執(zhí)行自動(dòng)高內(nèi)涵細(xì)胞成像的系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]1.領(lǐng)域
[0002]本申請(qǐng)涉及高內(nèi)涵(high-content)篩選和分析的自動(dòng)成像系統(tǒng)的使用，高內(nèi)涵篩選和分析的自動(dòng)成像統(tǒng)稱作高內(nèi)涵成像。更特別地，本申請(qǐng)涉及利用具有多路復(fù)用的成像性能的系統(tǒng)進(jìn)行高內(nèi)涵成像，包括對(duì)不同的生色團(tuán)標(biāo)記的樣本進(jìn)行成像。
【背景技術(shù)】
[0003]2.相關(guān)技術(shù)
[0004]近十年來(lái)顯微鏡技術(shù)的增長(zhǎng)趨勢(shì)是對(duì)生物樣本的自動(dòng)成像。自動(dòng)顯微鏡技術(shù)不是對(duì)樣本進(jìn)行手動(dòng)觀察，而是涉及用計(jì)算機(jī)控制的樣本場(chǎng)的自動(dòng)選擇和數(shù)字成像，在不需要終端用戶輸入的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)大量的樣本進(jìn)行高產(chǎn)能成像。
[0005]當(dāng)利用所獲得的圖像進(jìn)行自動(dòng)定量分析，應(yīng)用于熒光標(biāo)記的細(xì)胞時(shí)，自動(dòng)成像通常被稱作HCI (高內(nèi)涵成像)。特別地，HCI是基于細(xì)胞的篩選方法，產(chǎn)生關(guān)于細(xì)胞構(gòu)成和加工的暫時(shí)空間的動(dòng)力學(xué)的細(xì)節(jié)信息，并在為了藥物候選的識(shí)別和確認(rèn)使用基于細(xì)胞的篩選中起到重要作用。由HCI提供的信息弱化了通過(guò)提供深度生物信息的藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的瓶頸問(wèn)題。與該方法關(guān)聯(lián)的分析利用固定的或活的細(xì)胞，這取決于所需要的生物信息。
[0006]作為HCI操作的方法的例子，感興趣的組織或細(xì)胞被裝載到顯微鏡載波片的部分上或者標(biāo)準(zhǔn)樣本板(也被稱作微-滴定或微-井平板)中的井陣列中。然后將載波片的部分或者樣本板定位在成像系統(tǒng)內(nèi)的平臺(tái)上，這樣載波片或者樣本板能隨著平臺(tái)在垂直于系統(tǒng)配置的光路的兩個(gè)方向上移動(dòng)。系統(tǒng)通常包括用于評(píng)估目標(biāo)細(xì)胞的顯微鏡。結(jié)果，任何單個(gè)的井或者載波片的部分能夠與顯微鏡對(duì)準(zhǔn)地定位，從而通過(guò)顯微鏡物鏡成像。
[0007]在典型的掃描過(guò)程中，平臺(tái)通過(guò)配置的馬達(dá)移動(dòng)，直到其中一個(gè)井或者載波片的部分與物鏡對(duì)準(zhǔn)，井或者載波片的部分內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞通過(guò)該物鏡成像。對(duì)于井而言，整個(gè)井可以同時(shí)成像，或者井內(nèi)的不同場(chǎng)單獨(dú)成像。
[0008]當(dāng)完成成像時(shí)，通過(guò)馬達(dá)移動(dòng)平臺(tái)，直到另一個(gè)井或載波片的部分與物鏡對(duì)準(zhǔn)，與上面討論的類似，新對(duì)準(zhǔn)的微-井或載波片的部分內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞通過(guò)物鏡成像。一直持續(xù)這樣的移動(dòng)和成像，直到例如，所有的井或者載波片的定義的部分都通過(guò)物鏡成像。然后在獲得的圖像上執(zhí)行計(jì)算機(jī)分析，從而確定關(guān)于細(xì)胞的信息。這樣的掃描類型可以對(duì)不同的HCI掃描，在同一機(jī)器上在一天內(nèi)執(zhí)行多次。
[0009]HCI主要應(yīng)用于用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，諸如朝向特定的細(xì)胞目標(biāo)的熒光配合基和免疫熒光探針，熒光環(huán)境或細(xì)胞狀態(tài)傳感器，或者由細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的熒光蛋白質(zhì)嵌合體。對(duì)于最優(yōu)的信噪比檢測(cè)，典型地，熒光需要使用成像系統(tǒng)的落射熒光幾何形狀，其中熒光信號(hào)作為照明信號(hào)折回到同一路徑，兩束光通過(guò)諸如二向色鏡，衍射光柵或者諸如A0TF或LCTF的固態(tài)鑒別器的波長(zhǎng)鑒別器彼此分開。HCI的附加的優(yōu)勢(shì)在于它的多路復(fù)用的多光譜特性，其中多個(gè)熒光探針可被檢測(cè)，每個(gè)發(fā)射的熒光信號(hào)的顏色都不同，以及對(duì)使用白光明亮場(chǎng)成像所獲得的圖像進(jìn)行合并的能力，這是在大多數(shù)HCI平臺(tái)上可用的選擇。
[0010]明亮場(chǎng)顯微鏡使用透射光幾何圖形，其中樣本的照明和到達(dá)檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)都橫跨相同的波長(zhǎng)。但是，當(dāng)應(yīng)用于生物樣本時(shí)，使用明亮場(chǎng)顯微鏡的不足在于它的對(duì)比度比較差。典型地，可以通過(guò)諸如相位對(duì)比和DIC(差分干涉對(duì)比)顯微鏡方法來(lái)增強(qiáng)對(duì)比度，其中樣本照明和到達(dá)檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)仍然覆蓋相同的波長(zhǎng)。
[0011]用于提高樣本對(duì)比度和利用透射光成像來(lái)區(qū)別特定細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)的可選擇的方法是利用不同的生色團(tuán)對(duì)樣本進(jìn)行染色。生色團(tuán)吸收特定波長(zhǎng)的光，差分吸收(即，減法混合)以及透射光的透過(guò)率加強(qiáng)樣本的對(duì)比度。此外，根據(jù)不同的生色團(tuán)對(duì)于細(xì)胞和組織中的不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域的不同的親和力，通過(guò)這些生色團(tuán)對(duì)光束的差分吸收，能夠檢測(cè)這些不同的細(xì)胞或組織區(qū)域。利用生色團(tuán)以高對(duì)比度差分地檢測(cè)不同細(xì)胞或組織區(qū)域，諸如利用H&E (蘇木精和伊紅)染色，是顯微鏡在生命科學(xué)研究以及臨床診斷應(yīng)用中的常規(guī)和傳統(tǒng)的用法。
[0012]還指出，數(shù)字病理學(xué)的自動(dòng)組織掃描器具有對(duì)熒光和生色團(tuán)吸收率成像的能力，但是，這些方法因?yàn)槭褂貌煌臋z測(cè)器捕獲主要顏色或者使用彩色照相機(jī)捕獲生色團(tuán)的差分顏色吸收而受到限制。此外，增加彩色照相機(jī)或者多個(gè)單色照相機(jī)會(huì)很昂貴。另外，對(duì)彩色照相機(jī)所獲得的圖像的分析需要圖像處理算法，該算法首先無(wú)法對(duì)在參考圖像的幫助下所完成的不同顏色進(jìn)行混合。
[0013]因而，期望提供其他低成本以及自動(dòng)的系統(tǒng)和方法以提高樣本對(duì)比度以及區(qū)分特定細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)，這對(duì)于自動(dòng)成像系統(tǒng)的僅僅由熒光標(biāo)記的細(xì)胞類型的成像是免費(fèi)的。
[0014]相應(yīng)地，這里的實(shí)施例提供一種在細(xì)胞和/或組織樣本上進(jìn)行高內(nèi)涵成像(HCI)的系統(tǒng)和方法，該細(xì)胞和/或組織樣本由熒光探針標(biāo)記和/或也由生色團(tuán)標(biāo)記。因?yàn)镠CI是多路復(fù)用方法，其中多種不同的熒光顏色，以及白光明亮場(chǎng)成像可并合并，這里的實(shí)施例通過(guò)僅僅使用單一的探測(cè)器利用不同的生色團(tuán)進(jìn)行多路復(fù)用成像來(lái)擴(kuò)展已有的系統(tǒng)的性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]這里所公開的各個(gè)實(shí)施例涉及高內(nèi)涵成像(HCI)系統(tǒng)，該系統(tǒng)提供在細(xì)胞和/或組織樣本上進(jìn)行HCI，該細(xì)胞和/或組織樣本利用熒光探針進(jìn)行標(biāo)記，也可利用生色團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。此外，如這里所詳述的，HCI能夠多路復(fù)用不同成像模式意味著可以使用三種操作模式的任意組合，然而，之前僅明亮場(chǎng)白光圖像能與熒光進(jìn)行組合。特別地，之前僅明亮場(chǎng)白光圖像能與熒光進(jìn)行組合，而這里所公開的實(shí)施例加強(qiáng)了 HCI的能力從而也能夠通過(guò)生色團(tuán)檢測(cè)不同的差分顏色吸收。
[0016]第一方面提供了細(xì)胞自動(dòng)分析方法，包括:提供包含多個(gè)細(xì)胞的位置的陣列，多個(gè)細(xì)胞具有一個(gè)或多個(gè)熒光報(bào)告分子和/或一個(gè)或多個(gè)生色團(tuán)染色分子，其中每個(gè)位置中的多個(gè)細(xì)胞作為多個(gè)細(xì)胞子集被容納以提供多個(gè)場(chǎng)；提供配置為向位置的陣列中的任意位置中的多個(gè)場(chǎng)選擇性地引導(dǎo)一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)的輻射的光源；在一個(gè)或多個(gè)期望的位置中掃描多個(gè)場(chǎng)中的每一個(gè)；利用單一的單色照相機(jī)為每個(gè)場(chǎng)提供多個(gè)圖像，其中多個(gè)圖像中的每一個(gè)包括位于細(xì)胞內(nèi)或上的誘發(fā)的熒光信號(hào)和/或誘發(fā)的生色團(tuán)吸收信號(hào)，其中每個(gè)圖像包括至少一個(gè)選自下列的光學(xué)形態(tài):一個(gè)或多個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)的輻射，選擇的濾波的波長(zhǎng)的輻射，以及期望的成像曝光周期；成像時(shí)比較多個(gè)圖像中的每個(gè)圖像以便將來(lái)自多個(gè)圖像中的每一個(gè)的誘發(fā)的熒光信號(hào)和/或生色團(tuán)吸收信號(hào)轉(zhuǎn)變成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)；利用數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)自動(dòng)測(cè)量來(lái)自細(xì)胞上或內(nèi)的焚光報(bào)告分子的焚光信號(hào)的強(qiáng)度和/或分布，和/或自動(dòng)測(cè)量細(xì)胞上或內(nèi)的生色團(tuán)誘發(fā)的吸收信號(hào)的強(qiáng)度和/或分布；以及具有合并和顯示來(lái)自單色照相機(jī)上捕獲的不同通道的圖像的能力，這樣它們作為高對(duì)比度彩色圖像顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上。
[0017]這種增加的能力使得之前通過(guò)HCI平臺(tái)不可能實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用成為可能，諸如，但不限于:
[0018]?生色團(tuán)染色組織的自動(dòng)成像，以及顏色分布的定量分離和分析；
[0019]?生色團(tuán)染色組織上的免疫熒光一能夠檢測(cè)組織中的特定分子目標(biāo)一對(duì)于一個(gè)或多個(gè)樣本都以自動(dòng)的方式來(lái)完成；以及
[0020]?升至7 λ的擴(kuò)展的光學(xué)形態(tài)，λ是特殊的激發(fā)光(諸如，發(fā)光二極管(LED)或者經(jīng)濾光的白光)，特殊的成像光束(通常對(duì)從微-井接收的光進(jìn)行濾光)，和/或特殊的曝光周期等。
[0021]在一個(gè)方面，一種執(zhí)行自動(dòng)高內(nèi)涵細(xì)胞成像的系統(tǒng)包括:支承組件，熒光激發(fā)光源，傳輸光束組件，顯微鏡物鏡，以及成像設(shè)備。該支承組件配置為接收具有包含生物細(xì)胞的多個(gè)井的容器以及在可視位置處自動(dòng)地且選擇性地定位所述生物細(xì)胞。該熒光激發(fā)光源自動(dòng)產(chǎn)生激發(fā)光束，所述激發(fā)光束被引導(dǎo)至所述可視位置以從定位于可視位置處的所述生物細(xì)胞誘發(fā)熒光發(fā)射光束。該傳輸光束組件自動(dòng)產(chǎn)生傳輸光束，所述傳輸光束被引導(dǎo)至所述可視位置以從定位于可視位置處的所述生物細(xì)胞誘發(fā)生色團(tuán)吸收特征。該顯微鏡物鏡與所述可視位置對(duì)準(zhǔn)以接收所誘發(fā)的熒光發(fā)射光束和所誘發(fā)的生色團(tuán)吸收特征。該成像設(shè)備自動(dòng)成像并記錄所誘發(fā)的熒光發(fā)射光束和所誘發(fā)的生色團(tuán)吸收特征。
[0022]所述傳輸光束組件通過(guò)選擇性地產(chǎn)生多個(gè)傳輸波長(zhǎng)來(lái)產(chǎn)生傳輸光，每一個(gè)傳輸波長(zhǎng)是在分開的時(shí)間被引導(dǎo)至所述可視位置以從定位于可視位置處的所述生物細(xì)胞誘發(fā)多個(gè)生色團(tuán)吸收特征。所述成像設(shè)備按一次一個(gè)的方式對(duì)來(lái)自所述生物細(xì)胞的多個(gè)生色團(tuán)吸收特征中的每一個(gè)進(jìn)行成像和記錄。所述系統(tǒng)還包括計(jì)算機(jī)設(shè)備，其基于多個(gè)成像的生色團(tuán)吸收特征來(lái)產(chǎn)生定位于可視位置處的所述生物細(xì)胞的合成圖像。
[0023]所述傳輸光束組件包括光漫射器和防反射窗口從而使得從光束組件發(fā)出的傳輸光束可穿過(guò)其中，而來(lái)自其它方向的光束無(wú)法穿過(guò)其中。
[0024]所述成像設(shè)備包括單色照相機(jī)。
[0025]所述系統(tǒng)還包括具有一個(gè)或多個(gè)處理器和存儲(chǔ)器的計(jì)算機(jī)設(shè)備，所述計(jì)算機(jī)設(shè)備可操作以對(duì)誘發(fā)的熒光發(fā)射光束和誘發(fā)的生色團(tuán)吸收特性的所記錄的圖像執(zhí)行圖像分析。
[0026]所述系統(tǒng)被適配成同時(shí)引導(dǎo)激發(fā)光束和傳輸光束至所述可視位置，并且所述成像設(shè)備被適配成同時(shí)對(duì)誘發(fā)的熒光發(fā)射光束和誘發(fā)的生色團(tuán)吸收特性進(jìn)行成像。
[0027]所述傳輸光束組件具有光軸，并包括:支架;固定到所述支架的光組件，所述光組件包括圍繞所述光軸設(shè)置的多個(gè)光源，所述多個(gè)光源包括多個(gè)光組，每個(gè)光組具有一對(duì)光源，每個(gè)光組的光源被定位在所述光軸的相對(duì)側(cè)，所述光組可被選擇性地激發(fā)；與所述光軸對(duì)準(zhǔn)且固定到所述支架以便圍繞所述光組件的鏡筒；定位在所述鏡筒內(nèi)的光漫射器；以及定位在所述鏡筒內(nèi)的防反射窗口，這樣由任何光組發(fā)射的光穿過(guò)所述光漫射器和防反射窗口從而通過(guò)所述傳輸光束組件沿著所述光軸進(jìn)行傳輸。
[0028]所述光組件還包括多個(gè)可移除的圓環(huán)，每個(gè)圓環(huán)具有定位在其上的一個(gè)光組，每個(gè)圓環(huán)被定位從而使得對(duì)應(yīng)光組的光源被定位在所述光軸的相對(duì)側(cè)。
[0029]所述光漫射器是乳白光漫射器。
[0030]光源通常以圓形形狀圍繞所述光軸設(shè)置。
[0031]所述光組件還包括通常定位在所述圓形形狀的中心處的附加光源。
[0032]所述光源是發(fā)光二極管(LED)。
【附圖說(shuō)明】
[0033]現(xiàn)在將參考附圖對(duì)各個(gè)實(shí)施例進(jìn)行描述。應(yīng)該理解的是，這些附圖僅表示典型的實(shí)施例，因此并不認(rèn)為是對(duì)本申請(qǐng)的范圍的限制。還應(yīng)該理解的是，附圖不必按比例繪制，以及一些元件的繪制只是為了清楚。
[0034]在附圖中，相同的數(shù)字表示相同的元件。此外，一個(gè)元件的多個(gè)例子的每一個(gè)可包括附加到元件數(shù)字后面的單獨(dú)的字母，例如，特定元件“20”的兩個(gè)例子可標(biāo)記為“20a”和“20b”。在這種情況下，在沒(méi)有使用附加字母(例如，“20”)的元件標(biāo)記通常可指代元件的每個(gè)例子；而當(dāng)指代元件的特定例子時(shí)，元件標(biāo)記將包括附加的字母(例如，“20a” )。
[0035]圖1示出包含這里所公開的或想象的特征的系統(tǒng)的示例性實(shí)施例。
[0036]圖2是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的細(xì)胞成像設(shè)備的橫截面?zhèn)纫晥D。
[0037]圖3是圖2的細(xì)胞成像設(shè)備的橫截面頂視圖，示出激發(fā)和發(fā)射光束穿過(guò)該設(shè)備的流程。
[0038]圖4是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的傳輸光束組件的橫截面?zhèn)纫晥D。
[0039]圖5是圖4中所示的傳輸光束組件的分解圖。
[0040]圖6是圖4和5中所示的光束組件的平面頂視圖。
[0041]圖7A-7D是表示光束組件的可選擇的實(shí)施例的平面頂視圖。
[0042]圖8表示根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的關(guān)于選擇的透射光LED所利用的二向色鏡和發(fā)射濾光片的透過(guò)率和波長(zhǎng)的關(guān)系圖。
[0043]圖9A-9E示出利用10倍物鏡在四種不同波長(zhǎng)拍攝的H&E染色組織的差分吸收?qǐng)D像。
[0044]圖