專利名稱：天然章魚肉堿的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適合規(guī)?；a(chǎn)天然章魚肉堿的制備方法，尤其是涉及一種集成多級膜分離、離子交換、中壓色譜技術(shù)從頭足類海產(chǎn)品加工下腳料中制備天然章魚肉堿的方法，屬于生物提取分離技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
頭足類是重要的海洋經(jīng)濟動物，具有生命周期短、生長快等特點，資源極為豐富。重要經(jīng)濟種類主要有章魚、烏賊和魷魚。我國是生產(chǎn)頭足類的主要國家之一，年產(chǎn)量已超過百萬噸。頭足類是經(jīng)濟價值很高的海洋軟體動物，其肉質(zhì)肥厚而鮮美，富含蛋白質(zhì)和氨基酸，味道鮮美，口感獨特，一直深受廣大消費者青睞。頭足類可謂全身都是寶，肉除鮮食外，還可以加工成干制品、魚丸、魚糜等，食用方式多種多樣。目前大多數(shù)從事頭足類生產(chǎn)企業(yè)在將可食用部分進行加工利用后，對加工過程產(chǎn)生的下腳料只有部分簡單的加工成魚粉或提取粗魚油，絕大部分被丟棄，既浪費資源，又污染環(huán)境。章魚肉堿(Octopine)的化學(xué)名稱為α，α ’ -亞氨-(δ -胍基戊酸)-丙酸，分子式為C9H18N4O4,分子量為246，在自然界中主要存在于章魚、烏賊、魷魚等頭足類水產(chǎn)動物中。章魚肉堿是由精氨酸與丙氨酸或丙酮酸經(jīng)酶催化作用形成的一種特異性的小分子物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)章魚肉堿具有降膽固醇、抗疲勞、提高免疫力等生理活性功能，具有藥用開發(fā)價值；還可開發(fā)為海產(chǎn)鮮味調(diào)味品、功能性食品或飲料添加劑。目前制備獲取章·魚肉堿的方法有化學(xué)合成法和生物提取法?；瘜W(xué)合成法存在產(chǎn)品得率低，尤其是手性拆分成本極高，至今未實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。生物提取法是指從海洋生物中提取分離獲得。Robin Yvonne 等(Yvonne Robin, Yvonne Guillou.An 1n-Exchange ColumnChromatographic Method for the Isolation of Octopine from Sepia officinalisL.Muscle.Analytical Biochemistry, 1977,83(1):45-51.)采用 AG 50W-X8 和 AG 50W-X4離子交換凝膠色譜、多次活性炭脫色、醇沉、結(jié)晶等方法從每公斤烏賊肌肉中分離獲得4.5克章魚肉堿，該方法步驟冗長，大量使用吡啶、強酸、Ba(OH)2等化學(xué)試劑，屬于實驗室制備方法，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有制備天然章魚肉堿方法所存在的不足，提供一種從頭足類水產(chǎn)品加工下腳料中制備天然章魚肉堿的工業(yè)化方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究，最終獲得了如下技術(shù)方案:一種天然章魚肉堿的制備方法，包括以下步驟:I)預(yù)處理:將頭足類水產(chǎn)品下腳料去除污染物，清洗干凈；2)提取:經(jīng)預(yù)處理的下腳料絞碎后置于反應(yīng)釜中，加3 6倍純水，控制反應(yīng)溫度50-100°C，攪拌I 4小時，得到章魚肉堿提取液；3)固液分離:采用轉(zhuǎn)速3000 13000rpm的連續(xù)流離心機去除提取液中的固體雜質(zhì)；4) 一級膜分離:將離心液采用一級膜進行澄清除雜，所述一級膜為孔徑0.05 0.8 μ m管式陶瓷膜或截留分子量為10000 200000Da平板有機膜組件，操作壓力為0.1 0.5Mpa，濃縮倍數(shù)為5 10倍，加水倍數(shù)為0.2 I倍；5) 二級膜分離:采用二級膜對一級膜分離的透過液進行脫色除雜，所述二級膜是截留分子量為200 2000Da的卷式納濾膜組件，操作壓力為0.5 1.5Mpa，濃縮倍數(shù)為6 15倍，加水倍數(shù)為0.2 I倍；6)三級膜分離:采用三級膜對二級膜分離的透過液進行快速濃縮，所述三級膜是對NaCl截留率大于99%的卷式反滲透膜組件，操作壓力為I 2Mpa，濃縮倍數(shù)為10 20倍;7)強酸性陽離子交換柱層析:采用強酸性陽離子交換柱對三級膜分離的濃縮液中的章魚肉堿進行選擇性富集，以層析柱中強酸性陽離子交換樹脂體積為IBV進行計算，反滲透濃縮液的上柱量為I 2BV，上樣流速為0.5 2BV ;洗脫劑為I 2mol -T1的氨水，洗脫劑用量為2 3BV，洗脫流速為I 2BV.h—1 ；8)弱堿性陰離子交換柱層析:采用弱堿性陰離子交換柱對步驟7)的洗脫液進行選擇性分離，以層析柱中弱堿性陰離子交換樹脂體積為1BV，上柱量為I 2BV，上樣流速為0.5 2BV.;洗脫劑為I 2mol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為2 3BV，洗脫流速為I 2BV.IT1 ；9)中壓色譜純化:色譜填料選用C8或C18，流動相為醋酸水溶液，濃度為0.01% 0.3% (質(zhì)量百分比， 下同)；10)濃縮與干燥:減壓濃縮，沉淀，干燥，得到純度大于95%的天然章魚肉堿。本發(fā)明所述的天然章魚肉堿的制備方法，其中所述的頭足類水產(chǎn)品選自如下的至少一種:章魚、烏賊、魷魚。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的章魚肉堿制備工藝具有常溫操作、無相變及化學(xué)變化、設(shè)備模塊化且易放大、選擇性高及能耗低等優(yōu)點，特別適合于現(xiàn)代工業(yè)對節(jié)能、提高生產(chǎn)效率、低品味原材料再利用和消除環(huán)境污染的需要。
具體實施例方式實例一:1.將200公斤章魚加工下腳料集中處理后去除污染物，清洗干凈，經(jīng)絞肉機絞碎后置于反應(yīng)釜中，然后加1200公斤純水，提取溫度控制在50°C，攪拌4小時，得到章魚肉堿提取液。2.采用轉(zhuǎn)速3000rpm的連續(xù)流離心機去除上述提取液中的固體雜質(zhì)。3.采用孔徑為0.8 μ m管式陶瓷膜對連續(xù)流離心機的離心液進行澄清除雜，操作壓力為0.1Mpa，運行溫度為50°C，濃縮倍數(shù)為5倍，加水倍數(shù)為I倍。4.采用截留分子量為200Da的卷式納濾對一級管式陶瓷微濾工藝透過液進行脫色除雜，操作壓力為1.5Mpa,運行溫度為40°C,濃縮倍數(shù)為6倍,加水倍數(shù)為I倍。5.采用對NaCl截留率為99%卷式反滲透膜組件對二級卷式納濾工藝透過液進行快速濃縮，操作壓力為2Mpa，運行溫度為35°C，濃縮倍數(shù)為20倍。
6.采用強酸性苯乙烯陽離子交換柱層析工藝對三級反滲透工藝濃縮液進行選擇性富集。反滲透濃縮液的上柱量為1BV，上樣流速為0.5BV.;洗脫劑為Imol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為3BV，洗脫流速為IBV.h'7.采用弱堿性苯乙烯陰離子交換柱層析工藝對強酸性陽離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿洗脫液進行選擇性分離。上柱量為1BV，上樣流速為0.5BV.IT1 ;洗脫劑為Imol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為3BV，洗脫流速為IBV.h'8.采用C18中壓色譜純化工藝對弱堿性陰離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿的洗脫液進行選擇性分離，流動相為0.01%醋酸水溶液。9.濃縮與干燥:在50°C、真空度為0.04MPa條件下進行減壓濃縮，沉淀，干燥，得到純度大于95%的天然章魚肉堿。實例二:1.將300公斤章魚加工下腳料集中處理后去除污染物，清洗干凈，經(jīng)絞肉機絞碎后置于反應(yīng)釜中，然后加900公斤純水，提取溫度控制在100°C，攪拌I小時，得到章魚肉堿提取液。2.采用轉(zhuǎn)速13000rpm的連續(xù)流離心機去除上述提取液中的固體雜質(zhì)。3.采用孔徑為0.05 μ m管式陶瓷膜對連續(xù)流離心機的離心液進行澄清除雜，操作壓力為0.5Mpa，運行溫度為50°C，濃縮倍數(shù)為10倍，加水倍數(shù)為0.2倍。4.采用截留分子量為2000Da的卷式納濾對一級管式陶瓷微濾工藝透過液進行脫色除雜，操作壓力為0.5Mpa，運行溫度為40°C，濃縮倍數(shù)為15倍，加水倍數(shù)為0.2倍。5.采用對NaCl截留率為99.5%卷式反滲透膜組件對二級卷式納濾工藝透過液進行快速濃縮，操作壓力為IMpa，運行溫度為35°C，濃縮倍數(shù)為10倍。6.采用強酸性苯乙烯陽離子交換柱層析工藝對三級反滲透工藝濃縮液進行選擇性富集。反滲透濃縮液的上柱量為2BV，上樣流速為2BV.IT1 ;洗脫劑為2mol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為2BV.h'7.采用弱堿性苯乙烯陰離子交換柱層析工藝對強酸性陽離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿洗脫液進行選擇性分離。上柱量為2BV，上樣流速為2BV.IT1 ;洗脫劑為2mol.L—1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為2BV.h—1。8.采用CS中壓色譜純化工藝對弱堿性陰離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿的洗脫液進行選擇性分離，流動相為0.3%醋酸水溶液。9.濃縮與干燥:在60°C、真空度為0.06MPa條件下進行減壓濃縮，沉淀，干燥，得到純度大于95%的天然章魚肉堿。實例三:1.將400公斤烏賊加工下腳料集中處理后去除污染物，清洗干凈，經(jīng)絞肉機絞碎后置于反應(yīng)釜中，然后加2000公斤純水，提取溫度控制在80°C，攪拌3小時，得到章魚肉堿提取液。2.采用轉(zhuǎn)速5000rpm的連續(xù)流離心機去除上述提取液中的固體雜質(zhì)。

3.采用截留分子量為200000Da平板有機膜對連續(xù)流離心機的離心液進行澄清除雜，操作壓力為0.3Mpa，運行溫度為40°C，濃縮倍數(shù)為7倍，加水倍數(shù)為0.5倍。

4.采用截留分子量為IOOODa的卷式納濾對一級管式陶瓷微濾工藝透過液進行脫色除雜，操作壓力為1.2Mpa,運行溫度為40°C,濃縮倍數(shù)為10倍,加水倍數(shù)為0.5倍。5.采用對NaCl截留率為99.2%卷式反滲透膜組件對二級卷式納濾工藝透過液進行快速濃縮，操作壓力為1.6Mpa，運行溫度為35°C，濃縮倍數(shù)為15倍。6.采用強酸性苯乙烯陽離子交換柱層析工藝對三級反滲透工藝濃縮液進行選擇性富集。反滲透濃縮液的上柱量為1.5BV，上樣流速為IBV.;洗脫劑為1.5mol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為1.5BV.h—1。7.采用弱堿性苯乙烯陰離子交換柱層析工藝對強酸性陽離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿洗脫液進行選擇性分離。上柱量為1.5BV，上樣流速為IBV.IT1 ;洗脫劑為1.5mol.L-1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為1.5BV.h-1。8.采用C18中壓色譜純化工藝對弱堿性陰離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿的洗脫液進行選擇性分離，流動相為0.05%醋酸水溶液。9.濃縮與干燥:在45°C、真空度為0.03MPa條件下進行減壓濃縮，沉淀，干燥，得到純度大于95%的天然章魚肉堿。實例四:1.將500公斤烏賊加工下腳料集中處理后去除污染物，清洗干凈，經(jīng)絞肉機絞碎后置于反應(yīng)釜中，然后加2000公斤純水，提取溫度控制在60°C，攪拌4小時，得到章魚肉堿提取液。2.采用轉(zhuǎn)速IOOOOrpm的連續(xù)流離心機去除上述提取液中的固體雜質(zhì)。3.采用截留分子量為IOOOODa平板有機膜對連續(xù)流離心機的離心液進行澄清除雜，操作壓力為0.5Mpa，運行溫度為40°C，濃縮倍數(shù)為6倍，加水倍數(shù)為0.7倍。4.采用截留分子量為500Da的卷式納濾對一級管式陶瓷微濾工藝透過液進行脫色除雜，操作壓力為1.5Mpa,運行溫度為40°C,濃縮倍數(shù)為8倍,加水倍數(shù)為0.6倍。5.采用對NaCl截留率為99.1 %卷式反滲透膜組件對二級卷式納濾工藝透過液進行快速濃縮，操作壓力為1.4Mpa，運行溫度為35°C，濃縮倍數(shù)為16倍。6.采用強酸性苯乙烯陽離子交換柱層析工藝對三級反滲透工藝濃縮液進行選擇性富集。反滲透濃縮液的上柱量為1BV，上樣流速為IBV.IT1 ;洗脫劑為Imol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為2.5BV ，洗脫流速為IBV.h'7.采用弱堿性苯乙烯陰離子交換柱層析工藝對強酸性陽離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿洗脫液進行選擇性分離。上柱量為2BV，上樣流速為IBV.IT1 ;洗脫劑為2mol.L—1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為2BV.h—1。8.采用CS中壓色譜純化工藝對弱堿性陰離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿的洗脫液進行選擇性分離，流動相為0.04%醋酸水溶液。9.濃縮與干燥:在55°C、真空度為0.05MPa條件下進行減壓濃縮，沉淀，干燥，得到純度大于95%的天然章魚肉堿。實例五:1.將400公斤魷魚加工下腳料集中處理后去除污染物，清洗干凈，經(jīng)絞肉機絞碎后置于反應(yīng)釜中，然后加2400公斤純水，提取溫度控制在70°C，攪拌3.5小時，得到章魚肉堿提取液。2.采用轉(zhuǎn)速IOOOOrpm的連續(xù)流離心機去除上述提取液中的固體雜質(zhì)。
3.采用截留分子量為IOOOOODa平板有機膜對連續(xù)流離心機的離心液進行澄清除雜，操作壓力為0.3Mpa，運行溫度為40°C，濃縮倍數(shù)為9倍，加水倍數(shù)為0.3倍。4.采用截留分子量為IOOODa的卷式納濾對一級管式陶瓷微濾工藝透過液進行脫色除雜，操作壓力為1.2Mpa,運行溫度為40°C,濃縮倍數(shù)為8倍,加水倍數(shù)為0.5倍。5.采用對NaCl截留率為99%卷式反滲透膜組件對二級卷式納濾工藝透過液進行快速濃縮，操作壓力為1.2Mpa，運行溫度為35°C，濃縮倍數(shù)為12倍。6.采用強酸性苯乙烯陽離子交換柱層析工藝對三級反滲透工藝濃縮液進行選擇性富集。反滲透濃縮液的上柱量為2BV，上樣流速為IBV.IT1 ;洗脫劑為2mol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為2BV.h'7.采用弱堿性苯乙烯陰離子交換柱層析工藝對強酸性陽離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿洗脫液進行選擇性分離。上柱量為2BV，上樣流速為IBV.IT1 ;洗脫劑為2mol.L—1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為2BV.h—1。8.采用CS中壓色譜純化工藝對弱堿性陰離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿的洗脫液進行選擇性分離，流動相為0.1 %醋酸水溶液。9.濃縮與干燥:在40°C、真空度為0.03MPa條件下進行減壓濃縮，沉淀，干燥，得到純度大于95%的天然章魚肉堿。實例六:1.將300公斤魷魚加工下腳料集中處理后去除污染物，清洗干凈，經(jīng)絞肉機絞碎后置于反應(yīng)釜中，然后加1500公斤純水，提取溫度控制在50°C，攪拌4小時，得到章魚肉堿提取液。 2.采用轉(zhuǎn)速6000rpm的連續(xù)流離心機去除上述提取液中的固體雜質(zhì)。3.采用孔徑為0.2μπι管式陶瓷膜對連續(xù)流離心機的離心液進行澄清除雜，操作壓力為0.2Mpa，運行溫度為50°C，濃縮倍數(shù)為7倍，加水倍數(shù)為0.4倍。4.采用截留分子量為1500Da的卷式納濾對一級管式陶瓷微濾工藝透過液進行脫色除雜，操作壓力為IMpa,運行溫度為40°C,濃縮倍數(shù)為12倍,加水倍數(shù)為0.3倍。5.采用對NaCl截留率為99%卷式反滲透膜組件對二級卷式納濾工藝透過液進行快速濃縮，操作壓力為1.5Mpa，運行溫度為35°C，濃縮倍數(shù)為16倍。6.采用強酸性苯乙烯陽離子交換柱層析工藝對三級反滲透工藝濃縮液進行選擇性富集。反滲透濃縮液的上柱量為1.5BV，上樣流速為1.5BV ;洗脫劑為1.5mol -T1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為1.5BV.h—1。7.采用弱堿性苯乙烯陰離子交換柱層析工藝對強酸性陽離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿洗脫液進行選擇性分離。上柱量為1.5BV，上樣流速為1.5BV.IT1 ;洗脫劑為
1.5mol.L-1的氨水，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為1.5BV.h-1。8.采用C18中壓色譜純化工藝對弱堿性陰離子交換柱層析工藝中富含章魚肉堿的洗脫液進行選擇性分離，流動相為0.2%醋酸水溶液。9.濃縮與干燥:在50°C、真空度為0.06MPa條件下進行減壓濃縮，沉淀，干燥，得到純度大于95%的天然章魚肉堿。
權(quán)利要求
1.一種天然章魚肉堿的制備方法，包括以下步驟: 1)預(yù)處理:將頭足類水產(chǎn)品下腳料去除污染物，清洗干凈； 2)提取:經(jīng)預(yù)處理的下腳料絞碎后置于反應(yīng)釜中，加3 6倍純水，控制反應(yīng)溫度50-100°C，攪拌I 4小時，得到章魚肉堿提取液； 3)固液分離:采用轉(zhuǎn)速3000 13000rpm的連續(xù)流離心機去除提取液中的固體雜質(zhì)； 4)一級膜分離:將離心液采用一級膜進行澄清除雜，所述一級膜為孔徑0.05 0.8μπι管式陶瓷膜或截留分子量為10000 200000Da平板有機膜組件，操作壓力為0.1 0.5Mpa，濃縮倍數(shù)為5 10倍，加水倍數(shù)為0.2 I倍； 5)二級膜分離:采用二級膜對一級膜分離的透過液進行脫色除雜，所述二級膜是截留分子量為200 2000Da的卷式納濾膜組件，操作壓力為0.5 1.5Mpa，濃縮倍數(shù)為6 15倍，加水倍數(shù)為0.2 I倍； 6)三級膜分離:采用三級膜對二級膜分離的透過液進行快速濃縮，所述三級膜是對NaCl截留率大于99%的卷式反滲透膜組件，操作壓力為I 2Mpa，濃縮倍數(shù)為10 20倍； 7)強酸性陽離子交換柱層析:采用強酸性陽離子交換柱對三級膜分離的濃縮液中的章魚肉堿進行選擇性富集，以層析柱中強酸性陽離子交換樹脂體積為IBV進行計算，反滲透濃縮液的上柱量為I 2BV，上樣流速為0.5 2BV.IT1 ;洗脫劑為I 2mol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為2 3BV，洗脫流速為I 2BV.h—1 ； 8)弱堿性陰離子交換柱層析:采用弱堿性陰離子交換柱對步驟7)的洗脫液進行選擇性分離，以層析柱中弱堿 性陰離子交換樹脂體積為1BV，上柱量為I 2BV，上樣流速為0.5 2BV.;洗脫劑為I 2mol.Γ1的氨水，洗脫劑用量為2 3BV，洗脫流速為I 2BV.IT1 ； 9)中壓色譜純化:色譜填料選用C8或C18，流動相為醋酸水溶液，濃度為0.01% 0.3% ； 10)濃縮與干燥:減壓濃縮，沉淀，干燥，得到純度大于95%的天然章魚肉堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然章魚肉堿的制備方法，其特征在于:所述的頭足類水產(chǎn)品選自如下的至少一種:章魚、烏賊、魷魚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天然章魚肉堿的制備方法，該方法通過多級膜分離、離子交換和中壓色譜技術(shù)，從頭足類海產(chǎn)品加工下腳料中大規(guī)模提取分離天然章魚肉堿。采用本發(fā)明的方法具有常溫操作、無相變及化學(xué)變化、設(shè)備模塊化且易放大、選擇性高及能耗低等優(yōu)點，特別適合于現(xiàn)代工業(yè)對節(jié)能、提高生產(chǎn)效率、低品味原材料再利用和消除環(huán)境污染的需要的優(yōu)點。
文檔編號C07C279/14GK103242202SQ201310216458
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月29日
發(fā)明者謝全靈, 易瑞灶, 洪專, 陳暉 , 張怡評, 方華, 孫繼鵬, 朱芮琳 申請人:國家海洋局第三海洋研究所