一種非酶切的膠原肽段制備方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了一種可用于膠原蛋白的非酶切肽段的制備方法。屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。主要解決目前膠原蛋白酶法分解時對制品純度的干擾問題，克服傳統(tǒng)膠原肽段由于酶解造成對測試結(jié)果干擾或?qū)ι锊牧现苽浼兓挠绊憽?br> 【專利說明】一種非酶切的膠原肽段制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于膠原蛋白的非酶切肽段的制備方法，制備的肽段可用于膠原分型、電泳和架橋分析，也可用于生物材料的制備。

【背景技術(shù)】
[0002]無論是在膠原蛋白一級結(jié)構(gòu)分析中，還是在膠原類生物材料的制備中，由于反應定量性的限制或材料性質(zhì)的特殊要求，常需要對膠原蛋白進行切斷處理，傳統(tǒng)方法一般是利用胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶解切斷，但由于酶也是一種特殊的蛋白質(zhì)，其作用完成后的殘留即成為制品中的雜質(zhì)，對后期的分析和使用都會帶來干擾和純化的困難。本發(fā)明則利用CNBr與蛋白質(zhì)中蛋氨酸殘基反應，生成含有甲基硫氰酸和帶有高絲氨酸內(nèi)酯的肽段(位于C末端)，以及結(jié)合在蛋氨酸殘基C段的氨基酸殘基(成為新的N末端)形成的肽段。而副產(chǎn)物主要包括甲基硫氰酸、溴化氫和過量的CNBr，這些副產(chǎn)物極易揮發(fā)，通過簡單的凍干處理即可除去。這樣形成的肽段有利于后期分析測試和材料制備。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種膠原蛋白非酶切肽段的制備方法。其步驟如下:
[0004]1、取市售或自制膠原溶于I?50ml的50?80% (v/v)甲酸溶液中，通氮氣5?20min除氧；
[0005]2 JpACNBr固體10?80mg或濃度為90?99% (w/v) CNBr的甲酸溶液(所用甲酸濃度與上步驟一致)10?150ml，再次通氮氣I?5min ；
[0006]3、密封容器中攪拌反應2?40小時，控制反應溫度為4?35°C，反應后，加入2?15倍的去尚子水稀釋并凍干；
[0007]4、凍干樣品再加2?15倍的去離子水稀釋并凍干，可如此反復多次，直至過量反應物和副產(chǎn)物脫除干凈；
[0008]5、樣品分離:使用市售羧甲基纖維素或磷酸纖維素層析填料。起始緩沖液為0.01?0.05mol/L枸櫞酸鈉(PH2.0?4.5)緩沖液。洗脫緩沖液為0.10?0.33mol/L枸櫞酸鈉(PH2.0?4.5)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.01?0.5mol/L NaOH緩沖液；
[0009]6、填柱溫度為35?50 °C，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到2.0?4.5 ;
[0010]7、將冷凍干燥樣品10?10mg溶解于2?200ml起始緩沖液中，30?50°C條件下加熱處理8?20min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫；
[0011]8、以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。

【具體實施方式】
[0012]實施例一
[0013]取1mg市售或自制膠原溶于20ml的70% (v/v)甲酸溶液中，通氮氣1min除氧。加入CNBr固體40mg，再次通氮氣2min。密封容器中攪拌反應4小時，控制反應溫度為30°C，反應完成后，加入8倍的去離子水稀釋并凍干。凍干樣品再加5倍的去離子水稀釋并凍干，如此反復2次。使用市售羧甲基纖維素層析填料。起始緩沖液為0.02mol/L枸櫞酸鈉(PH3.6)緩沖液。洗脫緩沖液為0.18mol/L枸櫞酸鈉(PH3.6)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.0lmol/L NaOH緩沖液。填柱溫度為45°C，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到3.6。將冷凍干燥樣品1mg溶解于2ml起始緩沖液中，50°C條件下加熱處理1min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫。以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
[0014]實施例二
[0015]取1mg市售或自制膠原溶于50ml的50% (v/v)甲酸溶液中，通氮氣15min除氧。加入CNBr固體70mg，再次通氮氣5min。密封容器中攪拌反應8小時，控制反應溫度為10°C，反應完成后，加入10倍的去離子水稀釋并凍干。凍干樣品再加8倍的去離子水稀釋并凍干，如此反復2次。使用市售磷酸纖維素層析填料。起始緩沖液為0.05mol/L枸櫞酸鈉(PH2.2)緩沖液。洗脫緩沖液為0.23mol/L枸櫞酸鈉(PH2.2)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.lmol/L NaOH緩沖液。填柱溫度為35°C，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到2.2。將冷凍干燥樣品1mg溶解于5ml起始緩沖液中，35°C條件下加熱處理Smin后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫。以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
[0016]實施例三
[0017]取10mg市售或自制膠原溶于50ml的80% (v/v)甲酸溶液中，通氮氣20min除氧。加入濃度98% CNBr甲酸溶液90ml，再次通氮氣3min。密封容器中攪拌反應18小時，控制反應溫度為4°C，反應完成后，加入9倍的去離子水稀釋并凍干。凍干樣品再加2倍的去離子水稀釋并凍干，如此反復I次。使用市售磷酸纖維素層析填料。起始緩沖液為0.0lmol/L枸櫞酸鈉(PH4.5)緩沖液。洗脫緩沖液為0.17mol/L枸櫞酸鈉(PH4.5)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.3mol/L NaOH緩沖液。填柱溫度為50°C，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到4.5。將冷凍干燥樣品10mg溶解于10ml起始緩沖液中，40°C條件下加熱處理15min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫。以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
【權(quán)利要求】
1.一種用于膠原蛋白的非酶切肽段的制備方法，制備的肽段可用于膠原分型、電泳和架橋分析，也可用于生物材料的制備，其特征在于制備過程包括下列各步驟: (1)取市售或自制膠原溶于1?501111的50?80% 0/^)甲酸溶液中，通氮氣5?.20111111 除氧； (2)加入⑶此固體10?80呢或濃度為90?99%(界八)⑶此的甲酸溶液(所用甲酸濃度與上步驟一致)，再次通氮氣1?5111111 ； (3)密封容器中攪拌反應2?40小時，控制反應溫度為4?35。X:，反應完成后，加入.2?15倍的去離子水稀釋并凍干； (4)凍干樣品再加2?15倍的去離子水稀釋并凍干，可如此反復多次，直至過量反應物和副產(chǎn)物脫除干凈；(5)樣品分離:使用市售羧甲基纖維素或磷酸纖維素層析填料，起始緩沖液為0.01?.0.05001/1枸櫞酸鈉陳0?4.5)緩沖液，洗脫緩沖液為0.10?0.33001/1枸櫞酸鈉陳0?4.5)緩沖液，柱清洗緩沖液為0.01?0.5^01/1關(guān)!I緩沖液； (6)填柱溫度為35?501:，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至值達到2.0?4.5 ； (7)將冷凍干燥樣品10?100呢溶解于2?20001起始緩沖液中，30?501:條件下加熱處理8?20111111后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫； (8)以226=111測定吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
【文檔編號】C07K1/02GK104478988SQ201410662382
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】謝磊, 畢宏偉 申請人:天津市賽寧生物工程技術(shù)有限公司