一種從溪黃草中分離新西蘭牡荊苷-2的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從溪黃草中分離新西蘭牡荊苷-2的方法,涉及中藥化合物單體的制備方法。本發(fā)明步驟為,藥材的提取;大孔樹脂富集;聚酰胺純化;樣品的精制;以D101大孔樹脂、聚酰胺、Sephadex LH-20、ODS為填料,設計技術流程,建立一種從溪黃草中制備新西蘭牡荊苷-2的方法。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明能有效地從溪黃草水提液中分離制備新西蘭牡荊苷-2,為進一步明確溪黃草藥效物質基礎提供依據;新西蘭牡荊苷-2具有較強的生物活性,制備的新西蘭牡荊苷-2可用作標對照品,用于控制溪黃草藥材的質量。具有方法簡便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,經過中式放大,可大量制備新西蘭牡荊苷-2單體化合物,開展更多的藥理藥效實驗,為溪黃草這一嶺南中藥資源的進一步開發(fā)利用提供科學依據。
【專利說明】-種從溪黃草中分離新西蘭牡荊音-2的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥材單體化合物的分離方法,具體涉及從溪黃草中分離新西蘭牡荊 巧-2的方法。
【背景技術】
[0002] 中藥溪黃草[/soob/? sarra(Maxim. )Kudo]為民間常用草藥。溪黃草性味苦、甘、 寒,歸肝、膽經,具有清熱利濕、退黃、涼血散癒的功效,民間歷代名醫(yī)把溪黃草用作清熱巧 濕、利膽退黃藥,治療急性黃痘型肝炎、急性膽囊炎,為預防和治療肝膽疾病的常用藥?,F(xiàn)代 藥理實驗表明,溪黃草水提液具有較強的抗炎、保肝利膽、抗氧化、抗腫瘤等作用。
[0003] 然而溪黃草藥效物質基礎不夠明確,過去一直停留在對其低極性成分的研究,對 其水溶性成分涉足較少,嚴重阻礙了溪黃草資源的進一步開發(fā)利用。新西蘭牡荊巧-2是從 溪黃草中分離制得的水溶性極強的碳巧黃麗,具有較強的抗氧化、抗炎、抗腫瘤作用。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明的目的為建立一種從溪黃草中分離新西蘭牡荊巧-2的方法,通過建立的 方法制備新西蘭牡荊巧-2單體化合物。
[0005] 為達到本發(fā)明的目的所采用的技術方案;用柱色譜分離法建立一種從溪黃草中分 離新西蘭牡荊巧-2的方法;具體包括如下步驟: ①、藥材的提?。喝∠S草干燥藥材,10倍水煎提,3次,每次1.化,趁熱過濾,合并濾 液,并將濾液減壓濃縮至2. 4mg/mU即得溪黃草水提液。
[0006] ③、樣品的精制:溪黃草水提液上D101大孔樹脂柱,依次用水、10%-95%己醇洗 脫,收集己醇洗脫液,回收己醇,先用石油離萃取5次,棄去石油離層,下部的水層用己酸己 醋萃取5次,棄去己酸己醋層,收集下部的水層,上聚醜胺柱,用水洗脫,收集水洗脫液,上 S巧hadex LH-20柱,用50%甲醇洗脫,依次出現(xiàn)紅黑色、紅黃色、黃蹤色、淡綠色色帶,棄去 紅黑、紅黃及黃蹤色色帶部分,收集淡綠色色帶部分,濃縮至3. Omg/mU得水溶性黃麗溶液, 再過0DS柱,用20%-50%甲醇梯度洗脫,洗脫液50mL接一瓶,HPLC檢測,將含新西蘭牡荊 巧-2純度較高的洗脫液合并,濃縮,放冷,結晶,倒出母液,洗涂晶體,重結晶,真空冷凍干 燥,即得新西蘭牡荊巧-2樣品。
[0007] 進一步優(yōu)選的方法可W通過下述步驟實施: 所述步驟③樣品的精制,D101大孔樹脂,用95%己醇浸泡過夜,裝柱,水洗至無醇味,備 用;聚醜胺(80-100目),用95%己醇混息,裝柱,水洗至無醇味,備用;S巧hadex LH-20用甲 醇-水(1 ;1)溶脹化,裝柱,備用;0DS填料用甲醇混息,裝柱,梯度降至20%甲醇,備用;水 提液用濕法上樣法上D101大孔樹脂柱,水洗至顏色很淡,再用95%己醇洗脫,至顏色很淡, 收集95%己醇洗脫液,回收己醇,先用石油離萃取5次,棄去石油離層,下部的水層再用己酸 己醋萃取5次,棄去己酸己醋層,收集下部的水層,濃縮旋去少量有機溶劑,得水層濃縮液, 用濕法上樣法上聚醜胺(80-100目)柱,先用2倍柱體積水洗脫,棄去,繼續(xù)用水洗脫,至顏 色很淡,收集水洗脫液,濃縮至5. Omg/mU加入等體積的甲醇,超聲混勻,靜置,濾過,得濾 液,用濕法上樣法上Se地adex LH-20柱,50%甲醇洗脫,依次出現(xiàn)紅黑色、紅黃色、黃蹤色、 淡綠色色帶,棄去紅黑、紅黃及黃蹤色色帶部分,收集淡綠色色帶部分,濃縮至3. 〇111肖/111以得 水溶性黃麗溶液,用濕法上樣法上ODS柱,20% - 25% - 30% - 35% - 50%甲醇梯度洗脫,每 個梯度洗3倍柱體積,洗脫液50mL接一瓶,HPLC檢測,將含新西蘭牡荊巧-2純度較高的洗 脫液合并,濃縮,放冷,結晶,倒出母液,洗涂晶體,重結晶,真空冷凍干燥,即得新西蘭牡荊 巧-2樣品。
[0008] 本發(fā)明的原理是根據溪黃草水提液中主要化學成分是碳巧黃麗物質,其極性較大 且有較多酷輕基,再結合D101大孔樹脂、聚醜胺、S巧hadex LH-20、0DS填料的性質,制定出 一套從溪黃草中分離制備新西蘭牡荊巧-2的方法。
[0009] 本發(fā)明的有益效果如下: m本發(fā)明能有效地從溪黃草水提液中分離制備新西蘭牡荊巧-2,為進一步明確溪黃草 藥效物質基礎提供依據。
[0010] [引新西蘭牡荊巧-2具有較強的生物活性,本發(fā)明制備的新西蘭牡荊巧-2可作標 準對照品,用于控制溪黃草藥材的質量。
[0011] 巧]本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,經過中式放大,可大量制備新西 蘭牡荊巧-2單體化合物,開展更多的藥理藥效學研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 圖1、溪黃草中制備新西蘭牡荊巧-2的技術流程。
[0013] 圖2、新西蘭牡荊巧-2的結構。
【具體實施方式】
[0014] 為能進一步了解本發(fā)明的特征、技術手段W及所達到的目的、功能,解析本發(fā)明的 優(yōu)點與精神,藉由W下結合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明的詳述得到進一步的了解。
[0015] 實施例一:從溪黃草中分離新西蘭牡荊巧-2 1.儀器與試藥 1. 1儀器Shimadzu高效液相色譜儀(LC-20AT粟;S比-20A自動進樣器;SPD-20A二 極管陣列檢測器)Jhermo Hypersil Gold C18 色譜柱(250 mmX4. 6mm,5Mm) ;CP22抓十萬 分之一電了天平(德國Sartorius公司);BP110S萬分之一天平(德國Sartorius公司); KQ3200DE醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);LCQ Deca XP液一質聯(lián)用儀; Bruker AVANCE III皿500超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀。
[0016] 1. 2試劑甲醇、95%己醇(分析純)、超純水;D101大孔樹脂、聚醜胺(80-100目)、 Sephadex LH-20、孤S。
[0017] 2.藥材的提??;取溪黃草干燥藥材(3. 0kg),10倍水煎提,3次,每次1.化,趁熱過 濾,合并濾液,將濾液減壓濃縮至2. 4mg/mU即得溪黃草水提液。
[001引 3.大孔樹脂富集,取3. 0kg的D101大孔樹脂,用95%己醇浸泡過夜,裝柱,水洗至 無醇味,水提液濕法上樣,水洗至顏色較淡,再用95%己醇洗脫,洗至顏色很淡,收集95%己 醇洗脫液。
[0019] 4.聚醜胺純化,95%己醇洗脫液回收己醇,先用石油離萃取5次,棄去石油離層, 下部的水層再用己酸己醋萃取5次,棄去己酸己醋層,收集下部的水層,濃縮旋去少量有機 溶劑,得水層濃縮液。取聚醜胺(80-100目),用95%己醇混息,裝柱,水洗至無醇味,水層濃 縮液濕法上樣,水洗2倍柱體積,棄去,繼續(xù)用水洗,收集水洗液。
[0020] 5.樣品的精制;水洗液濃縮至5. Omg/mU加入等體積的甲醇,超聲混勻,靜置,濾 過,得濾液。S巧hdex LH-20用甲醇-水(1 ;1)溶脹化,裝柱,濾液濕法上樣,甲醇-水(1 ;1) 洗脫,依次出現(xiàn)紅黑色、紅黃色、黃蹤色、淡綠色色帶,收集淡綠色色帶部分,濃縮至3. Omg/ mU得水溶性黃麗溶液。ODS填料用甲醇混息,裝柱,梯度降至20%甲醇,水溶性黃麗溶液 濕法上樣,20% - 25% - 30% - 35% - 50%甲醇梯度洗脫,每個梯度洗3倍柱體積,洗脫液 50mL -瓶,HPLC檢測,將含新西蘭牡荊巧-2純度較高的洗脫液合并,濃縮,放冷,析晶,再結 晶,倒出母液(母液濃縮繼續(xù)結晶),洗涂晶體,真空冷動干燥,精制得新西蘭牡荊巧-2樣品 80. 8mg〇
[0021] 通過上述方法所建立的一種從溪黃草中分離新西蘭牡荊巧-2的技術流程如圖1 所示。
[0022] 所分離的新西蘭牡荊巧結構如圖2所示。
[0023] W上所述實施例僅表達了本發(fā)明的部分實施方式,于此所掲示的實施例與所有觀 點,應被視為用W說明本發(fā)明,其描述較為具體和詳細,但并不能因此而理解為對本發(fā)明范 圍的限制。應當指出的是,對于本領域的普通技術人員來說,在不脫離本發(fā)明構思的前提 下,還可W做出若干變形和改進,該些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此,本發(fā)明的保護范圍 應W權利要求為準,并涵蓋其合法均等物。
【權利要求】
1. 一種從溪黃草中分離新西蘭牡荊苷-2的方法,該方法包括如下步驟: ① 、藥材的提取:取溪黃草干燥藥材,10倍水煎提,3次,每次I. 5h,趁熱過濾,合并濾 液,并將濾液減壓濃縮至2. 4mg/mL,即得溪黃草水提液; ② 、樣品的精制:溪黃草水提液上DlOl大孔樹脂柱,依次用水、10%-95%乙醇洗脫,收集 乙醇洗脫液,回收乙醇,先用石油醚萃取5次,棄去石油醚層,下部的水層用乙酸乙酯萃取5 次,棄去乙酸乙酯層,收集下部的水層,上聚酰胺柱,用水洗脫,收集水洗脫液,上S^hadex LH-20柱,用50%甲醇洗脫,依次出現(xiàn)紅黑色、紅黃色、黃棕色、淡綠色色帶,棄去紅黑、紅黃 及黃棕色色帶部分,收集淡綠色色帶部分,濃縮至3.Omg/mL,得水溶性黃酮溶液,再過ODS 柱,用20% - 50%甲醇梯度洗脫,洗脫液50mL接一瓶,HPLC檢測,將含新西蘭牡荊苷-2純 度較高的洗脫液合并,濃縮,放冷,結晶,倒出母液,洗滌晶體,重結晶,真空冷凍干燥,即得 新西蘭牡荊苷-2樣品。
2. 根據權利要求1所述的一種從溪黃草中分離新西蘭牡荊苷_2的方法,其特征在 于: 所述步驟②樣品的精制,DlOl大孔樹脂,用95%乙醇浸泡過夜,裝柱,水洗至無醇味,備 用;聚酰胺(80-100目),用95%乙醇混懸,裝柱,水洗至無醇味,備用;SephadexLH-20用甲 醇-水(1 :1)溶脹4h,裝柱,備用;ODS填料用甲醇混懸,裝柱,梯度降至20%甲醇,備用;水 提液用濕法上樣法上DlOl大孔樹脂柱,水洗至顏色很淡,再用95%乙醇洗脫,至顏色很淡, 收集95%乙醇洗脫液,回收乙醇,先用石油醚萃取5次,棄去石油醚層,下部的水層再用乙酸 乙酯萃取5次,棄去乙酸乙酯層,收集下部的水層,濃縮旋去少量有機溶劑,得水層濃縮液, 用濕法上樣法上聚酰胺(80-100目)柱,先用2倍柱體積水洗脫,棄去,繼續(xù)用水洗脫,至顏 色很淡,收集水洗脫液,濃縮至5.Omg/mL,加入等體積的甲醇,超聲混勻,靜置,濾過,得濾 液,用濕法上樣法上S印hadexLH-20柱,50%甲醇洗脫,依次出現(xiàn)紅黑色、紅黃色、黃棕色、 淡綠色色帶,棄去紅黑、紅黃及黃棕色色帶部分,收集淡綠色色帶部分,濃縮至3.Omg/mL,得 水溶性黃酮溶液,用濕法上樣法上ODS柱,20% - 25% - 30% - 35% - 50%甲醇梯度洗脫,每 個梯度洗3倍柱體積,洗脫液50mL接一瓶,HPLC檢測,將含新西蘭牡荊苷-2純度較高的洗 脫液合并,濃縮,放冷,結晶,倒出母液,洗滌晶體,重結晶,真空冷凍干燥,即得新西蘭牡荊 苷-2樣品。
3. 根據權利要求1-2任一項所述的一種從溪黃草中分離新西蘭牡荊苷-2的方法,其特 征在于:所制備的新西蘭牡荊苷-2,為芹菜素6,8-二-C-^D-葡萄糖苷,水溶性極強的碳 苷黃酮,且有多方面的生物活性,可作標準對照品用于溪黃草的含量測定。
【文檔編號】C07D407/04GK104447720SQ201410763353
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月12日 優(yōu)先權日:2014年12月12日
【發(fā)明者】賴小平, 黃松, 唐海明 申請人:東莞廣州中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院