一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種用于活性細(xì)胞中Zn2+成像的熒光探針方法，其特征是以1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，簡稱探針s3，為微量Zn2+的熒光增強(qiáng)型探針，探針s3及Zn2+能分別滲透到活性細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞具有良好的相容性，通過探針s3對細(xì)胞內(nèi)Zn2+染色后，用熒光倒置顯微鏡檢測顯現(xiàn)清晰的藍(lán)色熒光細(xì)胞圖像，探針s3是活性細(xì)胞的熒光照影試劑，探針s3的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為。
【專利說明】一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地說是一種用于活體細(xì)胞成像的熒光探針方法。
[0002]【背景技術(shù)】:突光傳感器與突光顯微技術(shù)的結(jié)合，使突光傳感器在生物活性物質(zhì)檢測和細(xì)胞成像方面得到廣泛應(yīng)用。對生物活性物質(zhì)而言，檢出靈敏度極限是單個(gè)分子?；罴?xì)胞成像技術(shù)是生命科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】種重要的研究手段，與固定細(xì)胞研究結(jié)合起來，可以解釋活細(xì)胞中的多種生命現(xiàn)象。近年來，隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，人們對細(xì)胞內(nèi)的活性物種、細(xì)胞信號傳導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等方面的研究越來越深入。美國加州大學(xué)戴維斯分校(UC Davis)生物光子學(xué)科學(xué)技術(shù)中心(CBST)的科研人員首次通過熒光標(biāo)記成功地對活腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的納米尺寸區(qū)室的運(yùn)動進(jìn)行了成像。這一成果為未來理解癌癥和一大批其他疾病的分子原因和生物力學(xué)的突破進(jìn)展帶來了希望，它還能促進(jìn)神經(jīng)科學(xué)和干細(xì)胞研究等領(lǐng)域。熒光成像分析是目前廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞分析的一種高靈敏的可視化分析技術(shù)。目前用于活細(xì)胞成像分析的熒光探針多為有機(jī)熒光染料分子，為活細(xì)胞分析提供了有效的探測手段。在實(shí)際應(yīng)用中，這些有機(jī)熒光染料分子存在著熒光壽命較短、容易猝滅及穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)。所以，實(shí)現(xiàn)長時(shí)間的實(shí)時(shí)動態(tài)連續(xù)測定，提高可視化分析的選擇性和精度是目前迫切需要解決的問題。而金屬配合物熒光探針具有熒光壽命長、發(fā)射峰窄、穩(wěn)定性好等發(fā)光性質(zhì)，引起了人們的重視與關(guān)注。有機(jī)染料具有良好的光穩(wěn)定性、合適的水溶性及很好的細(xì)胞膜通透性，而且在細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的熒光，合成相對簡單，收率較高。作為細(xì)胞內(nèi)的成像探針，必須滿足(O良好的水溶性；(2)在生理?xiàng)l件下具有良好的熱穩(wěn)定性和動力學(xué)惰性；(3)良好的膜穿透性，并且對細(xì)胞是無毒的；(4)有較長的激發(fā)波長和較高的量子產(chǎn)率。
[0003]細(xì)胞內(nèi)的小分子物種包括各種活性氧物種(單線態(tài)氧、過氧化氫、超氧負(fù)離子自由基等彡^^+^一+^^人^+等是人們研究關(guān)注的焦點(diǎn)’因?yàn)樗鼈冋{(diào)控著細(xì)胞的諸多功能與性質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)起著非常重要的作用，因此實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞內(nèi)各種生理活性小分子物種的實(shí)時(shí)在線動態(tài)檢測對生命科學(xué)研究與發(fā)展具有重要的價(jià)值。
鋅是繼鐵之后人體內(nèi)含量最豐富的過渡金屬離子，是許多生物過程如大腦功能和病理學(xué)、基因轉(zhuǎn)錄、免疫功能和哺乳動物繁殖中的重要輔助因子，它的新陳代謝紊亂會引起諸多疾病。鋅還參與病理過程，如阿爾茨海默氏癥、癲癇、缺血性中風(fēng)和嬰兒腹瀉等。大多數(shù)生物組織中鋅離子或是被緊密地綁定于蛋白、或游離、或螯合等多種形態(tài)存在，細(xì)胞內(nèi)鋅離子的檢測是人們研究的熱點(diǎn)。熒光傳感器的主要目標(biāo)是對出現(xiàn)在人體各種組織中，包括大腦、腸道、胰腺和視網(wǎng)膜的鋅離子的檢測。到目前為止，對鋅離子的熒光傳感器已經(jīng)成功應(yīng)用在活體細(xì)胞、海馬切片的鋅離子熒光成像。目前利用探針檢測鋅離子的相關(guān)報(bào)道已有不少，但真正能夠應(yīng)用到活細(xì)胞內(nèi)成像的卻不多。文獻(xiàn)報(bào)道了一種以雙(2-吡啶甲基)胺為Zn2+螯合基團(tuán)、二乙基三胺五乙酸為配體的稀土銪探針，并將其用于HeLa細(xì)胞內(nèi)Zn2+的成像分析。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:本發(fā)明的目的在于研究一種能高靈敏、高選擇的對活體細(xì)胞成像的熒光探針新方法。通過發(fā)明人研制合成的新的熒光探針，是一種對Zn2+高靈敏、高選擇性檢測識別的熒光探針，并能實(shí)現(xiàn)對活體細(xì)胞中微量Zn2+的熒光染色和成像。
[0005]本發(fā)明一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，是以1，5_ 二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，簡稱探針s3，為細(xì)胞內(nèi)微量Zn2+的熒光增強(qiáng)型探針，探針s3及Zn2+能分別滲透到活細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞具有良好的相容性，通過探針s3對細(xì)胞內(nèi)Zn2+染色后，用熒光倒置顯微鏡檢測出清晰的藍(lán)色熒光細(xì)胞圖像，探針s3是一種活細(xì)胞中Zn2+的熒光成像試劑。
[0006]本發(fā)明所述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，是用探針S3對細(xì)胞內(nèi)Zn2+進(jìn)行染色，用熒光倒置顯微鏡觀測活體細(xì)胞，染色成像的具體方法為:活性PC3細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇接種于含10%胎牛血清以及含1%雙抗的培養(yǎng)基(RPMI 1640)中，在溫度為37°C，5% CO2及飽和濕度為100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天傳代I次，選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于12孔板中培養(yǎng)，密度為2X 14個(gè)/ml，次日用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，將細(xì)胞浸入含10μ mol ?171探針83(90(^1^咅養(yǎng)基+10(^11101 ?I/1 探針 s3 的 DMFAI2C^eI合溶液 100 μ L)中，在37°C，5%C02、飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸出含探針s3的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞三次，熒光倒置顯微鏡下觀察并進(jìn)行亮場和暗場拍照；再浸入含50 μ mol.L—1Zn2+ 溶液(900 μ L 培養(yǎng)基 +500 μ mol.171 Zn2+ 溶液 100 μ L)，在 37°C、5%C02、飽和濕度 100%的培養(yǎng)箱中孵育30 min,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)探針對Zn2+染色，吸出含Zn2+溶液的培養(yǎng)液，染色后的細(xì)胞再用新鮮培養(yǎng)基清洗三次，在熒光倒置顯微鏡下觀察探針對細(xì)胞內(nèi)Zn2+染色后的熒光成像，對細(xì)胞影像拍照獲得清晰的細(xì)胞輪廓影像。
[0007]上述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，是細(xì)胞成像中，探針S3和Zn2+都能滲透到活體PC3細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞呈圓滑飽滿狀，探針與細(xì)胞具有良好的相容性，未見細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞無毒性；探針與Zn2+離子在細(xì)胞內(nèi)染色后，熒光倒置顯微鏡檢測顯示了清晰的藍(lán)色熒光細(xì)胞分布，染色具有特定區(qū)域的選擇性聚集能力。
[0008]上述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針技術(shù)，是所用的試劑為分析純或生化試齊U，所用水為二次蒸餾水或生理鹽水；所用活體PC3細(xì)胞為人體前列腺癌細(xì)胞；所用的拍照設(shè)備為熒光倒置顯微鏡。
[0009]上述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，是所述探針S3化學(xué)結(jié)構(gòu)式為:

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分子式:C21H14N4O7
分子量:434.09
熔點(diǎn):大于300°C
溶解性:微溶于氯仿、二甲亞砜、N, N- 二甲基甲酰胺等，不溶于乙醇。
[0010]光譜性質(zhì):在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液與水的混合溶劑(v/v，2/3)中的熒光激發(fā)波長是310nm,發(fā)射波長是454nm,紫外吸收波長是310nm。
[0011]上述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，是作為細(xì)胞成像的熒光探針S3，化學(xué)名稱為1，5_ 二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，是本發(fā)明人合成。
[0012]本發(fā)明合成的熒光探針s3作為細(xì)胞內(nèi)的成像探針，滿足了(I)良好的水溶性；(2)在生理?xiàng)l件下具有良好的熱穩(wěn)定性；(3)良好的膜穿透性，并且對細(xì)胞是無毒的；(4)與Zn2+有選擇性、高靈敏的熒光增強(qiáng)作用，有較長的激發(fā)波長和較高的發(fā)光產(chǎn)率。利用探針s3在活體細(xì)胞內(nèi)與Zn2+的染色作用，用熒光倒置顯微鏡能清晰獲得發(fā)射藍(lán)色熒光的細(xì)胞圖像。發(fā)明了一種新穎的活體細(xì)胞的熒光成像技術(shù)。
[0013]本發(fā)明合成的熒光探針S3的結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振波譜、質(zhì)譜和紅外光譜進(jìn)行了表征。結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)列于表1。

【權(quán)利要求】
1.一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，其特征是以1，5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，簡稱探針s3，為細(xì)胞內(nèi)微量Zn2+的熒光增強(qiáng)型探針，探針s3及Zn2+能分別滲透到活細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞具有良好的相容性，通過探針s3對細(xì)胞內(nèi)Zn2+染色后,用熒光倒置顯微鏡檢測出清晰的藍(lán)色熒光細(xì)胞圖像，探針s3是一種活細(xì)胞中Zn2+的熒光成像試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，其特征是用探針s3對細(xì)胞內(nèi)Zn2+進(jìn)行染色，用熒光倒置顯微鏡觀測活體細(xì)胞，染色成像的具體方法為:活性PC3細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇接種于含10%胎牛血清以及含1%雙抗的培養(yǎng)基(RPMI 1640)中，在溫度為370C，5% CO2及飽和濕度為100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天傳代I次，選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于12孔板中培養(yǎng)，密度為2 X 14個(gè)/ml，次日用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，將細(xì)胞浸入含10 μ mo I. 1探針s3 (900 μ L培養(yǎng)基+100 μ mo I.L—1探針s3的DMF/H20混合溶液100 μ L)中，在37°C，5%C02、飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸出含探針s3的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞三次，熒光倒置顯微鏡下觀察并進(jìn)行亮場和暗場拍照；再浸入含 50 μ mol. 1 Zn2+溶液(900 μ L 培養(yǎng)基+500 μ mol. 1 Zn2+溶液 100 μ L)，在 37°C、5%C02、飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中孵育30 min,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)探針對Zn2+染色，吸出含Zn2+溶液的培養(yǎng)液，染色后的細(xì)胞再用新鮮培養(yǎng)基清洗三次，在熒光倒置顯微鏡下觀察探針對細(xì)胞內(nèi)Zn2+染色后的熒光成像，對細(xì)胞影像拍照獲得清晰的細(xì)胞輪廓影像。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，其特征是細(xì)胞成像中，探針s3和Zn2+都能滲透到活體PC3細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞呈圓滑飽滿狀，探針與細(xì)胞具有良好的相容性，未見細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞無毒性；探針與Zn2+離子在細(xì)胞內(nèi)染色后，熒光倒置顯微鏡檢測顯示了清晰的藍(lán)色熒光細(xì)胞分布，染色具有特定區(qū)域的選擇性聚集能力。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針技術(shù)，其特征是所用的試劑為分析純或生化試劑，所用水為二次蒸餾水或生理鹽水；所用活體PC3細(xì)胞為人體前列腺癌細(xì)胞；所用的拍照設(shè)備為熒光倒置顯微鏡。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，其特征是所述探針s3化學(xué)結(jié)構(gòu)式為:
熔點(diǎn):大于300 °C溶解性:微溶于氯仿、二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺等，不溶于乙醇，光譜性質(zhì):在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液與水的混合溶劑(v/v，2/3)中的熒光激發(fā)波長是310nm,發(fā)射波長是454nm,紫外吸收波長是310nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，其特征是作為細(xì)胞成像的熒光探針s3，化學(xué)名稱為1，5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，是本發(fā)明人合成。
【文檔編號】C07D311/16GK104198449SQ201410387054
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】李麗, 牟蘭, 曾晞, 沈韻 申請人:貴州大學(xué)