治療活性的α-MSH類似物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及治療活性的α-MSH類似物。本發(fā)明描述了α-促黑素細(xì)胞激素（α-MSH）的肽類似物，所述肽類似物與天然α-MSH肽相比具有提高的功效。與α-MSH相比，α-MSH類似物表現(xiàn)出提高的抗炎效果以及提高的防止局部缺血情況的能力。本發(fā)明進(jìn)一步公開了該肽用于制備藥物組合物的用途，和藥物組合物，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防哺乳動物的一個或多個器官的組織的病況。
【專利說明】治療活性的a -MSH類似物
[0001]本申請是原申請的申請日為2005年8月26日，申請?zhí)枮?00580051680.9，發(fā)明名稱為“治療活性的a -MSH類似物”的中國專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及a-促黑素細(xì)胞激素(a-MSH)的肽類似物，所述肽類似物與天然a-MSH肽相比具有提高的功效。與a-MSH相比，a-MSH類似物表現(xiàn)出提高的抗炎效果以及提高的治療或預(yù)防與局部缺血或后面是血管再灌注的局部缺血相關(guān)的全身損傷、器官損傷或細(xì)胞損傷的能力。
【背景技術(shù)】
[0003]天然肽a -促黑素細(xì)胞激素(a -MSH)作為I型、3型、4型和5型黑皮質(zhì)素(MC)受體的天然激動劑已經(jīng)為人們熟知。MC受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體的類型。所有的受體亞型都被偶聯(lián)到激活型G-刺激蛋白(G-stimulatory protein),這意味著受體激活涉及到提高的cAMP含量。ACTH是2型受體(MC2)的天然配基。
[0004]在許多組織中關(guān)于MC受體已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。已經(jīng)知道，a -MSH以極大的親和力結(jié)合到其上的I型受體(MCl)在一些組織和細(xì)胞例如腦中表達(dá)，包括星形細(xì)胞、睪丸、卵巢、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。然而，MCl可能能在更寬范圍的組織中表達(dá)，盡管這還需要去建立。MC受體結(jié)合不同MSH肽的選擇性是變化的。MCl以極大的親和力結(jié)合a-MSH，也以較低的親和力結(jié)合運(yùn)-MSH、y-MSI^PACTH。據(jù)報導(dǎo)，MC2僅結(jié)合ACTH，而不結(jié)合任何一種MSH肽。對其他受體的配基的最高親和力包括Y-MSH (MC3-受體)和P-MSH (MC4-受體)。相反，MC5以與MCl相同的方式以非常低的親和力結(jié)合MSH肽(即對a-MSH最高的親和力)。
[0005]通過激活MC-受體起作用的MSH-`肽具有各種功能，包括免疫、抗炎、體溫調(diào)節(jié)、痛感、醛固酮合成、血壓調(diào)節(jié)、心率、血管緊張度、腦血流量、神經(jīng)生長、胎盤發(fā)育、許多激素(例如醛固酮、甲狀腺素、催乳激素、FSH)的合成/釋放。ACTH在激活類固酮生成(steroidoneogenesis)上具有主要作用。a -MSH也誘導(dǎo)皮膚色素形成。
[0006]需要重點強(qiáng)調(diào)的是，MSH肽，特別是a -MSH的關(guān)于哪些受體被涉及的許多作用還沒有完全建立起來。據(jù)推測a-MSH的抗炎作用涉及各種過程包括干擾NO生產(chǎn)、內(nèi)皮素-1作用、白介素10形成，這又關(guān)聯(lián)到巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)的MCl受體。
[0007]已經(jīng)證實MC受體對a-MSH的激活作用在各種炎癥過程中是重要的(Lipton和Catanial997):1)抑制嗜中性粒細(xì)胞的趨藥性遷移(Cataniaigge)J) a-MSH包括其類似物抑制對LPS處理響應(yīng)的細(xì)胞因子(IL-1，TNF-a )的釋放(Goninardl996)。3)抑制對細(xì)菌內(nèi)毒素響應(yīng)的1,-0(數(shù))叩，1(.￥.等，1997)。4)ICV或IP給藥a-MSH抑制通過局部給予LPS而引起的中樞系統(tǒng)的TNF-a生產(chǎn)。5)已經(jīng)證實0-|^11減輕實驗性炎癥性腸病(1^]_0^，N.等，1997)和局部缺血誘導(dǎo)的急性腎衰竭(Star，R.A.等，1995)的炎癥。6)通過抑制接觸性過敏的誘導(dǎo)和激發(fā)，a -MSH還具有一定的預(yù)防效果以及誘導(dǎo)半抗原耐受性，并且人們推測a-MSH可能介導(dǎo)皮膚炎癥和高增生皮膚病的重要的負(fù)調(diào)節(jié)(Luger，T.A.，1997)。最后，a -MSH導(dǎo)致來自皮膚微維管結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞的提高的IL-8釋放(Hartmeyer，M.，1997)。
[0008]低氧癥(局部缺血)和再灌注損傷兩者在人病理生理學(xué)中都是重要的因素。組織低氧癥的實例(在再灌注過程中預(yù)先處理為損傷)包括循環(huán)系統(tǒng)休克、心肌局部缺血、中風(fēng)、一過性腎局部缺血、大外科手術(shù)和器官移植。因為歸因于局部缺血的疾病是極其常見的發(fā)病率和死亡率原因，并且因為器官移植越來越頻繁，為了改善公眾的健康水平，非常需要具有限制再灌注損傷能力的治療策略。局部缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)病理生理學(xué)是復(fù)雜的，不僅涉及到對嗜中性粒細(xì)胞-浸潤的典型的炎癥再灌注反應(yīng)，而且涉及到再灌注組織/器官內(nèi)細(xì)胞因子的基因表達(dá)，所述細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-a (TNF-a )、白介素(IL)_1 3、IL-6、IL_8、干擾素-Y和胞間粘附分子-1 (ICAM-1)。此外，人們認(rèn)為，通過直接抑制收縮性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，局部產(chǎn)生的TNF-a促成如在梗死后心臟中引起局部缺血后器官機(jī)能障礙。由于局部缺血和/或再灌注復(fù)雜的性質(zhì)，已經(jīng)證實簡單的抗炎治療概念是無效的:因此，大多數(shù)實驗研究指向這樣的事實，即為了保護(hù)避免再灌注損傷，需要有與一個以上激活通路的伴行的相互作用。已經(jīng)證實，a-MSH同時具有抗炎的、抗氧化的和抗細(xì)胞凋亡的能力，這對于該化合物為了保護(hù)避免再灌注損傷的效力給出了很好的解釋。
[0009]已知a-MSH氨基酸序列的氨基酸殘基的特定修飾可導(dǎo)致肽提高的受體親和力(對例如MC4受體)、延長的生物活性或更多的受體特異性結(jié)合分布型(receptor-specificbinding profile) (Schiotil 等，1997 ；Hruby 等，1995 ；Sawyer 等，1980 ；Hiltz 等 1991 ；Scardenings等,2000)。然而，當(dāng)旨在生產(chǎn)肽藥物時,這些肽還具有對酶降解低穩(wěn)定性的問題。
[0010]如上所述，開發(fā)肽治療活性的藥物的問題是肽快速并且非常高效地被酶降解，通常具有在幾分鐘范圍內(nèi)的半衰期。蛋白酶和其他蛋白水解酶是無所不在的，特別是在胃腸道中更是如此，因此在口服時肽常常在多個位點對降解敏感，并且在血、肝、腎和血管內(nèi)皮中在某種程度上也對降解敏感。此外，特定肽常常在主鏈內(nèi)的一個以上鍵上對降解敏感；每一個水解位置由特定蛋白酶介導(dǎo)。即使克服了這些障礙，特別是對于神經(jīng)肽，已經(jīng)遇到了在它們跨越血-腦屏障運(yùn)輸方面的困 難。
[0011]為了提高肽的代謝穩(wěn)定性，Larsen等1999 (W099/46283)已經(jīng)開發(fā)出了一種被稱為SIP (結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)探針)的技術(shù)。SIP技術(shù)基于結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)探針的使用，該結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)探針以短肽序列為代表，即附加到親本肽的C-端或N-端或者同時附加到C-端和N-端的(Lys)6?；诜肿觾?nèi)的氫鍵，結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)探針強(qiáng)迫親本肽成為更有序的構(gòu)象，借此，與處于無規(guī)卷曲構(gòu)象的肽相反，肽嵌合體(連接到探針的肽)對蛋白酶敏感度低。作為結(jié)構(gòu)化的結(jié)果，肽嵌合體更難于被蛋白酶降解。附加SIP到生物活性肽常常導(dǎo)致肽的酶穩(wěn)定性的提高而同時生物活性保持不變(Rizzi等2002)。
[0012]發(fā)明概述
[0013]令人意外的是，本發(fā)明已經(jīng)證實，與天然a -MSH肽相比，a -MSH和a -MSH類似物在肽的N-端的SIP-修飾提高了肽的最大功效。與天然a-MSH肽相比，本發(fā)明的肽顯示出了提聞的抗炎效果和提聞的預(yù)防局部缺血癥狀的能力。
[0014]因此，本發(fā)明涉及特定的肽，所述肽包括在肽的N-端部分的SIP修飾和在肽的C-端部分的a -MSH或a -MSH變體的氨基酸序列。[0015]第一方面，本發(fā)明提供了總計為12~19個氨基酸殘基的肽，所述肽包括如下氨基酸序列:
[0016]X-Aaj-Aag-Aag-Aa4^ag-Y-Aag-Aay-Z
[0017]其中X包括6個氨基酸殘基R1-R2-R3-R4-R5-R6，其中Rl、R2、R3、R4、R5和R6可以獨立地是Lys或Glu,和
[0018]其中Y 包括選自 His-Phe-Arg、His- (D-Phe) -Arg> His-Nal-Arg 和His- (D-Nal)-Arg的氨基酸序列,和
[0019]其中Z包括選自Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val)的氨基酸序列，和
[0020]其中AapAa2JayAapAapAa6和Aa7可以獨立地是任何一種天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基或者缺失，和
[0021]其中所述肽的羧基端是-C(=0)-BI，其中BI選自0H、NH2、NHB2、N(B2) (B3)、0B2和B2，其中B2和B3獨立地選自可以被取代的CV6烷基、可以被取代的C2_6鏈烯基、可以被取代的C6-Ki芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；和
[0022]其中所述肽的氨基端是(B4) HN-、(B4) (B5) N-或(B6) HN-，其中B4和B5獨立地選自H、可以被取代的CV6烷基、可以被取代的C2_6鏈烯基、可以被取代的C6,芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；B6是B4-C(=0)-。
[0023]本發(fā)明還涉及所述肽用于制備用于治療或預(yù)防哺乳動物的一個或多個器官的組織的病況的藥物組合物的用 途。此外，本發(fā)明涉及組合物例如藥物組合物，根據(jù)本發(fā)明的肽在醫(yī)學(xué)上的用途以及用于治療哺乳動物的一個或多個器官的組織的病況的方法，其中所述藥物組合物包括一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽和藥學(xué)上可接受的載體，所述方法包括給予有效劑量的根據(jù)本發(fā)明的肽。具體地，本發(fā)明關(guān)注于用于治療由局部缺血、炎癥和/或中毒或者藥物治療的毒性效應(yīng)引起的病況的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024]本發(fā)明涉及治療活性的肽，所述肽具有減輕或防止由局部缺血、炎癥和/或毒中毒或者藥物治療的毒性效應(yīng)引起的器官機(jī)能障礙的效果。
[0025]如本文所定義的，如果它能夠用于治療、緩解或減弱疾病狀態(tài)、生理病況、癥狀或病原學(xué)指示或評價或其診斷，那么肽序列是“治療活性的”。如果它能夠用于防止疾病狀態(tài)、生理病況、癥狀或病原學(xué)指示，那么肽序列是“預(yù)防活性的”。藥理學(xué)活性的制劑也是生理和/或生物活性的。藥理學(xué)活性測量在離體、體內(nèi)或體外的生理系統(tǒng)或生物系統(tǒng)中物質(zhì)(肽)的效果，并且可以使用本領(lǐng)域熟知的、用于特定肽或者具有相似生理功能的肽的、標(biāo)準(zhǔn)的離體、體內(nèi)或體外分析法進(jìn)行分析。
[0026]本發(fā)明的肽
[0027]本發(fā)明涉及一種肽，所述肽包括包括在肽的C-端部分的a-MSH或a_MSH變體的氨基酸序列和在肽的N-端部分的結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)探針(SIP)。本發(fā)明的肽被稱為a-MSH類似物。在本說明書和權(quán)利要求中，這些術(shù)語被同義使用。
[0028]a-MSH變體被定義為一種氨基酸序列，所述氨基酸序列與天然a-MSH (Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val, SEQ ID NO:101)相比，被修飾為在序列中具有至少一個氨基酸殘基缺失、取代、疊加或修飾。a-MSH變體優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)=Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Y-Aa6-Aa7-Z,其中 Y 包括選自 His-Phe-Arg、His-(D-Phe)-Arg、His-Nal-Arg和His-(D-Nal)-Arg的氨基酸序列，和其中Z包括選自Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val),和其中AapAayAayAapAapAa6和Aa7可以獨立地是任何一種天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基或者缺失。
[0029]在本文中，術(shù)語“氨基酸殘基”是指任何一種天然存在的氨基酸殘基(天然的氨基酸殘基)或者非天然存在的氨基酸殘基(非天然的氨基酸殘基)。
[0030]天然的氨基酸殘基被定義為在自然界出現(xiàn)的氨基酸殘基，例如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Tyr、Thr、Trp、Val。
[0031]至于a-MSH變體結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的天然的氨基酸殘基的實例是Ser、Tyr、Met、Glu、lie、Trp 和 Gly0
[0032]非天然的氨基酸殘基被定義為不在自然界出現(xiàn)的而是實驗創(chuàng)造的氨基酸殘基。非天然的氨基酸殘基包括合成的a、0或Y-氨基酸殘基(不管L-構(gòu)型還是D-構(gòu)型)以及側(cè)鏈修飾的氨基酸，例如修飾的酪氨酸，其中芳環(huán)還取代有例如一個或多個鹵素、磺酸基、硝基等，和/或苯酚基被轉(zhuǎn)變?yōu)轷セ龋龇翘烊坏陌被釟埢▊?cè)鏈保護(hù)的氨基酸，其中根據(jù)肽化學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的方法對氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)，例如記載于例如Bodanszky等1994與J.Jones和Jonesl991的方法。優(yōu)選的非天然的氨基酸殘基的實例是正亮氨酸(Nle)、Nal ( P _2_萘基-丙氨酸)、D_Nal ( P _2_萘基-D-丙氨酸)，D-苯丙氨酸(D-Phe )和 D-纈氨酸(D-Val)。
[0033]在最寬的方面，本發(fā)明涉及總計為12~19個氨基酸殘基的肽，所述肽包括如下氨基酸序列:
[0034]X~Aa1~Aa2~Aa^~Aai~Aa5~Y~Aa6~Aa7~Z`[0035]其中X包括6個氨基酸殘基R1-R2-R3-R4-R5-R6，其中Rl、R2、R3、R4、R5和R6可以獨立地是Lys或Glu,和
[0036]其中Y 包括選自 His-Phe-Arg、His-(D-Phe)-Arg、His-Nal-Arg 和His-(D-Nal)-Arg的氨基酸序列,和
[0037]其中Z包括選自Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val)的氨基酸序列，和
[0038]其中AapAa2JayAapAapAa6和Aa7可以獨立地是任何一種天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基或者缺失，和
[0039]其中所述肽的羧基端是-C(=0)-BI，其中BI選自0H、NH2、NHB2、N(B2) (B3)、0B2和B2，其中B2和B3獨立地選自可以被取代的CV6烷基、可以被取代的C2_6鏈烯基、可以被取代的C6-Ki芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；和
[0040]其中所述肽的氨基端是(B4) HN-、(B4) (B5) N-或(B6) HN-，其中B4和B5獨立地選自H、可以被取代的CV6烷基、可以被取代的C2_6鏈烯基、可以被取代的C6,芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；B6是B4-C(=0)-。
[0041]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“可以被取代的”是用來指所述的基團(tuán)可以被一個或多個選自Ci_8烷基、Ci_8烷氧基、氧代(可以表示為異構(gòu)的烯醇式)、羧基、氨基、羥基(當(dāng)存在于烯醇系統(tǒng)時可表示為異構(gòu)的酮式)、硝基、氰基、二鹵代-Cm烷基、三鹵代-Cu烷基、鹵素的基團(tuán)取代一次或幾次，例如I~5次，優(yōu)選I~3次，更優(yōu)選I~2次。通常，上述取代可進(jìn)行另外的任選取代。[0042]在本文中，術(shù)語“(^_6烷基”是用來指直鏈的或支鏈的飽和烴鏈，其中最長的鏈具有I~6個碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基和辛基。支鏈烴鏈?zhǔn)怯脕碇冈谌魏我粋€碳原子被烴鏈取代的C^6烷基。
[0043]在本文中，術(shù)語“C2_6鏈烯基”是用來指有2~6個碳原子并且含有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈經(jīng)基。C2_6鏈烯基的不例性實例包括稀丙基、聞稀丙基、乙烯基、巴基、丁烯基、戍烯基和己烯基。具有一個以上雙鍵的C2_6鏈烯基的不例性實例包括丁二烯基、戍二烯基、己二烯基和己三烯基以及它們的支化形式。不飽和鍵(雙鍵)的位置可以是在碳鏈的任何一個位置。
[0044]在本文中術(shù)語“C3_8-環(huán)烷基”是用來覆蓋只含碳原子的三、四、五、六、七和八元環(huán)，而術(shù)語“雜環(huán)”是用來指碳原子與I~3個雜原子一起構(gòu)成的三、四、五、六、七和八元環(huán)。雜原子獨立地選自氧、硫和氮。
[0045]C3_8_環(huán)烷基和雜環(huán)可以任選地含有一個或多個不飽和鍵，但是所述不飽和鍵處于不形成芳族電子體系的情形。
[0046]優(yōu)選的“C3_8-環(huán)烷基”的示例性實例是環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)戊二烯、環(huán)己烷、環(huán)己烯、1，3-環(huán)己二烯，1，4-環(huán)己二烯、環(huán)庚烷、環(huán)庚烯、1，2-環(huán)庚二烯、1，3-環(huán)庚二烯、I, 4-環(huán)庚二烯和1，3, 5-環(huán)庚三烯。
[0047]“雜環(huán)”的示例性實例是2H-噻喃、3H-噻喃、4H-噻喃、四氫噻喃、2H-吡喃、四氫吡喃、哌唳、1，2-二硫雜環(huán)己 烯、1，2-二硫雜環(huán)己燒、1，3-二硫雜環(huán)己烯、1，3-二硫雜環(huán)己燒、I, 4- 二硫雜環(huán)己烯、1，4- 二硫雜環(huán)己烷、I, 2- 二氧雜環(huán)己烯，I, 2- 二氧雜環(huán)己烷、1，3- 二氧雜環(huán)己烯、1，3-二氧雜環(huán)己 烷、1，4-二氧雜環(huán)己烯、1，4-二氧雜環(huán)己烷、哌嗪、1，2-氧硫雜環(huán)己烯、1，2-氧硫雜環(huán)己燒、4H-1, 3-氧硫雜環(huán)己烯、1，3-氧硫雜環(huán)己燒、1，4-氧硫雜環(huán)己烯、1，4-氧硫雜環(huán)己烷、2H-1，2-噻嗪、四氫-1，2-噻嗪、2H-1，3-噻嗪、4H-1，3-噻嗪、5，6- 二氫-4H-噻嗪、4H-1，4-噻嗪、四氫-1, 4-噻嗪、2H-1，2-鳴嗪、4H-1，2-喝.嗪、6H-1, 2-爆.嗪、2H-1，3-嚷嗪、4H-1，3-嚷嗪、4H-1，4-噃嗪、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺、咪
唑、吡唑、吡咯、爆唑、呋咱、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、異嗔唑、乙內(nèi)酰脲、二氫尿嘧啶、嗎啉、三氧雜環(huán)己烷、4H-1，2，3-三硫雜環(huán)己烯、1，2，3-三硫雜環(huán)己烷、1，3，5-三硫雜環(huán)己烷、六氫-1，3，5-三嗪、四氫噻吩、四氫呋喃、吡咯啉、吡咯烷、吡咯烷酮、吡咯烷二酮、吡唑啉、吡唑烷、咪唑啉、咪唑烷、1，2-二氧雜環(huán)戊烯、1，2-二氧雜環(huán)戊烷、1，3-二氧雜環(huán)戊烯、1，3- 二氧雜環(huán)戊烷、3H-1，2- 二硫雜環(huán)戊烯、1，2- 二硫雜環(huán)戊烷、1，3- 二硫雜環(huán)戊烯、I，3- 二硫雜環(huán)戊烷、異嗓唑啉、異嗔,唑烷、略唑啉、鳴.唑烷、噻唑啉、噻唑烷、3H-1, 2-氧硫雜環(huán)戍烯、1，2-氧硫雜環(huán)戍燒、5H-1, 2-氧硫雜環(huán)戍烯、1，3-氧硫雜環(huán)戍烯、I, 3-氧硫雜環(huán)戊烷、1,2, 3-三硫雜環(huán)戊烯、1，2，3-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2, 3-三氧雜環(huán)戊烯、1，2，3-三氧雜環(huán)戊烷、1，2，4-三氧雜環(huán)戊烷、1，2，3-三唑啉和1，2，3-三唑烷。對雜環(huán)的結(jié)合可以是在雜原子的位置或者通過雜環(huán)的碳原子。
[0048]在本文中術(shù)語“芳基”是用來指芳香碳環(huán)或環(huán)體系。此外，術(shù)語“芳基”包括稠環(huán)體系其中至少兩個芳環(huán)，或者至少一個芳基和至少一個C3_8_環(huán)烷基，或者至少一個芳基和至少一個雜環(huán)共用至少一個化學(xué)鍵?！胺蓟杯h(huán)的示例性實例包括可以被取代的苯基、萘基、菲基、蒽基、苊基、1，2，3，4-四氫化萘基、芴基、茚基、吲哚基、苯并二氫呋喃基、香豆素基、苯并二氫批喃基、異苯并二氫批喃基.蕊和基(azulenyl)。優(yōu)選的芳基是苯基。
[0049]在本文中術(shù)語“C7_16芳烷基”是用來指以CV6烷基取代的C6,芳基。
[0050]在本文中術(shù)語“C7_16烷基芳基”是用來指以C6,芳基取代的Cu烷基。
[0051] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及總計為12~19個氨基酸殘基的肽，所述肽包括選自由以下物質(zhì)所組成的組中的氨基酸序列:
[0052]X-Y-Z，
[0053]X-Aa1-Y-Z?
[0054]X_Aa「Aa2_Y_Z，
[0055]X_Aa「Aa2_Aa3_Y_Z，
[0056]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4U,
[0057]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Y-Z,
[0058]X_Aa「Y_Aa6_Z，
[0059]X_Aa「Aa2_Y_Aa6_Z，
[0060]X-Aa1-Aa2-Aa3-Y-Aa6-Z,
[0061 ]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Y-Aa6-Z,
[0062]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Y-Aa6-Z，
[0063]X_Aa「Y_Aa6_Aa7_Z，
[0064]X_Aa「Aa2_Y_Aa6_Aa7_Z，
[0065]X-Aa1-Aa2-Aa3-Y-Aa6-Aa7-Z，
[0066]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Y-Aa6-Aa7-Z,和
[0067]X_Aa1_Aa2_Aa3_Aa4_Aa5_Y_Aa6_Aa7_Z。
[0068]其中X包括6個氨基酸殘基R1-R2-R3-R4-R5-R6，其中Rl、R2、R3、R4、R5和R6可以獨立地是Lys或Glu，和
[0069]其中Y 包括選自 His-Phe-Arg、His-(D-Phe)-Arg、His-Nal-Arg 和His-(D-Nal)-Arg的氨基酸序列，和
[0070]其中Z包括選自Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val)的氨基酸序列，和
[0071]其中Aa1、Aa2、Aa3、Aa4、Aa5、Aa6和Aa7可以獨立地是任何一種天然的或者非天然的氣基酸殘基或者缺失，和
[0072]其中所述肽的羧基端是-C(=0)-BI，其中BI選自0H、NH2、NHB2、N(B2) (B3)、0B2和B2，其中B2和B3獨立地選自可以被取代的Cp6烷基、可以被取代的C2_6鏈烯基、可以被取代的C6—1C)芳基、可以被取代的C7—16芳烷基和可以被取代的C7—16烷基芳基；和
[0073]其中所述肽的氨基端是(B4)HN-、(B4) (B5)N_或(B6)HN_，其中B4和B5獨立地選自H、可以被取代的Cp6烷基、可以被取代的C2—6鏈烯基、可以被取代的C6,芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；B6是B4-C(=0)-。
[0074]在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種肽，其中肽包括下述氨基酸序列:
[0075]X_Aa1_Aa2_Aa3_Aa4_Aa5_Y_Aa6_Aa7_Z。
[0076]其中Aa1' Aa2.Aa3、Aa4.Aa5' Aa6和Aa7可以獨立地是任何一種天然或非天然氨基酸。因而，Aa1'Aa2、Aa3、Aa4、Aa5、Aa6和Aa7均存在于本發(fā)明的肽中。[0077]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，其中氨基端是(B4)HN_，其中B4=H。
[0078]在另ー實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，其中所述肽的羧基端是-C(=0)-B1，其中 BI = OH0
[0079]有幾種方法能夠用來穩(wěn)定肽使其抗降解以及降低肽與其他化合物、試劑和/或肽/蛋白質(zhì)(例如在血漿中)進(jìn)行反應(yīng)的能力。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明被那些本領(lǐng)域熟知的方法修飾的肽。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，其中肽的氨基端被乙酰化修飾。因此，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，其中氨基端是(B6)HN-，其中B6 = B4-C(=0)-，和B4 = CH3。在另ー優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，其中肽的羧基端被酰胺化修飾。因此，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，其中所述肽的羧基端是-C(=0)-B1，其中 BI = NH20
[0080]在本發(fā)明最寬的方面，X選自Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (序列表序列37 (SEQ IDNo:37))、Glu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (序列表序列 38)、Lys-Glu-Lys-Lys-Lys-Lys (序列表序列 39)、Lys-Lys-Glu-Lys-Lys-Lys (序列表序列 40)、Lys-Lys-Lys-Glu-Lys-Lys (序列表序列 41)、Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-Lys (序列表序列 42)、Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu(序列表序列 43)、Glu-Glu-Lys-Lys-Lys_Lys (序列表序列 44)、Glu-Lys-Glu-Lys-Lys_Lys(序列表序列 45) ^Glu-Lys-Lys-Glu-Lys-Lys (序列表序列 46) ^Glu-Lys-Lys-Lys-Glu-Lys(序列表序列 47)^Glu-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu (序列表序列 48)^Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Lys(序列表序列 49)、Lys-Glu-Lys-Glu-Lys_Lys (序列表序列 50)、Lys-Glu-Lys-Lys-Glu_Lys(序列表序列 51)、Lys-Glu-Lys-Lys-Lys_Glu (序列表序列 52)、Lys-Lys-Glu-Glu-Lys_Lys(序列表序列 53)、Lys-Lys-Glu-Lys-Glu_Lys (序列表序列 54)、Lys-Lys-Glu-Lys-Lys_Glu(序列表序列 55)、Lys-Lys-Lys-Glu-Glu_Lys (序列表序列 56)、Lys-Lys-Lys-Glu-Lys_Glu(序列表序列 57)、Lys-Lys-Lys-Lys-Glu_Glu (序列表序列 58)、Glu-Glu-Glu-Lys-Lys_Lys(序列表序列 59) ^Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Lys (序列表序列 60) ^Glu-Glu-Lys-Lys-Glu-Lys(序列表序列 61)、Glu-Glu-Lys- Lys-Lys_Glu (序列表序列 62) ^Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys(序列表序列 63) ^Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys (序列表序列 64) ^Glu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu(序列表序列 65) ^Glu-Lys-Lys-Glu-Glu-Lys (序列表序列 66) ^Glu-Lys-Lys-Glu-Lys-Glu(序列表序列 67)、Glu-Lys-Lys-Lys-Glu_Glu (序列表序列 68)^Lys-Lys-Lys-Glu-Glu-Glu(序列表序列 69)、Lys-Lys-Glu-Lys-Glu_Glu (序列表序列 70)、Lys-Lys-Glu-Glu-Lys_Glu(序列表序列 71)、Lys-Lys-Glu-Glu-Glu_Lys (序列表序列 72)、Lys-Glu-Lys-Lys-Glu_Glu(序列表序列 73)、Lys-Glu-Lys-Glu-Lys_Glu (序列表序列 74)、Lys-Glu-Lys-Glu-Glu_Lys(序列表序列 75)、Lys-Glu-Glu-Lys-Lys_Glu (序列表序列 76)、Lys-Glu-Glu-Lys-Glu_Lys(序列表序列 77)、Lys-Glu-Glu-Glu-Lys_Lys (序列表序列 78)、Lys-Lys-Glu-Glu-Glu_Glu(序列表序列 79)、Lys-Glu-Lys-Glu-Glu_Glu (序列表序列 80)、Lys-Glu-Glu-Lys-Glu_Glu(序列表序列 81)、Lys-Glu-Glu-Glu-Lys_Glu (序列表序列 82)、Lys-Glu-Glu-Glu-Glu_Lys(序列表序列 83) ^Glu-Lys-Lys-Glu-Glu-Glu (序列表序列 84) ^Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Glu(序列表序列 85) ^Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu (序列表序列 86) ^Glu-Lys-Glu-Glu-Glu-Lys(序列表序列 87)、Glu-Glu-Lys-Lys-Glu_Glu (序列表序列 88)^Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu(序列表序列 89) ^Glu-Glu-Lys-Glu-Glu-Lys (序列表序列 90) ^Glu-Glu-Glu-Lys-Lys-Glu(序列表序列 91)、Glu-Glu-Glu-Lys-Glu_Lys (序列表序列 92)、Glu-Glu-Glu-Glu-Lys_Lys(序列表序列 93)、Lys-Glu-Glu-Glu-Glu_Glu (序列表序列 94)、Lys-Glu-Glu-Glu-Glu_Glu(序列表序列 94)、Glu-Lys-Glu-Glu-Glu_Glu (序列表序列 95)、Glu-Glu-Lys-Glu-Glu_Glu(序列表序列 96)^Glu-Glu-Glu-Lys-Glu-Glu (序列表序列 97)、Glu-Glu-Glu-Glu-Lys_Glu(序列表序列 98)、Glu_Glu_Glu_Glu_Glu_Lys (序列表序列 99)、Glu_Glu_Glu_Glu_Glu_Glu(序列表序列100)。
[0081]目前本發(fā)明優(yōu)選的肽是如下肽序列的穩(wěn)定化合物:
[0082]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列I)
[0083]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列2)
[0084]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列3)
[0085]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列4)
[0086]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Ar g-Trp-GIy-Lys-Pro-Val (序列表序列5)
[0087]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列6)
[0088]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 7)
[0089]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 8)
[0090]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列9)
[0091]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列10)
[0092]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 11)
[0093]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 12)
[0094]Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Ser—ber—Iie—Ile—ber—his—Pne—Arg—Trp—Giy—Lys—Pro-Val (序列表序列13)
[0095]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列14)
[0096]Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Ser—ber—Iie—Ile—ber—his—Pne—Arg—Trp—Giy—Lys—Pro-(D-Val)(序列表序列15)
[0097]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列16)[0098]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列17)
[0099]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列18)
[0100]Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Ser_ber_I _Le_Ile_ber_his_ (D-Phe) -Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 19)
[0101]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 20)
[0102]Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Ser_ber_Ij_e_Ile_ber_his_D_Nal—Arg—Trp—biy—Lys-Pro-Val (序列表序列21)
[0103]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列22)
[0104]Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Ser_ber_Ij_e_Ile_ber_his_D_Nal—Arg—Trp—biy—Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 23)
[0105]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 24)
[0106]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列25) [0107]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列26)
[0108]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val)(序列表序列27)
[0109]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val)(序列表序列28)
[0110]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Nle-Glu-His-(D-Phe)_Arg_Trp_Gly_Lys_Pro_Va丄(序列表序列29)
[0111]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(序列表序列30)
[0112]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-VaI)(序列表序列31)
[0113]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-VaI)(序列表序列32)
[0114]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列33)
[0115]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列34)
[0116]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val)(序列表序列35)和
[0117]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val)(序列表序列36)
[0118]可以通過修飾上述肽的N-端和/或C-端進(jìn)行穩(wěn)定化，例如こ酰化本發(fā)明肽的N-端和/或酰胺化本發(fā)明肽的C-端。
[0119]對于天然氨基酸，用熟知的三字母密碼給出氨基酸序列。天然氨基酸殘基的修飾和取代縮寫如下:Nle是用于正売氨酸的縮寫。D-Nal是用于P-2-萘基-d_丙氨酸的縮寫。D-Val (D-纈氨酸)是用于D-構(gòu)型纈氨酸的縮寫。D-Phe (D-苯丙氨酸)是用于D-構(gòu)型苯丙氨酸的縮寫。
[0120]在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及ー種肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0121]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列I)。
[0122]在另ー優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0123]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列2)。
[0124]在另ー優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽是以下氨基酸序列的N-端こ酰化并且C-端酰胺化的化合物:
[0125]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列3)。`
[0126]在另ー優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ?；⑶褻-端被酰胺化的化合物:
[0127]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列5)。
[0128]在另ー優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ?；⑶褻-端被酰胺化的化合物:
[0129]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His- (D-Nal )_Arg_Trp_Gly_Lys-Pro-Val (序列表序列9)。
[0130]在另ー優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0131]Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Ser—ber—Iie—Ile—ber—his—Pne—Arg—Trp—Giy—Lys—Pro-Val (序列表序列13)。
[0132]在另ー優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0133]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列17)。
[0134]如上所述，與天然存在的肽a -MSH相比，本發(fā)明的肽具有提高的治療效果和/或提聞的最大響應(yīng)和/或提聞的最大功效。
[0135]發(fā)明人已經(jīng)檢驗過了一些本發(fā)明的肽的生物學(xué)效果:
[0136]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列I*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0137]Ac- (Glu) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列2*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0138]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)-NH2(序列表序列3*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0139]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GIy-Ly s-Pro-Va1-NH2(序列表序列5*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)，
[0140]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2(序列表序列9*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0141]Ac- (Lys) 6-Ser-Ser-1 Ie-1 Ie-Ser-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列13*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0142]Ac- (Lys) 6-Ser-Ser-1Ie-1Ie-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GIy-Ly s-Pro-Va1-NH2(序列表序列17*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)。
[0143]通常，“Ac-”說明本發(fā)明的肽在N-端被こ?；?，“-NH2”說明本發(fā)明的肽在C-端被
酰胺化。
[0144]在人白細(xì)胞懸液中(實驗方案I )，所有七個肽劑量依賴地抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積(實施例1-7)。令人意外 的是，我們發(fā)現(xiàn)與天然促黑素a-MSH相比，所有七個肽是更有效的以及更有效能的，前者由對TNF-a生產(chǎn)的最大抑制效果所定義，后者由提供最大的TNF-a累積抑制所需的化合物濃 度所定義(實施例1-7)。
[0145]在通過靜脈注入LPS在大鼠中誘導(dǎo)全身性炎癥的方案中(實驗方案2)，發(fā)明人還研究了以上所列的七個肽的效果(序列表序列I*、序列表序列2*、序列表序列3*、序列表序列5*、序列表序列9*、序列表序列13*、序列表序列17*，所有*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)。我們證實，所述肽極大地抑制了循環(huán)血中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積。令人意外的是，所有七個肽(序列表序列I*、序列表序列2*、序列表序列3*、序列表序列5*、序列表序列9*、序列表序列13*、序列表序列17*，所有*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)能抑制循環(huán)血中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積到比天然促黑素細(xì)胞激素a-MSH更高的程度(實施例1-7)。
[0146]在通過大鼠吸入LPS誘導(dǎo)炎癥的方案中(實驗方案3)，發(fā)明人還研究了如下肽的效果:
[0147]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列I*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)，
[0148]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GIy-Ly s-Pro-Va1-NH2(序列表序列5*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0149]已經(jīng)證實這兩個肽(序列表序列I*和5*)極大地抑制肺泡內(nèi)LPS誘導(dǎo)的嗜酸性細(xì)胞累積(實施例1和實施例2)。令人意外的是，肽(序列表序列5*)除了這種對嗜酸性細(xì)胞的作用外，還顯著地抑制嗜中性粒細(xì)胞浸潤到比在用天然促黑素a-MSH處理的大鼠中發(fā)現(xiàn)的程度高很多的程度。
[0150]腎的ー過性局部缺血(temporal ischemia)常常被視為低血壓、血容量不足、外科手術(shù)介入的結(jié)果，所述結(jié)果涉及腎和/或大動脈血流量的降低，或者與敗血病有夫。這導(dǎo)致局部缺血誘導(dǎo)的急性腎衰竭，對于大部分患者來說其將惡化為慢性腎衰竭。目前還沒有出現(xiàn)有效的治療方法來防止腎衰竭的發(fā)展。在局部缺血后階段常見發(fā)現(xiàn)是尿濃縮缺陷的發(fā)展，所述尿濃縮缺陷具有提高的無溶質(zhì)尿(solute free urine)產(chǎn)量的形成。
[0151]人們已經(jīng)知道，由局部缺血和再灌注誘導(dǎo)的大鼠的局部缺血誘導(dǎo)的實驗性急性腎衰竭(ARF)引起與尿濃縮機(jī)制的損害相關(guān)的腎小管上皮細(xì)胞的特征性結(jié)構(gòu)改變。這個局部缺血誘導(dǎo)的ARF模型提供了合適的模型來評價在局部缺血誘導(dǎo)的損傷中MSH類似物的效果。在由暫時雙向阻塞腎動脈誘導(dǎo)的重癥急性腎衰竭中，本發(fā)明人已經(jīng)研究了肽Ac-(Lys)
6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-HiS-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列 I* 在 N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)的效果，并且將其與天然肽a -MSH的效果進(jìn)行了比較(實驗方案6)。當(dāng)暫時阻塞腎動脈之后5天進(jìn)行評價時，以載體處理的大鼠發(fā)展為多尿癥(由比對照大鼠高101%的多尿量所定義)，所述對照大鼠進(jìn)行假的腎動脈阻塞。令人意外的是，服用與天然肽a-MSH相同的摩爾量的所述化合物(序列表序列I*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)完全使多尿量正?；?，這說明所述肽具有保護(hù)避免局部缺血誘導(dǎo)的ARF的能力，而在該模型中用天然肽處理不能使尿生產(chǎn)正?；?br> [0152]在發(fā)達(dá)國家中急性心肌梗塞(AMI)是最常見的死亡原因之一。由于突然的冠狀動脈血栓癥，AMI幾乎總是發(fā)生在具有冠狀動脈的患者中。目前，纖維蛋白溶解療法或初期經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)是標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，能夠在50-70%的病人中獲得早期再灌注(自發(fā)的再灌注率小于30%)。再灌注的目的是減小梗塞的大小，從而降低被損壞的心肌功能的發(fā)展。纖維蛋白溶解/PTCA的全部效果是短期和長期死亡率下降20%。然而，AMI伴隨有炎癥反應(yīng)，這對于愈合和瘢痕形成來說是先決條件。冠狀動脈阻塞嚴(yán)重地減小了到心肌部分的血流量，這顯著地?fù)p害了能量代謝。局部缺血持續(xù)相當(dāng)長的時間(>20min)引起梗塞并且導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，當(dāng)再灌注局部缺血心肌時兩者都會加速和擴(kuò)大。
[0153]心肌缺血/再灌注(MIR)不僅激活對嗜中性粒細(xì)胞-浸潤的典型的炎癥再灌注反應(yīng)，而且激活心肌細(xì)胞因子的基因表達(dá)，所述細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-a (TNF- a )、白介素(1し)-10、1レ6、1レ8、干擾素-￥和胞間粘附分子_1 (ICAM-1)。細(xì)胞因子的這種局部心肌過表達(dá)不僅在梗塞面積的調(diào)節(jié)上而且在心肌機(jī)能障礙(包括血管壁重作、心カ衰竭和心臟肥大)的發(fā)展上起重要作用。此外，人們認(rèn)為，通過直接抑制收縮性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，局部生成的TNF-a促成缺血后器官機(jī)能障礙。
[0154]越來越多的實驗研究已經(jīng)證實抗炎/抗氧化/抗細(xì)胞凋亡策略具有減小MIR動物模型的梗塞面積的能力。然而，沒有臨床研究證實在人類中的顯著效果。
[0155]在大鼠的心肌缺血/再灌注模型中，在所述模型中左前冠狀動脈被阻塞60分鐘，恰好在去掉冠狀動脈阻塞之前給予用根據(jù)本發(fā)明的肽的處理，然后再跟蹤大鼠3小吋。然后評價所述肽減小梗塞面積的能力，并將其與天然肽a-MSH的效果進(jìn)行比較(實驗方案5)。
[0156]令人意外的是，所有如下三個肽:
[0157]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列I*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)，
[0158]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GIy-Ly s-Pro-Va1-NH2(序列表序列5*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)，和[0159]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2(序列表序列9*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)減小梗塞面積到比天然肽a -MSH更高的程度(實施例1、3-4)。
[0160]根據(jù)上面以及實施例所描述的肽的功能特性，本發(fā)明涉及具有至少ー種如下特性的肽:
[0161]a)抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-a的產(chǎn)生，其中TNF-a由人白細(xì)胞產(chǎn)生
[0162]b)抑制肺中炎癥誘導(dǎo)的嗜酸性細(xì)胞浸潤
[0163]c)抑制肺中炎癥誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞浸潤
[0164]d)抑制循環(huán)血中炎癥誘導(dǎo)的TNF-a累積
[0165]e)減輕局部缺血誘導(dǎo)的急性腎衰竭
[0166]f)減小心肌梗塞面積
[0167]g)減輕心肌梗塞后心力衰竭的程度
[0168]h)減輕肺血管高血壓
[0169]i)減輕順鉬誘導(dǎo)的腎衰竭
[0170]肽可以具有ー個以上這些特性，例如2、3、4、5、6、7、8或者上述所有特性。這些特性能夠用如實施例中概述的方法進(jìn)行檢驗。
`[0171]如上所述，本發(fā)明的a-MSH類似物的特征為具有比天然a-MSH提高的功效。
[0172]在本說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語“功效”被定義為化合物可獲得的最大響應(yīng)。在實施例記載的各種試驗中，本發(fā)明的a-MSH類似物能夠產(chǎn)生比天然a-MSH更高的最大響應(yīng)。
[0173]優(yōu)選地，與a -MSH相比，本發(fā)明的a -MSH類似物抑制由人白細(xì)胞產(chǎn)生的LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)最少10%，更優(yōu)選25%以及最優(yōu)選40%。
[0174]進(jìn)ー步，本發(fā)明的a -MSH類似物可以抑制肺中炎癥誘導(dǎo)的嗜酸性細(xì)胞浸潤，通過降低支氣管肺泡灌洗或者類似方法收集的液體中嗜酸性細(xì)胞數(shù)量的能力測定。當(dāng)與a -MSH比較時，我們發(fā)現(xiàn)最小預(yù)期效果是嗜酸性細(xì)胞減少10%，更優(yōu)選25%以及最優(yōu)選50%。
[0175]此外，本發(fā)明的a-MSH類似物可以抑制肺中炎癥誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞浸潤，通過降低支氣管肺泡灌洗或類似方法收集的液體中嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量的能力測定。當(dāng)與a -MSH比較時，發(fā)現(xiàn)最小預(yù)期效果是嗜中性粒細(xì)胞減少10%，更優(yōu)選20%以及最優(yōu)選40%。
[0176]與a-MSH相比，本發(fā)明的a-MSH類似物還可以抑制循環(huán)血中炎癥誘導(dǎo)的TNF-a生產(chǎn)最少10%，更優(yōu)選25%以及最優(yōu)選40%。
[0177]此外，本發(fā)明的a -MSH類似物可以減輕局部缺血誘導(dǎo)的急性腎衰竭，這通過減輕局部缺血后多尿癥程度的能力測定。當(dāng)與a-MSH比較時，發(fā)現(xiàn)最小預(yù)期效果是多尿癥減少10%,更優(yōu)選30%以及最優(yōu)選50%。
[0178]進(jìn)ー步，本發(fā)明的a -MSH類似物可以減小心肌梗塞面積，通過降低局部缺血心肌中壞死面積的大小的能力證明。當(dāng)與a-MSH比較時，發(fā)現(xiàn)最小預(yù)期效果是梗塞面積減少10%,更優(yōu)選20%以及最優(yōu)選30%。
[0179]在另一方面，本發(fā)明的a -MSH類似物可以減輕心肌梗塞后心力衰竭的程度，通過直接測量左心室末端舒張壓或類似定量方法評價心臟的表現(xiàn)來證明。當(dāng)與a-MSH比較時，發(fā)現(xiàn)最小預(yù)期效果是心力衰竭的程度減少10%，更優(yōu)選20%以及最優(yōu)選25%。
[0180]在另一方面，本發(fā)明的a-MSH類似物可以減輕肺血管高血壓癥。當(dāng)與a-MSH比較時，發(fā)現(xiàn)最小預(yù)期效果是肺血管高血壓癥減少10%，更優(yōu)選20%以及最優(yōu)選30%。
[0181]在另一方面，本發(fā)明的a-MSH類似物可以減輕順鉬誘導(dǎo)的腎衰竭。當(dāng)與a-MSH比較時，發(fā)現(xiàn)最小預(yù)期效果是低血鎂癥(hypomagnesia)和/或腎小球浸潤率減少10%,更優(yōu)選20%以及最優(yōu)選30%。
[0182]如前所述，天然肽a-促黑素(a-MSH)作為I型、3型、4型和5型黑皮質(zhì)素(MC)受體的天然激動劑已經(jīng)為人們熟知，而ACTH是2型受體(MC2)的天然配基。因為所述肽包括a-MSH或其類似物的氨基酸序列，所述肽具有激活ー種或多種黑皮質(zhì)素受體(即I型、3型、4型或5型黑皮質(zhì)素受體)的能力。
[0183]本發(fā)明肽的制備方法
[0184]本發(fā)明的肽可以通過本領(lǐng)域本身熟知的方法進(jìn)行制備。因而，a-MSH、a -MSH變體、a-MSH類似物和X基元(motif)可以通過標(biāo)準(zhǔn)的肽制備技術(shù)(例如溶液合成法或Merrifield型固相合成法)制備。
[0185]在ー個可能的合成策略中，本發(fā)明的肽可以通過固相合成法制備:首先使用公知的標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)、偶聯(lián)和脫保護(hù)步驟構(gòu)建藥理活性的肽序列(a -MSH、a -MSH變體、a -MSH類似物)，此后在活性肽上用與構(gòu)建活性肽類似的方式繼續(xù)偶聯(lián)基元X的氨基酸序列，最后從載體上切除整個肽。這種策略獲得了ー種肽，其中肽序列X在肽的N-端氮原子上被共價結(jié)合到該藥理活性的肽上。
[0186]另ー可能的策略是通過溶液合成法、固相合成法、重組技術(shù)或酶合成法分別制備a -MSH肽/類似物和X-基元(或其部分)的序列，接著在溶液中或者使用固相技術(shù)或其組合通過公知的片段縮合步驟偶聯(lián)兩個序列。在一個實施方式中，a-MSH肽/類似物可以通過重組DNA方法制備，X基元可以通過固相合成法制備。a -MSH肽/類似物與X基元的接合可以通過使用化學(xué)接合法進(jìn)行。這種技術(shù)允許在高特異性方式下組裝完全無保護(hù)的肽片段(Liu等，1996)。還可以通過 蛋白酶催化的肽鍵形成進(jìn)行所述接合，其提供了ー種高度特異的技術(shù)以通過肽鍵接合完全無保護(hù)的肽片段(Kullmann, 1987 )。
[0187]合適的固體支持材料(SSM)的實例是例如功能化的樹脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、纖維素、聚乙烯、聚乙二醇接枝的聚苯乙烯、膠乳、戴諾免疫磁珠(dynabeads)等。
[0188]應(yīng)當(dāng)理解的是，將X-基元的肽序列的C-端氨基酸或者a-MSH、a-MSH變體、a-MSH類似物的C-端氨基酸通過常用連接子連接到固體支持材料上是必須的或者需要的，常用連接子是例如2，4- 二甲氧基-4’ -羥基-二苯甲酮、4-(4-羥基-甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁酸、4-羥基-甲基苯甲酸、4-羥甲基-苯氧基こ酸、3- (4-羥基甲基苯氧基)丙酸、和P-[ (R, S)-a[1-(9H-芴-9-基)甲氧基甲酰胺基]_2，4- 二甲氧基苯基]-苯氧基-乙酸。
[0189]通過酸(例如三氟こ酸、三氟甲磺酸、溴化氫、氯化氫、氟化氫等)任選地與ー種或多種適于該目的的“清除劑”(例如こ二硫醇、三異丙基硅烷、苯酚、苯硫基甲烷等)組合的方法，可以將本發(fā)明的肽從固體支持材料上切除，或者，通過堿的方法例如氨、肼、醇鹽例如こ醇鈉、氫氧化物例如氫氧化鈉等，將本發(fā)明的肽接合物從固體支持材料上切除。
[0190]本發(fā)明的肽也可以通過重組DNA技術(shù)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一般方法和原理來進(jìn)行制備。通過已制定的標(biāo)準(zhǔn)方法例如亞磷酰胺方法(phosphoamidite method),可以合成地制備編碼本發(fā)明的肽的核酸序列。根據(jù)亞磷酰胺方法，例如在自動DNA合成儀中，在合適載體上合成、純化、退火、連接以及克隆寡核苷酸。
[0191]然后將編碼本發(fā)明的肽的核酸序列插入到重組表達(dá)載體中，所述重組表達(dá)載體可以是可以方便地進(jìn)行重組DNA步驟的任何ー種載體。載體的選擇通常依賴于其將要被轉(zhuǎn)入的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可以是自發(fā)復(fù)制的載體，即作為染色體外個體存在并且其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒。此外，所述載體可以是ー種載體，即當(dāng)被轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞時，載體被整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)并且與它所整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制。
[0192]在載體中，需要將編碼本發(fā)明的肽的核酸序列可操作地連接到適當(dāng)?shù)膯幼由?。啟動子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或者異源的蛋白的基因中導(dǎo)出的任意的核酸序列。用于在哺乳動物細(xì)胞中指導(dǎo)編碼本發(fā)明的肽的核酸序列轉(zhuǎn)錄的、合適的啟動子的實例是SV40啟動子、MT-1 (金屬硫蛋白基因)啟動子或腺病毒2主要晩期啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)啟動子。用在昆蟲細(xì)胞的適當(dāng)?shù)膯幼邮嵌嘟求w蛋白啟動子。
[0193]合適的啟動子(其用于指導(dǎo)編碼本發(fā)明的肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中)的實例是從以下來源獲得的啟動子:大腸桿菌乳糖操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌a -淀粉酶基因5 (amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌a -淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核@ -內(nèi)酰胺酶基因，以及tac啟動子。更多的啟動子記載于"Useful proteins fromrecombinant bacteria"Scientific American, 1980, 242:74-94;和 Sambrook 等，1989(同前)。
[0194]用于在絲狀真菌宿主 細(xì)胞中指導(dǎo)編碼本發(fā)明的肽的核酸序列轉(zhuǎn)錄的、合適的啟動子的實例是從編碼以下酶的基因獲得的啟動子:米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸 蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉耐酸性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉こ酰胺酶、尖孢錸刀菌(Fusarium oxysporum)類胰蛋白酶水解酶(記載于美國專利4，288，627，在此引入作為參考)，以及它們的雜化物。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的、特別優(yōu)選的啟動子是TAKA淀粉酶、NA2_tpi (來自編碼黑曲霉中性a-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的啟動子的雜化物)和glaA啟動子。
[0195]在酵母宿主中，有用的啟動子可以從以下基因獲得:釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GALl)、釀酒酵母こ醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油激酶基因。用于酵母宿主細(xì)胞的其他有用啟動子記載于Romanos等1992，酵母(Yeast) 8:423-488。
[0196]編碼本發(fā)明的肽的核酸序列還可以被可操作地連接到合適的終止子例如人生長激素終止子上。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的終止子從編碼如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸鹽合成酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖孢錸刀菌類胰蛋白酶水解酶。
[0197]用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選的終止子從編碼以下酶的基因獲得:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C (CYC1 )、釀酒酵母こ醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶。用于酵母宿主細(xì)胞的其他有用終止子記載于Romanos等1992(同前)。
[0198]所述載體還可以包括元件例如聚腺苷酸化信號(例如，來自SV40或腺病毒5Elb區(qū))、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列(例如，SV40增強(qiáng)子)和翻譯增強(qiáng)子(例如，編碼腺病毒VA RNAs的增強(qiáng)子)。此外，用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的聚腺苷酸化信號從編碼以下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸鹽合成酶。用于酵母宿主細(xì)胞的有用的聚腺苷酸化信號記載于Guo和Sherman, 1995，分子細(xì)胞生物學(xué)(MolecularCellular Biology) 15:5983-5990。
[0199]重組表達(dá)載體還可以包括能夠使所述載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這種序列(當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞時)的實例是SV40或多瘤病毒的復(fù)制起點。細(xì)菌的復(fù)制起點的實例是質(zhì)粒 pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUBH0、pE194、pTA1060 和 pAM3 I的復(fù)制起點。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點(2micron origin ofreplication), CEN6與ARS4的組合、CEN3與ARSl的組合。復(fù)制起點可以是具有突變的復(fù)制起點以使在宿主細(xì)胞中其功能是溫度敏感的(參見Ehrlich，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1433)o
[0200]所述載體還可以包括選擇性標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補(bǔ)足宿主細(xì)胞的缺陷的基因，例如用于編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或者賦予對藥物抗性的基因，所述藥物是例如新霉素、遺傳霉素(geneticin)、氨節(jié)青霉素、潮霉素(hygromycin)。用于酵母宿主細(xì)胞的合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPI和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記可以選自如下組以及來源其他物種的等同物，所述組包括但不限于amdS (こ酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar (草丁膦こ酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD (硝酸還原酶)、pyrG (乳清酸核苷-5’-磷酸鹽脫羧酶)、SC (硫酸鹽腺苷轉(zhuǎn)移酶)、trpC (氨基苯甲酸鹽合成酶)和草銨膦抗性標(biāo)記。用于曲霉細(xì)胞的優(yōu)選的選擇性標(biāo)記是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標(biāo)記以及吸水鏈霉菌的bar標(biāo)記。此外,選擇性可以通過共轉(zhuǎn)化完成，例如如W091/17243所記載的，選擇性標(biāo)記在單獨的載體上。
`[0201]用于連接分別編碼本發(fā)明的肽、啟動子以及終止子的核酸序列，以及將它們插入到含有復(fù)制必須的信息的合適的載體中的步驟，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的(參照，例如Sambrook等,在引文中列舉)。
[0202]表達(dá)載體所轉(zhuǎn)入的宿主細(xì)胞可以是能夠生產(chǎn)本發(fā)明的肽的任何細(xì)胞，可以是真核細(xì)胞，例如無脊椎動物(昆蟲)細(xì)胞或者脊椎動物細(xì)胞(例如爪蟾卵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞)，尤其是昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。合適的哺乳動物細(xì)胞系的實例是COS (例如，ATCCCRL1650)、BHK (例如?，ATCC CRL1632, ATCC CCL10)或者 CHO (e.g.，ATCC CCL61)細(xì)胞系。
[0203]用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞以及表達(dá)已轉(zhuǎn)入到細(xì)胞的DNA序列的方法可以是任何一種本領(lǐng)域熟知的方法(例如，MANIATIS, T.，E.F.FRITSCH 和 J.SAMBR00K, 1982MolecularCloning:A Laboratory Manual.冷泉港實驗室出版社,冷泉港，紐約州)。
[0204]宿主細(xì)胞還可以是單細(xì)胞病原體(例如原核細(xì)胞)或者非單細(xì)胞病原體(真核細(xì)胞)。有用的單細(xì)胞細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞例如革蘭氏陽性菌(包括但不限于芽孢桿菌細(xì)胞，例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)、凝固芽胞桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽胞桿菌(Bacillus Iautus)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)以及蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)),或者鏈霉菌細(xì)胞(例如，淺青紫鏈霉菌(Streptomyces Iividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)),或者革蘭氏陰性菌(例如大腸桿菌(E.Coli)和假單胞菌(Pseudomonas sp))。細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、通過使用感受態(tài)細(xì)胞、通過電穿孔或者通過融合法進(jìn)行。
[0205]宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。這里使用的“真菌”包括子囊菌門(phylaAscomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和結(jié)合菌門(Zygomycota)以及卵菌門(Oomycota)和所有的有絲分裂孢子真菌(mitosporic fungi)。子囊菌門的代表性組包括，如,脈孢菌屬(Neurospora)、正青霉菌屬(Eupenicillium)(=青霉菌屬(Penicillium))、翅孢霉屬(Emericella)(=曲霉(Aspergillus))、散囊菌(Eurotium)(=曲霉(Aspergillus))以及下面列出的真正酵母。真菌宿主細(xì)胞也可以是酵母細(xì)胞。這里所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenous yeast)(內(nèi)孢霉科(Endomycetales))、擔(dān)子孢子形成酵母(basidiosporogenous yeast)以及屬于半知菌門(Fungi Imperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適宜生長哺乳動物細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基(例如含有適當(dāng)?shù)奶砑游锏暮迮囵B(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基)，或者是用于生長昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞的合適培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可以從商業(yè)廠商獲得或者根據(jù)已公開的配方來制備(例如，美國典型微生物菌種保藏中心的目錄)。
[0206]然后通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收由細(xì)胞生產(chǎn)的本發(fā)明的肽，所述方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，用鹽例如硫酸銨沉淀上清液或濾液的蛋白組分，通過各種色譜法例如離子交換色譜、親和色譜等純化。
[0207]因此，本發(fā)明涉及用于制備根據(jù)本發(fā)明的肽的方法，所述方法用重組DNA技術(shù)，其包括如下步驟:(a)將編碼所述肽的核酸序列轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞中，和(b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和(C)從所述培養(yǎng)物中分離所 述肽；或者，(a)在允許所述肽生產(chǎn)的條件下，培養(yǎng)含有編碼所述肽的核酸序列的重組宿主細(xì)胞，和(b)從所述培養(yǎng)物中分離所述肽。
[0208]用途
[0209]本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的肽在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途，特別是與ー種或多種上面或者下面提到的病況、不適或疾病有關(guān)的用途。
[0210]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防哺乳動物的一個或多個器官的組織的病況。所述器官選自但不限于由下述所組成的組中:腎、肝、腦、心臟、肌肉、骨髄、皮膚、骨骼、肺、呼吸道、脾、外分泌腺、膀胱、內(nèi)分泌腺、包括輸卵管的生殖器官、眼、耳、血管系統(tǒng)、包括小腸、結(jié)腸、直腸及肛管的胃腸道和前列腺。
[0211]如上所述，與a-MSH相比，本發(fā)明的肽顯示出提高的抗炎效果以及提高的防止局部缺血病況的能力。
[0212]因此，本發(fā)明涉及一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防哺乳動物的一個或多個器官的組織的病況，其中所述病況是局部缺血或炎癥病況。所述病況還可以是歸因于毒素或藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞、組織或器官的衰竭。
[0213]在本說明書和權(quán)利要求中，如果上下文沒有特別地排除這種解釋，術(shù)語“治療”通常包括已有病況的治療以及這種病況的預(yù)防(預(yù)防性治療)。
[0214]在最寬的方面，本發(fā)明涉及任何病況其中器官或組織的正常功能由于局部缺血或炎癥而改變。損傷可以包括急性和/或慢性損傷。慢性損傷包括處于器官或組織的完全或部分恢復(fù)期間的重復(fù)損傷的情形。
[0215]局部缺血
[0216]在本說明書和權(quán)利要求中，局部缺血定義為對ー個或多個器官降低的血流量，導(dǎo)致組織降低的氧輸送和/或利用。局部缺血可以發(fā)生在ー個或多個器官中，所述器官包括(非完全列表(non-listing list)):腦、心臟、四肢、腎、脾、肝、腸、胃、肺、眼、皮膚、肌肉、膜、內(nèi)分泌器官以及其他。
[0217]通過降低的/完全的阻止動脈血供給，局部缺血誘導(dǎo)許多組織反應(yīng)包括嗜中性粒細(xì)胞累積、其他炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡。局部缺血涉及許多疾病，其與大外科(majorsurgery)相關(guān)并且繼發(fā)于其他重癥疾病。鑒定能夠抑制或預(yù)防(完全地或部分地)許多作為局部缺血的結(jié)果而發(fā)生的細(xì)胞/組織/器官損傷或破壞的化合物是非常有益的。
[0218]進(jìn)行治療的病況能夠歸因于組織的局部缺血或者由組織的局部缺血所產(chǎn)生，例如動脈狹窄癥或者任何其他完全的或部分的血供給限制。局部缺血可以是急性的或者慢性的，這依賴于疾病的嚴(yán)重程度，此外，所述病況可以是可逆的或者不可逆的。可逆病況的實例可以歸因于在手術(shù)或其他介入性治療過程中血壓下降。因此，進(jìn)行治療的病況可以是任何系統(tǒng)血流量的降低例如低血壓，其將影響對腸、心臟、腎或任何其他器官的系統(tǒng)血流量。
`[0219]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備用于治療局部缺血的藥物組合物的用途，其中所述病況是由急性、亞急性或慢性的局部缺血引起的。
[0220]器官或四肢或組織的急性、亞急性或慢性的局部缺血可以由許多疾病引起。其包括(非完全列表)具有血栓形成的動脈粥樣化疾病、來自心臟或者來自血管或者來自任何器官的栓塞、痙攣、其他器官的主動脈瘤或動脈瘤、胸或腹或壁間動脈瘤、歸因于心臟病的低血壓、歸因于系統(tǒng)性疾病(包括傳染病或過敏反應(yīng))的低血壓、歸因于ー個或多個毒性化合物或毒藥或藥物的低血壓。
[0221]在第二實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備用于治療局部缺血的藥物組合物的用途，其中所述病況是由繼發(fā)性局部缺血引起的。
[0222]繼發(fā)于疾病或病況的局部缺血能夠在ー種或多種選自如下的疾病和病況中觀察到:糖尿病、高脂血癥、閉塞性血栓血管炎(伯格氏病)、高安氏綜合征、ー過性動脈炎、皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征(川崎氏病)、心血管梅毒、如雷諾氏病的結(jié)締組織疾病、藍(lán)色靜脈炎、血管創(chuàng)傷(包括醫(yī)源性創(chuàng)傷例如套管插入木或手術(shù)或器官移植)。此外，該列表包括由ー個或多個器官手術(shù)、ー個或多個器官移植、手術(shù)插入移植、裝置、移植物、假肢或其他生物醫(yī)學(xué)化合物或設(shè)備引起的局部缺血。
[0223]在第三實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽的用途，其中所述病況是由歸因于敗血癥休克的局部缺血或與系統(tǒng)性低血壓相關(guān)的病況引起的。
[0224]炎癥癥狀
[0225]術(shù)語“炎癥癥狀”在本文中是指ー種病況，在所述病況中例如特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)或者抗體與抗原的反應(yīng)的機(jī)理引起炎性細(xì)胞和內(nèi)生媒介化學(xué)物質(zhì)的募集。在一些情況下，器官或組織的正常功能由于血管浸潤性的増加和/或內(nèi)臟平滑肌的收縮而改變。這種炎癥病況會產(chǎn)生炎癥疾病。
[0226]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防哺乳動物的一個或多個器官的組織的病況，其中所述病況是炎癥病況。[0227]炎癥病況可以由炎癥疾病引起，其包括(非完全列表):關(guān)節(jié)炎(包括與關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疾病)、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；脊柱關(guān)節(jié)病(例如強(qiáng)直性脊柱炎)、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(包括風(fēng)濕熱之后的關(guān)節(jié)炎)、過敏性紫癜和Reiter病。此外，炎性疾病包括結(jié)締組織疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多肌炎/皮膚肌炎、系統(tǒng)性硬化、混合型結(jié)締組織病、肉狀瘤病和原發(fā)性舍格倫綜合征(包括干燥性角膜結(jié)膜炎)、風(fēng)濕性多肌痛、和其他類型的血管炎、結(jié)晶沉積癥(包括痛風(fēng))、焦磷酸性關(guān)節(jié)病、急性鈣化性關(guān)節(jié)周圍炎。此外，炎性疾病包括幼年型關(guān)節(jié)炎(斯提耳氏病)、牛皮癬、骨關(guān)節(jié)炎、繼發(fā)于過度移動癥的骨關(guān)節(jié)炎、先天性發(fā)育不良、股骨頭骺松脫、派爾特斯病(Perthes’ disease)、關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、半月板切除術(shù)、肥胖癥、復(fù)發(fā)性脫位、重復(fù)性動作、結(jié)晶沉積癥和軟骨代謝異常癥(包括焦磷酸性關(guān)節(jié)病)、褐黃病、血色素沉積癥、缺血性壞死(包括錸刀型細(xì)胞病)、用腎上腺皮質(zhì)激素或其他藥物的治療法、減壓病、敗血性或感染性關(guān)節(jié)炎(包括結(jié)核性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎雙球菌性關(guān)節(jié)炎、淋菌性關(guān)節(jié)炎、沙門氏菌性關(guān)節(jié)炎)、感染性心內(nèi)膜炎(包括由綠色鏈球菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、組織胞漿菌屬、布魯氏菌屬、念珠菌屬、曲霉屬和貝鈉氏考克期體(Coxiellaburnetii)引起的心內(nèi)膜炎)、病毒性關(guān)節(jié)炎(包括感染有風(fēng)疹、流行性腮腺炎、こ型肝炎、HIV或細(xì)小病毒)，或再發(fā)性關(guān)節(jié)血腫。此外，炎癥疾病包括血管炎例如歸因于感染有細(xì)菌的感染性血管炎，包括螺旋體疾病如拉姆病、梅毒、立克次氏體和分枝桿菌感染、真菌、病毒或原蟲感染。此外，炎癥疾病包括非感染性血管炎，包括高安氏病、巨細(xì)胞性動脈炎(一過性動脈炎和風(fēng)濕性多肌痛)、伯格氏病、結(jié)節(jié)性多動脈炎、顯微鏡下多動脈炎、韋格納肉芽腫、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(Churg-Strauss綜合征)、繼發(fā)于結(jié)締組織疾病的血管炎包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多肌炎/皮膚肌炎、系統(tǒng)性硬化、混合型結(jié)締組織病、肉狀瘤病和原發(fā)性舍格倫綜合征。此外，炎癥疾病包括繼發(fā)于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的血管炎。
[0228]此外，炎癥疾病包括繼發(fā)于過敏癥的非感染性血管炎和白細(xì)胞增多性血管炎包括血清病、過敏性紫癜、藥物誘導(dǎo)的血管炎、特發(fā)性混合性冷球蛋白血癥、低補(bǔ)體血癥、與其他惡性腫瘤聯(lián)發(fā)的血管炎、炎癥性腸病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肺出血腎炎綜合征(古德帕斯JX綜合征 Goodpasture syndrome 入
[0229]此外，炎癥疾病包括所有類型的兒童關(guān)節(jié)炎，例如幼年型關(guān)節(jié)炎包括斯提耳氏病，幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)、幼年型強(qiáng)直性脊柱炎。
[0230]此外，炎癥疾病包括上氣道病和下氣道病例如慢性阻塞性肺病(C0PD)、變應(yīng)性氣喘和非變應(yīng)性氣喘、變應(yīng)性鼻炎、過敏性和非過敏性結(jié)膜炎。此外，炎性疾病還包括過敏性或非過敏性皮炎。
[0231 ] 此外炎癥疾病包括所有類型的沉積病，如痛風(fēng)、焦磷酸性關(guān)節(jié)病、急性鈣化性關(guān)節(jié)周圍炎。
[0232]此外炎癥疾病所有類型的產(chǎn)生背痛的炎癥病況包括感染、敗血性關(guān)節(jié)盤炎、結(jié)核病、惡性腫瘤(例如轉(zhuǎn)移性肝腫瘤、骨髓瘤以及其他)、脊柱腫瘤、強(qiáng)直性脊柱炎、急性盤間突出、慢性盤間疾病/骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、軟骨病。它還包括變形性骨炎、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、腎病性骨營養(yǎng)不良、脊椎前移、錐管狹窄癥先天性異常和纖維肌痛。
[0233]此外炎癥疾病包括所有類型的軟組織風(fēng)濕病包括滑囊炎、腱鞘炎或腱膜炎、肌腱末端炎、神經(jīng)擠壓癥、關(guān)節(jié)周炎或囊炎、肌肉緊張和肌肉功能失調(diào)。
[0234]此外炎癥疾病包括胃腸道系統(tǒng)的炎癥疾病(包括所有類型的胃炎、天皰瘡、大皰類天皰瘡、良性粘膜性類天皰瘡)、唾液腺疾病(例如肉狀瘤病、唾液管堵塞和舍格倫綜合征)、食道炎癥(例如胃食管反流性疾病或感染有念珠菌屬物種、單純性皰疹和巨細(xì)胞病毒)、胃的炎癥疾病(包括急性和慢性胃炎、幽門螺桿菌感染、肥大性胃炎)、小腸的炎癥(包括腹腔病、麩質(zhì)過敏性腸病、皰疹樣皮炎、熱帶性腹瀉、惠普爾病、放射性腸炎、系統(tǒng)性淀粉樣變病、結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多肌炎/皮膚肌炎、系統(tǒng)性硬化、混合型結(jié)締組織病和肉狀瘤病)、嗜酸性胃腸炎、小腸淋巴管擴(kuò)張癥、炎癥性腸病(包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)、結(jié)腸憩室病、和腸易激綜合征。
[0235]在優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明涉及一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防哺乳動物的一個或多個器官的組織的病況，其中所述病況是選自肺炎、關(guān)節(jié)炎、皮炎、胰腺炎和炎癥性腸病的炎癥病況。
[0236]藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞、組織和器官衰竭
[0237]在一個實施方式，本發(fā)明涉及一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防毒素或藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞、組織或器官衰竭。
[0238]在本說明書和權(quán)利要求中，“藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞、組織或器官衰竭”定義為由藥理學(xué)化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞或組織功能 和/或形態(tài)上的變化。所述藥理學(xué)化合物包括但不限于癌化療藥包括順鉬、卡鉬、達(dá)卡巴嗪(dacarbezine)、丙卡巴肼、六甲基蜜胺、司莫司汀、洛莫司汀、卡莫司汀、白消安、噻替哌、美法侖、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、二氯甲基二こ胺、阿扎胞苷、克拉曲濱、阿糖胞苷、氟拉達(dá)濱、巰嘌呤、甲氨碟呤、硫鳥嘌呤、別嘌呤醇、博來霉素、更生霉素、正定霉素、多烯紫杉醇、阿霉素(亞德里亞酶素)、足葉こ甙、伊達(dá)比星、伊立替康、絲裂霉素、紫杉醇、普卡霉素、拓?fù)涮婵怠㈤L春花堿、長春新堿、長春瑞賓、阿瑪薩克瑞恩(amasacrine)、天門冬酰胺酶、羥基脲、咪替他恩(mititane)、米托蒽醌；如氨基糖苷類的抗生素包括鏈霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、托普霉素、西索米星、奈替米星；免疫抑制化合物如環(huán)孢霉素、三環(huán)類抗抑郁藥、鋰鹽、普尼拉明和吩噻嗪類衍生物。
[0239]其中細(xì)胞、組織或器官的正常功能已經(jīng)被改變的病況包括與如下疾病相關(guān)的病況:局部缺血、急性和/或慢性炎癥、過敏性反應(yīng)、風(fēng)濕病、感染(包括病毒、真菌、細(xì)菌感染)、蛋白感染素和其他微生物和本領(lǐng)域熟知的其他感染性制劑、所有形式的毒性反應(yīng)(包括藥物誘導(dǎo)的毒性)、和急性與慢性損傷。慢性損傷包括隨器官或組織功能的完全或部分復(fù)原的時間變化的重復(fù)性損傷的情形。其中細(xì)胞、組織或器官的正常功能已改變的病況包括損傷，其與ー個或多個器官或者用于移植的其他裝置的植入相關(guān)，并且可以預(yù)期本發(fā)明的肽也將在所述病況的治療或預(yù)防中有用。所述器官可以來源于個體自身、動物體自身或者來源于其他個體或動物。這包括:器官移植、骨移植、軟組織植入(硅酮植入)、金屬和塑料植入，或者其他醫(yī)學(xué)上可移植的裝置。所述個體代表人以及其他哺乳動物。
[0240]進(jìn)行治療的病況也可以是由癌癥或者由具有對器官(例如對呼吸系統(tǒng)包括肺、細(xì)支氣管、上氣道，和/或?qū)π呐K和/或?qū)δI和/或?qū)ξ改c系統(tǒng))影響的癌前病變引起的，包括急性白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、霍奇金病、淋巴肉瘤、骨髄瘤、任何病原的轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤。可以預(yù)期本發(fā)明的肽也將在所述病況的治療或預(yù)防中有用。
[0241]此外，進(jìn)行治療的病況也可以是由任何一種選自如下的疾病引起的:糖尿病、具有提高的空腹LDL-膽固醇水平的病況、具有組合提高的空腹LDL-膽固醇和甘油三酯水平的病況、具有提高的空腹甘油三酯水平的病況、具有提高的空腹HDL-膽固醇水平的病況、腹膜后纖維化、紅斑狼瘡、多結(jié)性動脈炎、硬皮病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏癥、血清病、溶血性貧血和過敏性粒細(xì)胞缺乏癥?？梢灶A(yù)期本發(fā)明的肽也將在所述病況的治療或預(yù)防中有用。
[0242]許多導(dǎo)致性能降低的感染可能具有對組織的影響作用并且干擾正常的功能，其可以通過給予有效劑量的本發(fā)明的肽來進(jìn)行改善。這些感染包括原生動物、病毒、細(xì)菌和真菌感染，以及包括病況例如AIDS、細(xì)菌性敗血癥、系統(tǒng)性真菌感染、立克次體病、中毒性休克綜合征、感染性單核細(xì)胞增多癥、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、巨細(xì)胞病毒感染、弧形桿菌、沙門氏菌、流感、脊髓灰質(zhì)炎、弓形蟲病、拉沙熱病、黃熱病、血吸蟲病、大腸桿菌、腸球菌、變形桿菌(preteus)、克雷伯氏菌屬、假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、結(jié)核病、腮腺炎、感染性單核細(xì)胞增多癥、肝炎和柯薩奇病毒。
[0243]進(jìn)行治療的病況可以與涉及ー種或多種毒性物質(zhì)和/或藥物的化學(xué)外傷有夫。這些藥物包括三環(huán)類抗抑郁藥、鋰鹽、普尼拉明和吩噻嗪類衍生物，癌癥化療藥包括順鉬、卡鉬、達(dá)卡巴嗪(dacarbezine)、丙卡巴肼、六甲基蜜胺、司莫司汀、洛莫司汀、卡莫司汀、白消安、噻替哌、美法侖、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、二氯甲基二こ胺、阿扎胞苷、克拉曲濱、阿糖胞苷、氟拉達(dá)濱、巰嘌呤、甲氨碟呤、硫鳥嘌呤、別嘌呤醇、博來霉素、更生霉素、正定霉素、多烯紫杉醇、阿霉素((亞德里亞酶素)、足葉こ甙、伊達(dá)比星、伊立替康、絲裂霉素、紫杉醇、普卡霉素、拓?fù)涮婵?、長春花堿、長春新堿、長春瑞賓、amasacrine、天門冬酰胺酶、羥基脲、mititane、米托蒽醌；如氨基糖苷類的抗生素包括鏈霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、托普霉素、西索米星、奈替米星；免疫抑制化合物如環(huán)孢霉素。物理外傷包括電磁輻射也可以引起損傷，能夠通過施用有效劑量的根據(jù)本發(fā)明的a-MSH類似物使其減輕。
[0244]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的病況還可以包括結(jié)締組織疾病例如硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，或者神經(jīng)肌病，例如杜興(Duchenne)型進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥、弗里德賴希(Friedreich)共濟(jì)失調(diào)、肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良。所述病況可以例如涉及哺乳動物腸的組織。
[0245]本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽的用途，其中所述病況選自由如下所組成的組中:心肌缺血、心絞痛、心包炎、心肌梗塞、心肌缺血、心肌炎、粘液性水腫(myxodemia)、心內(nèi)膜炎。
[0246]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽的用途，其中所述病況與心律失常相關(guān)。
[0247]治療方法
[0248]本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防在其需要的哺乳動物個體的ー個或多個器官的組織的病況的方法，所述方法包括給予有效劑量的一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽。所述病況可以是局部缺血癥狀或炎癥病況和/或來自中毒或藥物治療的毒性作用的結(jié)果。
[0249]對由任何ー種器官或脈管移植產(chǎn)生的或與之相關(guān)的病況,包括防止移植物對宿主的反應(yīng)，本發(fā)明的治療方法是特異有效的。在這些病況中，整個器官對關(guān)于營養(yǎng)、代謝、灌注等的所有變化極度敏感，并且我們相信，根據(jù)本發(fā)明的治療能穩(wěn)定所述病況并且使所述組織對任何壓迫器官的功能的情形更有抗性。根據(jù)本發(fā)明的方法還包括在移植到受體的過程中給予器官移植物有效劑量的本發(fā)明的肽，包括添加有效劑量的本發(fā)明的肽到移植基質(zhì)中。
[0250]此外，本申請?zhí)峁┝俗C據(jù)，在重度疾病(例如心肌缺血)中用根據(jù)本發(fā)明的a -MSH類似物治療顯著地防止了死亡以及器官功能失調(diào)。
[0251]最常見的心臟病況之一是間歇性心絞痛或胸痛，其中根據(jù)本發(fā)明的治療是特異有效的。涉及心絞痛的病況包括不穩(wěn)性心絞痛、穩(wěn)定性心絞痛和Prinzmetal變異型心絞痛。
[0252]在另一方面,可以在由心包炎、心肌梗塞、心肌缺血、心肌炎、myxodemia、心內(nèi)膜炎引起的情形中利用所述預(yù)防和治療。
[0253]進(jìn)行治療的病況可以與心律失常相關(guān)，其或者是原發(fā)性疾病或者是繼發(fā)于個體的另ー病況。心律失常的各種原因的實例包括急性感染(特別是那些影響肺的急性感染)、肺栓塞、低血壓、中風(fēng)、血液缺氧癥或者能夠加速心肌缺血并且從而引起心律失常的貧血癥。心律失常會惡化循環(huán)障礙并且從而建立起錯誤的、能使自身永久存在的循環(huán)。
[0254]我們相信，根據(jù)本發(fā)明的治療將增加用于發(fā)展心律失常的閾值，從而防止心律失常的發(fā)展。通過直接地對輸送系統(tǒng)作用或者間接地通過對引導(dǎo)或者是心律失常的原因的病況進(jìn)行作用可以實現(xiàn)所述效果。
[0255]能夠根據(jù)本發(fā)明方法減輕的綜合癥或者心律失常可以是原發(fā)性的或者是繼發(fā)性的，可以選自:室性快速性心律失常或上室性快速性心律失常、房室傳導(dǎo)阻滯、竇房結(jié)疾病、Wolff-Parkinson-White綜合癥、Len6gres疾病、Lev疾病以及任何涉及心房和心室之間不正常心肌連接的綜合癥。
[0256]g在抑制心律失常的抗心律失常治療法常常伴隨有產(chǎn)生新的心律失常的危險。心律失?？梢宰鳛闅w因于超劑量藥物毒性反應(yīng)發(fā)生。然而，尤其是在用被稱為IA類藥物的藥物組治療的過程中，心律失?？梢宰鳛榉莿┝恳蕾嚨母弊饔?特異質(zhì)反應(yīng)-在藥物濃度在有效藥濃度范圍內(nèi)的情況下發(fā)展)發(fā)生。根據(jù)另ー實施方式，病況可以是由ー種或多種抗心律失常藥物引起的，包括洋地黃、奎尼丁、丙吡胺、腺苷、阿普林定、氟卡尼、胺碘酮、索他洛爾、美西律、(6-阻滯劑、維拉帕米。
[0257]可以預(yù)期用根據(jù)本發(fā)明的a -MSH類似物進(jìn)行治療將降低發(fā)展心律失常的危險，心律失常是由于用其他抗心律失常藥物的伴生治療而產(chǎn)生的。
[0258]在本發(fā)明的另一方面，病況可以是特征為ー個或多個通過心電圖掃描法(ECG)測量的異常。ECG上的異?？梢陨婕斑x自ー個或多個選自如下構(gòu)型改變的變化:P波、ST片段、T波、QRS復(fù)合波、Q波、A波和U波。
[0259]可以通過給予有效劑量的根據(jù)本發(fā)明的肽減輕的其他病況是器官(例如心臟)電解質(zhì)混亂以及自身混亂，包括一種離子對另ー種離子的相對濃度的異常。該病況包括ー種或多種電解質(zhì)的異常血清濃度，所述電解質(zhì)選自如下所組成的組中:鉀、鈣、鈉和鎂。
[0260]根據(jù)本發(fā)明，可以被影響的組織包括存在于器官的ー個或多個細(xì)胞類型，可以選自:上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T-細(xì)胞、B-細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。尤其是，T-細(xì)胞、B-細(xì)胞和肥大細(xì)胞在這一方面是有特別意義的。
[0261]本發(fā)明的優(yōu)選的方面涉及預(yù)防或治療，其中預(yù)防性地給予根據(jù)本發(fā)明的a-MSH類似物的劑量用于防止病況或者病況的任何征兆的發(fā)展。
[0262]預(yù)防的或預(yù)防性的治療可以是在例如手術(shù)過程中正在進(jìn)行的治療或者是用于防止患冠狀動脈狹窄的患者的心臟病發(fā)作。預(yù)防治療還可以用于短時期。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于緊急情況評價具體的治療程序。在優(yōu)選的實施方式，所述治療或預(yù)防能夠減小局部缺血冠狀動脈的梗塞面積。與未治療的個體相比，這種梗塞面積可以減小20%，例如至少30%，優(yōu)選地至少50%。
[0263]因此，預(yù)防性地給予根據(jù)本發(fā)明的a -MSH類似物的劑量用于防止病況或者病況的任何征兆的建立。
[0264]根據(jù)本發(fā)明的a -MSH類似物的劑量可以作為單劑量、規(guī)則的或者連續(xù)的給藥，或者作為順序的給藥而進(jìn)行給予。
[0265]給藥可以是全身性給藥、局部給藥包括藥物靶系統(tǒng)的應(yīng)用、導(dǎo)管和植入、ロ服給藥、腸胃外給藥，例如皮下給藥、肌內(nèi)注射、靜脈注射、腹腔注射、鞘內(nèi)注射、肺部給藥例如通過吸入、外用、粘膜給藥、經(jīng)皮給藥。
[0266]因此，給藥包括全身性給藥；注射到組織或者到體腔內(nèi)包括關(guān)節(jié)；植入到組織或者到體腔內(nèi)；外用到皮膚或者到任何胃腸表面，或者到粘膜表面包括體腔村里。
[0267]因為從上面可以很明顯地看出，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備藥物的用途，所述藥物通過任何一種相關(guān)的給藥途徑用于治療或預(yù)防本文所公開的任何ー種病況。
[0268]藥物制劑和組合物
[0269]本發(fā)明還涉及包括一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽的藥物組合物。所述藥物組合物還可以包括ー種或多種藥物載體。進(jìn)ー步，所述藥物組合物還可以包括一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑。
[0270]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以是，但不限于腸胃外組合物、ロ服組合物、外用組合物、經(jīng)粘膜組合物或者經(jīng)皮組合物。
[0271]在以下實施例中，給出了含有一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽的合適的組合物。對于給個體(動物或人)給藥，物質(zhì)優(yōu)選制成藥物組合物，其含有所述物質(zhì)以及任選的ー種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑。
[0272]組合物可以以例如固態(tài)、半固態(tài)或流體組合物的形式存在比如，例如但不限于，可生物吸收片、浸濕物、敷料、水凝膠敷料、水狀膠體敷料、薄膜、泡沫、薄片、繃帶、膏藥、輸送裝置、植入物、粉劑、顆粒、小顆粒、膠囊、瓊脂糖或脫こ酰殼多糖珠、片劑、丸剤、小球、微膠囊、微球、納米顆粒、噴灑劑、氣霧劑、吸入裝置、凝膠、水凝膠、糊劑、軟膏、乳膏、皂、栓劑、維吉托瑞(vagitorie)牙膏、溶液、分散液、懸浮液、乳狀液、混合物、洗液、漱ロ液、洗發(fā)精、灌腸劑、試劑盒，所述試劑盒包含例如兩個分開的容器，第一個容器含有根據(jù)本發(fā)明的肽，第二個容器含有適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)以備在使用前加入到第一個容器以獲得待用的組合物；以及其他一些合適的形式，例如植入物或植入物涂層或一種適合于植入和移植條件下使用的形式。
[0273]組合物可以通過常規(guī)的制藥方法進(jìn)行制備，參見例如"Remington:藥劑學(xué)的科學(xué)和實踐 U'he science and practice of pharmacy；弟二版? Mack Publishing, EastonPA, 2000ISBN0-912734-04-3” 和〃制藥技術(shù)百科全書(Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology) 〃，Swarbrick, J.&J.C 編輯.Boylan,Marcel Dekker, Inc., NewYork,1988ISBN0-8247-2800-9.[0274]含有活性物質(zhì)的藥物組合物用作藥物輸送系統(tǒng)。在本文中術(shù)語“藥物輸送系統(tǒng)”表示一種藥物組合物(藥物制劑或劑型)，其在給藥時代表對人體或動物體的活性物質(zhì)。因此，術(shù)語“藥物輸送系統(tǒng)”包含普通的藥物組合物例如乳膏、軟膏、液體、粉末、片劑等，以及更復(fù)雜的劑型例如噴霧劑、膏藥、繃帶、敷料、裝置等。
[0275]如上所述，用于根據(jù)本發(fā)明的用途的藥物組合物可以包括藥學(xué)或美容學(xué)可接受的賦形劑。
[0276]在用于根據(jù)本發(fā)明的用途的組合物中，藥學(xué)可接受的賦形劑的選擇及其最佳濃度一般不能預(yù)知，需要基于其實驗測定進(jìn)行確定。一種藥學(xué)可接受的賦形劑是否適合用于藥物組合物中一般還依賴于所選擇的劑型的類型。然而，制藥領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠在
Remmgton:The science and practice oi pharmacy 果二te.Mack Publishing, EastonPA, 2000ISBN0-912734-04-3” 找到指導(dǎo)。
[0277]藥學(xué)可接受的賦形劑是對組合物將要給予的個體基本無害的物質(zhì)。這種賦形劑通常要滿足藥品管理部門頒布的要求。官方藥典例如英國藥典、美國藥典和歐洲藥典都規(guī)定了公知的藥學(xué)可接受的賦形劑的標(biāo)準(zhǔn)。
[0278]以下給出了用于根據(jù)本發(fā)明的用途的相關(guān)的藥物組合物的綜述。該綜述是基于特定的給藥途徑。然而，應(yīng)理解的是，在那些藥學(xué)可接受的賦形劑可以不同的劑型或組合使用的情形下，特定的藥學(xué)可接受的賦形劑的應(yīng)用并不限于特定劑型或該賦形劑的特定功能。
[0279]腸胃外組合物
[0280]對于全身性應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以含有常規(guī)的無毒性的藥學(xué)可接受的載體和賦形劑,包括微球和脂質(zhì)體。`
[0281]根據(jù)本發(fā)明使用的組合物包括所有形式的固態(tài)、半固態(tài)和流體組合物。特定相關(guān)的組合物是，例如溶液、懸浮夜、乳液、凝膠、植入片以及植入物。
[0282]藥學(xué)可接受的賦形劑可以包括，溶剤、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、鰲合劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、懸浮劑、膠凝劑、稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑以及潤濕劑。不同試劑的
實例參考如下。
[0283]局部組合物、經(jīng)粘膜組合物以及經(jīng)皮組合物
[0284]對于對粘膜或皮膚的應(yīng)用。用于根據(jù)本發(fā)明的用途的組合物可以含有通常無毒的藥學(xué)可接受的載體和賦形劑，包括微球和脂質(zhì)體。
[0285]用于根據(jù)本發(fā)明的用途的組合物包括所有形式的固態(tài)、半固態(tài)和流體組合物。特定相關(guān)的組合物是，例如，糊劑、軟膏、親水軟膏、乳膏、凝膠、水凝膠、溶液、乳液、懸浮夜、洗劑、擦劑、里索瑞布賴特(resoriblet)、栓劑、灌腸劑、陰道栓劑、模制陰道栓劑、陰道膠囊、陰道片劑、洗發(fā)劑、者哩、皂劑、粘貼物、噴霧劑、粉劑、薄膜、泡沫、墊料、海綿(例如膠原海綿)、墊、敷料(如，例如吸收性傷ロ敷料)、浸濕劑、繃帶、膏藥以及經(jīng)皮輸送系統(tǒng)。
[0286]藥學(xué)可接受的賦形劑可以包括溶剤、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、鰲合劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、乳化剤、懸浮劑、膠凝劑、軟膏基質(zhì)、栓劑基質(zhì)、浸潤增強(qiáng)劑、香料、皮膚保護(hù)劑、稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑以及潤濕劑。不同試劑的實例參考如下。
[0287]ロ服組合物[0288]對于對粘膜或皮膚的應(yīng)用。用于根據(jù)本發(fā)明的用途的組合物可以含有通常無毒的藥學(xué)可接受的載體和賦形劑，包括微球和脂質(zhì)體。
[0289]用于根據(jù)本發(fā)明的用途的組合物包括所有類型的固態(tài)、半固態(tài)和液態(tài)組合物。特定相關(guān)的組合物是例如溶液、懸浮液、乳液、裸片、控釋片、腸溶片、ロ分散片、泡騰片、咀嚼片、軟膠囊、硬膠囊、控釋膠囊、腸溶膠囊、裸顆粒、泡騰顆粒、用于制備ロ服使用的液體的顆粒、包膜顆粒、腸溶顆粒、控釋顆粒、用于ロ服給藥的粉劑以及用于制備ロ服使用的液體的粉劑。
[0290]藥學(xué)可接受的賦形劑可以包括溶剤、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、鰲合劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、懸浮劑、膠凝劑、稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑以及潤濕劑。不同試劑的實例參考如下。
[0291]各種試劑的實例
[0292]溶劑的實例是但不限于水、酒精、植物油或魚油，(例如，食用油，如杏仁油、蓖麻油、可可油、椰子油、玉米油、棉籽油、亞麻子油、橄欖油、棕櫚油、花生油、罌粟籽油、菜籽油、芝麻油、大豆油、向日葵油、以及茶子油)、礦物油、脂肪油、液體石蠟、聚乙二醇、丙二醇、甘油、液體聚烷基硅氧烷，和其混合物。
[0293]緩沖劑的實例是但不限于檸檬酸、こ酸、酒石酸、乳酸、磷酸、二こ胺等。
[0294]用于組合物的防腐劑的實例是但不限于對羥基苯甲酸酯類(例如對羥基苯甲酸甲酷、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酷、對羥基苯甲酸丁酷、對羥基苯甲酸異丁酯、對羥基苯甲酸異丙酷)、山梨酸鉀、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯氧こ醇、溴硝丙二醇、布洛尼道克斯(bronidox)、MDM海因(MDM hydantoin)、碘代丙炔基丁基氨基甲酸酯、こ二胺四こ酸(EDTA)、苯扎氯銨和苯甲醇，或者防腐劑混合物。
[0295]濕潤劑的實例是但不限 于甘油、丙二醇、山梨醇、乳酸、脲，和相應(yīng)的混合物。
[0296]鰲合劑的實例是但不限于EDTA鈉鹽和檸檬酸。
[0297]抗氧化劑的實例是但不限于丁基羥基茴香醚(BHA)、抗壞血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、半胱氨酸，以及其混合物。
[0298]乳化劑的實例是但不限于天然存在的樹膠，例如阿拉伯樹膠或黃芪膠，天然存在磷脂例如大豆卵磷脂；山梨糖醇酐單油酸酯衍生物；羊毛脂；羊毛脂醇；山梨糖酯；單甘油酷；脂肪醇；脂肪酸酷(例如脂肪酸的甘油三酸酷)；及其混合物。
[0299]懸浮劑的實例是但不限于纖維素以及纖維素衍生物，例如羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素，角叉菜膠、阿拉伯樹膠、阿拉伯膠、黃芪膠，以及它們的混合物。
[0300]凝膠基質(zhì)以及粘性增強(qiáng)劑的實例是但不限于液體石蠟、聚乙烯、脂肪油、膠體二氧化硅或膠體鋁、鋅皂、甘油、丙二醇、黃芪膠、羧乙烯基聚合物、硅酸鎂鋁、聚羧乙烯
(Carbopoi? )、親水性聚合物，例如淀粉或纖維素衍生物例如羧甲基纖維素、羥乙基纖維
素，以及其他纖維素衍生物，水溶脹性水解膠體、角叉菜膠、透明質(zhì)酸鹽(例如任選地含有氯化鈉的透明質(zhì)酸凝膠)，和海藻酸鹽(包括丙二醇海藻酸鹽)。
[0301]軟膏基質(zhì)的實例是但不限于蜂蠟、石蠟、鯨蠟醇、鯨蠟醇十六酸酷、植物油、失水山梨糖醇脂肪酸酷(斯潘Span)、聚乙二醇、以及失水山梨糖醇脂肪酸酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚環(huán)氧乙烷失水山梨醇單油酸酯(吐溫Tween)。[0302]疏水性軟膏基質(zhì)的實例是但不限于石蠟、植物油、動物脂肪、合成甘油酷、蠟、羊毛脂以及液體聚烷基硅氧烷。
[0303]親水性軟膏基質(zhì)的實例是但不限于固態(tài)macrogols (聚乙二醇)。
[0304]粉末組分的實例是但不限于海藻酸鹽、膠原、乳糖，當(dāng)應(yīng)用到傷ロ時能夠形成凝膠的粉末(吸收液體/傷ロ滲出液)。
[0305]稀釋劑以及崩解劑的實例是但不限于乳糖、蔗糖、淀粉-糖類復(fù)合物(emdex)、磷酸鈣、碳酸鈣、硫酸鈣、甘露醇、淀粉以及微晶纖維素。
[0306]粘合劑的實例是但不限于蔗糖、山梨醇、阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、明膠、淀粉、纖維素、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇(Polyetyleneglycol)o
[0307]潤濕劑的實例是但不限于十二烷基硫酸鈉和聚山梨酯80。
[0308]潤滑劑的實例是但不限于滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、氧化硅、棕櫚酰硬脂酰甘油酯(precirol)和聚乙二醇。
[0309]包膜劑的實例是但不限于羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、こ基纖維素和聚甲基丙烯酸酷。
[0310]栓劑基質(zhì)的實例是但不限于可可豆油、混合脂肪酸甘油酯以及聚乙二醇。
[0311]a-MSH類似物可以以藥劑重量的0.001-99%的量存在于藥劑中，優(yōu)選為0.01-75%，更優(yōu)選為0.1_20%，尤其是1-15%例如ト10%。
[0312]劑量依賴于進(jìn)行治療的病`況。各種藥物可以在本領(lǐng)域熟知的劑量下使用?？梢灶A(yù)期的是，一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽的劑量在Ing-lOOmg/kg體重的范圍，優(yōu)選為I U g-10mg/kg體重,更優(yōu)選為10 u g-lmg/kg體重,例如50-500 u g/kg體重。
[0313]在另一方面，本發(fā)明涉及如上所述的藥物組合物，其包括一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽以及任選藥學(xué)可接受的載體。
[0314]可以通過使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)和常規(guī)的藥學(xué)載體來制備根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。此外，藥物組合物可以是適于本文所描述的任一用途的任意形式。
[0315]本文記載并且要求保護(hù)的發(fā)明并不限于本文所公開的【具體實施方式】的范圍，因為這些實施方式是用來說明本發(fā)明的幾個方面的。任何等同實施方式都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，除了本文已經(jīng)顯示和描述的那些修改之外，從上述說明書本發(fā)明的各種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯而易見。這些修改也落入后附的權(quán)利要求的范圍。
[0316]本文引用了各種參考文獻(xiàn)，將其公開的內(nèi)容以它們整體的方式并入本文作為參考。
[0317]貫穿本說明書，單詞“包括”，或其變形例如“包括”或“包含”應(yīng)當(dāng)理解為指含有指出的元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組，但并不排除任何其他的元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組。
[0318]關(guān)于本發(fā)明的各種方面的上述說明書以及這些方面的【具體實施方式】，應(yīng)該理解的是，上述描述或提到的、與本發(fā)明的ー個方面和/或ー個方面的一個實施方式相關(guān)的任一特征和特性通過類推也適于本發(fā)明所描述的任何或者所有的其他方面和/或?qū)嵤┓绞健?br> [0319]以下將通過以下無限制作用的附圖和實施例來描述本發(fā)明。
[0320]實施例[0321]以下概括描述了用于試驗本發(fā)明的肽的方法。試驗過的肽的結(jié)果在實施例1-7中給出。方法的目標(biāo)是試驗本發(fā)明的肽用于抗炎效果以及抑制或防止作為局部缺血、炎癥或藥物的毒性作用的結(jié)果而發(fā)生的細(xì)胞/組織/器官損傷或破壞的能力。
[0322]炎癥反應(yīng)或者慢性炎癥的惡化的特征是細(xì)胞源性介質(zhì)(例如腫瘤壞死因子-a(TNF-a )、白介素(IL-1 P、IL-8)、氧化氮(NO)和氧自由基)的生產(chǎn)，這最終會誘導(dǎo)出分布廣泛的內(nèi)皮損傷，所述內(nèi)皮損傷具有全身脈管的動脈張カ損失、提高的毛細(xì)管浸潤性、持續(xù)的低血壓以及器官功能失調(diào)，其在肺中伴隨有在肺泡腔內(nèi)的白細(xì)胞累積(包括嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)。通過誘導(dǎo)包括TNF-a的炎癥介質(zhì)，從感染物釋放出來的脂多糖(LPS)在對感染的炎癥反應(yīng)方面起重要作用。因此，具有抑制TNF-a生產(chǎn)能力的治療方法相信具有顯著的抗炎效果。發(fā)明人在許多方案中使用LPS刺激來產(chǎn)生炎癥反應(yīng)(參見實驗方案1-3)，用于根據(jù)本發(fā)明的肽的抗炎效果的主要標(biāo)記是抑制TNF-a生產(chǎn)的能力。
[0323]通過降低的/完全的動脈血供給阻止誘導(dǎo)的局部缺血誘導(dǎo)許多組織反應(yīng)，包括嗜中性粒細(xì)胞累積、其他炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡。鑒定能夠抑制或預(yù)防(完全地或部分地)作為局部缺血的結(jié)果而發(fā)生的多數(shù)細(xì)胞/組織/器官損傷或破壞的化合物是非常有益的。發(fā)明人使用兩個ー過性局部缺血模型:1)大鼠的心肌缺血再灌注模型，其模擬了后面是血供給恢復(fù)的急性心肌梗塞的發(fā)展，因為它是通過纖維蛋白溶解療法或者冠狀血管成形術(shù)獲得的(實驗方案4);2)雙向腎動脈阻塞，其誘導(dǎo)急性腎衰竭(ARF)，其類似于在進(jìn)行大外科介入治療的患者中所見到的、由腎血液供給的瞬時減小誘導(dǎo)的ARF(由于腹主動脈瘤實施例能夠進(jìn)行手術(shù)介入治療)(實驗方案5)。
[0324]中毒性腎損害是順鉬治療的公知的副作用。盡管限制腎毒性的劑量不一定仍然影響大多數(shù)患者，但是治療過程中觀察到腎小球浸潤率的明顯降低。順鉬的腎毒性可以看作對外髓層(尤其是近端小管的S3片段)和Henle環(huán)的升支粗段的腎單位直接的細(xì)胞毒素?fù)p傷。因此，順鉬治療常常導(dǎo)致腎小管的重吸收缺陷，包括損壞的稀釋尿的能力。在大約50%的以順鉬治療過的患者中觀察到低血鎂癥，其很可能是由于腎的鎂(Mg)重吸收的缺陷。最近的研究表明補(bǔ)充Mg是保護(hù)免于環(huán)孢菌素A的腎毒性作用的重要因素，并且最近已指出了Mg損失和順鉬誘導(dǎo)的腎中毒之間的可能的關(guān)系。因此，g在防止低血鎂癥的治療具有有益的效果，不僅為了降低補(bǔ)充Mg的需要而且為了降低順鉬的腎毒性。根據(jù)本發(fā)明的肽對于順鉬誘導(dǎo)的腎毒性在實驗方案6中檢驗。
[0325]方法與材料
[0326]在下面描述的方法中本發(fā)明的肽是實驗化合物。
[0327]實驗方案I
[0328]抑制體外由人白細(xì)胞產(chǎn)生的LPS誘導(dǎo)的TNF-a的產(chǎn)生
[0329]在含有EDTA的真空血液收集管(vacutainer tube)中收集20mL人血。使用安瑪西亞說明書(Amersham，s Instruction)71-7167-00AD, 2002-06 的菲科帕克 +(Ficoll-PaquePlus)來分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。使用臺盼蘭溶液(西格瑪(Sigma))對PBMC計數(shù)，并且以5X IO5細(xì)胞/mL的濃度將PBMC溫育在RPMI1640 (艾普力化學(xué)產(chǎn)品(Applichem))中，RPMI1640添加有IOmM輕乙基哌嗪こ磺酸(Hepes) (Sigma)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、0.1%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)和50U/50 u g/mL青霉素/鏈霉素(Sigma)。在5%C02、95%空氣的氣氛中，在37°C下，將分離出來的PBMC溫育在具有培養(yǎng)基、IOng LPS/mL (Sigma)和實驗化合物的24孔平底板(康寧公司(Corning Incorporated))中。18小時后,將樣品離心，使用來自人類百垂克(Human Biotrak)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)系統(tǒng)(Amersham)的腫瘤壞死因子 a (Tumour Necrosis Factor Alpha) [ (h) TNF- a ]檢測上清液的 TNF_a。
[0330] 每個供體采用如下的方式將樣品溫育:
[0331 ] PBMC 在 RPMI (時間對照)
[0332]PBMC 在 IOng LPS/mL (載體)
[0333]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT17M a -MSH 或 a -MSH 類似物
[0334]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT15M a -MSH 或 a -MSH 類似物
[0335]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT13M a -MSH 或 a -MSH 類似物
[0336]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT11M a -MSH 或 a -MSH 類似物
[0337]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT9M a -MSH 或 a -MSH 類似物
[0338]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT7M a -MSH 或 a -MSH 類似物
[0339]將所有的樣品從初始儲液稀釋到1.4X 10_4M和1.8 X 10_3M之間。
[0340]將所有的溶液在BSA包被過的小瓶中處理以保護(hù)避免化合物鍵合到小瓶的表面上。
[0341]數(shù)據(jù)以平均數(shù)土SE表示。實驗`化合物對LPS誘導(dǎo)的TNF-a釋放的影響表示為LPS-載體組中TNF-a累積的百分?jǐn)?shù)。用學(xué)生不成對t_檢驗分析所有的對比。在0.05的置信水平(P)下認(rèn)為差異是顯著的。
[0342]實驗方案2
[0343]抑制大鼠體內(nèi)的LPS誘導(dǎo)的TNF-a生產(chǎn)
[0344]實驗動物:雌性Wistar 大鼠(220_240g)來自查理河(Charles River), Sulzfeld,德國，并使其居住在溫度(22-24°C)以及濕度(40-70%)控制的、具有12小時明-暗循環(huán)(從6:00A.M.到6:00P.M.進(jìn)行光照)的房間內(nèi)。使大鼠保持標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類飼料(具有140mmol/kg 鈉、275mmol/kg 鉀和 23% 蛋白質(zhì)，阿爾托敏國際公司(Altromin International), Lage,德國)，并且具有接近水源的自由。
[0345]動物準(zhǔn)備:在異氟烷-氧化亞氮麻醉的狀態(tài)下，分別經(jīng)由股動脈和靜脈，將耐久的醫(yī)用聚乙烯(Tygon)導(dǎo)管植入到腹主動脈和下腔靜脈中。在植入之后，將動物単獨圈養(yǎng)
7-10天直到實驗日。
[0346]實驗程序:在實驗之前，通過訓(xùn)練所有大鼠兩個周期(毎次兩個小吋)，使它們適應(yīng)用于實驗的限制籠。在實驗日，將動物轉(zhuǎn)移到限制籠中，并且開始進(jìn)行靜脈注射含有150mM葡萄糖的載體溶液。整個實驗過程中注射速率是0.5ml/h。在短暫的適應(yīng)周期之后，開始注射脂多糖(LPS)。以4mg/kg體重的劑量給予LPS(大腸桿菌血清型0127B8，L3129, Sigma, St.Louis, USA)，靜脈注射超過I小時進(jìn)行輸送。在LPS注射開始之后的60、90和120分鐘取
0.3ml動脈血樣品，并且立即用肝素化的來自正常供體大鼠的血替代。
[0347]實驗組:
[0348]除了 LPS注射外所有大鼠用快速注射(bolus injection)處理:
[0349]載體(0.5mL等滲鹽水)；
[0350]處于如下劑量之一的a-MSH:50 ii g/kg體重；200 ii g/kg體重或1000 ii g/kg體重；[0351]處于如下劑量之一的實驗化合物:50 U g/kg體重；200 u g/kg體重或1000 U g/kg體重。[0352]血漿TNF- a的測定:在具有0.5mM EDTA, pH7.4，和20xl06IU/ml抑肽酶的預(yù)冷實驗管中收集血液樣品。經(jīng)過4°C離心之后，將血漿樣品轉(zhuǎn)移到預(yù)冷實驗管中并在-20°C貯藏用于后面的TNF-a測定。通過ELISA (Biotrak, Amersham,英國)測定血衆(zhòng)的TNF-a。
[0353]統(tǒng)計分析:結(jié)果以平均數(shù)土SE表示。使用用于重復(fù)測量的兩因素方差分析(two-way AN0VA)檢驗組間差異。在p < 0.05的情況下,通過具有置信水平的邦費羅尼(Bonferroni)校正的不成對t_檢驗,來評價相應(yīng)期之間的差異。
[0354]實驗方案3
[0355]抑制大鼠吸入LPS之后嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤
[0356]使用來自M&B A/S, DK_8680Ry，丹麥的雄性Sprague-Dawley大鼠用于所有實驗。將大鼠關(guān)在3型標(biāo)準(zhǔn)籠中，使其居住在溫度(22-24°C)以及濕度(40-70%)控制的、具有12小時明-暗循環(huán)(從6:00A.M.到6:00P.M.進(jìn)行光照)的房間內(nèi)。飼料是高壓釜處理過的Altrominl324 特殊配方，該配方由 Altromin Denmark (Chr.Pedersen A/S, 4100Ringsted,丹麥)生產(chǎn)。無限制地給予飼料和水。
[0357]馴化之后將大鼠隨機(jī)分派到實驗組，在LPS誘導(dǎo)開始時靜脈注射劑量給予實驗化合物以及LPS誘導(dǎo)之后8小時再次靜脈注射劑量給予實驗化合物。
[0358]用0.1ml芬太尼/多美康/100g將組3的大鼠麻酔，并且靜脈注射劑量給予實驗化合物。在劑量給藥之后立即將它們放置到呼吸室中，其中使它們噴霧LPS溶液。LPS的濃度為lmg/ml。劑量給藥時間為15分鐘。在以實驗物質(zhì)劑量給藥之后24小時處死大鼠。最后用C02/02處死大鼠。
[0359]通過注入以及抽出6X2.5ml PBS到右肺中進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。以在去掉胸骨和肋骨之后使肺仍然保持在胸中的狀態(tài)進(jìn)行灌洗。在該過程中將到左肺的連接管打結(jié)。在4°C、1000rpm下離心支氣管肺泡灌洗液(BALF) 10分鐘。去掉上清液后將細(xì)胞重懸浮在
0.5ml PBS中并進(jìn)行總細(xì)胞計數(shù)。對來自姆一個大鼠的、用姬姆薩(May-Griiwald Giemsa)染料染色過的BALF，制備兩個涂片。對來自每ー個大鼠的BALF進(jìn)行總細(xì)胞計數(shù)和白細(xì)胞分類計數(shù)。
[0360]實驗組:
[0361 ] 載體(0.5mL等滲鹽水)；
[0362]a -MSH:200 U g/kg 體重；
[0363]a -MSH 類似物:200 U g/kg 體重。
[0364]最后用載體處理沒有吸入LPS的時間對照組。
[0365]統(tǒng)計:
[0366]數(shù)據(jù)以平均數(shù)土SE表示。通過后面是費舍最小顯著性差異法的單因素變量分析進(jìn)行組間對比。在0.05水平認(rèn)為差異是顯著的。
[0367]實驗方案4
[0368]抑制豬體內(nèi)的LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的釋放和肺高血壓
[0369]將雌性長白豬(Landrace pig)(~30kg)禁食過夜但允許自由接近水源。然后肌肉注射氯胺酮(10mg/kg)和咪唑達(dá)侖(0.25mg/kg)對豬進(jìn)行術(shù)前用藥。靜脈注射氯胺酮(5mg/kg)引起麻酔。將豬從口腔插入管子，并且用連續(xù)的靜脈注射芬太尼(eoyg/kg/h)和咪唑達(dá)侖(6mg/kg/h)來保持麻酔。以5cm H2O的呼氣末正壓用體積控制的通風(fēng)管(Servo900通風(fēng)機(jī)(ventilator);西門子(Siemens) Elema, Solna,瑞典)對動物通氣。呼吸容量保持在10-15ml/kg,并且調(diào)整呼吸速率(20-25次/min)以保持血碳酸不變(動脈二氧化碳[PaCO2]在34-45mmHg)。用混合空氣的氧氣進(jìn)行通氣_在使動脈氧壓カ(PaO2)高于105mmHg。將一個動脈鞘和兩個靜脈鞘設(shè)置在頸動脈和相應(yīng)靜脈中，所述靜脈用于灌注、通過充滿流體的導(dǎo)管測量血壓、取血、和用于引入導(dǎo)管。
[0370]經(jīng)由右上腔靜脈在肺動脈中插入肺動脈漂浮導(dǎo)管(Swan-Ganz)(愛德華生物公司(Edwards Lifescience Corp.) , Irvine,カロ利福尼亞州)。因為它是通過心臟的右側(cè)進(jìn)入到肺動脈中的，可以通過觀察監(jiān)測器上的特征壓力曲線以及通過X-射線來確定氣囊導(dǎo)管的位置。在左頸動脈插入另一導(dǎo)管(5French;St.Jude Medical Company, St.Paul,明尼蘇達(dá)州)用于連續(xù)血壓監(jiān)測以及血液取樣。插入尿?qū)Ч苡糜谑占?。?dāng)評估心臟表現(xiàn)時，將臨時起博導(dǎo)管通過靜脈鞘插入到右心房(X-射線指導(dǎo))用來使心率標(biāo)準(zhǔn)化。
[0371]血液動力學(xué)監(jiān)測:進(jìn)行連續(xù)觀測動脈血壓、心率(從心電圖)以及肺動脈壓力(PAP)0
[0372]脂多糖注入:在每ー實驗之前120min將大腸桿菌脂多糖內(nèi)毒素(E.coli026:_6, Bacto脂多糖;迪夫可實驗室(Difco Laboratories), Detroit,密歇根州)溶解在鹽水中以溶解任何沉淀物。經(jīng)過一段穩(wěn)定時間后，在基線為2.g/kg/h的速度并且在30分鐘內(nèi)逐步增加到15y g/kg/h的條件下開始注射脂多糖。之后，在150分鐘內(nèi)將注射速度保持在2.5 u g/kg/h，此后停止注射。
[0373]介入組:在LPS注射開始前立即給予對照組與介入組相等體積的載體。將a -MSH類似物(劑量為200 y g/kg)作為單靜脈快速注射給予到介入組。
[0374]細(xì)胞因子:通過根據(jù)產(chǎn)品說明書使用商品酶聯(lián)免疫分析，使用從EDTA穩(wěn)定了的血獲得的新鮮冷凍血漿樣品來測量 TNF-a，
[0375]統(tǒng)計:數(shù)據(jù)以平均數(shù)土SE表示。通過后面是費舍最小顯著性差異法的單因素變量分析進(jìn)行組間對比。在0.05水平認(rèn)為差異是顯著的。
[0376]實驗方案5
[0377]抑制通過阻塞大鼠左前降支冠狀動脈60min誘導(dǎo)的心肌梗塞面積
[0378]隔離喂養(yǎng)的以及無特定病原體的雌性Wistar大鼠(250g)來自CharlesRiver, Hannover,德國。使動物居住在溫度(22_24°C )以及濕度(40-70%)控制的、具有12小時明-暗循環(huán)(從6:00A.M.到6:00P.M.進(jìn)行光照)的房間內(nèi)。所有動物允許自由接觸自來水和丸狀大鼠飼料，其大約含有140mmol/kg鈉、275mmol/kg鉀和23%蛋白(Altromincatalogue n0.1310, Altromin International, Lage,德國)。
[0379]經(jīng)由股動脈和靜脈，將耐久的醫(yī)用Tygon導(dǎo)管植入到下腔靜脈和腹主動脈中。一周后在呼吸腔內(nèi)用含有4%異氟烷的O2使大鼠麻酔。在插入氣管導(dǎo)管之后，使用如下HugoBasile Rodent通氣機(jī)用含有1.0%異氟烷的O2對動物進(jìn)行人工通氣。呼吸容量是8_10ml/kg體重，呼吸速率是保持動脈pH在7.35-7.45之間。手術(shù)過程中，將動物放置在可保持直腸溫度在37-38°C的加熱的手術(shù)臺上。使用Hugo Sachs ECG儀測量標(biāo)準(zhǔn)ECG (第二導(dǎo)線)，并且在PowerLab上在4，OOOHz的線上收集標(biāo)準(zhǔn)ECG。在胸骨旁切開以及打開心包膜之后，目視固定左前降支冠狀動脈(LAD)。圍繞LAD四周在肺動脈干和左耳廓的右下端之間設(shè)置具有允許縫線再開ロ的咬合器的無害6-0絲線。10分鐘后，使左前降支冠狀動脈(LAD)咬合。通過ECG的變化(ST-片段上升并且R-波放大增加)以及MAP的下降來確認(rèn)咬合成功。60分鐘后通過打開咬合器進(jìn)行再灌注。對照大鼠進(jìn)行假手木。
[0380]將大鼠進(jìn)行以下靜脈注射處理的ー種:
[0381]載體:0.5mll50mM NaCl。
[0382]a -MSH:溶于 0.5mll50mM NaCl 的 200 ii g 或 1000 Uga-促黑素 /kg 體重。
[0383]實驗化合物:溶于0.5mll50mM NaCl的200 ii g或1000 U g實驗化合物/kg體重。
[0384]在再灌注之前5分鐘給予上述處理。
[0385]如下確定局部缺血以及壞死的心肌的大小
[0386]在局部缺血/再灌注之后使大鼠保持在麻醉狀態(tài)，在三小時再灌注后進(jìn)行LAD的重咬合。在這個時期，連續(xù)測量ECG和MAP。然后靜脈注射伊文思藍(lán)染料用來確定局部缺血面積的大小。將心臟切除并將其切成水平分層用來確定局部缺血面積的大小和將缺血的心肌從壞死的心肌中分開出來。將局部缺血的面積分離，將其在37°C下在0.5%2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液中溫育10分鐘。然后使用計算機(jī)成像程序測定壞死的組織的大小。為了評價對充血性心臟衰竭的醫(yī)學(xué)治療效果，將另一方案的動物術(shù)后用丁丙諾啡處理，然后返回到籠子中用于兩周后測量左室舒張末壓(LVEDP)。使用經(jīng)由右頸動脈插入到左心室的2F微頂導(dǎo)管測量LVEDP。調(diào)節(jié)異氟烷濃度使平均動脈壓力(MAP)穩(wěn)定在85-90mmHg。
[0387]統(tǒng)計:`
[0388]數(shù)據(jù)以平均數(shù)土SE表示。用學(xué)生成對t檢驗分析組內(nèi)對比。通過后面是費舍最小顯著性差異法的單因素變量分析進(jìn)行組間對比。在0.05水平認(rèn)為差異是顯著的。
[0389]實驗方案6
[0390]抑制通過雙向堵塞大鼠腎動脈40分鐘誘導(dǎo)的腎衰竭
[0391]隔離喂養(yǎng)以及無特定病原體的雌性Wistar大鼠(250g)來自CharlesRiver, Hannover,德國。使動物居住在溫度(22_24°C )以及濕度(40-70%)控制的、具有12小時明-暗循環(huán)(從6:00A.M.到6:00P.M.進(jìn)行光照)的房間內(nèi)。所有動物允許自由接觸自來水和丸狀大鼠飼料，其大約含有140mmol/kg鈉、275mmol/kg鉀和23%蛋白(Altromincatalogue n0.1310, Altromin International, Lage,德國)。
[0392]將預(yù)先植入有長期腎導(dǎo)管的大鼠放置于代謝籠中，經(jīng)過代謝籠的兩天適應(yīng)期之后，通過堵塞腎動脈的兩端60min誘導(dǎo)實驗性ARF。在手術(shù)過程中，用異氟烷-一氧化氮麻醉大鼠，將其放置在加熱的手術(shù)臺上以保持直腸溫度在37°C。通過肋腹切開使兩個腎暴露，通過將其從腎周圍脂肪上切除使其松動，然后從靜脈上輕輕地切下一小部分腎動脈。用表面光滑的血管夾(60g壓カ；World Precision Instruments,英國)堵塞腎動脈40min。通過觀察整個腎表面的變白現(xiàn)象確認(rèn)完全局部缺血。在局部缺血期間，暫時縫合傷ロ以保持體溫。在去掉夾子之后，再觀察腎2-5min以確保指示血回流的顏色變化。然后用3-0絲線縫合傷ロ。將大鼠放回代謝籠中，每天測定24h的尿排出量和水?dāng)z取量，共5天。作為對照組，大鼠進(jìn)行與用于ARF相同的假手術(shù)而不堵塞腎動脈。平行監(jiān)測假手術(shù)的大鼠與具有ARF的大鼠。
[0393]使大鼠進(jìn)行如下靜脈注射處理的ー種:[0394]載體組:0.5mll50mM NaCl。
[0395]a -MSH 組:溶于 0.5mll50mM NaCl 的 200 ii g a -促黑素 /kg 體重。
[0396]實驗化合物組:溶于0.5mll50mM NaCl的200 U g實驗化合物/kg體重。在腎的再灌注之前的5分鐘，接著在6小時和24小時后給予上述處理。
[0397]統(tǒng)計:
[0398]數(shù)據(jù)以平均數(shù)土SE表示。用學(xué)生成對t檢驗分析組內(nèi)對比。通過后面是費舍最小顯著性差異法的單因素變量分析進(jìn)行組間對比。在0.05水平認(rèn)為差異是顯著的。
[0399]實驗方案7
[0400]抑制順鉬誘導(dǎo)的腎衰竭
[0401]將預(yù)先植入有長期腎導(dǎo)管的大鼠放置于代謝籠中，經(jīng)過對代謝籠的適應(yīng)期之后，用腹腔注射溶于0.5mll50mM NaCI的順鉬5.0mg/kg體重或載體(0.5mll50mM NaCI)來處理大鼠。然后，5天后將大鼠放回代謝籠，每天測定并收集接下來5天內(nèi)24h尿排出量和水?dāng)z取量。然后在氟烷/N2O中將所有的大鼠麻酔，在預(yù)冷的EDTA包被的小瓶中收集動脈血樣品。將血液樣品收集在含有0.5mM EDTA, pH7.4,以及20xl06IU/ml抑肽酶的預(yù)冷實驗管中。經(jīng)過4°C離心后，將血漿樣品轉(zhuǎn)移到預(yù)冷實驗管，并且保存在-20°C用于以后測定肌酸酐和鎂(Mg)。除此之外，還測定在血液收集之前的最近24小時期間收集的尿中的肌酸酐。用作腎小球浸潤率指數(shù)的肌酸酐清除率(Cra)可以計算如下:Cra=Vu X U。ノPra，這里Vu是24小時尿產(chǎn)量；Ura是尿中肌酸酐濃度，Pra是血漿中肌酸酐濃度。使用臨床化學(xué)系統(tǒng)VITE0S950(校正臨床診斷公司(Ortho-Cl inical Diagnostics Inc.) , Johnson&Johnson,新澤西州)以及羅氏日立模塊(Roche Hitachi Modular)(羅氏診斷(Roche Diagnostics),曼海姆(Mannheim),德國)進(jìn)行尿和血衆(zhòng)中肌酸酐的測定。
[0402]使大鼠進(jìn)行如下靜脈注射處理的ー種:
[0403]載體組:0.5mll50mM NaCl。
[0404]a -MSH 組:溶于 0.5mll50mM NaCl 的 200 ii g a -促黑素 /kg 體重。
[0405]實驗化合物組:溶于0.5mll50mM NaCl的200 U g實驗化合物/kg體重。在腎的再灌注之前的5分鐘，接著在6h和24h后給予上述處理。
[0406]統(tǒng)計:
[0407]數(shù)據(jù)以平均數(shù)土SE表示。用學(xué)生成對t檢驗分析組內(nèi)對比。通過后面是費舍最小顯著性差異法的單因素變量分析進(jìn)行組間對比。在0.05水平認(rèn)為差異是顯著的。
[0408]結(jié)果
[0409]實施例1
[0410]實驗化合物是a -MSH類似物#1:
[0411]Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列I*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)
[0412]將該化合物在實驗方案1-7進(jìn)行實驗。
[0413]抑制體外由人白細(xì)胞產(chǎn)生的LPS誘導(dǎo)的TNF-a的產(chǎn)生
[0414]a -MSH和a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)兩者都劑量依賴地降低人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積。令人意外的是，a-MSH類似物#I (序列表序列I*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。a-MSH抑制TNF-a累積到最大反應(yīng)(LPS-載體)的73±9%。與此相反，a-MSH類似物#I (序列表序列I*)能降低TNF-a累積到載體的 47±2% (對 a-MSH 組 p〈0.01)(見圖1)
[0415]抑制大鼠體內(nèi)的LPS誘導(dǎo)的TNF-a生產(chǎn)
[0416]在靜脈注射LPS的過程中，a -MSH和a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)兩者都降低了大鼠中TNF-a累積。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH以及a-MSH類似物#1 (序列表序列I*)的最大抑制效果，并且在LPS注射開始之后120分鐘顯示出對TNF- a生產(chǎn)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH類似物#I (序列表序列I*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。盡管a-MSH抑制大鼠血漿中的TNF-a濃度到最大反應(yīng)(LPS-載體)的17±3%，但是a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)能降低TNF-a累積到載體的 9±1% (對 a-MSH 組 p = 0.05)(見圖 2)。
[0417]抑制大鼠吸入LPS之后嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤
[0418]如LPS吸入之后24小時收集的BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的顯著降低所顯示的那樣，a -MSH和a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)兩者都降低在肺泡腔內(nèi)的對LPS吸入的炎癥反應(yīng)。與BALF內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量是164.6±42.2X 105個細(xì)胞的、載體處理的大鼠相比，a-MSH處理減小BALF內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量到26.7±4.3X IO5個細(xì)胞(對載體組，p〈0.05)，a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)減小BALF內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量到49.0±10.5X105個細(xì)胞(對載體組，p〈0.05)(見圖3)。與上相同，對于a-MSH和a-MSH類似物#1 (序列表序列I*)來說，BALF內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量的效果是相似的。
[0419]抑制豬體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的釋放和肺高血壓
[0420]如在用a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)處理的豬中在LPS注射之后顯著降低的TNF-a的血漿濃度所顯示的那樣，a-MSH類似物#I (序列表序列I*)具有顯著的抗炎效果。除了這種抗炎效果之外，令 人意外的是，a-MSH類似物#I (序列表序列I*)還具有保護(hù)避免肺高血壓發(fā)展的能力，這可以通過在用a-MSH類似物#I (序列表序列I*)處理的大鼠中發(fā)現(xiàn)的、顯著減弱LPS誘導(dǎo)的PAP增幅來證實(最大PAP增幅:載體組:22±4mmHg，a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)組:8±2mmHg ；p = 0.05)(見圖4)。
[0421]抑制通過阻塞大鼠左前降支冠狀動脈60min誘導(dǎo)的心肌梗塞面積
[0422]與a -MSH相反，令人意外的是，a -MSH類似物#1(序列表序列I*)降低了心肌梗塞面積，心肌梗塞面積以壞死面積/梗死危險面積表示，并且在LAD再灌注之后3小時測定。在200 u g/kg體重的劑量下獲得了 a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)的最大抑制效果，其中與載體處理的大鼠相比，梗塞面積的降低是~30% (載體組:危險面積的50.6±2.6%，a -MSH類似物#1(序列表序列I*)組:危險面積的35.7±5.6% ；p = 0.01)。在1000 u g/kg體重的劑量下，與載體處理的大鼠相比，梗塞面積的降低還是~30% ( a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)組:危險面積的35.0±4.4%，對載體組p〈0.01)(見圖5)。在堵塞LAD60分鐘之后14天測量另一方案動物的左室舒張末壓(LVEDP)，結(jié)果顯示a -MSH類似物#1(序列表序列I*)對梗塞面積的有益效果伴隨有LVEDP以及梗死后充血型心臟衰竭發(fā)展的顯著降低(LVEDP: a -MSH 類似物 #1 (序列表序列 I*)組:10.4±2.9mmHg ;對載體組:20.2±2.2mmHg ；p<0.01 ;對時間對照:7.5±2.3mmHg ;無顯著性)(見圖6)。
[0423]抑制通過雙向堵塞大鼠腎動脈40分鐘誘導(dǎo)的腎衰竭
[0424]60分鐘雙向腎局部缺血(RIR)誘導(dǎo)明顯的缺血后多尿癥。RIR大鼠具有相同的多尿癥，與假手術(shù)的對照大鼠相比，在局部缺血損害之后的第5天多尿量増加101%(RIR-載體組:34.8±3.3ml/24 小時，時間對照:17.3±2.lml/24 小時，p〈0.01)。a -MSH 處理不能減輕多尿癥(RIR-a-MSH組:29.0±2.9ml/24小時；對RIR-載體無顯著性)。令人意外的是，a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)能夠誘導(dǎo)尿流量的完全正?；?RIR- a -MSH類似物#1(序列表序列I*)組:18.8±3.6ml/24小時；對時間對照無顯著性；對RIR-載體組p〈0.01)(見圖7)。
[0425]抑制順鉬誘導(dǎo)的腎衰竭
[0426]如GFR下降所證實的那樣，順鉬處理誘導(dǎo)明顯的低血鎂癥和腎中毒。根據(jù)這一點，用順鉬和載體處理大鼠誘導(dǎo)出低血鎂癥(血漿Mg:0.61 土 0.04mM,對照大鼠:0.77±0.05mM，p〈0.05)以及明顯的GFR下降。在用順鉬和a-MSH處理過的大鼠中血漿Mg同樣降低(0.37 + 0.04mM，對對照大鼠p〈0.05)。令人意外的是，用a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)處理防止了順鉬誘導(dǎo)的低血鎂癥(0.84±0.04禮，相對于對照大鼠無顯著性)以及防止了順鉬誘導(dǎo)的GFR下降。
[0427]實施例2
[0428]實驗化合物是a -MSH類似物#2:
[0429]Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GlY-Lys-Pro-Val-NH2 (序列表序列5*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)
[0430]通過在位點10用Nle取代Met以及通過在位點13用(D-Phe)立體化學(xué)取代Phe，使a -MSH類似物#2 (序列表序列5)區(qū)別于a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)。
[0431]在實驗方案1-3和5-7中試驗該化合物。
[0432]抑制體外人白細(xì)胞產(chǎn)生的LPS誘導(dǎo)的TNF-a生產(chǎn)
[0433]a -MSH和a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)兩者都劑量依賴地降低人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積。令人意外的是，a-MSH類似物#2 (序列表序列5*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。a-MSH抑制TNF-a累積到最大反應(yīng)(LPS-載體)的73±9%。與此相反，a-MSH類似物#2 (序列表序列5*)能降低TNF-a累積到載體的 42±11% (對 a-MSH 組 p〈0.01)(見圖 8)。
[0434]抑制大鼠體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)
[0435]在靜脈注射LPS的過程中，a -MSH和a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)兩者都降低了大鼠的TNF-a累積。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH以及a-MSH類似物#2 (序列表序列5*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH類似物#2 (序列表序列5*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。盡管a-MSH抑制大鼠血漿中的TNF-a濃度到最大反應(yīng)(LPS-載體)的17±3%，但是a-MSH類似物#2 (序列表序列5*)能降低TNF- a累積到載體的9± 1% (對a -MSH組p〈0.05)(見圖9)。
[0436]抑制大鼠吸入LPS之后嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤
[0437]如LPS吸入之后24小時收集的BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的顯著降低所顯示的那樣，a -MSH和a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)兩者都降低肺泡腔內(nèi)的對LPS吸入的炎癥反應(yīng)。與BALF內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量是164.6±42.2X 105個細(xì)胞的、載體處理的大鼠相比，a -MSH處理減小BALF內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量到26.7±4.3 X IO5個細(xì)胞(對載體組，p〈0.05)，a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)減小BALF內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量到34.0±8.6X105個細(xì)胞(對載體組，p〈0.05)(見圖10)。令人意外的是，a-MSH類似物#2(序列表序列5*)具有比a -MSH更明顯的對BALF內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞的抑制效果(a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)組:9.1±2.4X105個細(xì)胞，a-MSH組:20.1 ±2.5 X IO5個細(xì)胞;p〈0.05)(見圖 11)。
[0438]抑制通過阻塞大鼠左前降支冠狀動脈60分鐘誘導(dǎo)的心肌梗塞面積
[0439]與a -MSH相反，令人意外的是，a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)降低了心肌梗塞面積，心肌梗塞面積以壞死面積/梗死危險面積表示，并且在LAD再灌注之后3小時測定。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH類似物#2 (序列表序列5*)的最大抑制效果，其中與載體處理的大鼠相比，梗塞面積的降低是~27% (載體組:危險面積的51.4±2.1%, a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)組:危險面積的37.4±5.1% ；p = 0.01)(見圖12)。在堵塞LAD60分鐘之后14天測量另一方案動物的左室舒張末壓(LVEDP)，結(jié)果顯示a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)對梗塞面積的有益效果伴隨有LVEDP以及梗死后充血型心臟衰竭發(fā)展的顯著降低。
[0440]抑制通過雙向堵塞大鼠腎動脈40分鐘誘導(dǎo)的腎衰竭
[0441]60分鐘雙向腎局部缺血(RIR)誘導(dǎo)明顯的缺血后多尿癥。RIR大鼠具有相同的多尿癥，與假手術(shù)的對照大鼠相比，在局部缺血損害之后的第5天多尿量増加101% (RIR-載體組:34.8±3.3ml/24 小時，時間對照:17.3±2.lml/24 小時，p〈0.01)。a -MSH 處理不能減輕多尿癥(RIR-a-MSH組:29.0±2.9ml/24小時；對RIR-載體組無顯著性)。與此相反，用a-MSH類似物#2 (序列表序列5*)處理顯著降低了在RIR之后發(fā)現(xiàn)的多尿癥程度。
[0442]抑制順鉬誘導(dǎo)的腎衰竭
[0443]如GFR下降所證實的那樣，順鉬處理`誘導(dǎo)明顯的低血鎂癥和腎中毒。根據(jù)這一點，用順鉬和載體處理大鼠誘導(dǎo)出低血鎂癥(血漿Mg:0.61 土 0.04mM,對照大鼠:0.77±0.05mM，p〈0.05)以及明顯的GFR下降。在用順鉬和a-MSH處理過的大鼠中血漿Mg同樣降低(0.37±0.04mM，對對照大鼠p〈0.05)。與此相反，a -MSH類似物#2 (序列表序列5*)防止了順鉬誘導(dǎo)的低血鎂癥以及順鉬誘導(dǎo)的GFR下降。
[0444]實施例3
[0445]實驗化合物是a -MSH類似物#3:
[0446]Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (序列表序列9*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)
[0447]通過在位點10用Nle取代Met以及通過在位點13用D-Nal取代Phe，使a -MSH類似物#3 (序列表序列9)區(qū)別于a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)。
[0448]在實驗方案1、2和5中試驗該化合物。
[0449]抑制體外LPS誘導(dǎo)的TNF-a產(chǎn)生，其中TNF-a由人白細(xì)胞產(chǎn)生。
[0450]a -MSH和a -MSH類似物#3 (序列表序列9*)兩者都劑量依賴地降低人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積。令人意外的是，a-MSH類似物#3 (序列表序列9*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。a-MSH抑制TNF-a累積到最大反應(yīng)(LPS-載體)的73±9%。與此相反，a-MSH類似物#3 (序列表序列9*)能降低TNF-a累積到載體的 53 ±13% (對 a-MSH 組 p〈0.05)(見圖 13)。
[0451 ] 抑制大鼠體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)[0452]在靜脈注射LPS的過程中，a -MSH和a -MSH類似物#3 (序列表序列9*)兩者都降低了大鼠的TNF-a累積。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH以及a-MSH類似物#3 (序列表序列9*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH類似物#3 (序列表序列9*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。盡管a-MSH抑制大鼠血漿中的TNF-a濃度到最大反應(yīng)(LPS-載體)的17±3%，但是a -MSH類似物#3 (序列表序列9*)能降低TNF-a 累積到載體的 11±3% (對 a-MSI^ip〈0.05)(見圖 14)。
[0453]抑制通過阻塞大鼠左前降支冠狀動脈60min誘導(dǎo)的心肌梗塞面積
[0454]與a -MSH相反，令人意外的是，a -MSH類似物#3 (序列表序列9*)降低了心肌梗塞面積，心肌梗塞面積以壞死面積/梗死危險面積表示，并且在LAD再灌注之后3小時測定。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH類似物#2 (序列表序列5*)的最大抑制效果，其中與載體處理的大鼠相比，梗塞面積的降低是~24% (載體組:危險面積的51.3±2.1%, a -MSH類似物#3 (序列表序列9*)組:危險面積的39.0±3.4% ；p = 0.05)(見圖15)。在堵塞LAD60分鐘之后14天測量另一方案動物的左室舒張末壓(LVEDP)，結(jié)果顯示a -MSH類似物#3 (序列表序列9*)對梗塞面積的有益效果伴隨有LVEDP以及梗死后充血型心臟衰竭發(fā)展的顯著降低。
[0455]實施例4
[0456]實驗化合物是a -MSH類似物#4:
[0457]Ac_Lys_Lys_Lys_しys_Lys_Lys_ber_Ser_Ile_Iie_Ser_His_Phe_Arg_Trp_(aly_LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列13*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)
[0458]通過在位點8用Ser取代Tyr，在位點9用Ile取代Ser，在位點10用Ile取代Met以及通過在位點11用Ser取代Glu，使a -MSH類似物#4 (序列表序列13)區(qū)別于a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)。
[0459]在實驗方案I和2中試驗該化合物。
[0460]抑制體外由人白細(xì)胞產(chǎn)生的LPS誘導(dǎo)的TNF-a的產(chǎn)生
[0461]a -MSH和a -MSH類似物#4 (序列表序列13*)兩者都劑量依賴地降低人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF- a累積。令人意外的是，a -MSH類似物#4 (序列表序列13*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。
[0462]抑制大鼠體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)
[0463]在靜脈注射LPS的過程中，a -MSH和a -MSH類似物#4 (序列表序列13*)兩者都降低了大鼠的TNF-a累積。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH以及a-MSH類似物#4 (序列表序列13*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH類似物#4 (序列表序列13*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。盡管a-MSH抑制大鼠血漿中的TNF-a濃度到最大反應(yīng)(LPS-載體)的17±3%，但是a-MSH類似物#4 (序列表序列13*)能降低TNF-a累積到載體的12±2% (對a-MSH組p〈0.05)(見圖16)。
[0464]實施例5
[0465]實驗化合物是a -MSH類似物#5:
[0466]Ac_Lys_Lys_Lys_しys—Lys—Lys—ber—Ser—Ile—Iie—Ser—His—(D-Phe)—Arg—Trp—G丄Y-Lys-Pro-Val-NH2 (序列表序列17*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)
[0467]通過在位點8用Ser取代Tyr，在位點9用Ile取代Ser，在位點10用Ile取代Met，通過在位點11用Ser取代Glu以及通過在位點13用(D-Phe)立體化學(xué)取代Phe，使a -MSH類似物#5 (序列表序列17)區(qū)別于a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)。
[0468]在實驗方案I和2中試驗該化合物。
[0469]抑制體外由人白細(xì)胞產(chǎn)生的LPS誘導(dǎo)的TNF-a的產(chǎn)生
[0470]a -MSH和a -MSH類似物#5 (序列表序列17*)兩者都劑量依賴地降低人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF- a累積。令人意外的是，a -MSH類似物#5 (序列表序列17*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。
[0471 ] 抑制大鼠體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)
[0472]在靜脈注射LPS的過程中，a -MSH和a -MSH類似物#5 (序列表序列17*)兩者都降低了大鼠的TNF-a累積。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH以及a-MSH類似物#5 (序列表序列17*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH類似物#5 (序列表序列17*)的抑制效果比天然肽a -MSH的抗炎效果更顯著。
[0473]實施例6
[0474]實驗化合物是a -MSH類似物#6:
[0475]Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列2*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)
[0476]通過在位點1-6用(Glu) 6取代(Lys) 6，使a -MSH類似物#6 (序列表序列2)區(qū)別于a-MSH類似物#I (序列表序列 I *)。
[0477]在實驗方案I和2中實驗該化合物。
[0478]抑制體外由人白細(xì)胞產(chǎn)生的LPS誘導(dǎo)的TNF-a的產(chǎn)生
[0479]a -MSH和a -MSH類似物#6 (序列表序列2*)兩者都劑量依賴地降低人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積。令人意外的是，a-MSH類似物#6 (序列表序列2*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。
[0480]抑制大鼠體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)
[0481 ] 在靜脈注射LPS的過程中，a -MSH和a -MSH類似物#6 (序列表序列2*)兩者都降低了大鼠的TNF-a累積。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH以及a-MSH類似物#6 (序列表序列2*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH類似物#6 (序列表序列2*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。
[0482]實施例7
[0483]實驗化合物是a -MSH類似物#7:
[0484]Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val) -NH2 (序列表序列3*在N-端被こ?；⑶以贑-端被酰胺化)
[0485]通過在位點19用(D-Val)化學(xué)立體取代Val，使a -MSH類似物#7 (序列表序列3)區(qū)別于a -MSH類似物#1 (序列表序列I*)。
[0486]在實驗方案I和2中實驗該化合物。
[0487]抑制體外由人白細(xì)胞產(chǎn)生的LPS誘導(dǎo)的TNF-a的產(chǎn)生
[0488]a -MSH和a -MSH類似物#7 (序列表序列3*)兩者都劑量依賴地降低人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積。令人意外的是，a-MSH類似物#7 (序列表序列3*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。[0489]抑制大鼠體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)
[0490]在靜脈注射LPS的過程中，a -MSH和a -MSH類似物#7 (序列表序列3*)兩者都降低了大鼠的TNF-a累積。在200 ii g/kg體重的劑量下獲得了 a-MSH以及a-MSH類似物#7 (序列表序列3*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH類似物#7 (序列表序列3*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更顯著。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0491]圖1人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF- a累積
[0492]該圖顯示了在實驗方案I中a -MSH類似物#1 (序列表序列I*) (MCA#I)的最大抗炎效果。對于。-|^11和1?^#1在10_%情況下獲得對1^3誘導(dǎo)的1即-0生產(chǎn)的最大抑制效果。平均值土SE (每組中N = 6-9)。*:對載體組p〈0.05，#:對a -MSH組p〈0.05。
[0493]圖2血漿中LPS誘導(dǎo)的TNF- a累積
[0494]該圖顯示了在實驗方案2中a -MSH類似物#1 (序列表序列I*) (MCA#I)的最大抗炎效果。對于a -MSH和MCA#1在靜脈注射200 u g/kg體重情況下獲得對大鼠LPS誘導(dǎo)的TNF-a生產(chǎn)的最大抑制效果。平均數(shù)土SE (每組中N = 4_6)。*:對載體組p〈0.05，#:對 a -MSH 組 p〈0.05。
[0495]圖3嗜酸性粒細(xì)胞
[0496]該圖顯示了在實驗方案3中a -MSH和a -MSH類似物#1(序列表序列1*)(MCA#1)對肺泡內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞累積的作用。兩個化合物在200 u g/kg體重的劑量下靜脈推注給藥。平均數(shù)土SE (每組中N = 6-9)。與載體不同。
[0497]圖4肺動脈壓
[0498]該圖顯示了 a-MSH類似物#I (序列表序列I*) (MCA#1)對LPS誘導(dǎo)的豬肺動脈壓變化的作用。平均數(shù)土SE (每組中N = 6-9)。*:與載體不同。
[0499]圖5再灌注之后3小時的梗塞面積
[0500]該圖顯示了在實驗方案4中a -MSH類似物#1 (序列表序列I*) (MCA#1)對心肌梗塞面積的保護(hù)作用。通過靜脈注射給予200 y g/kg體重獲得MCA#1的最大效果。平均數(shù)土SE (姆組中N = 5-10)。*:與載體不同。
[0501 ] 圖6在60min LAD堵塞之后兩周的LVEDP
[0502]該圖顯示了在實驗方案4中a -MSH類似物#1 (序列表序列I*) (MCA#1)對梗死后充血性心カ衰竭的保護(hù)作用。通過200 u g/kg體重獲得MCA#1的效果。平均數(shù)土SE(每組中N = 6-9)。*:對假手術(shù) 組p〈0.05，#:對載體組p〈0.05。
[0503]圖1多尿量
[0504]該圖顯示了在實驗方案5中a -MSH類似物#1 (序列表序列I*) (MCA#1)對缺血后多尿癥發(fā)展的保護(hù)作用。通過靜脈注射給予200 y g/kg體重獲得MCA#1的效果。平均數(shù)土SE (每組中N = 5-7)。與載體不同。
[0505]圖8人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF- a累積
[0506]該圖顯示了在實驗方案I中a -MSH類似物#2 (序列表序列5*) (MCA#2)的最大抗炎效果。對于a -MSH和MCA#2在10_7M情況下獲得對LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)的最大抑制效果。平均數(shù)土SE (每組中N = 6-9)。*:對載體組p〈0.05，#:對a -MSH組p〈0.05。[0507]圖9血漿中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積
[0508]該圖顯示了在實驗方案2中a -MSH類似物#2 (序列表序列5*) (MCA#2)的最大抗炎效果。對于a-MSH和MCA#2在靜脈注射200 ii g/kg體重情況下獲得對大鼠LPS誘導(dǎo)的TNF-a生產(chǎn)的最大抑制效果。平均數(shù)土SE (每組中N = 4_6)。*:對載體組p〈0.05，#:對 a -MSH 組 p〈0.05。
[0509]圖10嗜酸性粒細(xì)胞
[0510]該圖顯示了在實驗方案3中a -MSH和a -MSH類似物#2(序列表序列5*)(MCA#2)對肺泡內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞累積的作用。兩個化合物在200 u g/kg體重的劑量下靜脈推注給藥。平均數(shù)土SE (每組中N = 6-9)。與載體不同。
[0511]圖11嗜中性粒細(xì)胞
[0512]該圖顯示了在實驗方案3中a -MSH和a -MSH類似物#2(序列表序列5*)(MCA#2)對肺泡內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞累積的作用。兩個化合物在200 u g/kg體重的劑量下靜脈推注給藥。平均數(shù)土SE (每組中N = 6-9)。與載體不同。
[0513]圖12再灌注之后3小時的梗塞面積
[0514]該圖顯示了在實驗方案4中a -MSH類似物#2 (序列表序列5*) (MCA#2)對心肌梗塞面積的保護(hù)作用。通過靜脈注射給予200 y g/kg體重獲得MCA#1的最大效果。平均數(shù)土SE (姆組中N = 5-10)。*:與載體不同。
[0515]圖13人白細(xì)胞懸液中LPS誘導(dǎo)的TNF-a累積
[0516]該圖顯示了在實驗方案I中a -MSH類似物#3 (序列表序列9*) (MCA#3)的最大抗炎效果。對于a -MSH和MCA#3在1`0_7M情況下獲得對LPS誘導(dǎo)的TNF- a生產(chǎn)的最大抑制效果。平均數(shù)土SE (每組中N = 6-9)。*:對載體組p〈0.05，#:對a -MSH組p〈0.05。
[0517]圖14血漿中LPS誘導(dǎo)的TNF- a累積
[0518]該圖顯示了在實驗方案2中a -MSH類似物#3 (序列表序列9*) (MCA#3)的最大抗炎效果。對于a-MSH和MCA#3在靜脈注射200 ii g/kg體重情況下獲得對大鼠LPS誘導(dǎo)的TNF-a生產(chǎn)的最大抑制效果。平均數(shù)土SE (每組中N = 4_6)。*:對載體組p〈0.05，#:對 a -MSH 組 p〈0.05。
[0519]圖15再灌注之后3小時的梗塞面積
[0520]該圖顯示了在實驗方案4中a -MSH類似物#3 (序列表序列9*) (MCA#3)對心肌梗塞面積的保護(hù)作用。通過靜脈注射給予200 y g/kg體重獲得MCA#3的最大效果。平均數(shù)土SE (姆組中N = 5-10)。*:與載體不同。
[0521]圖16血漿中LPS誘導(dǎo)的TNF- a累積
[0522]該圖顯示了在實驗方案2中a -MSH類似物#4 (序列表序列13*) (MCA#4)的最大抗炎效果。對于a -MSH和MCA#4在靜脈注射200 u g/kg體重情況下獲得對大鼠LPS誘導(dǎo)的TNF-a生產(chǎn)的最大抑制效果。平均數(shù)土SE (每組中N = 4_6)。*:對載體組p〈0.05，#:對 a -MSH 組 p〈0.05。
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【權(quán)利要求】
1.肽的制備方法，所述肽的長度為19個氨基酸殘基且包括如下氨基酸序列: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列1)， 其中，所述肽的氨基端是CH3-C (=0)-，所述肽的羧基端是-C (=0) -NH2, 所述肽通過溶液合成法、Merrifield型固相合成法或重組DNA技術(shù)來制備。
2.肽的制備方法，所述肽的長度為19個氨基酸殘基且包括如下氨基酸序列: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列5)，和
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列9)， 其中所述肽的氨基端是CH3-C (=0)以及 其中所述妝的羧基端是-C (=0)-NH2 ； 其中所述肽具有激活選自1、3、4和5型黑皮質(zhì)素受體的一種或多種黑皮質(zhì)素受體的能力， 所述肽通過溶液合成法、Merrifield型固相合成法或重組DNA技術(shù)來制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方 法，其中，所述肽包括如下序列:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列5)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述肽包括如下序列:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列9)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項所述的方法,其中,所述肽通過Merrifield型固相合成法來制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項所述的方法，其中，所述方法使用功能化的樹脂，所述功能化的樹脂選自由聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、纖維素、聚乙烯、聚乙二醇接枝的聚苯乙烯、膠乳和戴諾免疫磁珠組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，通過酸將本發(fā)明的肽從固體支持材料上切除。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，通過堿將本發(fā)明的肽從固體支持材料上切除。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項所述的方法，其中，所述肽通過溶液合成法、Merrifield型固相合成法或重組DNA技術(shù)來制備。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項所述的方法，其中，所述肽通過重組DNA技術(shù)來制備，其包括如下步驟: (a)在允許所述肽生產(chǎn)的條件下，培養(yǎng)含有編碼所述肽的核酸序列的重組宿主細(xì)胞，和 (b)從所述培養(yǎng)物中分離所述肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項所述的方法，其中，所述肽通過重組DNA技術(shù)來制備，其包括如下步驟: Ca)將編碼所述肽的核酸序列轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞中，(b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和(c)從所述培養(yǎng)物中分離所述肽。`
【文檔編號】C07K1/04GK103497237SQ201310198558
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2005年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2005年8月26日
【發(fā)明者】托馬斯·恩格爾布雷希特·諾克爾德·約納森, 瑟倫·尼爾森, 約爾延·弗洛基爾, 比亞內(nèi)迪尤·拉爾森 申請人:艾伯維有限公司