該檢測液中如權(quán)利要求1所限定的LMW-EGR的含量，(c)將該測定的含量與健康個體LMW-EGR平均含量相比較，高于平均值的含量表明該個體患有癌癥，或者具有發(fā)生癌癥的高危險性。19.一種制備基本上純化的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子的方法，其包括(a)使細(xì)胞在一定條件下生長，使細(xì)胞能產(chǎn)生，并向其周圍的培養(yǎng)基中分泌或釋放細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，(b)收集該細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，(c)將含有分子量大于約3000道爾頓物質(zhì)的上清液級分，與含有分子量小于大約3000道爾頓物質(zhì)的上清液級分分開，選取后者。20.權(quán)利要求18的方法，其包括(d)對被選取的級分作進(jìn)一步層析純化處理。21.一種增殖基本上純化的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子的方法，其包括(a)培養(yǎng)肌細(xì)胞或白血細(xì)胞，(b)從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集上清液，(c)通過具有大約500-3000道爾頓截止分子量的膜過濾該上清液，(d)通過反相高壓液相色譜(RP-HPLC)柱，層析在(c)中得到的濾液，并選取對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)有生長抑制活性的級分。22.權(quán)利要求20的方法，其包括(e)通過RP-HPLC柱再次層析在步驟(d)中得到的被選取級分，并選取對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)有生長抑制活性的級分。23.權(quán)利要求20的方法，其包括(e)通過體積排阻層析，層析在步驟(d)中得到的被選取級分，并選取對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)有生長抑制活性的級分。全文摘要本發(fā)明公開了一種由肌細(xì)胞和白血細(xì)胞分泌或釋放的新的物質(zhì)。這種新的物質(zhì)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制被激活淋巴細(xì)胞增殖的活性。該物質(zhì)不抑制正常細(xì)胞的增殖。據(jù)本發(fā)明，這種物質(zhì)可用于治療或預(yù)防癌癥，并且，該物質(zhì)在體液中的，或者在通過個體細(xì)胞在其中生長而條件化的液體中的含量，可用于診斷癌癥，或用于測定個體發(fā)生癌癥的危險程度。文檔編號C07KGK1164190SQ9519633公開日1997年11月5日申請日期1995年9月22日優(yōu)先權(quán)日1994年9月22日發(fā)明者P·費(fèi)徹曼,R·吉亞吉斯申請人:坎菲特技術(shù)有限公司