專利名稱：：表位類似物的制作方法表位類似物相關(guān)申請的交叉參考本申請要求于2005年6月17日提交的美國臨時專利申請序列號.60/691,889的提交日期的利益，其無放棄地完全結(jié)合于此作為參考。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域在某些實施方案中，本文所公開的發(fā)明涉及與I類MHC限制性T細胞表位相對應(yīng)的肽的類似物，和用于它們的產(chǎn)生的方法。這些類似物可以含有在直接與MHC分子相互作用的殘基上的氨基酸取代，并且可以賦予提高的、改善的或有用的免疫特性。特別地，鑒定了來自腫瘤相關(guān)的抗原SSX-2、NY-ES0-1、PRAME、PSMA、酪氨酸酶、和melan-A的表位類似物。另外，公開了類似物的種類，其中各種取代包括非標準的殘基正亮氨酸和/或正纈氨酸。相關(guān)技術(shù)的描述主要組織相容性復合體與T細胞靶點識別T淋巴細胞(T細胞)是在應(yīng)答具體的抗原信號中起作用的抗原-特異性免疫細胞。B淋巴細胞和它們產(chǎn)生的抗體也是抗原-特異性的實體。然而，與B淋巴細胞不同，T細胞不應(yīng)答游離的或溶解形式的抗原。對于T細胞應(yīng)答抗原，它需要所述抗原結(jié)合到包含主要組織相容性復合體(MHC)蛋白的呈遞復合體上。MHC蛋白提供T細胞區(qū)分本有的或"自身"細胞與外來細胞的方式。MHC分子是一類免疫受體，其呈遞隨后要受到T細胞監(jiān)測的潛在的肽表位。存在2種類型的MHC，I類MHC和II類MHC。CD4+T細胞與II類MHC蛋白相互作用，并且主要具有輔助表型，而CD8+T細胞與I類MHC蛋白相互作用，并且主要具有細胞溶解表型，但是它們每一種還可以表現(xiàn)出調(diào)控功能，特別是抑制性的功能。I類和II類兩類MHC都是跨膜蛋白，它們的大部分結(jié)構(gòu)位于細胞的外表面。另外，兩類MHC都在它們的外側(cè)部分具有肽結(jié)合裂口。就是在這一裂口，將小片段蛋白，內(nèi)在的或外來的，結(jié)合并且呈遞到細胞外環(huán)境。稱為抗原呈遞細胞(APCs)的細胞應(yīng)用MHC將抗原展示給T細胞。T細胞可以識別抗原，如果所述抗原是存在于MHC上的話。這種需要叫作MHC限制性。如果抗原不是由可識別的MHC所展示，所述T細胞將不識別和作用于所述抗原信號。對結(jié)合到可識別的MHC上的肽特異性的T細胞結(jié)合到這些MHC-肽復合體上，并且進行免疫應(yīng)答下面的階段.發(fā)明概述SSX-2^類似物實施方案實施方案包括I類MHC-限制性T細胞表位SSX-24M9的類似物，KASEKIFYV(SEQIDNO.1)，包括這些類似物的多肽(其可以由pAPC加工以呈遞所述表位類似物)，和表達所述類似物的核酸。與野生型表位相比較，所述類似物可以具有相似的或提高的免疫特性。一個特別的實施方案涉及一種分離的SSX-2肽，其具有包括序列KASEKIFYV(SEQIDNO.1)的一個或多個氨基酸取代的序列，所述SSX-2肽以充分的量存在，足以激發(fā)從由針對具有序列KASEKIFYV(SEQIDNO:1)的表位的免疫而產(chǎn)生的T細胞系產(chǎn)生細胞因子。一方面，所述充分的量小于10pM。另一方面，所述量小于3pM。另一方面，所述量小于l^iM。一方面，所述一個或多個氨基酸取代可以包括至少一個標準的氨基酸取代。當用于本文時，"標準氨基酸"包括20種遺傳編碼的氨基酸中的任一種。因此，一方面，例如，所述至少一個標準氨基酸取代可以為Tyr、Val、Leu、Ala、Ile、Met、Trp、Phe、Asp、Asn或Ser。另一方面，所述一個或多個氨基酸取代可以包括至少一個非標準的氨基酸取代。所述非標準的氨基酸包括，例如，但不限于，下列各項中的任一種正亮氨酸(Nle)，正纈氨酸(Nva)，苯基甘氨酸(Phg),4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F)),4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-N02)),oc-氨基丁酸(Abu),oc-氨基異丁酸(Aib),甲基-亮氨酸(MeLeu),甲基纈氨酸(MeVal),P-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸((3-(3-苯并噻吩基)Ala),O-甲基酪氨酸(O-methyltyorosine)(O-甲基-Tyr),環(huán)己基丙氨酸(Cha),P-(l-萘基)-丙氨酸(Nal-l),(3-(2-萘基)-丙氨酸(Nal-2),標準氨基酸的D-立體異構(gòu)體，或其中羧基末端已被修飾成酰胺(顯示為-NH2)的氨基酸。因此，在一個方面，所述至少一個非標準氨基酸取代可以是Nle、Nva、Abu、或標準氨基酸的D-立體異構(gòu)體。另一方面，所述一個或多個氨基酸取代可以包括修飾的末端氨基酸。一方面，所述修飾的末端氨基酸可以是酰胺化的C端氨基酸。另一方面，至少一種取代可以是氨基酸的添加，其中所述添加是C端添加。另一方面，肽還可以包括在任何位點的保守氨基酸的取代，但是優(yōu)選地在不明顯參與任何MHC相互作用的P3、P5或P7位點。另一個實施方案涉及9個氨基酸Pl-P9的分離的肽，其可以在每個位點包括一個氨基酸。例如，Pl可以是K、F、Y、W、Phg、Phe(4-F)、Phe(4-N02)、MeTyr、卩-(3-苯并噻吩基)-Ala、或D-Lys;P2可以是A、L、V、I、M、D-Ala、Nal陽2、Abu、Aib、Nle或Nva;P3可以是S;P4可以是E、Q、Nle、或Nva;P5可以是K;P6可以是I、L、V、Nle或Nva;P7可以是F;P8可以是Y、F、Phe(4-F);和在P9的PQ(P-Q)可以是V、I、A、Nva、MeVal、或Abu。在一些實例中，所述序列不是KASEKIFYV(SEQIDNO.1)。另一個實施方案涉及一種9個氨基酸P1-P9的分離肽，其可以在每個位點包括一個氨基酸。例如，P1可以是K、F、Y、W、Phg、Phe(4-F)、Phe(4-N02)、MeTyr、卩-(3-苯并噻吩基)-Ala、或D-Lys;P2可以是V、L、M、Abu、Nle或Nva;P3可以是S;P4可以是E、Q、Nle、或Nva;P5可以是K;P6可以是I、L、V、Nle或Nva;P7可以是F;P8可以是Y、F、Phe(4-F);和在P9的PQ可以是V、I、A、Nva、MeVal、Abu或V-NH2。另一個實施方案涉及一種9個氨基酸P1-P9的分離肽，其可以在每個位點包括一個氨基酸。例如，P1可以是K、F、Y、W、Phg、Phe(4-F)、Phe(4-N02)、MeTyr、卩-(3-苯并噻吩基)-Ala、或D-Lys;P2可以是A、L、V、M、Abu、Nle或Nva;P3可以是S;P4可以是E、Q、Me、或Nva;P5可以是K;P6可以是I、L、V、Nle或Nva;P7可以是F;P8可以是Y、F、Phe(4-F);P9可以是V;和在P10的PQ可以是I或L。另一個實施方案涉及一種9個氨基酸Pl-P9的分離肽，其可以在每個位點包括一個氨基酸。例如，P1可以是K、F、Y、W、Phg、Phe(4-F)、Phe(4-N02)、MeTyr、卩-(3-苯并噻吩基)-Ala、或D-Lys;P2可以是V;P3可以是S;P4可以是E、Q、Nle、或Nva;P5可以是K;P6可以是I、L、V、Nle或Nva;P7可以是F;P8可以是Y、F、Phe(4-F);P9可以是V;和在PIO的PQ可以是I、L、V、或Nle。另一個實施方案涉及一種9個氨基酸Pl-P9的分離肽，其可以在每個位點包括一個氨基酸。例如，P1可以是K、F、Y、W、Phg、Phe(4-F)、Phe(4-N02)、MeTyr、卩-(3-苯并噻吩基)-Ala、或D-Lys;P2可以是L;P3可以是S;P4可以是E、Q、Nle、或Nva;P5可以是K;P6可以是I、L、V、Nle或Nva;P7可以是F;P8可以是Y、F、Phe(4-F);P9可以是V;和在PIO的PQ可以是I、L、V、Nle或Nva。另一個實施方案涉及具有下述序列的分離肽K{L,V,M，I,D-Ala，D畫Val,Nal-2，Aib,Abu,Nle,或Nva}SEKIFYV(SEQIDNO.2);或(F，Phg,Y,Phe(4-F),Phe(4-N02)，O-甲基-Tyr，或卩-(3-苯并噻吩基)-Ala〉A(chǔ)SEKIFYV(SEQIDNO.3);或(Y,F,或W}{V,M,或1}SEKIFYV(SEQIDNO.4);或(F或W}LSEKIFYV(SEQIDNO.5);或K{A,V,或L}SEKIFYI(SEQIDNO.6);或K{L或V}SEKIFYV-NH2(SEQIDNO.7);或FVSEKIFY(I，A，Nva，Abu，或MeVal}(SEQIDNO.8);或FVS{Q，Nle,或Nva}KIFYV(SEQIDNO.9);或FVSEK(L，V,Nle,或Nva}FYV(SEQIDNO.10);或FVSEKIF(F或Phe(4-F》V(SEQIDNO.11);或KASEKIFYV(I或L)(SEQIDNO.12);或KVSEKIFYV(I,L，V,或Nle}(SEQIDNO.13);或KLSEKIFYV{L,V,Nle,或Nva}(SEQIDNO.14)。另一個實施方案涉及具有下述序列的分離肽:K{L,V,M,Abu，Nle,或Nva}SEKIFYV(SEQIDNO.15);或(F或Phg}ASEKIFYV(SEQIDNO.16);或YVSEKIFYV(SEQIDNO.17);或F{L，V，或1}SEKIFYV(SEQIDNO.18);或W{L或I}SEKIFYV(SEQIDNO.19);或K{V或L}SEKIFYI(SEQIDNO.20);或FVSEKIFY{I或Nva}(SEQIDNO.21)。另一個實施方案涉及具有下述序列的分離肽K{V或L}SEKIFYV(SEQIDNO.22);或(F或Y)ASEKIFYV(SEQIDNO.23);或FVSEKIFYI(SEQIDNO,24)。另一個實施方案涉及I類MHC/肽復合體，其中所述肽具有在上文和本文的其它地方所描述的實施方案中的任何一種肽的序列。一方面，所述復合體可以與識別I類MHC/SSX-24M9復合體的T細胞受體(TCR)交叉反應(yīng)。另一方面，所述復合體可以是HLA-A2/SSX-24M9復合體。另一個實施方案涉及一種免疫原性組合物，其可以包括上文和本文的其它地方所描述的肽實施方案中的任一種。一方面，所述肽可以具有，例如，下述序列K(L，V，M，Abu，Nle，或Nva}SEKIFYV(SEQIDNO.15);或(F或Phg}ASEKIFYV(SEQIDNO.16);或YVSEKIFYV(SEQIDNO.17);或F{L，V，或I)SEKIFYV(SEQIDNO.18);或W{L或I}SEKIFYV(SEQIDNO.19);或K{V或L}SEKIFYI(SEQIDNO.20);或FVSEKIFY{I或Nva}(SEQIDNO.21)，或K{V或L}SEKIFYV(SEQIDNO.22);或(F或Y)ASEKIFYV(SEQIDNO.23);或FVSEKIFYI(SEQIDNO.24)。一些其它的實施方案涉及I類MHC限制性T細胞表位NY-ESO-l157.I65，SLLMWITQC(SEQIDN0.25)的類似物，包含這些類似物的多肽，以及表達所述類似物的核酸，所述多肽可以由pAPC處理以呈遞所述表位類似物。與野生型表位相比較，所述類似物可以具有相似的或提高的免疫特性。一個實施方案涉及分離的NY-ESO-l157_165肽，其具有包括序列SLLMWITQC(SEQIDNO.25)的一個或多個氨基酸取代的序列，所述NY-ESO-l157.165肽以充分的量存在，足以激發(fā)從由針對具有序列SLLMWITQC(SEQIDNO.25)的表位的免疫而產(chǎn)生的T細胞系產(chǎn)生細胞因子。例如，一方面，所述充分的量可以小于10pM。另一方面，所述量可以小于3pM。此外，另一方面，所述量可以小于lpM。另一方面，所述量小于0.3^M。一方面，所述一個或多個氨基酸取代可以包括至少一個標準的氨基酸。另一方面，所述一個或多個氨基酸取代可以包括至少一個非標準的氨基酸。另一方面，所述一個或多個氨基酸取代可以包括修飾的末端氨基酸。一方面，所述修飾的末端氨基酸可以是酰胺化的C-端氨基酸。在另一方面，至少一種取代可以是氨基酸的添加，其中所述添加是C端添加。一個實施方案涉及一種具有這樣的序列的分離肽，其中-Pl是S,F,K,或W;P2是L,I,V,Me,或Nva;P3是L;P4是M，L,或N;P5是W;P6是I，A，L，V，或N;P7是T;P8是Q,E,D,或T;在P9的PQ是C,V，I,L,A,Nva,Me,V-NH2,或L-NH2;并且其中所述序列不是SLLMWITQ(C，V，I，L，或A}(SEQIDNO.26),FVLMWITQA(SEQIDNO.27),或FILMWITQ(L或1}(SEQIDNO.28)。另一實施方案涉及具有這樣的序列的分離肽，其中PI是Y;P2是L,V，I,Nle,或Nva;P3是L;P4是M，L，或N;P5是W;P6是I,A,L,V,或N;P7是T;P8是Q,E，D,或T;在P9的PQ是V，I,L，Nva,Nle,V-NH2,或L-NH2;并且其中所述序列不是YVLMWITL(SEQIDNO.29)或YLLMWIT{I或L}(SEQIDNO.30)。另一個實施方案涉及一種分離的十聚體肽，其具有序列(S或Y}LLMWITQ{C或V}{L,I或Nle}(SEQIDNO.31)。另一個實施方案涉及一種分離的肽，其具有序列SILMWITQ(C,V,L，或A}(SEQIDNO.32),YLLMWITQ(Nva或Nle}(SEQIDNO.33)，F(xiàn){L或V}LMWITQ{V，L，或I)(SEQIDNO.34)，Y{I，Nva，或Nle)LMWITQV(SEQIDNO.35)，YLLLWITQV(SEQIDNO,36),或TVLMWITQV(SEQIDNO.37)。另一個實施方案涉及一種分離肽，其具有序列(S或F}VLMWITQV(SEQIDNO.38)，SLMWITQNva(SEQIDNO.39),或SNvaLMWITQV(SEQIDNO.40)。另一個實施方案涉及一種具有序列SNvaLMWITQV(SEQIDNO.40)的分離肽。一些實施方案涉及一種分離肽。所述肽可以包括這樣的序列或基本上由其組成，其中P0是X，XX，或XXX，其中X指定任何氨基酸或無氨基酸；和PI是K，F(xiàn),Y，W，Phg,Phe(4-F)，Phe(4-N02),MeTyr,卩-(3-苯并噻吩基)-Ala,或D-Lys;禾口P2是A,L，V,I,M，D-Ala,Nal-2，Abu，Aib,Nle，或Nva;和P3是S;和P4是E，Q,Nle，或Nva;禾口P5是K;和P6是I,L，V，Nle,或Nva;禾口P7是F;禾口P8是Y,F,Phe(4-F);禾口在P9的是V，I，A,Nva，MeVal,Abu,或V-NH2,或P9是V,并且在P10的PQ是I,L，V,Nle或Nva;禾口PQ+1是X,XX,或XXX,其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸;并且其中所述序列不是KASEKIFYV(SEQIDNO.1);所述分離肽可以包括下述序列或基本上由下述序列組成K{L，V,M,I，D-Ala，D-Val,Nal-2,Aib,Abu，Nle,或Nva)SEKIFYV(SEQIDNO.2);或{F,Phg,Y,Phe(4-F)，Phe(4-N02)，O-甲基-Tyr,或|3-(3-苯并噻吩基陽Ala〉A(chǔ)SEKIFYV(SEQIDNO.3);或(Y,F,或W){V，M,或I)SEKIFYV(SEQIDNO,4);或{F或W}LSEKIFYV(SEQIDNO.5);或K(A,V,或L)SEKIFYI(SEQIDNO.6);或K{L或V}SEKIFYV-NH2(SEQIDNO.7);或FVSEKIFY卩,A，Nva,Abu，或MeVal}(SEQIDNO.8);或FVS(Q，Nle,或Nva}KIFYV(SEQIDNO.9);或FVSEK(L，V,Nle,或Nva}FYV(SEQIDNO.10);或FVSEKIF(F或Phe(4-F))V(SEQIDNO.11);或KASEKIFYV(I或L}(SEQIDNO.12);或KVSEKIFYV{I,L，V,或Nle}(SEQIDNO.13);或KLSEKIFYV{L,V,Nle,或Nva}(SEQIDNO.14)。所述分離肽可以包括下述序列或基本上由下述序列組成K{L,V，M,Abu,Nle,或Nva}SEKIFYV(SEQIDNO.15);或{F或Phg}ASEKIFYV(SEQIDNO.16);或YVSEKIFYV(SEQIDNO.17);或F{L，V，或I}SEKIFYV(SEQIDNO.18);或W{L或I}SEKIFYV(SEQIDNO.19);或K(V或L)SEKIFYI(SEQIDNO.20);或FVSEKIFY(I或Nva}(SEQIDNO.21)。此外，所述分離肽可以包括下述序列或基本上由下述序列組成K0/或L)SEKIFYV(SEQIDNO.22);或《F或Y)ASEKIFYV(SEQIDN0.23);或FVSEKIFYI(SEQIDN0.24);或KVSEKIFYV(SEQIDNO.41)。此外，所述分離肽可以包括或基本上由序列KVSEKIFYV(SEQIDN0.41)組成。所述分離肽可以具有對于I類MHC肽結(jié)合裂口的親和力。所述MHC可以是，例如，HLA-A2。一些實施方案涉及I類MHC/肽復合體，其中所述肽可以具有上文或本文其它地方所述的任一種肽的序列。所述I類MHC/肽復合體可以與識別I類MHC/SSX-241.49復合體的TCR交叉反應(yīng)。所述I類MHC/肽復合體可以是HLA-A2/SSX-24M9復合體。其它實施方案涉及一種包括如上文和本文其它地方所述的肽的多肽，其包埋在釋放序列(liberations叫uence)內(nèi)部。另一實施方案涉及免疫原性組合物，其包括如上文或本文其它地方所述的肽。其它實施方案涉及編碼或者用于表達如上文或本文其它地方所述的多肽的核酸或核酸工具(means)。并且，一些實施方案涉及包括這樣的核酸或核酸工具的免疫原性組合物。一些實施方案涉及誘導、維持、或增強CTL應(yīng)答的方法。所述方法可以包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用如上文和本文其它地方所述的組合物。其它實施方案涉及引發(fā)(entraining)I類MHC限制性T細胞應(yīng)答的方法，所述方法可以包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用如上文或本文其它地方所述的組合物。所述方法還可以包括免疫強化劑的施用。其它實施方案涉及誘導、維持、或引發(fā)CTL應(yīng)答的方法，所述方法可以包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用如上文和本文其它地方所述的組合物。一些實施方案涉及包括在序列KASEKIFYV(SEQIDNO.l)中有1-3個氨基酸取代的分離肽，其具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于KASEKIFYV(SEQIDNO.l)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。解離半衰期可以相似于或大于KASEKIFYV(SEQIDNO.l)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的解離半衰期。所述分離肽可以被具有對肽KASEKIFYV(SEQIDNO.l)的特異性的T細胞識別。其它實施方案涉及包括或基本上由下述序列組成的分離肽，其中PI是K，F(xiàn)，Y，W,Phg，Phe(4-F),Phe(4-N02)，MeTyr,卩-(3-苯并噻吩基)-Ala,或D-Lys;禾口P2是A，L,V,I,M,D-Ala,Nal-2，Abu,Aib,Nle，或Nva;和P3是S;和P4是E，Q，Nle,或Nva;和P5是K;和P6是I，L，V,Nle，或Nva;和P7是F;禾PP8是Y，F(xiàn),Phe(4-F);禾口在P9的PQ是V,I,A，Nva，MeVal,或Abu;其中所述序列不是KASEKIFYV(SEQIDNO.1);或Pl是K,F，Y,W,Phg,Phe(4-F),Phe(4-N02),MeTyr，卩-(3-苯并噻吩基)-Ala，或D-Lys;和P2是V，L,M,Abu,Nle，或Nva;和P3是S;和P4是E，Q，Nle，或Nva;和P5是K;和P6是I，L,V,Nle,或Nva;禾口P7是^禾口P8是Y，F(xiàn),Phe(4-F);禾口在P9的PQ是V,I,A，Nva，MeVal,Abu，或V-NH2;或PI是K,F，Y，W,Phg，Phe(4-F)，Phe(4-N02),MeTyr,(3-(3-苯并噻吩基)-Ala,或D-Lys;和P2是A,L,V，M,Abu,Nle,或Nva;和P3是S;和P4是E，Q,NIe，或Nva;和P5是K;和P6是I，L,V,Nle，或Nva;和P7是F;和P8是Y,F，Phe(4-F);和P9是V;和在PIO的PQ是I或L;或PI是K,F,Y,W，Phg,Phe(4-F)，Phe(4-N02)，MeTyr，(3-(3-苯并噻吩基)-Ala，或D-Lys;禾口P2是V;和P3是S;和P4是E，Q，Nle,或Nva;和P5是K;和P6是I，L，V,Nle,或Nva;和P7是F;和P8是Y，F(xiàn),Phe(4-F);和P9是V;和在P10的PQ是I,L，V，或Nle;或Pl是K，F(xiàn),Y，W，Phg，Phe(4-F)，Phe(4-N02),MeTyr，卩-(3-苯并噻吩基)-Ala,或D-Lys;和P2是L;禾口P3是S;和P4是E,Q，Nle,或Nva;禾口P5是K;和P6是I，L，V,Nle,或Nva;和P7是F;禾口P8是Y，F(xiàn)，Phe(4-F);禾口P9是V;和在P10的PQ是I,L，V,Nle或Nva。一些實施方案涉及包括或基本上由這樣的序列組成的分離肽，其中PO是X,XX或XXX,其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸；和Pl是S，F(xiàn)，K，W或Y;和P2是L,I，V，Nle,或Nva;禾口P3是L;禾口P4是M，L，或N;禾口P5是W;和P6是I，A,L,V，或N;禾口P7是T;禾口P8是Q,E，D，或T;禾口在P9的PQ是C,V,I,L，A,Nva,Nle，V-NH2，或L-NH2;和PQ+1是X,XX,XXX，其中X指定為任何氨基酸或沒有氨基酸；并且其中所述序列不是SLLMWITQ(C,V,I,L，或A}(SEQIDNO.26),FVLMWITQA(SEQIDNO.27),FILMWITQ(L或1}(SEQIDNO.28),YVLMWITL(SEQIDNO.29)或YLLMWIT{I或L}(SEQIDNO.30)。PI是S,F,K,或W;P2是L,I,V,Nle,或Nva;P3是L;P4是M，L,或N;P5是W;P6是I,A,L,V,或N;P7是T;P8是Q，E,D，或T;在P9的PQ是C，V，I,L，A,Nva，Nle，V-NH2，或L-NH2;并且其中所述序列不是SLLMWITQ(C，V，I，L，或A}(SEQIDNO.26),FVLMWITQA(SEQIDNO.27),或FILMWITQ{L或1}(SEQIDNO.28);或PI是Y;P2是L,V，I，Nle,或Nva;P3是L;P4是M,L,或N;P5是W;P6是I,A,L，V，或N;P7是T;P8是Q,E,D,或T;在P9的PQ是V,I,L,Nva,Nle,V，V-NH2，或L-NH2;并且其中所述序列不是YVLMWITL(SEQIDNO.29)或YLLMWIT(I或L}(SEQIDNO.30)。另一實施方案涉及I類MHC/肽復合體，其中所述肽可以具有上文或本文其它地方所述的實施方案中的任何肽的序列。一方面，所述復合體可以與識別I類MHC/NY-ES0-1157.165復合體的TCR交叉反應(yīng)。另一方面，所述復合體可以是HLA-A2/NY-ESO-l157.165復合體。在上述實施方案的一個方面中，所述肽可以具有對于I類MHC肽結(jié)合裂口，諸如HLA-A2的親和力。另一個實施方案涉及一種與釋放序列締合的多肽，其包括本文所述的任何實施方案的肽序列。另一個實施方案涉及包括本文所述的任何肽實施方案的免疫原性組合物。一方面，所述肽可以具有如本文所列出的序列。另一個實施方案涉及編碼本文所述的任何肽實施方案的核酸，但是優(yōu)選地是那些沒有非標準氨基酸取代的核酸。在另一個方面，所述核酸可以編碼在載體內(nèi)。另一個實施方案涉及包括編碼本文所公開的任何肽實施方案的核酸的免疫原性組合物。另一個實施方案涉及誘導CTL應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用本文所公開的實施方案的任何組合物或肽。在另一個方面，所述方法可以允許維持CTL應(yīng)答。在另一個方面，所述方法可以允許增強I類MHC限制性T細胞應(yīng)答。在另一個方面，所述方法可以允許引發(fā)I類MHC限制性T細胞應(yīng)答。在另一個方面，所述方法還可以包括施用免疫強化劑。一些實施方案涉及具有包括天然表位序列中1-3或4個氨基酸取代的序列的分離肽，其中激發(fā)從通過針對具有所述序列的表位免疫而產(chǎn)生的T細胞系產(chǎn)生細胞因子所需要的所述肽的濃度不大于具體的濃度，例如，10pM，1^M,0.3|iM,等。所述1-3或4個氨基酸取代可以包括至少一個標準氨基酸取代和/或至少一個非標準氨基酸取代，等等。所述至少一個非標準氨基酸可以是本文所述的那些中的任一種，例如，標準氨基酸的D-立體異構(gòu)體，Nva,或Nle。所述1-3或4個氨基酸取代可以包括修飾的末端氨基酸，并且所述修飾的末端氨基酸可以是酰胺化的C末端氨基酸。一種取代可以是氨基酸的添加，例如，所述添加可以是C末端添加。其它實施方案涉及具有某種氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包括與靶點相關(guān)抗原片段序列的至少一種差異，所述片段具有已知的或預(yù)測的對于MHC蛋白的肽結(jié)合裂口的親和力，其中所述至少一種差異可以是取代位于所述片段中MHC結(jié)合基序錨定位置的殘基的Nle或Nva。所述錨定位置可以是初級錨定位置，例如，P2或PQ。所述錨定位置可以是輔助性錨定位置。所述差異可以包括取代所述片段中的疏水性殘基的Nle或Nva殘基。在一些方面中，I,L,或V可以是MHC結(jié)合基序錨定位置中的優(yōu)選的殘基。一些方面中，所述肽可以具有約8-約14個氨基酸的長度，或者更優(yōu)選地，例如，9-10個氨基酸的長度。所述MHC蛋白可以是人MHC蛋白，例如，I類HLA蛋白。所述MHC蛋白可以是，例如，諸如HLA-A2,A3，A24,A30,A66，A68,A69，B7，B8,B15,B27,B35，B37，B38，B39，B40，B48,B51,B52，B53,B60，B61,B62,B63,B67,B70,B71，B75,B77，C4,Cwl，Cw3，Cw4，Cw6,Cw7，和CwlO的類型。在一些方面中，所述MHC蛋白可以是HLA-A2或A24。MHC可以具有錨定殘基結(jié)合口袋，其中所述口袋是與HLA-A+0201的B-或F-口袋同源的。負責形成結(jié)合口袋，并且所述結(jié)合口袋容納表位錨定殘基并且由此確定MHC分子的結(jié)合特異性的所述MHC殘基，在本領(lǐng)域內(nèi)是充分理解的。這樣的信息的一種匯編可以在FIMM(功能免疫學)網(wǎng)址以超文本轉(zhuǎn)移鏈接(http:〃)"sdmc.litorg.sg:8080/fimm/."找到。(也可以參見Sch6nbachC.,KohJ丄.Y.，ShengX.,WongL.，和V.Brusic.FIMM，功能分子免疫學數(shù)據(jù)庫。A^c/e/dz'^/^ewc/z(核酸研究)，2000.巻28.No.1222-224;Sch6nbachC.,KohJL,FlowerDR,WongL.,禾PBmsicV.FIMM,功能分子免疫學數(shù)據(jù)庫；2002更新，W"c/e/d油i^ewc/z(核酸研究)，2002.巻30.No.1226-229;以及Zhang,C.等，JMo/.Sz'o/.(分子生物學雜志)281:929-947，1998;它們中的每一個通過參考完全并入本申請中)。并且，所述肽可以具有至少一種結(jié)合特征，所述結(jié)合特征基本上等同于，或好于所述片段對于所述MHC的相應(yīng)的特征。例如，與所述片段相比較，所述結(jié)合特征可以是提高的。例如，在一些實施方案中，所述結(jié)合特征可以是結(jié)合的親和力或穩(wěn)定性。所述肽可以具有基本上等同于，或好于所述片段的免疫原性的免疫原性。所述免疫原性可以被增加。所述免疫原性可以引發(fā)與所述片段交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答，或者可以引發(fā)CTL應(yīng)答。所述免疫原性可以得到評估，例如，應(yīng)用通過測定識別所述肽的免疫應(yīng)答，通過測定識別所述片段的免疫應(yīng)答的MHC-四聚體檢測，細胞因子檢測，細胞毒性檢測，應(yīng)用體外免疫系統(tǒng)，或任何其它適宜的方法。所述免疫系統(tǒng)可以包括人細胞。所述免疫原性可以應(yīng)用體內(nèi)免疫系統(tǒng)進行評估，例如，包括轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫系統(tǒng)。所述肽可以具有如所述片段對于所述MHC的至少相似的結(jié)合特征。例如，在一些方面中，基于本公開內(nèi)容，可以確定認為什么是"相似的"。在一些具體的方面，"相似性"可以基于，例如，用于半最大結(jié)合的肽濃度，相對親和力，穩(wěn)定性(一半解離時間)和交叉反應(yīng)性/功能親和力(avidity)。作為實例，如果它具有在天然肽的值的2倍、甚至是3倍、4倍、5倍或IO倍內(nèi)的結(jié)果或特征，那么可以認為肽是相似的。例如，對于交叉反應(yīng)性/功能親和力，相似的結(jié)果可以是這樣的，即，其中所述數(shù)據(jù)在天然肽的3和10倍之內(nèi)。作為另一個實例，當在天然肽的2,3,4,5,6,7,10,15或20%之內(nèi)時，可以認為結(jié)合值的百分比是相似的。在一些方面中，當在天然序列的2或3倍之內(nèi)時，可以認為EDso值是相似的。例如，相似的半解離時間可以在2或3倍之內(nèi)。作為另一個實例，同野生型約有2倍不同的交叉反應(yīng)性值可以認為是相似的。這些相似的值僅是示例性的，并且在一些實施方案的一些方面的內(nèi)容中給出?；诒疚牡膶嶒灪徒虒В梢源_定其它"相似的"值。所述肽可以與所述片段免疫性交叉反應(yīng)。因此，所述交叉反應(yīng)性可以通過用所述片段免疫和評估所述肽的識別而進行評估。備選地，所述交叉反應(yīng)性可以通過用所述肽進行免疫和評估所述片段的識別而進行評估。例如，可以對上文和本文其它地方所述的肽進行修飾以包括兩種差異。在一些實例中，每種差異可以獨立地包括Nle或Nva殘基。在一些實例中，一種差異可以不是Nle或Nva取代。并且，上文和本文其它地方所述的肽可以包括3種或更多的差異。所述靶點-相關(guān)的抗原可以是腫瘤-相關(guān)抗原。所述靶點-相關(guān)的抗原可以是病原體-相關(guān)的抗原。其它實施方案涉及包括如上述和本文其它地方描述的本發(fā)明肽的免疫原性組合物。其它實施方案涉及免疫方法，其包括給哺乳動物施用這樣的組合物，例如，直接施用到哺乳動物的淋巴系統(tǒng)。其它實施方案涉及制備T細胞表位類似物的方法。所述方法可以包括提供靶點-相關(guān)抗原的片段的氨基酸序列，所述片段可以具有己知的或預(yù)測的對于MHC蛋白的肽結(jié)合裂口的親和力；將與MHC結(jié)合基序的錨定位置相對應(yīng)的序列的至少一個氨基酸改變成Nle或Nva;并且合成包含所改變的序列的肽。例如，所述合成可以是化學合成或任何其它的合成方法。一些實施方案涉及T細胞表位肽類似物，其中所述類似物不同于天然表位肽，其通過用Nle或Nva殘基置換與MHC結(jié)合基序的錨定位置相對應(yīng)的至少一個天然殘基而實現(xiàn)。一些實施方案涉及包括或基本上由這樣的序列組成的分離肽，其中PO是X,XX或XXX,其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸；和Pl是QA,S，Abu或Sar;和P2是L,M,I，Q，V,Nva，Nle，或Abu;禾口P3是P或W;禾口P4是S;和P5是I;禾口P6是P;和P7是V;和P8是H;和P9是P,A,L,S或T;和在P10的PQ是I,L,V,Nva,或Nle;和PQ+1是X,XX，或XXX，其中X指定為任何氨基酸或沒有氨基酸；并且其中所述序列不是GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)。所述分離肽可以包含或基本上由下述序列組成{S，Sar,或Abu)LPSIPVHPI(SEQIDNO.43);或G(M或Nle》PSIPVHPI(SEQIDNO.44);或G(L,I，Nva，或Nle〉WSIPVHPI(SEQIDN0.45);或GLWSIPVHP(Nva或V〉(SEQIDN0.46);或GLPSIPVH(A或S)I(SEQIDNO.47);或GLPSIPVHP(V，L,Nva,或Nle)(SEQIDNO.48);或G{Nle}PSIPVHP{Nva，或Nle)(SEQIDNO.49);或G{Nva)PSIPVHP{Nva}(SEQIDNO.50);或G(V,Nva,或Nle)PSIPVHPV(SEQIDN0.51);或(Sar或Abu)LPSIPVHP(V或Nva》(SEQIDNO.52);或A{V，I，Nva,或Nle)WSIPVHPI(SEQIDNO.53);或AVPSIPVHP(V或Nva)(SEQIDNO.54);或A{Nva}PSIPVHPV(SEQIDNO.55);或ALWSIPVHP(V或Nva)(SEQIDNO.56);或GVWSIPVHP(V或Nva)(SEQIDNO.57);或G{Nva}WSIPVHPV(SEQIDNO.58)。此外，所述分離肽可以包含或基本上由下述序列組成{Abu}LPSIPVHPI(SEQIDNO.59);或G{V，Nva，或Abu)PSIPVHPI(SEQIDNO.60);或GLPSIPVHP(V或Nva)(SEQIDN0.61);或GLWSIPVHP(I或Nva)(SEQIDNO.62);或G{Nle}PSIPVHP{Nva}(SEQIDNO.63);或G(Nle或Nva)PSIPVHPV(SEQIDN0.64);或{A或Abu}LPSIPVHP{V或Nva}(SEQIDNO.65);或G{Nva}WPSIPVHP{I或V)(SEQIDNO.66);或A{Nva或Nle}WSIPVHPI(SEQIDNO.67);或A(V或Nva}PSIPVHPV(SEQIDNO.68)。特別地，所述分離肽可以包含或基本上由下述序列組成{Abu}LPSIPVHPI(SEQIDNO.59);或GLPSIPVHP(V或Nva》(SEQIDNO.61);或GLWSIPVHPI(SEQIDNO.69);或G{Nle}PSIPVHP{Nva}(SEQIDNO.63)。優(yōu)選地，所述分離肽可以包含或基本上由下述序列組成GLPSIPVHPV(SEQIDNO.70)。所述肽可以具有對于I類MHC肽結(jié)合裂口的親和力，并且所述I類MHC可以例如是，HLA-A2。其它實施方案涉及I類MHC/肽復合體，其中所述肽具有上文及本文其它地方所述的肽序列。I類MHC/肽復合體可以與識另lJI類MHC/PSMA28s.297復合體的TCR交叉反應(yīng)。所述I類MHC/肽復合體可以是HLA-A2/PSMA288.297復合體。一些實施方案涉及包括如上文及本文其它地方所述的肽序列的多肽，所述肽序列包埋在釋放序列內(nèi)。其它實施方案涉及包含上文及本文其它地方所述的肽的免疫原性組合物。其它實施方案涉及編碼或者用于表達如上文及本文其它地方所述的多肽的核酸或核酸工具(means)，以及包括所述核酸或核酸工具的免疫原性組合物。一些其它的實施方案涉及誘導、維持、或增強CTL應(yīng)答的方法。所述方法可以包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用如上文及本文其它地方所述的組合物。此外，一些方法涉及引發(fā)I類MHC-限制性T細胞應(yīng)答的方法，所述方法可以包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用如上文及本文其它地方所述的組合物。所述方法還可以包括免疫強化劑的施用。其它實施方案涉及包括在序列GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)中有1-3個取代的分離肽，其具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。半解離時間可以相似于或大于GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)從所述I類MHC結(jié)合裂口半解離的時間。所述分離肽可以被具有針對肽GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)的特異性的T細胞識別。一些實施方案涉及包含這樣的序列或基本上由其組成的分離肽，其中P0是X，XX，或XXX，其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸；和P1是S,K，F(xiàn)，Y,T,Orn，或Hse;和P2是L,V，M，I,Nva,Nle，或Abu;和P3是L,Nva,Me或Abu;和P4是Q;禾口P5是H;和P6是L,Nva，Nle,或Abu;禾口P7是I;和P8是G，A,S，或Sar;和在P9的PQ是L，V，I，A,Nle，Nva,Abu,或L-NH2;禾口PQ+1是X，XX,或XXX，其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸；并且其中所述序列不是SLLQHLIGL(SEQIDNO.71)。所述分離肽可以包含或基本上由下述序列組成{K,F,Y,T,Orn,或Hse〉LLQHLIGL(SEQIDNO,72);或S{V,M,I,Nva，Nle,或Abu)LQHLIGL(SEQIDNO.73);或SL(Nva，Nle或Abu}QHLIGL(SEQIDNO.74);或SLLQH{Nva,Nle或Abu}IGL(SEQIDNO.75);或SLLQHLI(A,S，或Sar}L(SEQIDNO.76);或SLLQHLIG(V,I，A,Nle，Nva，Abu,或L-NH2}(SEQIDNO.77);或{F,Y，T，Om,或Hse}{Nva，Nle,M,或"LQHLIGL(SEQIDNO.78);S{Nva,Nle,或M)LQHLIG《Nva，Nle，或V)(SEQIDNO.79);或{K,F，Y,T,Om,或Hse)LLQHLIGV(SEQIDNO.80);或{F或T}LLQHLIG{Nle}(SEQIDNO.81);或{F或T){Nva或M}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO.82)。此外，所述分離肽可以包含或基本上由下述序列組成(F，Y,T,Om,或Hse)LLQHLIGL(SEQIDNO.83);或S(Nva，Nle,或M)LQHLIGL(SEQIDNO.84);或SLLQHLIG(Nle，Nva，或L-NH2}(SEQIDNO.85);或SLLQH{Nva或Abu}IGL(SEQIDNO.86);或S{Nva}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO.87);或{F或T}{L或Nva}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO.88)。此外，所述分離肽可以包含或基本上由下述序列組成S(L或Nva〉LQHLIG(Nle》(SEQIDNO.89);或T{Nva}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO.90)。所述分離肽可以包含或基本上由序列S(Nva)LQHLIG(Nle)(SEQIDNO.87)組成。所述分離肽可以具有對于I類MHC肽結(jié)合裂口的親和力，并且例如，所述I類MHC可以是HLA-A2。實施方案涉及I類MHC/肽復合體，其中所述肽可以具有上文及本文其它地方所公開的肽序列。I類MHC/肽復合體可以與識別I類MHC/PRAME^.433復合體的TCR交叉反應(yīng)。所述I類MHC/肽復合體可以是HLA-A2/PRAME425.433復合體。其它實施方案涉及包括如上文及本文其它地方所述的肽序列的多肽，所述肽序列與釋放序列締合。其它實施方案涉及包含上文及本文其它地方所述的肽的免疫原性組合物。一些實施方案涉及編碼和用于表達如上文及本文其它地方所述的多肽的核酸和核酸工具，以及包括所述核酸及工具的免疫原性組合物。一些其它的實施方案涉及誘導、維持、或增強CTL應(yīng)答的方法，所述方法可以包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用如上文及本文其它地方所述的組合物。一些實施方案涉及引發(fā)I類MHC-限制性T細胞應(yīng)答的方法，所述方法可以包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用如上文及本文其它地方所述的組合物。在一些實施方案中，所述方法還包括免疫強化劑的施用。一些實施方案涉及包括在序列SLLQHLIGL(SEQIDNO.71)中有1-3個取代的分離肽，其具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于SLLQHLIGL(SEQIDNO.71)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。半解離時間可以相似于或大于SLLQHLIGL(SEQIDNO.71)從所述I類MHC結(jié)合裂口半解離的時間。所述分離肽可以被具有針對肽SLLQHLIGL(SEQIDNO.71)的特異性的T細胞識別。其它實施方案涉及產(chǎn)生并且獲得包括(representing)免疫活性的并且在一個或多個MHC錨定殘基攜帶非天然氨基酸的肽的組合物的方法。本發(fā)明的另一個實施方案涉及pSEM質(zhì)粒以及由這一質(zhì)粒表達的與Melan-A26.35和/或酪氨酸酶，377表位相對應(yīng)的免疫原性肽。pSEM質(zhì)粒以允許它們通過pAPCs表達并且呈遞的方式而編碼Melan-A和酪氨酸酶表位。pSEM質(zhì)粒的詳細信息在美國專利申請公布號20030228634中公開，所述專利申請通過引用完全結(jié)合于此。在本發(fā)明的具體的實施方案中，提供由pSEM質(zhì)粒表達的免疫原性肽的分離的肽類似物，其基本上由下述序列組成E{A,L,Nva，或Nle)AGIGILT(V,Nva,或Nle}(SEQIDNO.91);或Y{M,V,Nva,或Nle}DGTMSQ{V，Nva,或Nle}(SEQIDNO.92);并且其中所述序列不是E(A或L}AGIGILTV(SEQIDNO.93)或YMDGTMSQV(SEQIDNO.94)。本發(fā)明的分離肽類似物可以選自由下列各項組成的組ELAGIGILTNva(SEQIDNO.95)，ENvaAGIGILTV(SEQIDNO.96)，YVDGTMSQNva(SEQIDNO.97),YVDGTMSQV(SEQIDNO.98)和YMDGTMSQNva(SEQIDNO.99)。在其它實施方案中，所述分離肽類似物是基本上由氨基酸序列ENvaAGIGILTV(SEQIDNO.96)組成的類似物。在其它實施方案中，所述分離肽類似物是基本上由氨基酸序列YMDGTMSQNva(SEQIDNO.97)組成的類似物。在其它實施方案中，所述肽具有針對I類MHC肽結(jié)合裂口的親和力。所述I類MHC是HLA-A2。本發(fā)明的其它實施方案涉及包括在序列EAAGIGILTV(SEQIDNO.100)中有l(wèi)-3個取代的分離肽類似物，其具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于EAAGIGILTV(SEQIDNO.IOO)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。在其它實施方案中，半解離時間相似于或大于EAAGIGILTV(SEQIDNO.IOO)從所述I類MHC結(jié)合裂口半解離的時間。在其它實施方案中，所述分離肽被具有針對肽EAAGIGILTV(SEQIDNO.IOO)的特異性的T細胞識別。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包括在序列YMDGTMSQV(SEQIDNO.94)中有l(wèi)-3個取代的分離肽類似物，其具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于YMDGTMSQV(SEQIDNO.94)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。在其它實施方案中，半解離時間相似于或大于YMDGTMSQV(SEQIDNO.94)從所述I類MHC結(jié)合裂口半解離的時間。在其它實施方案中，所述分離肽被具有針對肽YMDGTMSQV(SEQIDNO.94)的特異性的T細胞識別。本發(fā)明的實施方案還涉及I類MHC/肽復合體，其中所述肽具有下述肽序列E(A,L,Nva，或Nle)AGIGILT(V，Nva，或Nle〉(SEQIDNO.91);或Y{M,V,Nva,或Nle〉DGTMSQ(V，Nva，或Nle〉(SEQIDNO.92);并且其中所述序列不是E{A或L}AGIGILTV(SEQIDNO.93)或YMDGTMSQV(SEQIDN0.94)。在其它實施方案中，所述I類MHC/肽復合體與識另lJl類MHC/Mdan垂A26.35復合體的TCR交叉反應(yīng)。所述I類MHC/肽復合體是HLA-A2/Melan-A26.35復合體。在另一個實施方案中，所述I類MHC/肽復合體與識別I類MHC/酪氨酸酶369.377復合體的丁01交叉反應(yīng)。所述I類MHC/肽復合體是HLA-A2/酪氨酸酶369-377復合體。本發(fā)明的一些實施方案涉及包括包埋在釋放序列內(nèi)的下列肽序列的多肽E(A，L,Nva,或Nle〉A(chǔ)GIGILT(V，Nva，或Nle)(SEQIDNO.91);或Y{M，V,Nva，或Nle}DGTMSQ{V，Nva，或Nle〉(SEQIDNO.92);其中所述序列不是E(A或L)AGIGILTV(SEQIDNO.93)或YMDGTMSQV(SEQIDNO.94)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包括下述的任何肽的免疫原性組合物E{A,L,Nva,或Nle)AGIGILT(V,Nva,或Nle)(SEQIDNO.91);或Y(M,V,Nva,或Nle)DGTMSQ(V,Nva，或Nle〉(SEQIDNO.92);并且其中所述序列不是E(A或L}AGIGILTV(SEQIDNO.93)或YMDGTMSQV(SEQIDNO.94)。本發(fā)明還涉及包括含有下述任何肽的多肽的免疫原性組合物E{A,L,Nva，或Nle)AGIGILT(V,Nva,或Nle》(SEQIDNO.91);或Y(M，V，Nva，或Nle)DGTMSQ(V，Nva，或Nle〉(SEQIDNO.92)，并且涉及編碼這樣的多肽的核酸。本發(fā)明的實施方案還涉及包括所述核酸的免疫原性組合物。本發(fā)明的免疫原性組合物可以作為針對癌癥諸如成膠質(zhì)細胞瘤(glioblastoma)和黑素瘤的免疫策略的引發(fā)部分而施用，但是并不限于此。另外，與Mdan-A26.35和酪氨酸酶369.377表位及表位類似物相對應(yīng)的肽可以作為同一免疫策略的增強部分而施用。在優(yōu)選的實施方案中，所述肽類似物E(A，L,Nva,或Nle)AGIGILT(V,Nva,或Nle)(SEQIDNO.91);或Y{M,V，Nva，或Nle)DGTMSQ(V,Nva，或Nle)(SEQIDNO.92)可以用于增強步驟。本發(fā)明所用的引發(fā)-和-增強流程如在美國專利公布號20050079152和美國臨時專利申請?zhí)?0/640,402中更詳細地公開，二者的題目皆為METHODSTOELICIT,ENHANCEANDSUSTAINIMMUNERESPONSESAGAINSTMHCCLASSI-RESTRICTEDEPITOPES,FOR激發(fā)、增強并且維持針對I類MHC-限制性表位的免疫應(yīng)答的;法)，其每一個都通過引用完全結(jié)合于此。因此，在一個實施方案中，提供誘導、維持或增強CTL應(yīng)答的方法。所述方法可以包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用包括編碼某種多肽的核酸的免疫原性組合物，所述多肽包括由pSEM質(zhì)粒表達的免疫原性肽的肽序列，所述肽序列基本上由下述序列組成E{A，L,Nva,或Nle)AGIGILT(V,Nva,或Nle)(SEQIDNO.91);或Y(M,V，Nva,或Nle)DGTMSQ(V,Nva，或Nle〉(SEQIDN0.92)。在其它實施方案中，提供一種引發(fā)I類MHC-限制性T細胞應(yīng)答的方法，所述方法包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用免疫原性組合物和免疫強化劑。在其它實施方案中，提供誘導、維持或引發(fā)CTL應(yīng)答的方法，所述方法包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用本文公開的任何免疫原性組合物。附圖簡述圖1A和B總結(jié)對于SSX-24M9類似物分別在九聚體(nonamer)和十聚體的每個單獨的氨基酸位置的取代。圖2是鑒定類似物的優(yōu)選實施方案方法的示意圖。圖3是顯示在單一位置取代的SSX-24M9類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖4是顯示在兩個位置取代的SSX-24M9類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖5是顯示在多于兩個位置取代的SSX-24L49類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖6是顯示包括指定(nominal)的41-49肽的SSX-2化49十聚體類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖7是顯示SSX-24M9類似物注射時間表的圖表。圖8是顯示SSX-24M9A42V、A42L類似物和野生型在腫瘤細胞裂解物中的活性的柱狀圖。圖9是顯示對于體內(nèi)細胞毒性研究和離體(exWW)細胞毒性研究的注射時間表以及用于加強的SSX-24M9類似物肽的時間表。圖IO是顯示與對照(野生型肽)和EAA(Mdan-A26-35)相比，許多類似物的體內(nèi)特異性裂解結(jié)果的表格。圖11是顯示與對照(野生型肽)和EAA相比，許多SSX-24M9類似物的體內(nèi)特異性裂解結(jié)果，以及MHC結(jié)合和MHC穩(wěn)定性的表格。圖12是顯示與野生型對照相比，用許多類似物免疫后所獲得的腫瘤細胞(624.38人腫瘤細胞)的特異性裂解百分數(shù)的柱狀圖。圖13A-C是總結(jié)分別在九聚體和十聚體的每個單獨的氨基酸位置的取代，以及對于每個所獲得的結(jié)果的表格。圖14是顯示對于分析和檢測NY-ESO-l類似物所用的注射時間表的時間表。圖15A-C顯示當通過從受激發(fā)的動物移除脾和PBMC并且通過流式細胞術(shù)測量CFSE熒光所測量的靶細胞的特異性消除。圖16A和B是顯示在用NY-ES0-1類似物加強后，針對用野生型肽包被的靶細胞的體內(nèi)細胞毒性的柱狀圖。圖17A和B是顯示當通過細胞因子的產(chǎn)生進行評估時，對所述類似物引發(fā)針對所述野生型表位的增強的免疫性的能力的離體分析的柱狀圖。圖18圖示用于確認PSMA288.297表位的抗原性的流程，以及所述檢測的結(jié)果。圖19是顯示在單一位置取代的PSMA288.297類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖20是顯示在兩個位置取代的PSMA288一297類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖21是顯示在多于兩個位置取代的PSMA288—297類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖22是顯示通過Elisp0t測定的各種PSMA288.297類似物的免疫原性的柱狀圖。圖23是顯示通過Elispot測定的I297V類似物抗-PSMA288.297應(yīng)答的增強的線狀圖。圖24是顯示用I297V類似物加強的結(jié)果的柱狀圖。所述檢測顯示所述加強導致針對PSMA+人腫瘤系的細胞毒性免疫性。圖25圖示確認PRAME425433表位抗原性的流程，以及所述檢測的結(jié)果。圖26是顯示在單一位置取代的PRAME425-433類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖27A和B是顯示在兩個位置取代的PRAME425.433類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖28是顯示在多于兩個位置取代的PRAME425-433類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力的表格。圖29是顯示通過Elispot測定的PRAME425.433類似物的免疫原性的柱狀圖。圖30顯示使用L426NvaL433Nle類似物進行加強的結(jié)果。所述檢測表明所述加強導致針對天然表位包被的細胞的細胞毒性免疫性。圖31顯示用于PRAME類似物的體內(nèi)評估的流程，以及顯示所述評估的結(jié)果的柱狀圖。圖32顯示在類似物誘導的、天然表位重新刺激的T細胞內(nèi)產(chǎn)生細胞因子的離體剌激的流程，及顯示所述評估的結(jié)果的柱狀圖。圖33是顯示用L426NvaL433Nle類似物進行加強的結(jié)果的柱狀圖。所述檢測表明所述加強導致針對人腫瘤細胞系的細胞毒性免疫性。圖34描述針對PRAME425-433體外免疫的流程。圖35顯示在用PRAME425433類似物體外免疫后四聚體分析的結(jié)果。圖36描述質(zhì)粒pCTLR2的結(jié)構(gòu)，其為表達PRAME425.433表位的質(zhì)粒，。圖37是顯示其中人腫瘤細胞(624.38)被T細胞裂解的實驗的檢測結(jié)果的柱狀圖，其中所述T細胞用質(zhì)粒DNA激活并且用肽加強。圖38是顯示在用丁乂1"369.377質(zhì)粒激活和用V377Nva類似物肽加強后的四聚體分析的結(jié)果的柱狀圖。圖39是顯示針對類似的酪氨酸酶和MdanA表位的體內(nèi)應(yīng)答的柱狀圖。圖40是顯示酪氨酸酶類似物免疫原性評估流程的時間表。圖41是顯示針對與來自HHD的效應(yīng)細胞接觸的624.38細胞的免疫應(yīng)答結(jié)果的柱狀圖，所述HHD用質(zhì)粒激活并且用丁^369.377類似物加強。優(yōu)選實施方案詳述包含T細胞表位的肽通常是弱免疫原或免疫調(diào)節(jié)劑，原因在于下列多種因素的一種亞最佳的藥物代謝動力學模式，與MHC分子的有限結(jié)合(減小的K。n和增加的K。ff)，或在正常免疫所有組成成分中存在的T細胞的減少的內(nèi)在識別(例如，通過各種形式的耐受性)。已經(jīng)尋找了許多方法來提高肽的免疫特性，特別是其序列不同于天然表位的肽的篩選和應(yīng)用。在本領(lǐng)域內(nèi)，這樣的類似物通過各種命名而已知，諸如雜環(huán)(heterodytic)肽和改變的肽配體(APL)。這樣的類似物的產(chǎn)生最經(jīng)常地應(yīng)用來自于遺傳編碼的殘基的標準形式的氨基酸(參見，例如，Valmori，D.等.，J/mmw"o/.(免疫學雜志)160:1750-1758,1998)。典型地，非標準氨基酸的應(yīng)用與提高所述肽的生化穩(wěn)定性的努力相關(guān)(參見，例如，Blanchet,J,S.等.，J/mm柳o/.(免疫學雜志)167:5852-5861,2001)。一般地，可以將類似物分類成下述兩種主要類別(1)修飾肽錨定殘基，以獲得更好的HLA結(jié)合模式和更高的免疫應(yīng)答，和(2)修飾肽錨定殘基和TCR接觸殘基，以避免T細胞對自身抗原的耐受性。本文所述發(fā)明的一些實施方案涉及具有至少一種下述保留的或提高的特性的類似物，其包括但不限于1.與TCR的交叉反應(yīng)性和功能親和力；2.與I類MHC結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性；3.對免疫性的體內(nèi)作用，通過細胞毒性進行評估；4.對免疫性的體內(nèi)作用，通過IFN-Y的離體產(chǎn)生進行評估；禾口/或5.對蛋白質(zhì)水解的增加的抗性。一些實施方案涉及肽序列，其包括類似物，其中所述序列的氨基酸用位置指示顯示，例如，P1,P2,P3,PQ等。另外，所述肽序列可以顯示為包括P0禾卩/或PQ+1指示。在一些方面中，P0可以是X,XX,或XXX，其中X是任何氨基酸或沒有氨基酸。類似地，在一些方面中，PQ+1可以是X,XX，或XXX，其中X是任何氨基酸或沒有氨基酸。因此，例如，XXX可以意指任何氨基酸殘基的任何組合或沒有氨基酸殘基。因此，這些實施方案可以包括在特定序列的N端或C端具有多達3個添加的氨基酸(具有氨基酸殘基的任何組合)的多肽。并且，在一些方面中，所述實施方案可以在N端或C端不包括另外的氨基酸殘基。在本領(lǐng)域內(nèi)很好理解負責形成結(jié)合口袋的MHC殘基，哪個結(jié)合口袋容納表位錨定殘基，并且因此定義MHC分子的結(jié)合特異性。這樣的信息的一種匯編可以在FIMM(功能免疫學)網(wǎng)址以超文本轉(zhuǎn)移鏈接(http:〃)"sdmc.lit.org.sg:8080/fimm/."找到，將其全部內(nèi)容并入本文作為參考。(還可以參見Sch3nbachC.,KohJ丄.Y.,ShengX.，WongL.，和V.Brusic.FIMM，adatabaseoffimctionalmolecularimmunology(功倉旨分子免疫學數(shù)據(jù)庫).NucleicAcidsResearch(核酸研究)，2000.巻28.No.1222-224;禾口Sch6nbachC.，KohJL,FlowerDR，WongL.,和BrusicV.FIMM,功能分子免疫學數(shù)據(jù)庫；2002更新。NucleicAcidsResearch(核酸研究)，2002.巻30.No.1226-229;它們中的每一個通過參考完全并入本申請中)。當用于本文時，短語"釋放序列"是指包括或編碼表位或類似物的肽，其被包埋在更大的序列中，所述更大的序列提供容許所述表位或類似物通過免疫蛋白酶的加工，直接地或者與N端修剪或其它生理性過程組合，而被釋放出來的背景環(huán)境(context)。在一些方面中，所述類似物或表位可以是設(shè)計的或被改造的。其它實施方案涉及表位陣列和其它多肽，其包括可以被處理而釋放所述類似物的表位類似物序列。其它實施方案涉及核酸，特別是DNA質(zhì)粒，其編碼所述多肽，或只是編碼類似物，以及它們從所述核酸的表達。所述類似物、包含它們的多肽、和編碼核酸可以全部都是免疫原性組合物的成分，特別是適于淋巴內(nèi)遞送的組合物，所有這些組合物涉及其它實施方案。具有提高的免疫特性的肽類似物可以通過修飾參與同MHC分子相互作用的錨定殘基而設(shè)計，以增加結(jié)合并且穩(wěn)定MHC-肽復合體的形成。這樣的修飾可以由限制性MHC分子的結(jié)合基序或優(yōu)選錨定殘基的知識而指導。還存在可以用來預(yù)測攜帶各種取代的類似物的特性的各種規(guī)則、指標和運算法則，限制條件是，所述取代選自遺傳可編碼的氨基酸的標準系列。然而，沒有預(yù)測用非標準氨基酸置換錨定殘基的結(jié)果的數(shù)據(jù)庫或運算法則，并且先前沒有充分研究它們的有效性。本文公開了非標準氨基酸正亮氨酸(Nle)和正纈氨酸(Nva)可以有利地取代MHC-結(jié)合肽的錨定殘基位置。優(yōu)選地，它們應(yīng)該被置于由疏水性或大的氨基酸，特別是I、L、或V有利占據(jù)的位置。MHC-結(jié)合基序通常依據(jù)在8-10個氨基酸跨度內(nèi)指定位置的優(yōu)選殘基側(cè)鏈而定義(參見，例如，Rammensee等.，"MHCLigandsandPeptideMotifs，(MHC配體和肽基序)"(MolecularBiologyIntelligenceUnit(分子生物學信息所))，Springer-Verlag，德國，1997蘭迪斯生物科學(LandesBioscience),奧斯汀，德克薩斯州；和Parker,等.，"SchemeforrankingpotentialHLA-A2bindingpeptidesbasedonindependentbindingofindividualpeptideside-chains,(基于單個肽側(cè)鏈的獨立結(jié)合排列潛在的HLA-A2結(jié)合肽的方案)"J.Immunol.(免疫學雜志)152:163-175)。網(wǎng)上運算法則也是可用的，其可以用來預(yù)測MHC結(jié)合。參見，例如，Hans-GeorgRammensee,JuttaBachmann,NielsEmmerich,StefanStevanovic的全球網(wǎng)頁SYFPEITffl:關(guān)于MHC配體和肽基序的國際互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(AnInternetDatabaseforMHCLigandsandPeptideMotifs)(超文本轉(zhuǎn)移鏈接訪問通過syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)，禾口"bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind"。對于I類-限制性表位，C端位置，PQ，典型地是初級錨定基。第二個位置，P2，也通常是初級錨定基，或者，備選地，P3和/或P5可以起到這種作用。位置P2到P7都被認為是用于一種或另一種MHC的次級或輔助性錨定位置(參見Rammensee等.，和參見美國專利申請公布號20030215425的表6(美國專利申請?zhí)?0/026,066，于2001年12月7日遞交，題目為EPITOPESYNCHRONIZATIONINANTIGENPRESENTINGCELLS(抗原呈遞細胞中的表位同步性)；其通過參考將其全部公開內(nèi)容完全并入本申請中)。對于II類-限制性表位，Pl，P4,P6,P7和P9已被認為是錨定位置。前述內(nèi)容意欲作為一般指導，并且應(yīng)該被視為是示例性的而不是詳盡的或限制性的。結(jié)合基序、錨定殘基等的許多分析和匯編可以在科學和專利文獻中以及在國際互聯(lián)網(wǎng)上找到。當與本文的教導相結(jié)合時，它們的慣例和結(jié)果進一步為本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供關(guān)于設(shè)計表位類似物的有用的指導。實際上結(jié)合到呈遞MHC分子上的肽的長度可以比指定的基序序列更長。II類MHC分子的結(jié)合裂口末端是開放的，以便所結(jié)合的肽可以在核心基序的任一端延伸。相反，在I類MHC分子中所述結(jié)合裂口在兩端是閉合的，以致所結(jié)合的肽的末端通常必須與所述基序相對應(yīng)，然而，長度上的顯著變化可以通過將所結(jié)合的肽的中心區(qū)域凸起和折疊而進行調(diào)整，以致長度上多達至少大約14個氨基酸的肽可被呈遞(參見，例如，Probst-Kepper,M.等.，/附mw"o/.(免疫學雜志)173:5610-5616,2004)。表位類似物可以具有關(guān)于與I類MHC分子相互作用的提高的K^和K。ff，以及保留的或增加的與識別初始表位的T細胞受體的相互作用，在特異性T細胞群體增加的擴展中所反映出來的改進的或提高的體內(nèi)或離體活性，通過特異性T細胞的提高的細胞因子生產(chǎn)，或針對攜帶天然表位的耙點的體內(nèi)或體外細胞毒性，所述細胞毒性由與所述肽反應(yīng)的T細胞介導。另外，這樣的類似物可以以更理想的方式與多種不同的I類MHC分子相互作用。這樣具有提高的免疫特性的肽類似物可以包括一種或多種取代，其包括一種或多種非標準氨基酸取代。在非標準氨基酸取代中，由于，如下文示例，它們不但可以提高與I類MHC的相互作用，而且可以保持與對天然表位特異性的TCR的交叉反應(yīng)性，并且表現(xiàn)出提高的體內(nèi)免疫模式，所以由正纈氨酸或正亮氨酸組成的對初級錨定殘基的取代是優(yōu)選的。例如，將P2氨基酸殘基從A、L或V突變成正纈氨酸或正亮氨酸，改善了免疫特性，并且因此是優(yōu)選的。另外，將C端殘基修飾成正纈氨酸或優(yōu)選地正亮氨酸，改善了所述類似物的免疫特征。另外，包括在初級和/或次級錨定殘基的多種取代的類似物可以與改善的免疫特性相關(guān)，所述類似物包括在P2或PQ的正纈氨酸和/或正亮氨酸。正纈氨酸(Nva)和正亮氨酸(Nle)的某些應(yīng)用在美國專利號6,685,947、PCT公布號WO03/076585A2和WO01/62776Al以及美國專利公布號20040253218A1中提及。這些參考文獻沒有教導在MHC結(jié)合肽的錨定位置取代的Nva或Nle提高免疫特性的一般用途。所述'218公布教導所取代的殘基應(yīng)該結(jié)合在TCR-相互反應(yīng)位置，而不是MHC-相互反應(yīng)位置。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述肽是衍生于NS-特異性抗原的肽的類似物，所述NS-特異性抗原是免疫原性的但不是致腦炎性的。用于這一目的最適宜的肽是那些其中致腦炎性自身肽在T細胞受體(TCR)結(jié)合位點而不是在MHC結(jié)合位點被修飾的肽，以致免疫應(yīng)答被激活而不是使之無反應(yīng)性(Karin等，1998;Vergelli等，1996)。其他人還提議各種非標準氨基酸可以被取代而并不破壞肽的用途(參見，例如WO02/102299A)。非標準氨基酸還可以用來研究TCR和MHC-肽復合體之間的相互作用(參見，例如WO03/076585A和Sasada,T.等.Eur.J.Immunol.(歐洲免疫學雜志)30:1281-1289,2000)。Baratin顯示了在由鼠MHC分子H2-Db呈遞的p53肽中Nle和Abu在非錨定位置和Nle在錨定位置的一些應(yīng)用(J.PeptideSci.(肽科學雜志)8:327-334,2002)。上述文件的每一個都通過引用完全結(jié)合于此。WO01/62776中所公開的結(jié)合Nle的HLA-A2.1-限制性肽衍生于CEA、p53、禾卩MAGE-3。在CEA肽I(Nle)GVLVGV禾Qp53肽S(Nle)PPPGTRV(SEQIDNO.IOI)中，Nle存在于P2位置。沒有提供關(guān)于正亮氨酸的一般用途的教導，并且沒有提供當與天然序列比較時，表明這些取代怎樣或者是否改變所述類似物的特性的公開內(nèi)容。本發(fā)明實施方案的一些涉及在促進與MHC結(jié)合的位置結(jié)合Nva和/或Nle的表位類似物。一些實施方案特異地排斥在HLA-A2.1-限制性表位，來自CEA、p53、禾口/或MAGE-3的HLA-A2.1表位，或衍生于MAGE-3、CEA、禾口/或p53的其它肽中應(yīng)用Nle禾口/或Nva。在一些實施方案中，特異性排除了在上述引用的專利參考文獻中公開的一種或多種具體序列。在其它實施方案中，排除鼠或其它非人MHC-限制性表位的類似物。其它示例性實施方案包括Nle和/或Nva在P3、P5、和/或PQ錨定位置、在輔助性錨定位置的應(yīng)用，以在不是衍生于癌基因或胎性癌蛋白的肽的錨定位置，和在衍生于CT抗原的肽的錨定位置制備非-A2-或非-A2.1-HLA限制性表位的類似物。一般地，這樣的類似物可以有效用于各種疾病，諸如感染、癌癥或炎癥疾病的免疫治療和/或預(yù)防，其作為單一藥劑或在組合治療中而應(yīng)用。這是由于它們與MHC分子和T細胞受體的最優(yōu)化相互作用，其是免疫應(yīng)答發(fā)生和調(diào)控的關(guān)鍵。類似物制備所述類似物可以應(yīng)用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法而制備，包括應(yīng)用肽合成方法，或表達編碼需要的肽類似物的核酸而制備所述肽。因此，當所述類似物包括一種或多種非標準氨基酸時，更可能地，它們通過肽制備方法而產(chǎn)生。當所述類似物僅包括一種或多種標準氨基酸的取代時，它們可以應(yīng)用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法從表達載體表達出來。備選地，所述肽可以應(yīng)用基因治療方法而表達。類似物檢測為了評估類似物的有效性和/或活性、和/或改善的特性并且以任何方式將所述類似物與野生型相比較，進行一種或多種下述檢測對于hla-a*0201的肽結(jié)合親和力；肽-hla-aw201復合體穩(wěn)定性檢測；交叉反應(yīng)性檢測(通過野生型肽-特異性的ctl識別肽類似物，或通過應(yīng)用肽類似物所產(chǎn)生的ctl來識別野生型肽)；免疫原性檢測，諸如IFN-y分泌檢測，細胞毒性檢測，和/或Elispot檢測；抗原性檢測，諸如體外腫瘤細胞裂解檢測，離體腫瘤細胞裂解，和體內(nèi)腫瘤細胞裂解；以及蛋白質(zhì)水解檢測，以鑒定對蛋白質(zhì)水解的增加的抗性。示例性檢測的詳細內(nèi)容在下述實施例中陳述。應(yīng)用上述方法，鑒定有用的和/或改善的類似物。對于有用，類似物可以不必在所述被鑒定的檢測中被發(fā)現(xiàn)是改善的。例如，有用的肽可以含有其它特性，諸如在耐受性患者中有用或抗蛋白質(zhì)水解。對于改善，可以發(fā)現(xiàn)肽在與tcr結(jié)合、與mhc分子結(jié)合中具有明顯的提高，并且有提高的免疫應(yīng)答或任何其它生物活性。在一些實例中，當應(yīng)用鼠檢測系統(tǒng)時，有用的肽似乎不是改善的，但是由于在人免疫系統(tǒng)中的差異，當在人中檢測時確定是改善的。在一些情形中，所述的有用性可以源于在耐受性患者中破壞耐受的能力。在一些實例中，所述有用性可以源于這樣的能力，艮P，應(yīng)用所述肽作為基礎(chǔ)用于進一步的取代以鑒定改善的類似物。類似物的應(yīng)用應(yīng)用所公開的類似物誘導、引發(fā)(entraining)、維持、調(diào)控并且增強I類MHC-限制性T細胞應(yīng)答、和特別是針對抗原的效應(yīng)和記憶CTL應(yīng)答的有效方法在下列各項中描述美國專利號6,994,851(2/7/06)和6,977,074(12/20/2005)，二者題目皆為"AMethodofInducingaCTLResponse"("誘導CTL應(yīng)答的方法")；美國臨時申請?zhí)?0/479,393,于2003年6月17日提交，題目為"METHODSTOCONTROLMHCCLASSI-RESTRICTEDIMMUNERESPONSE"("控制I類MHC-限制性免疫應(yīng)答的方法")；和于2004年12月29日提交的美國專利申請?zhí)?0/871，707(公布號20050079152)和臨時美國專利申請?zhí)?0/640,402，二者題目皆為"METHODSTOELICIT,ENHANCEANDSUSTAINIMMUNERESPONSESAGAINSTMHCCLASSI-RESTRICTEDEPITOPES,FORPROPHYLACTICORTHERAPEUTICPURPOSE"("用于預(yù)防或治療目的，激發(fā)、增強并且維持針對I類MHC-限制性表位的免疫應(yīng)答的方法")。所述類似物還可以用于研究中，以獲得進一步優(yōu)化的類似物。許多管家表位在下列各項中提供美國申請?zhí)?0/117,937，于2002年4月4日提交(公布號20030220239Al)，和10/657,022(20040180354)，和PCT申請?zhí)朠CT/US2003/027706(公布號WO04022709A2)，于2003年9月5號提交；和美國臨時申請?zhí)?0/282,211，其于2001年4月6日提交；60/337,017,其于2001年11月7日提交;60/363,210，于2002年3月7日提交；和60/409,123，其于2002年9月5日提交；這些申請的每一個題目都是"EPITOPESEQUENCES"("表位序列")。所述類似物還可以用于這些申請中所描述的各種模式中的任一種。表位簇，其可以包括或含有本發(fā)明類似物，在美國專利申請?zhí)?9/561，571中公開并且更加充分地定義，所述美國專利申請?zhí)?9/561，571于2000年4月28日提交，題目為"EPITOPECLUSTERS"("表位簇")。應(yīng)用和遞送本發(fā)明類似物的方法學在美國專利申請09/380,534和6977074(2005年12月20日授權(quán))，和在PCT申請?zhí)朠CTUS98/14289(公布號WO9902183A2)中描述，上述每一申請題目為"AMETHODOFINDUCINGACTLRESPONSE"("誘導CTL應(yīng)答的方法")。對于這樣的免疫治療的有益表位選擇原則在下列各項中公開于2000年4月28日提交的美國專利申請?zhí)?9/560,465，于2001年12月7日提交的10/026,066(公布號20030215425Al)，和于2001年11月7日提交的10/005,905，上述所有專利申請題目皆為"EPITOPESYNCHRONIZATIONINANTIGENPRESENTINGCELLS"("抗原呈遞細胞中的表位同步性")；6,861,234(2005年3月1日授權(quán)；申請?zhí)?9/561,074)，題目為"METHODOFEPITOPEDISCOVERY("表位發(fā)現(xiàn)的方法")";09/561,571，于2000年4月28日提交，題目為"EPITOPECLUSTERS"("表位簇")；10/094,699(公布號20030046714Al)，于2002年3月7日提交，題目為"ANTI-NEOVASCULATUREPREPARATIONSFORCANCER"("用于癌癥的抗-新生脈管系統(tǒng)制劑")；申請?zhí)?0/117，937(公布號20030220239A1)和PCTUS02/11101(公布號WO02081646A2)，二者皆于2002年4月4日提交，并且題目皆為"EPITOPESEQUENCES"("表位序列")；和申請?zhí)?0/657,022禾卩PCT申請?zhí)朠CT/US2003/027706(公布號WO04022709A2)，二者皆于2003年9月5日提交，并且題目皆為"EPITOPESEQUENCES"("表位序列")。疫苗質(zhì)粒的綜合設(shè)計方面在下列各項中公開美國專利申請?zhí)?9/561，572，于2000年4月28日提交，題目為"EXPRESSIONVECTORSENCODINGEPITOPESOFTARGET-ASSOCIATEDANTIGENS"("編碼耙點-相關(guān)抗原的表位的表達載體")，和10/292，413(公布號20030228634A1)，于2002年11月7日提交，題目為"EXPRESSIONVECTORSENCODINGEPITOPESOFTARGET-ASSOCIATEDANTIGENSANDMETHODSFORTHEIRDESIGN"("編碼靶點-相關(guān)抗原的表位的表達載體及它們的設(shè)計方法")；于2002年8月20日提交的10/225，568(公布號2003-0138808)，于2003年8月19日提交的PCT申請?zhí)朠CT/US2003/026231(公布號WO2004/018666)，二者題目皆為"EXPRESSIONVECTORSENCODINGEPITOPESOFTARGET-ASSOCIATEDANTIGENS"("編碼靶點-相關(guān)抗原的表位的表達載體")；和美國專利號6,709,844，題目為"AVOIDANCEOFUNDESIRABLEREPLICATIONINTERMEDIATESINPLASMIDPROPAGATION"("在質(zhì)粒增殖中避免不需要的復制中間體")。在引導針對具體癌癥的免疫應(yīng)答中特別有益的特異性抗原組合在下列各項中公開于2003年6月17日提交的臨時美國專利申請?zhí)?0/479,554，和于2004年6月17日提交的美國專利申請?zhí)?0/871,708，和PCT專利申請?zhí)朠CT/US2004/019571(公布號WO2004/112825)，所有這些題目皆為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINVACCINESFORVARIOUSTYPESOFCANCERS"("腫瘤-相關(guān)抗原在用于各種類型的癌癥的疫苗中的組合")。與腫瘤新生脈管系統(tǒng)相關(guān)的抗原(例如，PSMA，VEGFR2,Tie-2)還與癌癥疾病相關(guān)應(yīng)用，如在美國專利申請?zhí)?0/094，699(公布號20030046714Al)中所公開的那樣，其于2002年3月7日提交，題目為"ANTI-NEOVASCULATUREPREPARATIONSFORCANCER"("用于癌癥的抗-新生脈管系統(tǒng)制劑")。通過生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物的靶點施用而引發(fā)、維持和調(diào)控免疫應(yīng)答的方法在于2004年12月29日提交的美國臨時申請?zhí)?0/640,727中公開。在免疫應(yīng)答誘導中繞過004+細胞的方法在于2004年12月29號提交的美國臨時申請?zhí)?0/640,821中公開。示例性的疾病，生物體，以及與目標生物體、細胞和疾病相關(guān)的抗原和表位在美國申請?zhí)?977074(于2005年12月20日授權(quán))中描述，所述申請于2001年2月2日提交，題目為"METHODOFINDUCINGACTLRESPONSE"("誘導CTL應(yīng)答的方法")。示例性的方法學在2004年6月17日提交的美國臨時申請?zhí)?0/580,969和2006年1月12日公布的美國專利申請?zhí)?006-0008468-A1中找到，所述申請的題目皆為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINDIAGNOTISTICSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS"("腫瘤-相關(guān)抗原在各種類型的癌癥的診斷中的組合")。方法學和組合物還在美國臨時申請?zhí)?0/640,598中公開，其于2004年12月29日提交，題目為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINCOMPOSITIONSFORVARIOUSTYPESOFCANCER"("腫瘤-相關(guān)抗原在用于各種類型的癌癥的組合物中的組合")。評估并且監(jiān)測用包括應(yīng)用本發(fā)明類似物的免疫方法的免疫應(yīng)答性的診斷技術(shù)的綜合在于2004年6月17日提交的臨時美國專利申請?zhí)?0/580，964和于2005年12月29日公布的美國專利申請?zhí)朥S-2005-0287068-Al中更加充分地討論，所述兩個申請的題目皆為"IMPROVEDEFFICACYOFACTIVEIMMUNOTHERAPYBYINTEGRATINGDIAGNOSTICWITHTHERAPEUTICMETHODS"("通過結(jié)合診斷和治療方法提高主動免疫治療的功效")。免疫原性多肽編碼載體在下列各項中公開美國專利申請?zhí)?0/292,413(公布號20030228634Al)，于2002年11月7日提交，題目為EXPRESSIONVECTORSENCODINGEPITOPESOFTARGET-ASSOCIATEDANTIGENSANDMETHODSFORTHEIRDESIGN(編碼靶點-相關(guān)抗原的表位的表達載體及它們的設(shè)計方法)，和美國臨時申請?zhí)?0/691，579，于2005年6月17日提交和相應(yīng)的美國專利申請序列號_(代理巻號MANNK,053A，與本申請在同一日提交)，題目皆為"METHODSANDCOMPOSITIONSTOELICITMULTIVALENTIMMUNERESPONSESAGAINSTDOMINANTANDSUBDOMINANTEPITOPESEXPRESSEDONCANCERCEIXSANDTUMORSTROMA"("激發(fā)針對在癌細胞和腫瘤基質(zhì)上表達的優(yōu)勢和次優(yōu)勢表位的多價免疫應(yīng)答的方法和組合物")。包括實質(zhì)方法和組合物的其它有用的公開內(nèi)容在美國臨時申請?zhí)?0/691,581中找到，其于2005年6月17日提交，題目為"MULTIVALENTENTRAIN-AND-AMPLIFYIMMUNOTHERAPEUTICSFORCARCINOMA"("用于癌癥的多價引發(fā)-和-增強免疫治療劑")。其它方法學、組合物、肽和肽類似物在美國臨時申請?zhí)?0/581,001和60/580,962中公開，上述申請皆于2004年6月17日提交，并且題目分別為"SSX-2PEPTIDEANALOGS"("SSX-2肽類似物")和"NY-ESOPEPTIDEANALOGS"("NY-ESO肽類似物")。在上段中提及的每一申請和專利全部通過參考將它們所教導的全部內(nèi)容結(jié)合于本申請中。其它類似物、肽和方法在下列各項中公開美國專利申請公布號20060063913，題目為"SSX-2PEPTIDEANALOGS"("SSX-2肽類似物")；和于2006年3月16日公布的美國專利公布號2006-0057673Al，題目為"EPITOPEANALOGS"("表位類似物")；禾口PCT申請公布號WO/2006/009920，題目為"EPITOPEANALOGS"("表位類似物")；所有申請于2005年6月17日提交，以及美國臨時專利申請?zhí)?0/691,889，其于2005年6月17日提交，題目為EPITOPEANALOGS(表位類似物)；和美國專利申請?zhí)?，題目為PRAMEPEPTIDEANALOGUES(PRAME肽類似物)(代理巻號MANNK.052A),美國專利申請?zhí)枴?_，題目為PSMAPEPTIDEANALOGUES(PSMA肽類似物)(代理人巻號MANNK.052A2)，和美國專利申請?zhí)朹_/_，題目為MELANOMAANTIGENPEPTIDEANALOGUES(黑素瘤抗原肽類似物)(代理人巻號MANNK.052A3),其中每一個通過引用完全結(jié)合于此。示例性的免疫原性產(chǎn)品在下述中公開于2005年6月17日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/691，581，和正好在本申請日期提交的美國專利申請?zhí)朸/_(代理人巻號MANNK,054A)，每一申請題目為MULTIVALENTENTRAIN-AND-AMPLIFYIMMUNOTHERAPEUTICSFORCARCINOMA(用于癌癥的多價引發(fā)-和-增強免疫治療劑)，并且每一申請通過引用完全結(jié)合于此。其它方法和組合物在下述中公開美國臨時申請?zhí)?0/581,001，于2004年6月17日提交，題目為"SSX-2PEPTIDEANALOGS"("SSX-2肽類似物")，和美國臨時申請?zhí)?0/580，962，于2004年6月17日提交，題目為"NY-ESOPEPTIDEANALOGS"("NY-ESO肽類似物")；每一申請通過引用完全結(jié)合于此。通過引用明確結(jié)合于本文中的其它申請為美國專利申請系列號11/156，253(公布號)，于2005年6月17日提交，題目為"SSX-2PEPTIDEANALOGS"("SSX-2肽類似物")；美國專利申請系列號11/155，929，于2005年6月17日提交，題目為"NY-ESO-lPEPTIDEANALOGS"("NY-ESO-l肽類似物")(公布號);美國專利申請系列號11/321,967,于2005年12月29日提交，題目為"METHODSTOTRIGGER,MAINTAINANDMANIPULATEIMMUNERESPONSESBYTARGETEDADMINISTRATIONOFBIOLOGICALRESPONSEMODIF正RSINTOLYMPHOIDORGANS"("通過向淋巴器官中靶點施用生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑而引發(fā)、維持并且處理免疫應(yīng)答的方法")；美國專利申請系列號11/323,572，于2005年12月29日提交，題目為"METHODSTOELICITENHANCEANDSUSTAINIMMUNEREPONSESAGAINSTMCHCLASSIRESTRICTEDEPITOPES,FORPROPHYLACTICORTHERAPEUTICPURPOSES"("為了預(yù)防或治療目的，激發(fā)、增強并且維持針對I類MHC限制性表位的免疫應(yīng)答的方法")；美國專利申請系列號11/323，520,于2005年12月29日提交，題目為"METHODSTOBYPASSCD4+CELLSINTHEINDUCTIONOFANIMMUNERESPONSE"("在誘導免疫應(yīng)答時繞過CD4+細胞的方法")；美國專利申請系列號11/323,049,于2005年12月29日提交，題目為"COMBINATIONOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINCOMPOSITIONSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS"("腫瘤-相關(guān)抗原在用于各種類型的癌癥的組合物中的組合")；美國專利申請系列號11,323,964,于2005年12月29日提交，題目為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINDIAGNOSTICSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS."(腫瘤-相關(guān)抗原在用于各種類型的癌癥的診斷劑中的組合)。作為實例，而不是局限于其，每一參考文獻通過引用將它們所教導的關(guān)于談MHC-限制性表位、類似物、類似物的設(shè)計、表位和類似物的應(yīng)用、應(yīng)用和制備表位的方法、和用于它們的表達的核酸載體的設(shè)計與應(yīng)用、以及制劑的內(nèi)容結(jié)合到本申請中?？乖嬖谠S多抗原，其表位可以被T細胞以MHC-限制性方式識別，因此，針對它們的免疫應(yīng)答的操作具有治療或預(yù)防潛力。本文所描述的用于制備MHC-結(jié)合肽的類似物的原理通常適用于這些抗原及其表位的任一種。本公開內(nèi)容特別關(guān)注的是來源于腫瘤相關(guān)抗原(TuAA)SSX-2、NY-ESO-l、PRAME、PSMA、酪氨酸酶、和Melan-A的表位。SSX-2，也叫作Hom-Md-40，是高度保守的睪丸癌抗原家族的一員(Gure,A.O.等UCa聽(國際癌癥雜志)72:965-971,1997,其通過參考全部并入本申請)。其作為TuAA抗原的鑒定在題目為"ISOLATEDNUCLEICACIDMOLECULESTHATENCODEAMELANOMASPECIFICANTIGENANDUSESTHEREOF"("編碼黑素瘤特異性抗原的分離的核酸分子及其應(yīng)用")的美國專利6,025，191中教導，其通過參考全部并入本申請中。睪丸癌抗原在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)，但是在除了睪丸外的正常成人組織中一般不存在。SSX-2表達在許多不同類型的腫瘤中，包括滑膜肉瘤、黑素瘤、頭頸癌、乳腺癌、結(jié)腸和卵巢癌。除了其在各種癌癥中的廣泛表達，它在患有晚期疾病的患者中也是免疫原性的。并且，存在這樣的證據(jù)，S卩，在轉(zhuǎn)移腫瘤患者中有針對這種抗原的自發(fā)的體液和細胞免疫應(yīng)答(AyyoubM，等.，C露er賊(癌癥研究)63(17):5601-6,2003;AyyoubM,等.J/mmw"o/.(免疫學雜志)168(4):1717-22,2002)，其通過參考完全并入本申請中。最近應(yīng)用反式T細胞免疫學，已經(jīng)鑒定了兩種HLA-A2限制性T細胞表位，即SSX-24M9(AyyoubM,等.J/mmw"o/.(免疫學雜志)168(4):1717-22，2002;美國專利號6，548，064，題目為"ISOLATEDPEPTIDESCONSISTINGOFAMINOACIDSEQUENCESFOUNDINSSXORNY-ESO-1MOLECULES,THATBINDTOHLAMOLECULE"("與HLA分子結(jié)合的由在SSX或NY-ESO-l分子中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列組成的分離的肽")；美國專利申請?zhí)?0/117,937(公布號US2003-0220239Al)，題目為"EPITOPESEQUENCES"("表位序列"))和SSX畫2!關(guān),(WagnerC,等.Owc^/m/mm/O;(癌癥免疫性)3:18,2003)，其每一個通過參考完全并入本申請中。兩種表位的C末端都可以通過體外蛋白酶體消化而有效地產(chǎn)生。來自SSX-2陽性患者的腫瘤-滲透性淋巴結(jié)的分離的HLA-AM201/SSX-24M9多聚體+CD8+T細胞表現(xiàn)出高度的功能親和力，并且可以有效地識別SSX-2陽性腫瘤；然而，自發(fā)發(fā)生的免疫應(yīng)答不足以使腫瘤停止生長，可能是由于這些免疫應(yīng)答直到疾病進展的相當晚期才發(fā)展，并且所活化的T細胞不是足夠多。美國專利號6,548,064(其通過參考完全并入本申請中)進一步描述了在SSX-2表位的P2和PQ位置取代T或A殘基。NY-ESO-l是在廣泛種類的腫瘤中發(fā)現(xiàn)的睪丸癌抗原，并且還叫作CTAG-1(睪丸癌癥抗原-l)和CAG-3(癌癥抗原-3)。作為腫瘤-相關(guān)抗原(TuAA)的NY-ESO-l在美國專利5，804,381中公開，其題目為"ISOLATEDNUCLEICACIDMOLECULEENCODINGANESOPHAGEALCANCERASSOCIATEDANTIGEN,THEANTIGENITSELF,ANDUSESTHEREOF"("編碼食道癌癥相關(guān)抗原的分離的核酸分子，抗原本身，及其應(yīng)用")，通過參考完全并入本申請中。編碼具有廣泛的序列同一性的抗原的旁系同源基因座，LAGE-la/s和LAGE-lb/L，已經(jīng)在人類基因組的公眾可用匯編中公開，并且推論其通過交替剪接(alternatesplicing)而產(chǎn)生。另夕卜，CT-2(或CTAG-2，睪丸癌癥抗原-2)似乎是LAGE-lb/L的等位基因、突變體、或測序偏差(sequencingdiscrepancy)。由于廣泛的序列同一性，許多來自NY-ES0-1的表位還可以誘導針對表達這些其它抗原的腫瘤的免疫性。所述蛋白到氨基酸70實質(zhì)上是相同的。從殘基71-134，NY-ES0-1和LAGE之間最長的同一性是6個殘基，但是存在潛在的交叉反應(yīng)序列。從殘基135-180，除了單個殘基外，NY-ESO和LAGE-la/s是相同的，但是由于交替剪接，LAGE-lb/L是不相關(guān)的。CAMEL和LAGE-2抗原似乎衍生于LAGE-1mRNA，但是衍生于改變的閱讀框，因此產(chǎn)生不相關(guān)的蛋白序列。最近，GenBank登記號AF277315.5，人染色體X克隆RP5-865E18，RP5-1087L19,完整序列，其通過引用完全結(jié)合于此，報道了這一區(qū)域中的3個獨立的基因座，其標記為LAGE1(在基因組集合中與CTAG-2相對應(yīng))，加上LAGE2-A和LAGE2-B(在基因組集合中二者與CTAG-1相對應(yīng))。在題百為"SOLATEDNUCLEICACIDMOUECUUBENCODINGCANCERASSOCIATEDANTIGEN,THEANTIGENITSELF,ANDUSESTHEREOF"("編碼癌癥相關(guān)抗原的分離的核酸分子，抗原本身，及其應(yīng)用")的美國專利號6,274,145中，將NY-ESO-hsw65鑒定為HLA-A2限制性表位，并且題目為"EPITOPESEQUENCES"("表位序列")的美國專利申請?zhí)?0/117,937(公布號20030220239)報道了這種C末端是在體外檢測中通過看家蛋白酶體而產(chǎn)生的。單獨地在PQ取代A,V,L，I，P，F(xiàn)，M，W,或G,或與另一位置的A組合的類似物，在美國專利號6，417,165和6，605，711中公開，二者題目皆為"NY-ESO-1-PEPTIDEDERIVATIVESANDUSESTHEREOF"("NY-ESO-1-肽衍生物及其應(yīng)用")。本段所述的每一參考文獻通過引用全部并入本申請中。PRAME，還叫作MAPE、DAGE、和OIP4，最初觀察為黑素瘤抗原。后來，它被公認為CT抗原，但是不同于許多CT抗原(例如，MAGE、GAGE、和BAGE)，它在急性髓細胞樣白血病中表達。PRAME是MAPE家族的一員，MAPE家族主要由同PRAME具有有限的序列相似性的假定的蛋白組成。PRAME作為TuAA的用途在美國專利號5,830,753中教導，其題目為"ISOLATEDNUCLEICACIDMOLECULESCODINGFORTUMORREJECTIONANTIGENPRECURSORDAGEANDUSESTHEREOF"("編碼腫瘤排斥抗原前體DAGE的分離的核酸分子及其應(yīng)用")，其通過參考全部并入本申請中。美國專利申請?zhí)?0/181,499(公布號US2003-0186355Al)，題目為"METHODSFORSELECTINGANDPRODUCINGTCELLPEPTIDEEPITOPESANDVACCINESINCORPORATINGSAIDSELECTEDEPITOPES"("選擇和生產(chǎn)T細胞肽表位的方法和結(jié)合所選表位的疫苗")(其通過參考全部并入本申請中)，應(yīng)用免疫蛋白酶體的體外消化，鑒定了許多潛在的表位，包括PRAME425-433。PSMA(前列腺-特異性膜抗原)，在題目為"PROSTATE-SPECIFICMEMBRANESANTIGEN"("前列腺-特異性膜抗原")的美國專利5,538,866中描述的TuAA，是由正常的前列腺上皮細胞所表達的，并且在前列腺癌中以更高的水平表達，所述美國專利5,538,866通過參考全部并入本申請中。它還在非前列腺腫瘤的新血管系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)。因此，PSMA可以形成針對前列腺癌和針對其它腫瘤的新血管系統(tǒng)的疫苗的基礎(chǔ)。后一觀點在下列各項中更充分地描述美國專利公布號20030046714;PCT公布號WO02/069907;和臨時美國專利申請?zhí)?0/274,063，題目為"ANTI-NEOVASCULARVACCINESFORCANCER"("用于癌癥的抗-新血管系統(tǒng)疫苗")，其于2001年3月7日提交，以及美國申請?zhí)?0/094,699(公布號US2003-0046714Al)，其于2002年3月7日提交，題目為"ANTI-NEOVASCULARPREPARATIONSFORCANCER"("用于癌癥的抗-新血管系統(tǒng)制劑")，上述每一項通過參考全部并入本申請中。在所述出版物和申請中公開的教導和實施方案提供與本發(fā)明相關(guān)的并且有效與本發(fā)明聯(lián)系的支持原理和實施方案。簡要地，由于腫瘤生長，它們恢復了新血管的向內(nèi)生長。由于未血管化的腫瘤中心通常是壞死的，并且已經(jīng)報道血管生成抑制劑引起腫瘤消退，所以這被理解為是維持生長所必需的。這樣的新血管或新血管系統(tǒng)，表達在已建立的脈管中沒有發(fā)現(xiàn)的抗原，并且因此可以被特異性地靶向。通過誘導針對新生血管抗原的CTL，所述血管可以被破壞，這中斷了營養(yǎng)向腫瘤的流動(并且從腫瘤移除廢物)，引起腫瘤的消退。PSMAmRNA的交替剪接還導致在Met58的具有明顯的起點的蛋白，由此刪除推定的PSMA膜錨定區(qū)域，如在美國專利5,935,818中所描述的那樣，所述專利題目為"ISOLATEDNUCLEICACIDMOLECULEENCODINGALTERNATIVELYSPLICEDPROSTATE-SPECIFICMEMBRANESANTIGENANDUSESTHEREOF"("編碼選擇剪接的前列腺-特異性膜抗原的分離的核酸分子及其應(yīng)用")，其通過參考完全并入本申請中。叫作PSMA樣蛋白的蛋白，Genbank登記號AF261715,其通過參考完全并入本申請中，幾乎同PSMA的氨基酸309-750—致，并且具有不同的表達模式。因此，更優(yōu)選的表位是那些具有位于氨基酸58-308的N端的表位。在WO01/62776中，PSMA288.297被確定為具有HLA-A2結(jié)合基序，所述WO01/62776題目為"HLABINDINGPEPTIDESANDTHEIRUSES"("HLA結(jié)合肽與它們的應(yīng)用")，其通過參考完全并入本申請中。它在體外用看家蛋白酶體消化產(chǎn)生并且實際上與HLA-A2結(jié)合，在題目為"EPITOPESEQUENCES"("表位序列")的美國專利申請公布號20030220239中公開。酪氨酸酶是黑色素生物合成酶，其被認為是黑素細胞分化的最特異的標記之一。酪氨酸酶在很少的細胞類型中表達，主要在黑素細胞中表達，并且高水平通常在黑素瘤細胞發(fā)現(xiàn)。酪氨酸酶作為TuAA的用途在美國專利5,747,271中教導，其題目為"METHODFORIDENTIFYINGINDIVIDUALSSUFFERINGFROMACELLULARABNORMALITYSOMEOFWHOSEABNORMALCELLSPRESENTCOMPLEXESOFHLA-A2/TYROSINASEDERIVEDPEPTIDES,ANDMETHODSFORTREATINGSAIDINDIVIDUALS"("鑒定患有細胞異常的個體的方法，其中一些異常細胞呈遞HLA-A2/酪氨酸酶衍生的肽復合體，以及治療所述個體的方法")，其通過參考完全并入本申請中。Mdan-A，也叫作MART-1(T細胞識別的黑素瘤抗原)，是在黑素瘤中以高水平表達的另一種黑色素生物合成蛋白。Mdan-A/MART-1作為TuAA的用途在美國專利號5,874,560和5,994,523中教導，二者題目皆為"MELANOMAANTIGENSANDTHEIRUSEINDIAGNOSTICANDTHERAPEUTICMETHODS"("黑素瘤抗原及其在診斷和治療方法中的應(yīng)用")，以及在美國專利號5,620,886中教導，其題目為"ISOLATEDNUCLEICACIDSEQUENCECODINGFORATUMORREJECTIONANTIGENPRECURSORPROCESSEDTOATLEASTONETUMORREJECTIONANTIGENPRESENTEDBYHLA-A2"("編碼被加工成至少一種由HLA-A2呈遞的腫瘤排斥抗原的腫瘤排斥抗原前體的分離的核酸序列")，所有這些通過參考完全并入本申請中。來源于這種TuAA的免疫顯性HLA-A2限制性表位是Melan-A26.35。已表明它是由看家蛋白酶體產(chǎn)生的(Morel，S.等.//wmm^(免疫性)12:107-117,2000，其通過參考完全并入本申請中)。結(jié)合標準氨基酸的各種類似物，包括在P2取代L的改善的類似物，在美國專利號6,025,470中公開，其題目為"ISOLATEDNONA-ANDDECAPEPTIDESWHICHBINDTOHLAMOLECULES,ANDTHEUSETHEREOF("結(jié)合HLA分子的分離的九-和十肽，及其應(yīng)用")"，其通過參考完全并入本申請中。結(jié)合非標準氨基酸的類似物的應(yīng)用，其具有改善生化穩(wěn)定性的基本目的，由Blanchet,J.-S.等.,//m/mmo/.(免疫學雜志)167:5852-5861,2001報道，其通過參考完全并入本申請中。SSX-241-49類似物如上文提及，癌癥患者中針對SSX-2的天然免疫應(yīng)答，包括針對SSX-24M9的應(yīng)答，可能不會有效地控制癌癥。另外，野生型SSX-241.49只是中等免疫原性肽，這可能進一步限制它的臨床潛力。由應(yīng)用超拮抗劑類似物誘導的更強的SSX-2特異性免疫應(yīng)答對患有SSX-2陽性腫瘤的患者產(chǎn)生臨床益處。因此，在一個實施方案中，所述類似物可以用在刺激受試者的免疫應(yīng)答的組合物中，以增加針對顯示靶點抗原的靶細胞的免疫應(yīng)答。所述實施方案可具有在治療和預(yù)防致瘤性和病毒性疾病中的用途。由于野生型SSX-24L49只是中等免疫原性肽，這可能會妨礙它在體內(nèi)有效地消除腫瘤，所以應(yīng)用一種方法重新設(shè)計更有效或具有許多改善的特性的SSX-24M9變體。通過應(yīng)用更有免疫原性的SSX-2類似物肽，可能刺激更強的免疫應(yīng)答和/或增強天然發(fā)生的免疫應(yīng)答，以獲得更好的臨床反應(yīng)時機。因此，對于每種類似物，分析與野生型表位的結(jié)合特性(親和力和HLA-AW201/肽復合體穩(wěn)定性)、免疫原性、抗原性和交叉反應(yīng)性，以確定改善的特性。在一些實施方案中，改善的特性一般意指，對于某些目的，所述類似物可以比野生型更好地應(yīng)用。因此，所述類似物不必展現(xiàn)出改善的結(jié)合、穩(wěn)定性、或要被改善的活性，并且甚至可以表現(xiàn)出減少的調(diào)控所述過程的某些部分的能力，但是對于其它方式的應(yīng)用仍然是改善的。例如，在耐受野生型抗原的人體系統(tǒng)中，保留某些活性但不是全部活性的類似物，可能更好。以前，通過結(jié)合有利的錨定殘基修飾天然腫瘤-相關(guān)的肽表位產(chǎn)生了具有改善的與HLA分子的結(jié)合模式和增強的免疫原性的類似物。最成功的實例之一是Melan-A26-35表位的A27L肽類似物。Valmori等.,"Enhancedgenerationofspecifictumor-reactiveCTLinvitrobyselectedMelan-A/MART-1immunodominantpeptideanalogs,"("通過選擇的Melan-A/MART-1免疫顯性肽類似物增強特異性腫瘤-反應(yīng)性CTL在體外的產(chǎn)生")J7扁歸/.(免疫學雜志)1998，160(4):1750-8;其通過參考完全并入本申請中。由于它在位置2缺少最佳的錨定氨基酸殘基，最初的表位沒能與HLA-A2分子形成穩(wěn)定的復合體。修飾的A27LMelanA26-35肽類似物明確地顯示出增加的與HLA-A2分子的結(jié)合模式和比其野生型負體更強的免疫原性。用這一類似物免疫患者可以產(chǎn)生能夠識別在細胞表面呈遞的野生型表位的強T細胞免疫應(yīng)答。已經(jīng)成功地獲得了相似的修飾，其具有許多其它腫瘤相關(guān)的表位，諸如GP100209-217(Parkhurst等.，"Improvedinductionofmelanoma-reactiveCTLwithpeptidesfromthemelanomaantigengplOOmodifiedatHLA-A*0201-bindingresidues,"('M吏用來源于在HLA-AM201-結(jié)合殘基修飾的黑素瘤抗原gpl00的肽提高黑素瘤-反應(yīng)性CTL的誘導")J7mmw"o/.(免疫學雜志)1996，157(6):2539-48;其通過參考完全并入本申請中)，和Her-2369-377(Vertuani等.，"ImprovedimmunogenicityofanimmunodominantepitopeoftheHER-2/neuprotooncogenebyalterationsofMHCcontactresidues,"("通過改變MHC接觸殘基提高HER-2/neu原癌基因的免疫顯性表位的免疫原性")//附應(yīng)朋/.(免疫學雜志)2004,172(6):3501-8;其通過參考完全并入本申請中)。本文公開可以用于鑒定并且產(chǎn)生滑膜肉瘤X斷裂點2(SSX-2)野生型序列的類似物的方法。應(yīng)用本文公開的方法，鑒定了一組95種基于氨基酸241-249的野生型序列的新SSX-24L49類似物，其具有各種改善的特性。所述改善的特性包括，但不限于，與I類MHC和T細胞受體(TCR)分子的結(jié)合，和生物反應(yīng)，諸如IFN-Y分泌、細胞毒性，和腫瘤細胞裂解。還鑒定了具有改善的效力的肽，其保持與野生型表位的交叉反應(yīng)性。在這些類似物中，一些已經(jīng)證明是野生型SSX-24M9肽的超拮抗劑變體，其中的一些已經(jīng)顯示出具有同HLA-A*0201分子高得多的親和力，并且所述肽-HLA復合體具有擴大的穩(wěn)定性。這些類似物在使用它們進行免疫的HHD轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導增強的CTL免疫應(yīng)答。所獲得的CTLs可以有效地在體內(nèi)和體外裂解A2+和SSX-2+腫瘤細胞系，這表明應(yīng)用所述類似物產(chǎn)生的CTLs能夠識別在細胞表面天然呈遞的野生型SSX-24L49表位。與野生型SSX-24M9表位相比較，所述類似物是研發(fā)癌癥疫苗的更好的候選物。因此，本發(fā)明公開的實施方案包括長度為9或10個氨基酸的一種或多種肽的家族，序列上與人睪丸癌(CT)抗原SSX-2的氨基酸41-49(SSX-24M9)相關(guān)。個體肽實施方案具有在野生型序列中的一至多個確定的氨基酸取代。所取代的氨基酸不同地為通常遺傳編碼的標準系列氨基酸的其它成員，其衍生物，其D-立體異構(gòu)體，或其它非標準L-氨基酸。這些類似物用于研究野生型表位與I類MHC和TCR分子以及免疫應(yīng)答其它成分之間的相互作用，并且用于設(shè)計具有進一步優(yōu)化的免疫學特性的其它類似物。在檢驗它們的HLA-轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，所述類似物的一些實施方案具有至少與野生型表位相似的免疫學特性。由于SSX-2是自體抗原，針對其可以預(yù)測一定程度的耐受性，并且類似物的氨基酸差異可以幫助刺激T細胞群體，所述T細胞群體避免了陰性選擇但是與野生型表位交叉反應(yīng)，所以這樣的肽可以用于人體。許多肽實施方案可以具有一種或多種改善的免疫學特性，因為它們具有對于MHC的更大的親和力或更大的與MHC結(jié)合的穩(wěn)定性，激發(fā)更多的細胞因子產(chǎn)生或需要更低的肽濃度來激發(fā)從識別野生型表位的T細胞產(chǎn)生相似的細胞因子，它們更有免疫原性，可以誘導或增強對野生型表位的交叉反應(yīng)性細胞溶解反應(yīng)，和/或可以破壞耐受性。在一個實施方案中，所述類似物可以在選自由P1、P2、P4、P6、P8、P9和P10組成的組的殘基具有至少一個取代。在另一個實施方案中，所述類似物可以在選自由P1、P2、P4、P6、P8、P9和P10組成的組的殘基具有至少兩個取代。在另一個實施方案中，所述類似物可以在選自由P1、P2、P4、P6、P8、P9和P10組成的組的殘基具有至少3個取代。在另一個實施方案中，所述類似物可以具有在位置P2和P9的取代。在另一個實施方案中，所述肽可以具有在殘基P1、P2和P9的取代。在另一個實施方案中，所述肽類似物可以具有在殘基Pl、P2和P4的取代。在另一個實施方案中，所述肽類似物可以具有在殘基Pl、P2和P6的取代。在另一個實施方案中，所述肽類似物可以具有在殘基Pl、P2和P8的取代。在一個實施方案中，兩種取代可以產(chǎn)生改善的特性。在另一個實施方案中，一種取代可以產(chǎn)生改善的特性。在另一個實施方案中，三種取代可以產(chǎn)生改善的特性。在另一個實施方案中，一種或多種取代可以產(chǎn)生改善的特性，但是仍然可以被識別野生型序列的TCR識別(仍然與野生型序列交叉反應(yīng))。一個實施方案涉及表位陣列和其它包括可以被加工以釋放所述類似物的表位類似物序列的多肽。其它實施方案涉及編碼所述多肽的核酸，特別是DNA質(zhì)粒，或只是類似物，及其從所述核酸的表達。所述類似物、包括它們的多肽、以及所述編碼的核酸可以都是免疫原性組合物的成分，特別是適于淋巴內(nèi)遞送的組合物的成分，這組成了其它的實施方案。類似物設(shè)計實施方案涉及SSX-24M9肽，其含有序列KASEKIFYV(SEQIDNO.1)的取代(參見圖1)。在另一個實施方案中，所述類似物通?？梢允蔷哂行蛄蠯ASEKIFYYY(SEQIDNO.l)的SSX-241-5Q十聚體肽的類似物。組成所述肽的殘基或氨基酸在本文中稱為Pl-P9或P1-P10，以指明在肽內(nèi)按照從N-到C-端編號的位置，在九聚體中P1對應(yīng)N端的賴氨酸，和P9對應(yīng)C端的纈氨酸。備選地，所述殘基可以通過它們涉及的分子的主要活性而指示。例如，殘基P2描述為N端一級錨定分子，而P9(或者在十聚體中的P10)描述為一級C端錨點。殘基P4，P6和P8主要參與TCR相互作用。取代可以應(yīng)用任何氨基酸，包括標準氨基酸和非標準氨基酸，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。本申請公開了許多示例性氨基酸，然而，本申請所公開的取代不必意指包括所有的設(shè)想取代的列表，而是可能的取代的示例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在目錄和參考文獻中找到許多其它非標準的氨基酸，其可以購買或化學產(chǎn)生，以與本申請的類似物一起使用。許多可能的類似物通過修飾肽錨定殘基而產(chǎn)生，以獲得更好的HLA結(jié)合模式和更高的免疫應(yīng)答，其包括在N端一級錨點(anchor)(P2位置)，在N端二級錨點(Pl位置)，在N端一級和二級錨點(P1和P2位置)，和在N端一級/二級錨點(P1和P2位置)以及C端一級錨點(P9位置)。并且，產(chǎn)生具有在錨定殘基和TCR接觸殘基的修飾的肽，以防止T細胞對自身抗原的耐受性，這些修飾包括在N端一級/二級錨點(P1和P2位置)和二級TCR識別位點(P4、P6和域P8位置)的修飾，在N端一級/二級錨點(P1和P2位置)的修飾，和在C端一級錨點(P9)以及在二級TCR識別位點(P4、P6和/或P8位置)的修飾。并且，產(chǎn)生了十聚體類似物。哪種殘基將最好地產(chǎn)生具有改善的特性的類似物的選擇包括對MHC肽相互作用的研究、TCR肽相互作用和本領(lǐng)域已知的先前的類似物的分析。一些殘基主要參與具體的相互作用，并且一些是次要地或者甚至是三級地參與。因此，所述殘基怎樣參與這些分子的結(jié)合的知識涉及所述分析。并且，優(yōu)選一些野生型殘基，意味著它們很好地進行所需要的相互作用；而其它不是優(yōu)選的，意味著它們極差地進行相互作用。因此，在一個實施方案中，非優(yōu)選的殘基可以被取代。例如，在C端的纈氨酸通常是優(yōu)選的錨定殘基，由于它產(chǎn)生與HLA分子的強相互作用，并且因此，更少優(yōu)選取代這一殘基。然而，通過結(jié)合有利的錨定殘基而修飾野生型腫瘤-相關(guān)的肽表位已經(jīng)產(chǎn)生了具有與HLA分子改善的結(jié)合模式和增強的免疫原性的類似物。最成功的實例之一是Melan-A26-35表位的A27L肽類似物(ValmoriD,等.J/mwM"o/.(免疫學雜志)160(4):1750-8，1998;其通過參考完全并入本申請中)。由于它在位置2缺少最適錨定殘基，初始表位沒能與HLA-A2分子形成穩(wěn)定的復合體。相反，修飾的MdanA26.35A27L肽類似物明確地表現(xiàn)出與HLA-A2分子增加的結(jié)合模式和比其野生型負體更高的免疫原性。用這種類似物免疫患者產(chǎn)生能夠識別在細胞表面存在的野生型表位的強T細胞免疫應(yīng)答。成功地獲得了相似的修飾，其具有許多其它腫瘤-相關(guān)的表位，諸如GP100209-217(ParkhurstMR，等.，J/mm朋o/.(免疫學雜志)157(6):2539-48，1996;其通過參考完全并入本申請中)，Her-2369-377(VertuaniS,等.，(免疫學雜志)172(6):3501-8,2004;其通過參考完全并入本申請中)。有多少殘基要取代的選擇包括這樣的要求，即，取代更好的殘基，但是仍然保留足夠的表位性質(zhì)，以便它仍然將被識別野生型表位的T細胞而識別。因此，在一個實施方案中，可以對野生型肽進行一種和兩種取代。在另一個實施方案中，可以對野生型肽進行多于兩種的取代，而仍然保留與野生型肽的交叉反應(yīng)性。一般地，理想地取代參與TCR識別的肽的部分，以產(chǎn)生改善的免疫原性，而仍然與野生型表位交叉反應(yīng)。在一個實例中，優(yōu)選表現(xiàn)出增加的免疫原性的肽。由于據(jù)信P2位置或在N末端的第二個氨基酸主要參與主要通過改善的結(jié)合特性產(chǎn)生改善的免疫原性的過程，所以它是優(yōu)選的取代位點，并且在示例性類似物中進行了許多修飾，以鑒定理想的取代。相似的考慮應(yīng)用到羧基端位置，PQ，其對于MHC結(jié)合也是重要的。因此，在一個實施方案中，所述類似物可以包括在P2殘基的取代，其用更加疏水性的殘基取代野生型丙氨酸。在另一個實施方案中，所述疏水性殘基還可以具有更大的側(cè)鏈。在另一個實施方案中，在P1的殘基可以用更加疏水的殘基取代。在另一個實施方案中，殘基Pl和P2都可以用更加疏水的殘基取代。其它實施方案中，在Pl、P2、和P9的至少一個殘基可以被取代。在另一個實施方案中，在Pl、P2、和P9的至少兩個殘基可以被取代。在另一個實施方案中，在P1、P2、P9、P4和P6的至少兩個殘基可以被取代，包括參與TCR結(jié)合的一個或多個殘基。在一些實施方案中，取代那些僅次要地參與同TCR或MHC分子結(jié)合的殘基可以是有利的。例如，取代次要的TCR結(jié)合氨基酸可以產(chǎn)生這樣的類似物，即，其仍然結(jié)合并且產(chǎn)生應(yīng)答，并不妨礙與MHC分子的結(jié)合，但是優(yōu)選地克服自身抗原的耐受組織。由于患有癌癥的患者可以部分地耐受所述抗原，所以這是有用的。因此，為了克服所述耐受性，保留一些活性的類似物可以優(yōu)選地為具有改善的免疫原性的類似物，原因在于它將被免疫系統(tǒng)識別為"自身"的可能性更少。除了取代在多個確定的指定表位位置的氨基酸之外，長度變體也可以用作類似物。最典型地，從肽的一端、另一端或兩端加上或移除額外的氨基酸殘基。在一些實例中，加上的末端殘基在施用給受試者之后通過蛋白水解去除，在與MHC結(jié)合之前重新生成指定的表位或相同長度的類似物。在其它情形中，改變長度的肽是真正抗原性交叉反應(yīng)的，如在實施例20中所述，或通過Mdan-A27.35和Melan-A26.35之間的關(guān)系而示例。應(yīng)該理解，特別包括或排除在這些加上的末端位置(在本文中的一些地方叫作P0和PQ+1)的任何位置的任何具體氨基酸的個體實施方案在本文公開的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。當說某種類似物基本上由某種序列組成時，應(yīng)該理解這需要被剪截或者保留交叉反應(yīng)性的這樣長度短的變體。在一些實施方案中，插入更小的氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸)，特別是在錨定位置之間，可以與在TCR-相互作用殘基中的改變相似地作用。1.N端近端一級錨點修飾(P2)N端一級錨點是肽的第二個N端氨基酸，并且是N端近端一級錨點。它主要參與與MHC分子的相互作用，并且取代可以導致改善的結(jié)合和穩(wěn)定性。然而，它還可以次要地參與TCR相互作用。因此，在這一位點的取代可以形成具有與MHC分子改善的相互作用以及與TCR改善的相互作用的肽。通常，據(jù)信對于與MHC分子相互作用，在野生型序列的這一位置發(fā)現(xiàn)的丙氨酸是非優(yōu)選的。因此，所述類似物的優(yōu)選的實施方案具有在這一位置的取代。在一個實施方案中，野生型序列中初始發(fā)現(xiàn)的Ala42可以用更加疏水性的氨基酸取代?？梢詰?yīng)用任何更加疏水性的氨基酸，包括任何可用的或為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，包括標準氨基酸和非標準氨基酸。在另一個實施方案中，初始Ala42用還具有大側(cè)鏈的更加疏水性的氨基酸取代。更加疏水性的氨基酸的實例包括，但不限于Leu、Val、Ile、Met、a-氨基丁酸、正亮氨酸和正纈氨酸。表l是N-端近端一級錨點修飾和每一修飾的結(jié)果的總結(jié)。表lN端近端一級錨點修飾<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>2.N端二級錨點修飾(Pl)N端二級錨點是在N端的第一個氨基酸。這一殘基是Lys41，并且定義為與HLA-AW201分子相互作用中的二級錨定殘基。然而，它還在某種程度上參與與T細胞受體的相互作用。因此，這一位置的修飾可以產(chǎn)生一些更有免疫原性并且更適于研發(fā)腫瘤疫苗的不規(guī)則的類似物。盡管通常認為在這一位置賴氨酸是有利的，但是取代可以導致高度改善的特性。因此，在一個實施方案中，在野生型序列中發(fā)現(xiàn)的初始Lys43可以用更加疏水的氨基酸取代?？梢詰?yīng)用任何更加疏水的氨基酸，包括任何可用的或本領(lǐng)域的技術(shù)人員己知的，包括標準氨基酸和非標準氨基酸。在另一個實施方案中，Lys43可以用芳香氨基酸取代。更加疏水的氨基酸的實例包括，但不限于Phe、Tyr、Trp、和D-Lys。表2是N-端二級錨點修飾和每一修飾的結(jié)果的總結(jié)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>3，N端一級和二級修飾(P2和Pl)在一個實施方案中，一級和二級錨定殘基都被取代，而導致對HLA分子提高的結(jié)合親和力。在另一個實施方案中，所述雙取代產(chǎn)生與HLA分子結(jié)合的提高的穩(wěn)定性。其它實施方案中，結(jié)合和/或穩(wěn)定性沒有提高，并且甚至可以被減小，但是改善了所述分子的其它特性，諸如活性或被耐受個體的識別。表3是N-端一級和二級錨點修飾和每一修飾的結(jié)果的總結(jié)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>4.N端一級/二級錨點和C端一級修飾(P2，Pl和P9)野生型肽的C端Val通常是優(yōu)選的錨定殘基，并且主要參與同MHC分子的相互作用。然而，進行取代，以確定哪個氨基酸改善了具有一級和二級N端修飾的類似物。在不存在一種或多種N端修飾時，也可以應(yīng)用這些C端取代。這些修飾表現(xiàn)出提高的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性，并且在一些情形中，導致具有減少的交叉反應(yīng)性的類似物。因此，在一些實施方案中，對C端的取代導致具有提高的結(jié)合和/或穩(wěn)定性而沒有減少的交叉反應(yīng)性的肽。然而，在其它實施方案中，對C端的取代導致具有提高的結(jié)合和/或穩(wěn)定性具有相等的或減少的交叉反應(yīng)性的肽。每種分子可以在特定情形中或在特定患者中應(yīng)用。在一個實施方案中，將C端的纈氨酸用大的脂族氨基酸取代。表4是N-端一級/二級錨點和C端一級修飾和每一修飾的結(jié)果的總結(jié)o表4N端一級/二級錨點和C端一級修飾<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>5.N端一級/二級錨點和TCR殘基修飾TCR位點通常認為是殘基P4、P6、和P8，并且是參與結(jié)合TCR的主要殘基。然而，其它殘基也可以較少程度地參與相互作用。在一個實施方案中，可以取代主要參與TCR相互作用的一個或多個位點以增加相互作用。優(yōu)選地，這些取代可以產(chǎn)生不規(guī)則的類似物，所述類似物不妨礙與MHC分子結(jié)合，但是克服野生型肽的耐受問題。在另一個實施方案中，可以包括至少一種TCR取代，其在位置P1、P2、和/或P9具有至少一個取代。在另一個實施方案中，在P4、P6、和P8位置的任何一個或多個的取代可以是極性氨基酸。在另一個實施方案中，所述取代可以是在位置P8的芳香族氨基酸。在另一個實施方案中，所述取代可以是在位置P6的具有大的脂族側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述取代可以是具有更大的側(cè)鏈以維持(preserve)相互作用的氨基酸。表5是N-端一級/二級錨點和TCR殘基修飾以及每一修飾的結(jié)果的總結(jié)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>MO6.C端酰胺在一些實施方案中，可以修飾C端殘基，以含有取代游離的羧酸的酰胺。因此，例如，如果所述肽是9-mer(九聚體)，那么可以修飾P9殘基。如果所述肽是10-mer(十聚體)，那么可以修飾P10殘基。優(yōu)選地，這形成在生物介質(zhì)中具有增加的穩(wěn)定性的肽或類似物，所述生物介質(zhì)包括但不限于血、淋巴、和CNS。優(yōu)選地，所述肽可以保留其它必要的活性，以形成可用于接種疫苗或作為免疫原的類似物。表6是C-端酰胺修飾和每一修飾的結(jié)果的總結(jié)。表6C端酰胺<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>典型的MHC結(jié)合肽的長度可以從大約8個到大約11個氨基酸的長度而不等。然而，大多數(shù)早先應(yīng)用的HLA-AM201是9-mers(九聚體)或10-mers(十聚體)。因此，在一個實施方案中，所述類似物可以是野生型序列SSX-2^5o的類似物。然而，由于所述野生型10-mer沒有正確的結(jié)合基序并且沒有表現(xiàn)出免疫學活性，所以通過取代在P10位置的氨基酸而制備10-mer，并且鑒定各種野生型和類似物的作用(參見圖1B)。8.其余殘基參考圖1A和1B，任何殘基還可以用保守氨基酸取代。保守取代可以與任何上述可以產(chǎn)生作用的取代組合。備選地，保守取代可以特異性地在這樣的殘基，g卩，據(jù)信其不參與一級、二級、或者甚至三級水平的任何活性。這樣的殘基包括P3、P5和P7。例如，在位置P3的絲氨酸可以用丙氨酸或蘇氨酸取代而產(chǎn)生類似物。典型地，這樣的保守取代沒有顯著地影響類似物的活性，然而，在一些實施方案中，它們可以增加某些活性或減少某些活性。上文公開了許多關(guān)于各種實施方案的特征和類似物設(shè)計的方面，通用的或如應(yīng)用到SSX-2表位上。應(yīng)該理解這樣的公開也可以應(yīng)用到這一表位和后續(xù)的表位上。為了簡潔，將這樣的公開的明確重述減少到最少。實施方案涉及I類MHC限制性T細胞表位NY-ESO-l157_165，SLLMWITQC(SEQIDNO.25)的類似物，包括這些可以被pAPC處理而呈遞所述表位類似物的類似物的多肽，和表達所述類似物的核酸。與野生型表位相比較，所述類似物可以具有相似的或提高的免疫學特性。一個實施方案涉及衍生并且改善NY-ESO-l157.165的類似物的方法，以及包括取代的特異序列。所述類似物可以含有至少一種取代，但是可以具有多種取代，包括單一的或以各種組合的標準的或非標準的氨基酸。所述類似物可以形成具有保留的或改善的特性的肽。通過測定針對這樣的細胞的表位特異性T細胞活性，已經(jīng)表明表位NY-ESO-l157.165由NY-ESO-1表達細胞系呈遞(Jaeger,E.等.，J.Exp.Med.(實驗醫(yī)學雜志)187:265-270，1998;美國專利號6,274,145，題目為"ISOLATEDNUCLEICACIDMOLECULEENCODINGCANCERASSOCIATEDANTIGEN,THEANTIGENITSELF,ANDUSESTHEREOF"("編碼癌癥相關(guān)抗原的分離的核酸分子，抗原本身，及其應(yīng)用"))，其每一個通過參考完全并入本申請中。在題目為"NY-ESO畫l-PEPTIDEDERIVATIVES,ANDUSESTHEREOF(NY-ESO-1-肽衍生物及其應(yīng)用)"的美國專利號6,417,165中描述了改善肽NY-ESO-"57.,65的物理化學特性的方法，其通過參考完全并入本申請中，并且所述方法可以由用保持或增強與MHC的相互作用且沒有干擾活性的二硫C-C鍵形成的不利特性的其它氨基酸置換末端半胱氨酸而組成。然而，C端半胱氨酸殘基的單獨處理忽視了這樣的益處，S卩，優(yōu)化遍及用于主要組織相容性(MHC)和/或T細胞受體(TCR)結(jié)合的肽的多個殘基。因此，除了突變Cys殘基的實用性外，存在相當多突變遍及所述肽的其它氨基酸的機會。例如，取代可以用于以使得在臨床中更加有效的方式進一步優(yōu)化與MHC和/或TCR的結(jié)合。實施方案涉及長度為9或10個氨基酸的一種或多種肽的家族，其在序列上與人睪丸癌(CT)抗原NY-ES0-1的氨基酸157-165(NY-ESO-l157.165)相關(guān)。類似物設(shè)計所述類似物通常是NY-ESO-l157.165的類似物，其具有序列SLLMWITQC(SEQIDNO:25)。野生型氨基酸是優(yōu)選的還是非優(yōu)選的分析應(yīng)用早先關(guān)于其它肽-MHC或TCR相互作用的分析。例如，由于它沒有產(chǎn)生同HLA分子的強相互作用，所以在C端的半胱氨酸通常是非優(yōu)選的錨定殘基，并且因此，取代這一殘基是高度優(yōu)選的。然而，盡管在位置PI的絲氨酸通常是優(yōu)選的，但是發(fā)現(xiàn)取代芳族氨基酸可產(chǎn)生具有改善的特性的肽。并且，在位置P2的亮氨酸通常是可接受的，但是取代疏水性和/或大氨基酸導致具有改善的活性的肽。主要參與同TCR相互作用的殘基(P4、P6和P8)表現(xiàn)出通常對于某種極性的偏好，并且在P8的情形中，芳族氨基酸(aromatic)通常產(chǎn)生具有有利特性的肽。一個優(yōu)選的實施方案涉及在P2位置具有取代的類似物。在一個這樣的實施方案中，所述取代可以是疏水性殘基。在另一個實施方案中，所述取代可以是大的疏水性殘基。在另一個實施方案中，Pl的殘基可以用更加疏水的殘基取代。在另一個實施方案中，殘基P1和P2都可以用更加疏水的殘基取代。在其它實施方案中，在Pl、P2、和P9的至少一個殘基可以被取代。在另一個實施方案中，在Pl、P2、和P9的至少兩個殘基可以被取代。在另一個實施方案中，在P1、P2、P9、P4和P6的至少兩個殘基可以被取代，包括參與TCR結(jié)合的一個或多個殘基。在另一個實施方案中，在P8的殘基可以用芳香殘基取代。下述取代的實例在圖13A-13C中顯示。1.N端近端一級錨點修飾(P2)N端一級錨點是肽的第二個N端氨基酸，因此，它是N端近端的一級錨點。盡管對于與MHC分子結(jié)合，初始亮氨酸158不被認為是"非優(yōu)選的"，但是取代可以產(chǎn)生具有提高的結(jié)合的肽。因此，在一個實施方案中，野生型序列中的初始Leu158可以用相似的或更加疏水性的氨基酸取代?？梢詰?yīng)用任何疏水性的氨基酸，包括任何可用的或為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，包括標準氨基酸和非標準氨基酸。在另一個實施方案中，初始Leu158可以用還具有大側(cè)鏈的更加疏水的氨基酸取代。更加疏水性的氨基酸的實例包括，但不限于Leu、Val、Ile、Met、a-氨基丁酸、正亮氨酸和正纈氨酸。并且，萘亞甲基側(cè)鏈也可被取代。優(yōu)選地，所述取代導致與HLA分子的提高的結(jié)合和穩(wěn)定性。然而，這一殘基可以二級或三級參與TCR相互作用，并且取代還可以導致提高的被TCR的識別。2.N端二級錨點修飾(P1)N端二級錨點是在N端的第一個氨基酸或Pl。這一殘基參與許多相互作用。殘基Ser157被確定為與HLA-A*0201分子相互作用的二級錨點殘基，它還在某種程度上參與與T細胞受體的相互作用。因此，這一位置的修飾產(chǎn)生一些更有免疫原性并且更適于研發(fā)腫瘤疫苗的不規(guī)則的類似物。因此，取代可以導致許多改善的性質(zhì)。盡管絲氨酸沒有被認為是"非優(yōu)選的"，但是許多取代可以導致改善的肽的性質(zhì)。因此，在一個實施方案中，在野生型序列中的初始Ser157可以用更加疏水的氨基酸取代?？梢詰?yīng)用任何更加疏水的氨基酸，包括可用的或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，包括標準氨基酸和非標準氨基酸。更加疏水的氨基酸的實例包括，但不限于Phe、Tyr、Trp、和D-Lys。3.N端一級和二級修飾(P2和Pl)在一個實施方案中，一級和二級錨定殘基都被取代，而導致對HLA分子提高的結(jié)合親和力。在另一個實施方案中，所述雙取代產(chǎn)生與HLA分子結(jié)合的提高的穩(wěn)定性。其它實施方案中，結(jié)合和/或穩(wěn)定性沒有提高，并且甚至可以被減小，但是改善了所述分子的其它特性，諸如活性或被耐受個體的識別。4.N端一級/二級錨點和C端一級修飾(P2，Pl和P9)野生型肽的C端半胱氨酸通常是非優(yōu)選的錨定殘基。由于這一殘基通常主要參與同MHC分子的相互作用，所以可以優(yōu)選地取代導致與MHC分子更強的相互作用的殘基。因此，取代表現(xiàn)出提高的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性，并且在一些情形中，導致具有減少交叉反應(yīng)性的類似物。在一些實施方案中，對C端的取代可以形成具有提高的結(jié)合和/或穩(wěn)定性而沒有減少的交叉反應(yīng)性的肽。然而，在其它實施方案中，對C端^J取代可以形成具有提高的結(jié)合和/或穩(wěn)定性具有相等的或減少的交叉反ii性的肽。由于先前已經(jīng)表明這一殘基的取代提供改善的肽，所以可以優(yōu)選地產(chǎn)生這樣的肽，即，其在與MHC分子的相互作用以及其它相互作用中，諸如被TCR識別中，是更加改善的。因此，在一些實施方案中，C端的取代可以與至少一種其它取代組合(paired)。對C端氨基酸的取代的實例包括，但不限于，纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、和異亮氨酸。5.N端一級/二級錨點和TCR殘基修飾參與同TCR相互作用的主要殘基通常被認為是殘基P4、P6、和P8。然而，其它殘基也可以較少程度地參與所述相互作用。在一個實施方案中，可以取代主要參與TCR相互作用的一個或多個位點以導致改善的相互作用。優(yōu)選地，這些取代產(chǎn)生不規(guī)則的類似物，所述類似物不妨礙與MHC分子結(jié)合，但是克服野生型肽的耐受問題。在一個實施方案中，可以包括至少一種TCR取代，在位置P1、P2、和/或P9具有至少一個取代。在一個實施方案中，在P4、P6、和P8，具有某種極性的氨基酸可以取代。在另一個實施方案中，芳族氨基酸可以在P8位置被取代。6.C端酰胺在一些實施方案中，可以修飾C端殘基，以含有取代游離的羧酸的酰胺。因此，例如，如果所述肽是9-mer(九聚體)，那么可以修飾P9殘基。如果所述肽是10-mer(十聚體)，那么可以修飾P10殘基。優(yōu)選地，這形成在生物介質(zhì)中具有增加的穩(wěn)定性的肽或類似物，所述生物介質(zhì)包括但不限于血、淋巴、和CNS。優(yōu)選地，所述肽保留它們其它的活性，以形成可用于接種疫苗或作為免疫原的類似物。7.十聚體典型的MHC結(jié)合肽的長度從大約8個到大約11個氨基酸的長度而不等。然而，大多數(shù)早先應(yīng)用的HLA-A*0201是9-mers(九聚體)或10-mers(十聚體)。因此，在一個實施方案中，所述類似物可以是野生型序列NY-ESO-"5W66的10-mer。然而，由于所述野生型10-mer沒有正確的結(jié)合基序并且沒有表現(xiàn)出免疫學活性，所以通過取代在P10位置的氨基酸而制備10-mer，并且鑒定各種修飾的作用(參見圖13A-13C)。在一個實施方案中，在C端添加或取代野生型的殘基可以選自由正纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、和丙氨酸組成的組。8.其余殘基參考圖13A和13C,任何殘基還可以用保守氨基酸取代。保守取代可以與可以產(chǎn)生作用的上述任何取代組合。備選地，保守取代可以特異性地在這樣的殘基，S卩，據(jù)信其不參與一級、二級、或者甚至三級水平的任何活性。這樣的殘基可以包括P3、P5和/或P7。保守取代是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，但是，例如，在位置P3的亮氨酸可以用丙氨酸或蘇氨酸取代而產(chǎn)生類似物。典型地，這樣的保守取代沒有顯著地影響類似物的活性。然而，在一些實施方案中，它們可以增加某些活性或減少某些活性。由于己知的相互作用，這樣的保守取代不可能對任何活性都具有顯著的作用。上文公開了許多關(guān)于各種實施方案的特征和類似物設(shè)計的方面，通用的或如應(yīng)用到具體表位上。應(yīng)該理解這樣的公開內(nèi)容也可以應(yīng)用到這一表位和后續(xù)的表位上。為了簡潔，將這樣的公開的清楚重述減少到最少。一些實施方案涉及I類MHC限制性T細胞表位PSMA288.297，GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)的類似物，包括這些可以被pAPC處理而呈遞所述表位類似物的類似物的多肽，和表達所述類似物的核酸。與野生型表位相比較，所述類似物可以具有相似的或提高的免疫學特性。確認這一表位通過人癌癥細胞呈遞的證據(jù)在下述實施例32中描述。一個實施方案涉及衍生和改善PSMA288.297的類似物的方法，以及包括取代的特異序列。所述類似物可以含有至少一種取代，但是可以具有多種取代，包括單一的或以各種組合的標準的或非標準的氨基酸。所述類似物可以形成具有保留的或改善的特性的肽。實施方案涉及長度為9或10個氨基酸的一種或多種肽的家族，其在序列上與人PSMA的氨基酸288-297相關(guān)。類似物設(shè)計在一些實施方案中，PSMA288.297類似物可以含有序列GLPSIPVHPI(SEQIDN0.42)的取代。參考結(jié)合基序數(shù)據(jù)，諸如在下述實施例2中的表7所列出的那些，表明P2錨定殘基可以在A2.1-限制性表位中對任何位置的親和力做出最大的個體貢獻。在這種情形中，在P2位置的氨基酸是最理想的優(yōu)選的亮氨酸。PQ錨定殘基，異亮氨酸，是有利的。應(yīng)用T2細胞檢測系統(tǒng)的體外結(jié)合研究(未顯示)已經(jīng)表明，特別是當與SSX-2和NY-ESO-l表位相比較時，天然肽通常具有優(yōu)良的結(jié)合特征。盡管這與飽和度的相對少的上升相匹配，但是所述表位在相對低的濃度表現(xiàn)出顯著的結(jié)合。可以改善野生型表位。諸如表7和8所代表的那些分析是平均情況，并且在具體序列中給出的殘基的行為可能不同于平均情況。與對于上文討論的SSX-2和NY-ESO-l表位用Nle和Nva所獲得的有利結(jié)果相一致，Nle和Nva還可以成功地用于所述PSMA表位。最后，如果與幫助克服可能存在的針對所述表位的任何耐受性的變化相組合，即使相似的結(jié)合特征可以增加所述肽的有效免疫原性。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，天然肽很少有免疫原性(例如參見實施例35)，其可以反映針對所述表位的耐受性；在小鼠和人PSMA之間，這一表位由此所衍生的PSMA區(qū)域是相同的。1.N端近端一級錨點修飾(P2)如上文所述，盡管在這一表位P2位置的天然殘基通常是遺傳編碼的氨基酸中優(yōu)化的殘基，但是，對于結(jié)合、耐受性破壞和交叉反應(yīng)免疫性的潛在的改善，檢驗了取代其它優(yōu)選的或大的疏水性殘基的效果。示例性的取代可以包括Met、Ile、Gln、Val、Nva、Nle、和氨基丁酸(Abu)。2.N端二級錨點修飾(P1)N端二級錨點是N端的第一個氨基酸。天然Gly是在這一位置唯一邊緣性優(yōu)選的。各種觀察(例如參見表7和8)表明具有改善所述表位的潛力的氨基酸包括Ala、Ser、Abu和肌氨酸(sarkosine)(Sar，艮卩，N-甲基甘氨酸)。3.C端一級錨點修飾(Pft)在這一位置的天然lie通常是優(yōu)選的但不是最理想的殘基。在這一位置的取代可以改善結(jié)合。示例性的取代可以包括Val、Leu、Nva、和Nle。4.二級錨點和TCR研究倒數(shù)第二個位置(PQ-1)可以作為二級錨點和TCR相互作用的位置。盡管它還可以促進改善的結(jié)合，但是Ala、Leu、Ser、或Thr的取代可以具有對TCR相互作用的主要作用。P3是可以影響結(jié)合和免疫原性的另一個位置。在這一位置的Trp取代可以改善二者。為了組合、協(xié)同、并且抵消用單一取代獲得的各種效果，其它實施方案涉及在多個位置的取代的組合。PRAME^^類似物上文公開了許多關(guān)于各種實施方案的特征和類似物設(shè)計的方面，通用的或應(yīng)用到具體表位上。應(yīng)該理解這樣的公開內(nèi)容也可以應(yīng)用到這一表位和后續(xù)的表位上。為了簡潔，將這樣的公開的清楚重述減少到最少。實施方案包括I類MHC-限制性T細胞表位PRAME425.433，SLLQHLIGL(SEQIDNO.71)的類似物，包含這些可以被pAPC處理而呈遞所述表位類似物的類似物的多肽，和表達所述類似物的核酸。與野生型表位相比較，所述類似物可以具有相似的或提高的免疫學特性。確認這一表位通過人癌癥細胞呈遞的證據(jù)在下述實施例39中描述。一個實施方案涉及衍生并且改善PRAME425.433的類似物的方法，以及包括取代的特異序列。所述類似物可以含有至少一種取代，但是可以具有多種取代，包括單一的或以各種組合的標準的或非標準的氨基酸。所述類似物可以形成具有保留的或改善的特性的肽。一些實施方案涉及長度為9或10個氨基酸的一種或多種肽的家族，其在序列上與人PRAME序列的氨基酸425-433相關(guān)。類似物設(shè)計一些實施方案涉及PRAME425.433的類似物，其可以含有序列SLLQHLIGL(SEQIDNO.71)的取代。參考結(jié)合基序數(shù)據(jù)，諸如在下述實施例2表7中列出的那些，表明P2錨定殘基可以在A2.1-限制性表位中對任何位置的親和力做出最大的個體貢獻。在這種情形中，在P2位置的氨基酸是最理想優(yōu)選的亮氨酸。PQ錨定殘基，亮氨酸是有利的，盡管不是強優(yōu)選的，對于所述位置野生型PQ殘基也不必是最優(yōu)選的。諸如表7和8所報道的那些分析是平均情況，并且具體序列中給出的殘基的行為可能不同于平均情況。與對于其它表位用Nle和Nva所獲得的有利結(jié)果相一致，用Nle和Nva取代這一序列可以獲得相似的改善。最后，如果與幫助克服可能存在的針對所述表位的任何耐受性的變化相配合，即使相似的結(jié)合特征也可以增加所述肽的有效免疫原性。各種取代的基本原理已經(jīng)在上文中列出。對于PRAME425.433表位所研究的具體取代遵循相同的邏輯，并且在實施例40-48和圖25-27中公開。取代在一級錨定位置P2和PQ(P9)、二級錨定位置P1和PQ-1(P8)進行。取代還可以在TCR相互作用位置(除了二級錨定位置外)P3和P6進行。所選的取代對I類MHC-肽復合體的結(jié)合和/或穩(wěn)定性有影響；I類MHC-肽復合體的結(jié)合和/或穩(wěn)定性是確定肽的免疫學特性的關(guān)鍵特征。另外，由于T細胞總體考慮，并且為了克服負責針對天然表位的有限的免疫性的機制，保持類似物與識別天然肽的T細胞受體相互作用的能力的取代可以是有實用價值的。實施例下述實施例提供類似物和鑒定類似物的方法。所述類似物可以用作，例如，免疫原，疫苗，和/或各種癌癥的治療。所述類似物可以如在實施例1中那樣制備。SSX-24M9類似物如在實施例2中所示那樣確定，并且在實施例3中列出。如實施例4-21所示那樣檢測所述類似物改善的特性。檢測NY-ESO-l,5W65類似物的改善的特性在實施例22-30中描述。檢測PSMA類似物的改善的特性在實施例33-38中描述。檢測PRAME425_433類似物的改善的特性在實施例40-48中描述。實施例l肽合成、純化和特征鑒定應(yīng)用標準的Fmoc固相化學，在Symphony多種肽合成儀(PTI技術(shù)公司(PTItechnologies),馬薩諸塞州(MA))或ABI433A肽合成儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems),福斯特城，加利福尼亞州)上以0.05-0.1毫摩爾規(guī)模合成肽。應(yīng)用預(yù)裝的PEG-PS樹脂(在Symphony上)或Wang樹脂(在ABI上)合成C端游離酸肽。C端酰胺化的肽在Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上合成。所有的樹脂從應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)(福斯特城，加利福尼亞州)購買。在肽合成中應(yīng)用的Fmoc-氨基酸從諾瓦生物化學(Novabiochem)(圣地亞哥，加利福尼亞州)禾nAnaSpec(圣何塞，加利福尼亞州)購買。通過標準流程進行合成后的切割。肽的純化在半制備HPLC柱或SPE柱體(菲羅門(Phenomenex),托蘭斯，加利福尼亞州)上進行。所有肽的純度》卯％。通過Maldi-TOFMS(VoyagerDE，應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))和應(yīng)用SynergiC12柱(菲羅門(Phenomenex),托蘭斯，加利福尼亞州)的分析HPLCs(瓦里安(Varian)或島津(Shimazu))，檢驗每種肽的特性。從新設(shè)計的SSX-2^類似物中等抗原性肽的結(jié)構(gòu)修飾可以極大地改善肽-MHC結(jié)合、CTL識別、和/或免疫原性。關(guān)于怎樣修飾野生型表位以獲得具有增強的功效的肽類似物的綜合指導是本領(lǐng)域已知的。一個重要的策略是將討論中用于結(jié)合具體的MHC分子的所謂的錨定位置的殘基優(yōu)化。在HLA-A2的情形中，已經(jīng)觀察到在P2和PQ位置對疏水性殘基的顯著偏愛，特別是在P2的L和M，以及在PQ的V(PQ表示表位的C端殘基。對于HLA-A2，取決于所述肽的長度，其是P9或P10。)。用芳香殘基，諸如F、Y和W置換P1位置也可以是有利的。表7.BIMAS運算法則所用的系數(shù)(運算法則可以通過超文本轉(zhuǎn)移鏈接//bimas.citnih.gov/molbio/hla一bind/可用)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>表8.通過SYFPEITHI運算法則所用的HLA-A*0201的得分模式(9-mers)(運算法則可以通過超文本轉(zhuǎn)移鏈接〃syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm可用)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>摘自Rammensee，Bachmann,Stevanovic:/z.ga"<is/e/"(iemo/的rM//C.LandesBioscience(Landes生物科學)1997實施例3下述類似物應(yīng)用實施例1中的預(yù)測而產(chǎn)生。表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>N-端二級錨點115';SX-24149(K4iF)!，ASEKIFYV1165SSX-24149(K41W，WASEKIFYV"75孤-241"49(K41Y)'^ASEKIFYV"8SSX-241-49(K4inD-Lys))D-Lys)ASEKIFYV1193SX-24M9(K41(Phg))。hgASEKIFYV120孤-2"49(K41fCha))ChaASEK!FYV1213SX-24149(K41(Phe-4F))Phe(44T)ASEKIFYV122SSX-24M9(K41(Ph"N02))Phe(4"N02)ASEKIFYV1233SX-24149(K41(0-甲基Tyr))D-甲基-TyrASEKIFYV124SSX-241"49(K41(P"(3-苯并瞜吩基)Ala))IH3-苯并噻紛基)AlaASEKIFYVN-端一級/二級錨點125SSX-24M9(K41Y,A42L)YLSEKIFYV126SSX-24!M9(K41Y,A42V)YVSEKIFYV127SSX-24149(K41Y,A42M)YMSEKIFYV128SSX-24149(K41Y,A42DYISEKIFYV129SSX-24149(K41F,A42L)FLSEKIFYV130SSX-24M9(K41F,A42V)FVSEKIFYV131SSX-24M9(K41F,A42M)FMSBKIFYV132SSX-24149(K41F,A42I)F1SEKIFYV133SSX-24M9(K41W,A42L)WLSEKIFYV134卩SX-24149(K41W，A42V)WVSEKIFYV135SSX-24149(K41W,A42M)WMSEKIFYV136SSX-24149(K41W,A42I)VVISEKIFYV137SSX-24149(K41(D-Lys),A42L)〔D-Lys)LSEKIFYV138SSX-24W9(K4l(D"Lys),A42V)[D-Lys)VSEKIFYVN-端一級/二級錨點，C-端一級錨點139SSX-24149(K41F,A42V,V49L)FVSEKIFYL140SSX-24149(K41F,A42V,V49I)FVSEKIFYI141SSX-24M9(K41F,A42V,V49A)FVSEKIFYA142SSX-24149(K41F.A42V,V49M)FVSEKIFYM143SSX-24M9(K4.1F,A42V,V49Nlc)FVSEKIFY(Nle)144SSX-241-49(K41F,A42V,V49Nva)FVSEKIFY(Nva)145SSX-24M9(K41F,A42V,V49MeVal)FVSEK!FY(MeVal)176SSX-24149(K41F,A42V,V49MeLeu)FVSEKIFY(MeLeu)146SSX-24"9(K41F,A42V,V49Aib)FVSEKIFY(Aib)147SSX-24149(K41F,A42Y,V49Abu)FYSEKIFY(Abu)N-端一級/二級錨點，TCR位點152SSX-241-49(K41F,A42V,E44D)FVSDKIFYV153SSX-24149(K41F,A42V,E44N)FVSNKIFYV154SSX-24149(K41F,A42V,E44S)FVSSKIFYV155SSX-24M9(K41F,A42V,E44T)FVSTKIFYV156SSX-24149(K41F,A42V,E44Q)FVS(3KIFYV157SSX-24M9(K41F,A42V,E44(Nle))FVS(N，e)KIFYV158SSX-24M9(K41F，A42V.E4爭a))FVS(Nva〉KIFYV159SSX-24"9(K41F,A42V,I46L)FVSEKLFYV160SSX-241-49(K41F,A42V,I46V)FVSEKVFYV<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>酸；Abu，a-氨基丁酸；Aib，a-氨基異丁酸；MeLeu，甲基-亮氨酸；MeVal，甲基纈氨酸；P-(3-苯并噻吩基)Ala，P-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸；O-甲基-Tyr，O-甲基酪氨酸；Cha，環(huán)己基丙氨酸；Nal-l，P-(l-萘基(napthyl))-丙氨酸；Nal-2，J3-(2-萘基)-丙氨酸；-順2表示羧基端已經(jīng)被修飾成為酰胺。實施例4-21檢測SSX-24，！類似物在下述實施例4-21中檢測實施例3中產(chǎn)生的類似物的活性，諸如結(jié)合和生物效果實施例4應(yīng)用T2細胞的肽的結(jié)合應(yīng)用基于T2細胞的檢測，評估肽類似物和野生型表位與HLA-A*0201.的親和力(RegnerM,等.，ExpC//"/wmwzoge"e"實驗臨床免疫遺傳學)1996;13(1):30-5;其通過參考完全并入本申請中)。對于結(jié)合檢測，簡要地說，將缺少TAP的表達并且因此不在細胞表面裝配穩(wěn)定的I類MHC的T2細胞用不同濃度的肽(對照或類似物)在37。C脈沖處理(pulsed)過夜，充分洗滌，用識別I類MHC(A2等位基因)的熒光標記抗體染色，并且通過FacsScan分析儀運行。在與給定濃度的類似物和陰性對照(非MHC結(jié)合物)相對應(yīng)的MFI(平均熒光強度)之間的差異，是有多少MHC和肽之間的穩(wěn)定復合體在T2細胞表面展示的函數(shù)。因此，在肽的有限濃度，這主要是K。n的測量，并且在肽的飽和水平，是K。n和Koff的測量。所述結(jié)合通過兩種數(shù)學相關(guān)的因子而量化半最大結(jié)合(給出50%的與飽和相對應(yīng)的信號的肽的濃度)和相對親和力(1/RA)。相對親和力RA是針對參考(野生型肽)標準化的結(jié)合；例如，在對照相對于肽類似物的半最大結(jié)合之間的比例。1/RA指數(shù)越高，并且半最大結(jié)合越低，類似物和MHC之間相互作用的K。n越高。應(yīng)用這些結(jié)合參數(shù)鑒定的53種類似物確定相對于野生型肽被改善。這些改善的結(jié)合物攜帶包括已知參與同MHC和/或TCR相互作用的位置的1個、2個、3個或多個取代(包括標準的和/或非標準的氨基酸)。然而，對MHC結(jié)合的全部作用取決于所述修飾。這樣的肽類似物可以用于治療性組合物或作為進一步衍生治療性組合物的平臺。實施例5應(yīng)用T2細胞的肽的穩(wěn)定性關(guān)于MHC的肽穩(wěn)定性(K。ff)通常不能僅從結(jié)合(Kon)推斷出來。由于T細胞的激活取決于"信號1"(MHC肽復合體與T細胞受體的相互作用)的持續(xù)時間，所以，關(guān)于這樣的肽的免疫性特性，除了結(jié)合之外，肽在I類MHC上的穩(wěn)定性公知是重要的。對于穩(wěn)定性檢測，簡要地說，將缺少TAP的表達并且因此不在細胞表面裝配穩(wěn)定的I類MHC的T2細胞，用一定濃度的已知獲得最大負荷的I類MHC("飽和")的肽(對照或類似物)在37'C脈沖處理過夜，充分洗滌，并且在吐根堿的存在下追蹤(chased)不同的時間間隔，所述吐根堿阻滯內(nèi)源蛋白的合成。充分洗滌后，將細胞用識別I類MHC(A2等位基因)的熒光標記抗體染色，并且通過FacsScan分析儀運行。在與給定濃度的類似物和陰性對照(非MHC結(jié)合物)相對應(yīng)的MFI(平均熒光強度)之間的差異，是有多少MHC和肽之間的穩(wěn)定復合體在T2細胞表面展示的函數(shù)。將所述信號隨時間的衰減用數(shù)學法表示為相對于在O小時(在追蹤時間間隔的開始)的結(jié)合的穩(wěn)定指數(shù)的50%。這樣改善的類似物可以攜帶包括已知參與同MHC和/或TCR相互作用的位置的l個、2個、3個或多個取代(包括標準的和/或非標準的氨基酸)，具有取決于所述修飾的對MHC穩(wěn)定性的全部作用。這樣的肽類似物可以用于治療性組合物或作為進一步衍生治療性組合物的平臺。43種類似物相對于天然肽具有增加的穩(wěn)定性。表現(xiàn)出改善的結(jié)合和穩(wěn)定性的類似物用于改善的組合物或者作為產(chǎn)生治療益處的改善的組合物的平臺。實施例6評估類似物的免疫學特性交叉反應(yīng)性和功能親和力肽的免疫學特性可以描述為與MHC分子結(jié)合(Kon和Koff)和與TCR(TCR和MHC-肽復合體之間相互作用的親和力)結(jié)合的函數(shù)。關(guān)于對與MHC分子結(jié)合的全部影響，一級MHC錨定殘基的修飾通常具有顯著程度的可預(yù)知性。二級MHC錨定殘基的修飾可以影響MHC-肽復合體與TCR的相互作用的親和力以及相對于肽-MHC相互作用的K。n和K。ff。設(shè)計一種方法，其允許以與提議的應(yīng)用方法一致的方式快速并且合理地篩選肽類似物，并且模擬全部免疫學特性(在整合方式中相對于MHC相互作用的K。n和K。ff和TCR結(jié)合特性)。在一些實例中，這種方法包括產(chǎn)生針對天然(未突變的)表位(SSX-24M9)的T細胞系，和應(yīng)用足以有效地在攜帶人MHC(諸如A2等位基因)的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生有效的應(yīng)答的免疫策略。在活性APCs和所測定的對天然(未突變的)表位特異性的T細胞的功能性影響存在下，離體檢驗肽類似物。由于在交叉反應(yīng)性肽的情形中期望的作用是兩階段性的(由于抗原-誘導的細胞死亡，AICD，在有限的濃度激活，并且在更高的濃度抑制)，所述評估在類似物的不同濃度進行。下述3種參數(shù)的測定可以用來定義肽類似物的基本和有用的特征1.引發(fā)指示T細胞活化的作用(例如，細胞因子產(chǎn)生)的最小需要的肽類似物濃度；2.在任何類似物濃度的最大(峰值)作用(例如，細胞因子產(chǎn)生)；3.在活化作用峰值的類似物濃度(例如，細胞因子濃度)。例如，導致與參數(shù)#1和3相關(guān)的減少的值但是增加與參數(shù)#2相關(guān)的值的類似物，可以是有用的。將天然表位和不相關(guān)的非交叉反應(yīng)性肽用作參考，在鑒定潛在值的類似物的種類中是有價值的。根據(jù)這樣的事實，即，盡管它們保留交叉反應(yīng)性，但是它們可以展現(xiàn)出與天然肽的免疫學特性截然不同的免疫學特性一一例如，更低的在體內(nèi)誘導AICD的傾向性或者破壞耐受性或恢復反應(yīng)性的能力，仍然認為展現(xiàn)出數(shù)量上相當?shù)幕蛘呱踔吝m當?shù)貜奶烊槐砦坏奶匦赃m當減弱的特性的類似物是有用的。這種篩選策略的一些優(yōu)點包括實用性和快速性，應(yīng)用更加相關(guān)的多克隆T細胞系而不是潛在有偏倚的T細胞克隆作為讀出，和復合值，積分參數(shù)，諸如K。n、K。ff和TCR親和力，所述參數(shù)可以轉(zhuǎn)化為肽-MHC復合體相對應(yīng)TCR的交叉反應(yīng)性和功能親和力。這些參數(shù)可以預(yù)測體內(nèi)免疫學特性，并且因此可以描述有用的肽類似物的全體，以進行進一步的評估、優(yōu)化和實際應(yīng)用。預(yù)計結(jié)合MHC并且保留針對對指定的野生型肽特異的TCR的交叉反應(yīng)性的類似物在這一檢測中引發(fā)可以測量的作用。全部方法在圖2中描述。用于產(chǎn)生T細胞系的方法如下在第O，4，14和18天，將攜帶A2人等位基因的HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(Pascolo等.J.ExpMed.(實驗醫(yī)學雜志)185(12):2043-51,1997，其通過參考完全并入本申請中)用與25昭pIpC混合的50嗎SSX-2天然表位(41-49)免疫，通過兩側(cè)施用到腹股溝淋巴結(jié)中而進行。在最后一次加強后7天，將小鼠處死，并且在完全HL-1培養(yǎng)基中制備5x10s百萬細胞/ml的脾細胞懸浮液。將細胞在平底96孔平板(200pl/L)中與不同濃度的肽溫育48小時，并且與添加到孔中的10U/ml的rlL-2繼續(xù)溫育24小時。收集上清，并且通過標準方法，諸如ELISA，評估IFN-y的濃度實施例7在單一位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力將上述方法(實施例6，圖2)用來檢查相對于以其野生型形式的天然SSX-24M9表位(KASEKIFYV(SEQIDNO.l))攜帶單一取代的類似物的文庫(圖3)。在離體激發(fā)IFN-y產(chǎn)生的最少需要的類似物的量和在類似物的任何濃度產(chǎn)生細胞因子的最大量之間發(fā)現(xiàn)強的反相關(guān)性。在這一檢測中評估，用L、V或M取代A42改善了所述肽的免疫學特性。L和V突變體是有活性的。M比天然表位更具活性。I突變體保留了針對識別野生型表位的TCR的交叉反應(yīng)性。在位置42用非標準氨基酸Abu、Nle或Nva置換A改善了所述肽相對于野生型表位的免疫學特性，在引發(fā)細胞因子產(chǎn)生所需的類似物的最少量和所產(chǎn)生的細胞因子的最大量這兩個方面改善。在這一檢測中，相對于天然肽，包括D-Ala、D-Val、Nal-2或Aib的突變體表現(xiàn)出保留的交叉反應(yīng)性和減少的免疫活性，但是還可以用于進一步的衍生(derivitization)，以調(diào)整或增強它們的特性。在位置42的Nal-l消除了所述活性。第一個殘基K^的改變表明，盡管在這一檢測中，用F或Phg置換提高了活性，但是W、D-Lys、和Cha消除了免疫學特性。用Y、Phe-4F、Phe(4-N02)、O-甲基-Tyr或P-(3-苯并噻吩基-Ala)置換K保留了活性。與初始表位相比較，通過用I置換位置V49(C端殘基)的修飾以更低的水平保留了活性。通過添加-NH2部分而修飾最后的殘基消除了肽的活性，所述活性隨后通過在位置42用L或V修飾A而恢復。這直接表明，具有比野生型肽的活性更低的活性的類似物仍然可用于進一步的衍生。實施例8在兩個位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力將實施例6的方法(圖2)用來檢查相對于以其野生型形式的野生型SSX-24M9表位攜帶兩個取代的類似物的文庫(圖4)。在位置1和2協(xié)調(diào)的修飾對類似物的活性具有可變的作用。例如，用Y、F或W取代K41，確證了(corroborated)用V、M或I取代A42，并導致類似物相對于野生型肽的保留的或增強的活性。由于P1殘基在某種程度上參與結(jié)合TCR，所以，這樣的雙突變肽提供增加的機會，從而以導致耐受性破壞的方式影響同TCR的相互作用(因此對實際應(yīng)用是有用的)。下列各項之間的組合:Y(位置W)與V(位置4",W(位置41)與I或L(位置42),和F(位置41)與L、V、1(位置42)，形成相對于野生型肽更加有活性的類似物。在位置41的Y和位置42的I，或位置41的W和42的V或M之間的組合，賦予同野生型肽的活性相似的活性。在位置41用D-賴氨酸置換K，在這一檢測中形成具有保留的活性的類似物。由于包括非標準氨基酸的這樣肽的代謝降解在體內(nèi)下降，這樣的肽可以是非常有用的。在位置42的V或L和位置49的I之間的組合導致比天然肽增加的活性。實施例9在多個位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力將實施例6的方法(圖2)用來檢查相對于以其野生型形式的天然SSX-24M9表位攜帶3個或更多取代的類似物的文庫(圖5)。分別在位置41和42的F和V，與在位置49的I或A組合，導致相對于野生型表位改善的或相似的活性。相反，在位置49的L或M導致極大減少的活性。在最后位置包括非標準氨基酸Nva、Abu或MeVal的三元突變體導致免疫活性的保持或提高。由于增加的體內(nèi)穩(wěn)定性和對酶促降解的抗性，這樣的肽極其有用。修飾在推定的TCR結(jié)合區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基可以形成相當大的價值的肽，其保持與MHC結(jié)合以及交叉反應(yīng)性。由于它們在MHC槽中的構(gòu)象與天然肽的構(gòu)象稍微不同，所述肽用于恢復免疫應(yīng)答性或者耐受性破壞。在位置44(Q，Nva或Nle)、位置46(L,V,Nle或Nva)或48(F或Phe-4F)的其它取代形成活性類似物，其中在位置44的D、N、S或T，在位置46的M或在位置48的T、S、Phg，或在位置46的L與在48的T，形成沒有活性的類似物。最后，具有5個取代的2種類似物沒有表現(xiàn)出活性(圖5)。實施例10包括天然肽和在不同位置的突變的十聚體的交叉反應(yīng)性和功能親和力將實施例6的方法(圖2)用來檢查包括指定的SSX-24M9肽的十聚體的類似物的文庫(圖6)。十聚體SSX-2^5o在刺激對41-49九聚體特異的T細胞系中，相對于后者顯著地更不活躍。在位置50將Y殘基修飾成I或L，但是以更少的或無的程度修飾成V、Nle或Nva，在這一檢測中導致活性的恢復。十聚體類似物活性的進一步優(yōu)化通過將位置2的A用L或V修飾而獲得。A42L取代挽救了Y50Nva十聚體的活性。由于i)更加有限的AICD;ii)由于在I類MHC上增加的穩(wěn)定性和/或稍微修飾的與TCR的相互作用，潛在更高的體內(nèi)活性，所述稍微修飾的與TCR的相互作用可能對于耐受性破壞是重要的，所以，與天然肽相比較，相似的或減少的體外活性(但是保留交叉反應(yīng)性)的肽類似物仍然有效用于誘導或加強免疫應(yīng)答。實施例11離體評估，應(yīng)用類似物來引發(fā)針對天然表位的增強的免疫性將3組小鼠(『4)用表達SSX-24M9天然表位的質(zhì)粒免疫，在第O，3，14和17天，以25^1PBS中25嗎質(zhì)粒/淋巴結(jié)，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)進行。這之后是在第28和31天的兩次額外的肽加強(相似的用量)。免疫的時間安排在圖7中顯示。加強后一周，將脾細胞用SSX-24M9天然肽離體剌激，并且在不同的E:T比例針對51Cr標記的靶細胞(T2細胞)進行檢測(圖8)。所述結(jié)果表明，與類似物A42L或野生型肽本身相比，作為加強劑，類似物A42V引發(fā)針對表達天然肽的靶細胞的更高的應(yīng)答。這與通過離體實驗確定的結(jié)合和穩(wěn)定參數(shù)相關(guān)。實施例12體內(nèi)評估，應(yīng)用類似物來引發(fā)針對天然表位的增強的免疫性將8組小鼠(r^4)用表達SSX-24L49天然表位的質(zhì)粒免疫，在第0，3，14和17天，以25^1PBS中25昭質(zhì)粒/淋巴結(jié)，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)進行。這之后是在第28和31天的兩次額外的肽加強(相似的用量)，其使用陰性對照肽(MelanA26-35"EAA")，天然肽或類似物，如在圖9中所示。為了評估針對天然肽的體內(nèi)應(yīng)答，將脾細胞從同窩出生的對照HHD小鼠分離，并且與20pg/mL或lpg/ml的天然肽一起溫育2小時。然后將這些細胞用CFSEhi熒光染色(4.0pM或lpM持續(xù)15分鐘)，并且與用CFSE1。熒光(0.4pM)染色的等量的對照脾細胞一起靜脈內(nèi)共同注射到免疫的小鼠中。18小時后，通過從被激發(fā)的動物移除脾和PBMC而測定靶細胞的特異性消除，并且通過流式細胞術(shù)檢測CFSE熒光。相對于對照(未負荷的)群體計算與負荷肽的脾細胞相對應(yīng)的群體的相對損耗，并且表示為Q/0寺異性裂解。圖10(脾)和11(血)顯示由圖7描述的方案激發(fā)的體內(nèi)細胞毒性。相對于天然肽，所檢測的肽中有3種，A42V、K41F和K41Y，在脾和血中都表現(xiàn)出針對用20|ig/ml以及l(fā)jig/ml的天然肽包被的耙細胞的增加的活性(圖11)。實施例13應(yīng)用類似物來弓I發(fā)針對腫瘤細胞的增強的應(yīng)答將8組小鼠(r^4訴表達SSX-24,-49天然表位的質(zhì)粒免疫，在第0，3，14和17天，以25^1PBS中25^g質(zhì)粒/淋巴結(jié)，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)進行。這之后是在第28和31天的兩次額外的肽加強(相似的用量)，其應(yīng)用陰性對照肽(MelanA26-35"EAA")，天然肽或類似物，如在圖9中所示。加強后一周，將脾細胞用SSX-24M9野生型肽離體刺激，并且在不同的E:T比例針對51Cr標記的人腫瘤細胞(624.38黑素瘤細胞)進行檢測(圖12)。類似物A42V和K41FA42VV49I激發(fā)這樣的免疫應(yīng)答，即，其調(diào)控針對表達天然SSX-24M9表位的人腫瘤細胞的增加的細胞毒性。實施例14N端近端一級錨點修飾(第2個AA)當檢測表3中所示的取代類似物時，與野生型肽表位相比較，所述類似物表現(xiàn)出改善的結(jié)合和穩(wěn)定性模式。然而，對于每種類似物，改善的量級不同，并且，在與HLA-AW201分子的結(jié)合親和力方面，A42V取代表現(xiàn)出最高的改善。并且，A42V-HLA-A*0201復合體的穩(wěn)定性比在野生型肽和HLA-AW201之間形成的復合體更好T1/2從11.5小時延長至20小時。具有42A到L、V和M取代的肽能夠在顯著更低的濃度誘導野生型肽特異的CTL的IFN-y分泌。42A到I取代產(chǎn)生具有改善的結(jié)合和穩(wěn)定性模式的類似物。在P2位置的殘基還可以以某種程度參與同TCR的相互作用。這一觀察也得到關(guān)于42A到Aib類似物的結(jié)果的支持，相對于野生型表位，所述類似物具有相似的與HLA-A*0201結(jié)合的親和力。實施例15N端二級錨點修飾(第1個AA)N端二級錨點是在N端的第一個氨基酸。因此，在一個實施方案中，野生型序列中發(fā)現(xiàn)的初始Lys43被更加疏水的和大的氨基酸取代。還可以應(yīng)用任何更加疏水的和大的氨基酸，包括任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員可獲得的或為本領(lǐng)域的技術(shù)人員己知的，包括標準氨基酸和非標準氨基酸。更加疏水的氨基酸的實例包括，但不限于Phe、Tyr、Trp、和D-Lys。殘基Lys41定義為與HLA-AW201分子相互作用中的二級錨定殘基，并且它還以某種程度參與同T細胞受體的相互作用。因此，這一位置的修飾可以產(chǎn)生一些不規(guī)則的類似物，其更有免疫原性并且更適于腫瘤疫苗的開發(fā)。如在表3所示，可以看出通過將Lys41置換成為Tyr、Phe或Phe衍生物(苯基甘氨酸、對氟代苯丙氨酸、對硝基苯丙氨酸)所獲得的類似物具有同HLA-AW201分子更高的親和力，并且形成更穩(wěn)定的復合體。另一方面，盡管基于所預(yù)測的運算法則，Trp類似物應(yīng)該具有同Tyr和Phe類似物的親和力相似的親和力，但是Lys到Trp或Trp衍生物的類似物已表現(xiàn)出同HLA-A*0201分子顯著減小的親和力。實驗數(shù)據(jù)證明了預(yù)測運算法則的局限性。例如Lys41到Phg取代形成具有同HLA-A*0201分子提高的親和力和擴大的穩(wěn)定性的類似物。盡管它與HLA-A*0201分子的親和力大約與野生型肽的親和力相同，但是表明對硝基苯丙氨酸類似物在低得多的濃度下誘導野生型肽特異性CTL的IFN-y分泌。實施例16n端一級/二級錨點修飾當N端的一級和二級錨定殘基都被修飾時，一般的趨勢是，所獲得的類似物表現(xiàn)出與HLA-A*0201分子改善的親和力和擴大的穩(wěn)定性(表3)，只有少數(shù)例夕卜(K41Y，A42V)，(K41Y,A42M)禾卩(K41(D-Lys),A42V)。另外，它們具有非常好的同野生型肽特異性CTL的交叉反應(yīng)性。將K41W取代與A42V或A42L組合改善了結(jié)合/穩(wěn)定性模式。這些類似物還具有理想的同野生型肽的交叉反應(yīng)活性。N端一級錨點和二級錨點的組合修飾在更大程度上改變了肽的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。實施例17n端一級/二級錨點和c端一級修飾野生型肽的C端Val是優(yōu)選的錨定殘基。然而，當它突變成具有一個附加的-CH2基團的Ile時，觀察到改善的效果。Val到Abu取代時也觀察到相似的改善。其余的類似物表現(xiàn)出同MHC分子改善的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性。這些類似物的結(jié)果表明，所述肽C端錨定殘基還在T細胞的識別中起重要作用。(表4)實施例18n端一級/二級錨點和tcr位點修飾二級TCR結(jié)合氨基酸殘基的取代產(chǎn)生不規(guī)則的類似物，所述不規(guī)則的類似物不妨礙同MHC分子的結(jié)合，但是克服了自身抗原的耐受性問題。通過將N端一級/二級錨定殘基(K41F和A42V)與TCR位點的取代組合，產(chǎn)生了具有改善的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性的類似物(表6)。這些類似物中的一些在更低的濃度誘導野生型肽特異性CTL的IFN-Y產(chǎn)生，諸如K41F、A42V、E44(Nva)/(Nle)突變體和K41F、A42V、I46L/(Nva)/(Nle)突變體。實施例19n端酰胺用酰胺置換肽的游離羧酸C末端通過賦予對蛋白質(zhì)水解的穩(wěn)定性而改善了肽在生物介質(zhì)中的穩(wěn)定性，并且賦予針對所述肽的二肽基羧肽酶的抗性。然而，所形成的類似物的一些失去了顯著量的它們與MHC分子的親和力，以及免疫原性和抗原性。出乎意料地，盡管本申請在表7中公開的3種類似物失去了它們與MHC分子的結(jié)合能力，但是SSX-24M9-NH2(A42V)保留其與野生型肽特異性CTLs的反應(yīng)性，如由它在與野生肽的濃度相似的濃度下誘導IFN-y分泌的能力所表明那樣。然而，SSX-24M9-NH2(A42L)能夠在更低的濃度刺激IFN-y的產(chǎn)生。實施例20十聚體典型的MHC結(jié)合肽的長度從8-mer至(Jll-mer不等，并且大多數(shù)HLA-A*0201結(jié)合肽是9-mers或10-mers。在早先的觀察中，發(fā)現(xiàn)來自天然序列的9-mer和10-mer都具有對于相同MHC的結(jié)合基序，并且具有相同的N端。從蛋白酶體處理的觀點來看，它們是不同的表位，但是雖然如此還是抗原性交叉反應(yīng)性的。在野生型表位SSX-24M9的情形中，所述表位是9-mer肽，并且10-mer肽，SSX-24M。，缺少適當?shù)腗HC結(jié)合基序，并且沒有表現(xiàn)出免疫學活性。因此，用可以產(chǎn)生適當?shù)慕Y(jié)合基序的氨基酸將野生型表位延長至10-mer。如在表8中所示，盡管許多10-mer類似物具有更低的與HLA-A*0201分子的結(jié)合親和力，但是類似物SSX-241-5()(A42L,Y50L/V/Nle/Nva)表現(xiàn)出提高的與HLA-A*0201分子的結(jié)合親和力。特別地，兩種10-mer類似物，A42L和Y50Nle/Nva，能夠在比野生型肽更低的濃度下誘導針對野生型肽免疫的T細胞產(chǎn)生IFN-Y。實施例21應(yīng)用類似物克服耐受性(TOLERIZATION)其中類似物可以代表對于野生型表位的改善的一個方面是在人體系統(tǒng)中增加的免疫原性和耐受性破壞。TCR全體中的差異，不管是由于種系差異還是在陰性選擇中的差異，具有給出反常結(jié)果的潛力。為了闡明所述問題，將所述類似物用于HLA-A2+血的體外免疫以產(chǎn)生CTL。體外免疫的技術(shù)，甚至應(yīng)用首次用于實驗的供體，是本領(lǐng)域已知的，例如，Staiiss等.，尸rac.A^/JcadSc/.(美國國家科學院學報)89:7871-7875,1992;Salgaller等.Ca證M(癌癥研究)55:4972-4979，1995;Tsai等.，>//mmw"o/(免疫學雜志)158:1796-1802,1997;和Chung等.，//mw朋oAer(免疫治療雜志)22:279-287，1999;其中每一篇通過參考全部并入本申請中。具體地，通過在Ficoll-Hypaque中離心將來自正常供體的PBMCs從淡黃色包被層中純化出來。所有的培養(yǎng)物應(yīng)用自身血漿(AP)進行，以避免暴露于潛在的異種病原體和FBS肽的識別。為了有助于在體外產(chǎn)生肽-特異性的CTL，將自體樹突細胞(DCs)用作APCs。產(chǎn)生DCs，并且用DCs和來自PBMCs的肽誘導CTLs，如在Keogh等，2001中描述的那樣，其通過參考全部并入本申請中。簡要地說，將單核細胞富集的細胞級分用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)5天，并且在具有2pg/mlCD40配體的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天，以誘導成熟。將2乂106個〔08+-富集的丁淋巴細胞/孔和2Xl()S個肽-脈沖的DCs/孔在24孔平板中在補充了10%AP、10ng/mlIL-7和20IU/mlIL-2的2mlRPMI中共同培養(yǎng)。在第7和14天將培養(yǎng)物再次用自身輻射的肽-脈沖的DCs刺激。應(yīng)用本文所描述的體外細胞毒性和細胞因子生產(chǎn)測定而檢測免疫原性。實施例22-30檢測NY-ESO-lw.，"類似物檢測圖13中列出的類似物的活性，諸如結(jié)合和生物作用，如在實施例22-30中所述.-實施例22在單一位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力(圖13A-C)將上述方法(實施例6)用來檢査相對于其天然(或野生型)形式的野生型NY-ES0-1^.^表位而攜帶單一取代的類似物的文庫(圖13)。在離體激發(fā)IFN-丫產(chǎn)生的最少需要的類似物的量和在類似物的任何濃度產(chǎn)生細胞因子的最大量之間發(fā)現(xiàn)強的反相關(guān)性。用F或K取代S157，形成部分保留MHC結(jié)合和與對指定表位特異的T細胞的交叉反應(yīng)性的類似物。用I取代L158改善了肽的免疫學特征，如通過這種方法所評估的那樣；而L158V導致活性的部分保持。用氨基酸V、L、A、或I的任何一種修飾C165導致改善的免疫特性。在N端位置或其它位置具有取代，并且在這一檢測中相對于野生型肽而具有保留的但沒有增加的活性的肽，可以用于人。另外，它們是用于進一步衍生的材料，以改善它們的特性，如下述所描述的那樣。實施例23在兩個位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力(圖13A-C)將實施例6的方法用來檢查相對于野生型NY-ESO-"5W65表位攜帶兩個取代的類似物的文庫。發(fā)現(xiàn)在位置2和9同時發(fā)生的半保守修飾對類似物的免疫特性具有顯著的作用，這取決于所述類似物精確的同一性。將L158I與C165V或C165L組合進一步增加了它們相對于野生型肽的活性。類似地，L158V改善了C165V或C165L類似物的活性，相對于野生型肽，其進一步增加了這樣的活性。L158V部分保持了C165A或C165I類似物的活性，表明一級錨定殘基雙突變的令人感興趣的效果。類似地，L158I部分保持了C165A類似物的活性。在位置1和9的同時修飾對類似物的免疫特性具有顯著的作用，這取決于所述類似物的精確的同一性。S157Y與位置9的C165Nva(正纈氨酸)或Nle(正亮氨酸)組合導致比單獨的S157Y或者野生型肽基本上改善的活性。C165V突變體還挽救了S157Y突變體的活性。在位置9的V-NH2或L-NH2部分挽救了S157Y類似物的活性一一然而，A-NH2沒有這樣的作用。S157F和在第9個位置上的V、L、I、以及更少程度上的A的組合，保持了類似物的強活性，并且由于第一個殘基參與同TCR的相互作用，其可以比在位置9的單一突變體更加有用。S157K和在第9個位置上的V、L、I、以及更少程度上的A的組合，保持了類似物的強活性，并且由于第一個殘基參與同TCR的相互作用和位置1的K對肽的可溶性的完全有益作用，其可以比在位置9的單一突變體更加有用。實施例24在多個位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力(圖13A-C)將實施例6的方法用來檢查相對于野生型NY-ESO-l表位攜帶多個取代的類似物的文庫。L158Nva或L158Nle極大地改善了S157YC165V突變體的活性。相對于野生型肽，在位置158的V或I和在165的V、L、A或I之間的組合，部分恢復類似物相對于野生型肽的功效。相對于野生型肽和具有C165V或C1651的S157V，S157YL158IC165V表現(xiàn)出增加的活性;并且具有C165L或I的S157I,保持了MHC結(jié)合和與對野生型肽特異性的T細胞的交叉反應(yīng)性。除了在160的L或N;在162的A、L、V、或N;或在164的E、D或T之外，包括分別在位置157和165的Y和V的三元取代，在這種交叉反應(yīng)性檢測中，保持了所述肽的活性，由于位置160、162和164參與同TCR的相互作用，這使得這些類似物成為用于在體內(nèi)破壞T細胞耐受性的有效化合物。在實施例2所描述的檢測中，包括157F和158V加上位置165的V、L或I的三元取代表現(xiàn)出活性。另外，包括S157F和L158I加上位置165的V或A的三元突變體保持了活性。綜合起來，這些數(shù)據(jù)強調(diào)了所述多個取代的復雜的相互作用和非線性的性質(zhì)。最后，相對于野生型肽，包括S157W和更高程度的S157T以及158V和165V的三元突變體，分別表現(xiàn)出保持的或者增加的活性。實施例25包括野生型肽和在不同位置突變的十聚體的交叉反應(yīng)性和功能親和力(圖13A-C)將實施例6的方法用來檢査包括指定的NY-ESO-l5W65肽的十聚體的類似物的文庫。盡管所述十聚體本身在體外缺少顯著的活性，但是在這一位置的各種取代部分地挽救了活性，諸如在166的L，或者在166的L、I、Nle與在157的Y和在165的V組合。由于i)更加有限的AICD(抗原-誘導的細胞死亡)；ii)由于在I類MHC上增加的穩(wěn)定性和/或稍微修飾的與TCR的相互作用而引起的更高的體內(nèi)活性，所以與野生型肽相比較，在體外具有相似的或減少的活性的肽類似物(但是具有保持的交叉反應(yīng)性)仍然有效用于誘導或加強免疫應(yīng)答。因此，這些類似物有效地用于破壞耐受性。實施例26評估類似物的免疫學特性與I類MHC分子結(jié)合的肽(圖13A-C)肽類似物和野生型表位與HLA-A*0201的親和力通過基于T2細胞的檢測進行評估(參考RegnerM,等.，￡jcpC//"/mm柳oge"d.(實驗臨床免疫遺傳學)1996;13(1):30-5，其通過參考全部并入本申請中)。對于結(jié)合檢測，簡要地說，將缺少TAP的表達并且因此不在細胞表面裝配穩(wěn)定的I類MHC的T2細胞用不同濃度的肽(對照或類似物)在37'C脈沖處理過夜，充分洗滌，用識別I類MHC(A2等位基因)的熒光標記抗體染色，并且通過FacsScan分析儀運行。結(jié)合A2的肽穩(wěn)定其在細胞表面的存在。在與給定濃度的類似物和陰性對照(非MHC結(jié)合肽)相對應(yīng)的MFI(平均熒光強度)之間的差異，是有多少MHC和肽之間的穩(wěn)定的復合體在T2細胞表面展示的函數(shù)。因此，在肽的限制性濃度，這主要是K。n的測量，并且在肽的飽和水平，是K。n和K。ff的測量。在圖13中，所述結(jié)合通過兩種數(shù)學相關(guān)的因子而量化半最大結(jié)合(給出50%的與飽和相對應(yīng)的信號的肽的濃度)和相對親和力(1/RA)，所述相對親和力是針對參考(野生型肽)標準化的結(jié)合一一即，在對照相對于肽類似物的半最大結(jié)合之間的比例。1/RA指數(shù)越高，并且半最大結(jié)合越低，類似物和MHC分子之間相互作用的K。n越高。圖13中，相對于野生型肽，有39種所述類似物具有改善的這樣的結(jié)合參數(shù)。這樣改善的結(jié)合物攜帶在已知參與同MHC和/或TCR相互作用的位置的l個、2個、3個或多個標準和/或非標準氨基酸的取代，對MHC結(jié)合的全部作用取決于精確的/綴合的修飾。這樣的肽類似物有效用于治療性組合物或作為進一步衍生治療性組合物的平臺。實施例27免疫方法(圖14)將8組小鼠(？4)用表達野生型NY-ESO-h57掘表位的質(zhì)粒免疫，在第0，3，14和17天，將每個淋巴結(jié)用在25plPBS中的25嗎質(zhì)粒，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)而進行。這之后是在第28和31天的兩次肽加強(相似的用量)，應(yīng)用陰性對照肽(HBVc)，野生肽或類似物，如在圖14中所示。實施例28在體內(nèi)評估類似物引發(fā)針對野生型表位的增強的免疫性的應(yīng)用(圖15A-C)為了評估所獲得的針對野生型表位的體內(nèi)應(yīng)答，將脾細胞從同窩出生的對照HHD小鼠分離，并且用20嗎/mL或l昭/ml的野生型肽溫育2小時。然后將這些細胞用CFSEh'和CFSE"^熒光染色(分別為4.0pM或lpM持續(xù)15分鐘)，并且與用CFSE"熒光(0.4nM)染色的等量的對照脾細胞一起靜脈內(nèi)共同注射到免疫的小鼠中。18小時后，通過從被激發(fā)的動物移除脾和PBMC而測定靶細胞的特異性消除，并且通過流式細胞術(shù)測定CFSE熒光。相對于對照(未負荷的)群體，計算與負荷肽的脾細胞相對應(yīng)的群體的相對消耗，并且表示為Q/^特異性裂解。圖15A顯示在接受陰性對照肽的小鼠中缺少體內(nèi)細胞毒性。圖15B顯示在用質(zhì)粒免疫并且用野生型肽增強的小鼠中的可變的細胞毒性。圖15C顯示在用質(zhì)粒免疫并且用類似物L158NvaC165V增強的小鼠中的基本上恒定的細胞毒性。實施例29在體內(nèi)評估各種類似物在弓1發(fā)針對野生型表位的增強的免疫性中的比較個16A-B)按照實施例8所述的免疫流程內(nèi)容和應(yīng)用實施例9所述的方法，在分別對于引發(fā)和增強流程應(yīng)用質(zhì)粒和肽類似物進行引發(fā)和增強流程后，對針對用有限的(lpM;圖16A)或超最適量的野生型肽(20pM;圖16B)包被的靶細胞的體內(nèi)細胞毒性進行評估。表示為平均％特異性裂解+/-SE的結(jié)果表明，類似物L158VC165Nva誘導最高的活性，并且類似物L158VC165V，L158VC165Nva和S157KL158VC165V表現(xiàn)出同野生型肽或C165V突變體相同范圍的效果。由于多個取代可以改變TCR結(jié)合位點，因此，這樣的類似物可以比野生型肽在破壞針對自身表位的耐受性中更加有效。另外，S157K三元突變體可以改善野生型肽或具有直接的實際應(yīng)用的其它類似物的極低的溶解度。實施例30通過細胞因子生產(chǎn)離體評估類似物引發(fā)針對野生型表位的增強的免疫性的應(yīng)用(圖17A-B)按照實施例27所述的免疫流程的內(nèi)容，并且按照實施例28所述的激發(fā)，將脾細胞分離，收集并且在體外用10nM的野生型肽NY-ESO-l^.i65分別刺激3和6天。收集上層清液，并且通過ELISA測定IFN-Y濃度。當離體刺激時，類似物L158NvaC165V更迅速地誘導生產(chǎn)巨大水平的IFN-y的T細胞(圖17A)。其它類似物，諸如S157FL158VC165V,L158VC165Nva,和L158VC165V，在用野生型肽離體再次剌激時，誘導生產(chǎn)增加量的IFN-y的T細胞(圖17B)。相反，相對于野生型肽，按照實施例27-28中所述的流程，C165V沒能誘導T細胞生產(chǎn)IFN-y的增加的能力。實施例31通過ELISA表征結(jié)合和穩(wěn)定性(ITOPIA檢測)將用所謂的占位肽(placeholderpeptide)負荷的含有I類單體的抗生物素蛋白包被的微量滴定平板用來評估肽的結(jié)合、親和力和解離率(off-rate)。提供單體包被的平板作為iTopia表位發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)試劑盒(iTopiaEpitopeDiscoverySystemKit)(貝克曼庫爾f寺公司(BeckmanCoulter,Inc.),圣地亞哥，加利福尼亞，美國)的部分。檢測緩沖液，抗-MHC-FITCmAb和(32-微球蛋白和對照肽也與試劑盒一起提供。結(jié)合檢測通過結(jié)合檢測，首先評估天然肽和類似物它們結(jié)合每種MHC分子的能力。這一檢測測定個體肽在標準化的最適結(jié)合條件下結(jié)合HLA分子的能力。首先將單體-包被的平板打開(stripped)，釋放占位肽并且只使MHC重鏈結(jié)合到平板上。然后，在最適折疊條件下，引入檢測肽，以及抗MHC-FITCmAb。將平板在2rC溫育18小時?？筂HC-FITCmAb優(yōu)先結(jié)合重折疊的MHC復合體。因此，每種肽產(chǎn)生的熒光強度與肽和MHC分子形成復合體的能力相關(guān)。相對于試劑盒中提供的陽性對照肽，評估每種肽的結(jié)合，并且將結(jié)果表示為"％結(jié)合"。隨后，將相對于天然肽鑒定為'更好的結(jié)合物'的類似物在親和力和解離率檢測中進行分析。親和力檢測對于親和力檢測，在開始去除占位肽后，將給定的等位基因的增加濃度(10—Mo-sm范國)的每種測試肽添加到一系列孔中，并且在前文所述的條件下溫育。將平板在熒光計上讀數(shù)。應(yīng)用Prism軟件產(chǎn)生S形劑量反應(yīng)曲線。將獲得最大值的50X所需要的肽的用量記作ED5o值。解離率檢測對于解離率檢測，在2rC溫育18小時后，洗滌平板以去除過量的肽。然后將平板在等位基因特異性的單體平板上在37'C溫育。在多個時間點(0,0.5,1，1.5，2，4，6和8小時)測量平板的相對熒光強度。將50%的肽與MHC單體解離所需要的時間定義為T1/2值(小時)。iScore計算-iScore是在iTopia軟件中提供的多參數(shù)計算。它的值是基于結(jié)合、親和力和穩(wěn)定數(shù)據(jù)計算的。實施例32檢驗PSMA^gg^的抗原性在第0，3，14和17天，將HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(『4)用PSMA288-29Jjt(每個淋巴結(jié)25iig，在25plPBS中，加上12.5iig的pI:C)免疫。加強后一周，將脾細胞用天然PSMA288.297肽離體刺激，并且在不同的E:T比例，針對"Cr-標記的人腫瘤細胞(PSMA+A2+LnCap細胞，或作為陰性對照，用I類MHC-封閉的抗體包被的LnCap細胞)進行檢測。表示為％特異性裂解(平均值士SEM)的結(jié)果，表明PSMA特異性T細胞能夠以一種取決于I類MHC可用性的方式裂解人腫瘤細胞，這證實了PSMA表位以一種允許免疫介導的攻擊的方式在腫瘤細胞的I類MHC上的展示。實施例33-38檢測PSMA^gg^類似物檢測在圖19和20中列出的類似物的各種特性，諸如改善的親和力和結(jié)合穩(wěn)定性，與天然表位的交叉反應(yīng)性，和免疫原性，如實施例33-38所述。實施例33在單一位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力應(yīng)用實施例31所述的方法，彼此互相比較評估？81\4八288.297和類似物的結(jié)合特征(參見圖19)。結(jié)合的陽性對照是melan-A26.35A27L。通過應(yīng)用類似物肽刺激對天然表位特異性的T細胞系分泌IFN-Y，基本上如在實施例6中所述的那樣，而評估與天然表位的交叉反應(yīng)性。圖19所示的數(shù)據(jù)通過用10(ig/ml的類似物(大約10pM)刺激而產(chǎn)生。對于所述類似物，這一濃度通常導致最大的或接近最大的IFN-Y產(chǎn)生，并且因此被選作代表交叉反應(yīng)性。觀察到的類似物的親和力在圖19中報道為ED5oS。Met,Ile，Gin,Val,Nva，Nle,和Abu在P2位置取代。這些取代一般導致相似的親和力。Nle和Met取代還維持了相似的結(jié)合穩(wěn)定性，作為以小時為單位的半解離時間而測定。Val、Nva、和Abu類似物激發(fā)相似水平的IFN^產(chǎn)生。在PQ—級錨定位置用Val、Leu、Nva、和Nle取代Ile。所有這4種具有相似的結(jié)合親和力。Val和Nva取代改善了結(jié)合的穩(wěn)定性，并且增加了生產(chǎn)的IFN-y的量，這表明交叉反應(yīng)性并且所述類似物可具有改善的免疫原性。在P1的Ser、Ala、Sar、和Abu取代維持了相似的結(jié)合特征，但是具有邊緣相似的交叉反應(yīng)性。在PQ-1位置的Ala、Leu、Ser、和Thr取代也維持了相似的結(jié)合特征。最后，在P3的Trp取代表現(xiàn)出都增加了大約2倍的親和力和結(jié)合穩(wěn)定性，以及為天然肽的2倍之內(nèi)的IFN-Y產(chǎn)量，所有都通常為相似的值。實施例34在兩個位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力上文可見的模式，在這種表位中的取代沒能極大地消弱結(jié)合親和力，繼續(xù)用雙取代來檢驗(圖20)與天然肽相比較，哪一種均一地表現(xiàn)出相似的或改善的結(jié)合親和力。在具有在兩個一級錨定位置具有取代的類似物中，具有在P2的Nva或Nle與在PQ的Val，和在P2的Val與在PQ的Nva的那些類似物顯示改善的結(jié)合穩(wěn)定性，并且前兩者增加了IFN-Y產(chǎn)生(對于第3種類似物沒有顯示數(shù)據(jù))。在PQ的Val和Nva取代還與在Pl的Ala和Abu取代配對。這些類似物都具有強的結(jié)合穩(wěn)定性，并且與單一的PQ取代比較，具有提高的IFN-y產(chǎn)生，因而進一步改善了PI的取代。盡管各種結(jié)合參數(shù)通常是相似的，但是當與P3Trp取代組合時，Nva取代還能夠維持比V更好的交叉反應(yīng)性。實施例35在三個位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力在P1、P2、禾口P3;Pl、P2、禾口PO;P2、P3、禾口PO;以及Pl、P3、和PQ進行三元取代(圖21)。在所有情形中，Pl取代是Ala，P3取代是Trp，以及PQ取代是Val或Nva。如上，保持了至少同天然肽相似的親和力。對于Pl、P2、P3類，在P2的Nva和Nle改善了結(jié)合穩(wěn)定性。這種P2Nva類似物激發(fā)了相似量的IFN-Y，而Nle類似物表現(xiàn)出基本的增加。對于Pl、P2、PQ類，以各種組合的在P2和PQ的Nva和Val改善了結(jié)合穩(wěn)定性。這種P2NvaPQVal類似物還在IFN-y產(chǎn)生上表現(xiàn)出基本的增加(數(shù)據(jù)未顯示)。在這種三元取代中在P2和PQ的Val都表現(xiàn)出結(jié)合穩(wěn)定性，和幾乎為天然肽的IFN-Y產(chǎn)生的一半的IFN-Y產(chǎn)生。對于P2、P3、PQ組，只有Nva/W/V類似物表現(xiàn)出提高的結(jié)合或IFN-y產(chǎn)生。對于所檢驗的兩種P1、P3、PQ類似物，PQ為Val或Nva的類似物改善了結(jié)合穩(wěn)定性。實施例36各種類似物的交叉反應(yīng)性免疫原性在第O，3，14和17天，將HHD轉(zhuǎn)基因小鼠組(n-8)用肽(天然表位PSMA288.297，或攜帶在一級或二級錨定殘基的取代的類似物)免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)中，每個淋巴結(jié)施用在25^1PBS中的25|ag+12.5pgpI:C而進行。在最后一次加強后10天，將小鼠處死，制備脾細胞，并且通過ELISPOT分析評估IFN-y產(chǎn)生。在用抗IFN-y抗體包被的ELISPOT平板中，將不同數(shù)目脾細胞/孔用10pg/ml的天然肽剌激。在溫育后48小時，進行檢測，并且自動計數(shù)識別天然PSMA288-297肽的生產(chǎn)細胞因子的T細胞的頻率。數(shù)據(jù)在圖22中作為斑點形成克隆/孔的數(shù)目(一式三份平均值±SD)列出。所述數(shù)據(jù)表明，通過I297V和P290W類似物獲得針對天然表位的免疫應(yīng)答的增加的引發(fā)，另一種類似物表現(xiàn)出比天然肽(1297Nva或G288Abu或L289Nle1297Nva)略微更高(但是顯著的)活性。在這種程度上，天然表位的弱的免疫原性反映耐受性，這些類似物的改善的活性代表耐受性的破壞。實施例37通過i297v類似物增強由質(zhì)粒誘導的針對psma^gg^的應(yīng)答在第0，3，14和17天，將2組HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(『8)用表達PSMA288_297的質(zhì)粒免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)，每個淋巴結(jié)施用在25^1PBS中的25昭質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行2次肽加強(25嗎)，使用天然肽或I297V類似物。在最后一次加強后10天，將小鼠處死，制備脾細胞，并且通過ELISPOT分析評估IFN-y產(chǎn)生。在用抗IFN-y抗體包被的ELISPOT平板中，將不同數(shù)目脾細胞/孔用10嗎/ml的天然肽刺激。在溫育后48小時，進行檢測，并且自動計數(shù)識別天然PSMA288-297肽的生產(chǎn)細胞因子的T細胞的頻率。數(shù)據(jù)在圖23中作為針對0.5百萬應(yīng)答細胞標準化的特異性T細胞的頻率(一式三份的平均值+SD)列出。所述數(shù)據(jù)表明，在用I297V類似物免疫的小鼠組中，不論脾細胞數(shù)目/孔，天然表位特異性T細胞的頻率是極高的。實施例38針對人腫瘤細胞的離體細胞毒性在第0，3，14和17天，將HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(『4)用表達PSMA288-297表位的質(zhì)粒免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)，每個淋巴結(jié)施用在25nlPBS中的25嗎質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行2次肽加強(相同的用量)，使用I297V類似物。在加強后一周，將脾細胞用天然PSMA288-297肽離體刺激，并且在不同E:T比例針對"Cr-標記的人腫瘤細胞(Lncap，A2+PSMA+;或624.38A2+PSMA-或?qū)φ?24.28細胞A2-PSMA')進行過夜檢測。所獲得的免疫性有效地介導針對LNCAP的細胞毒性(圖24)。實施例39檢驗PRAME^』w的抗原性在第0，3，14和17天，將HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(11=4)用PRAME425.433肽免疫(每個淋巴結(jié)施用在25^1PBS中的25嗎肽，加上12,5嗎pI:C)。在加強后一周，將脾細胞用天然PRAME425.433肽離體刺激，并且在不同E:T比例針對"Cr-標記的人腫瘤細胞(PRAME+A2+624.38黑素瘤細胞；或A2表達缺陷的陰性對照624.38細胞)進行檢測。表示為％特異裂解(平均值土SEM)的結(jié)果表明PRAME-特異性T細胞能夠裂解人腫瘤細胞，這證實了PRAME425.433表位在腫瘤細胞的I類MHC上以允許免疫介導的攻擊的方式展示(圖25)。實施例40-48檢測PRAMEw.c類似物檢測圖26-28列出的類似物的各種特性，諸如改善的親和力和結(jié)合穩(wěn)定性，與天然表位的交叉反應(yīng)性，以及免疫原性，如實施例40-48所述。應(yīng)用實施例31所述的方法，PRAME425.433和69種類似物的HLA-A*0201結(jié)合特征彼此相互比較進行評估。用于結(jié)合的陽性對照是mdan-A26.35A27L。觀察到的類似物的親和力報道為％結(jié)合(與陽性對照相比較)和ED5e，和作為半解離時間的結(jié)合穩(wěn)定性。與天然表位的交叉反應(yīng)性通過應(yīng)用類似物肽來刺激對天然表位特異的T細胞系分泌IFN-y而進行評估，基本上如實施例6所述的那樣。通過用大約0.3pM的類似物肽刺激而產(chǎn)生圖26-28所示的數(shù)據(jù)。所述結(jié)果從3次獨立的實驗收集而來，并且針對每次實驗中由天然肽激發(fā)的IFN-Y的量而標準化。在一些情形中，所報道的值是兩次確定的平均值。星號"*"表明IFN-Y的產(chǎn)生不能同背景區(qū)分開來。實施例40在單一位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力(圖26)對于P2—級錨定位置的Leu進行Val、Met、Ile、Nle、Nva、和Abu的單一取代。所有這些類似物表現(xiàn)出為天然肽的20%之內(nèi)的％結(jié)合。對于Met類似物的ED50具有與天然肽相當?shù)挠H和力，而Nva和Ile類似物的親和力減小了大約3倍以內(nèi)，但是仍然與PSMA288.287表位相當。所有的P2取代維持了至少與天然肽相似的結(jié)合穩(wěn)定性。Met、Nle、和Nva類似物激發(fā)了為天然肽2倍之內(nèi)的IFN-Y產(chǎn)生，并且Val類似物稍微更少一些。對于Pl位置的Ser，進行Lys、Phe、Tyr、Thr、Om(鳥氨酸)、和Hse(高絲氨酸)的單一取代。除了超出了上限(highside)的范圍的Phe類似物之外，所有這些類似物表現(xiàn)出為天然肽的20%內(nèi)的％結(jié)合。對于Lys類似物的ED50幾乎減少6倍，但是其它5種類似物具有為天然肽的3倍內(nèi)的親和力。結(jié)合穩(wěn)定性通常與天然肽相似，在這一組中，PhePl類似物表現(xiàn)出最大的結(jié)合穩(wěn)定性，與天然肽的12.2小時相比，其具有17.7小時的半解離時間。除了LysPl類似物，其激發(fā)天然肽的40X的IFN-y，由于它們激發(fā)為天然肽的2倍內(nèi)的IFN-Y產(chǎn)生，所以認為所有這些類似物是交叉反應(yīng)性的。對PQ錨定位置進行Val、Ile、Ala、Nle、Nva、Abu的單一取代，以及通過添加酰胺基而修飾羧基端。所有這些類似物表現(xiàn)出為天然肽的20%內(nèi)的％結(jié)合。ED50檢測在從少于Ala取代的大于10倍到Nle取代的相當?shù)闹档姆秶籒va取代和C-端酰胺還在天然肽的ED50的3倍之內(nèi)。結(jié)合穩(wěn)定性還通常與Nva類似物在高端的異常值相似，tl/2為17.2小時，并且在低端的C-端酰胺具有顯著的減少，t1/2只有3小時。Val、Ile、AIa、和AbuPQ類似物表現(xiàn)出更少優(yōu)選的交叉反應(yīng)性，但是其余的類似物激發(fā)為天然肽2倍之內(nèi)的IFN-y生產(chǎn)。還進行了在主要影響TCR相互作用位置的單一取代在P3和P6的Nle、Nva和Abu，以及在P8的Ala、Ser和Sar。P6Nva類似物產(chǎn)生為天然肽的2倍之內(nèi)的IFN-Y，盡管P6Abu類似物接近44%。實施例41在兩個位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力應(yīng)用上述單一取代的不同組合，在Pi和P2，P2和PQ，以及Pl和PQ產(chǎn)生雙取代類似物(圖27A和27B)。所檢驗的Pl-P2雙取代沒有一種具有結(jié)合親和力或穩(wěn)定性的基本變化，但是在IFN-y檢測中沒有一種表現(xiàn)出顯著的交叉反應(yīng)性。然而，關(guān)于P2-PQ雙取代的類似物觀察到相似的模式，在IFN-y檢測中，L426NvaL433Nle類似物表現(xiàn)出顯著水平的與天然肽的交叉反應(yīng)性，以及其相似的、稍微改善的結(jié)合特征。最后，對于P1-PQ雙取代，所檢驗的類似物還符合具有至少相似的結(jié)合特征的通用模式，但是在交叉反應(yīng)性檢測中激發(fā)可以忽略的IFN-y。這一組中的例外是S425FL433Nle類似物，其表現(xiàn)出稍微改善的結(jié)合穩(wěn)定性和顯著的交叉反應(yīng)性，并且S425FL433Nle類似物具有多于4倍減少的ED5Q，幾乎加倍的半解離時間，并且比天然肽激發(fā)更多的IFN-y。實施例42在三個位置取代的類似物的交叉反應(yīng)性和功能親和力研究了4種三元取代類似物，其具有在Pl的Phe或Thr，在P2的Nva或Met，以及在PQ的Nle。S425TL426ML433Nle類似物具有相似的親和力，而對于其余3種類似物，親和力被改善了。具有P2Nva取代的兩種類似物都表現(xiàn)出增加的結(jié)合穩(wěn)定性和顯著水平的交叉反應(yīng)性。參見圖28。實施例43L426NVAL433NLE類似物的交叉反應(yīng)免疫原性在第O，3，14和17天，將2組HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(『8)用下述實施例49中所述的表達PRAME425.433的質(zhì)粒pCTLR2免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)中，每個淋巴結(jié)施用在25plPBS中的25嗎質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天應(yīng)用天然肽或PRAME表位類似物L426NvaL433Nle進行兩次肽加強(2.5嗎)。在最后一次加強后IO天將小鼠處死，制備脾細胞，并且在用1(Hig/ml天然肽體外刺激0.5乂106細胞/孔后，評估IFN-y的產(chǎn)生。在溫育后48小時，收集上層清液，并且通過ELISA測定應(yīng)答PRAME425-433肽而產(chǎn)生的IFN-y的濃度。所述數(shù)據(jù)在圖29中描述，并且表明在用PRAME425.433L426NvaL433Nle類似物加強的小鼠中IFN-y產(chǎn)生的顯著增加。實施例44由L426NVAL433NLE類似物誘導的體內(nèi)細胞毒性將2組HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(11=8)如上述實施例43所描述的那樣進行免疫。為了評估針對天然表位獲得的體內(nèi)應(yīng)答，將脾細胞從同窩生的對照HHD小鼠分離，并且與20|iig/mL或l嗎/ml的天然肽一起溫育2小時。然后，將這些細胞用CFSEhi和CFSE^熒光(分別為4.0pM或lpM，15分鐘)染色，并且與用CFSE"o熒光(0.4pM)染色的等數(shù)目的對照脾細胞一起靜脈內(nèi)共同注射到免疫小鼠中。18小時后，通過從激發(fā)的動物移除脾和PBMC，而測定靶細胞的特異性消除，并且通過流式細胞術(shù)測定CFSE熒光。相對于對照(未負荷的)群體，計算與負荷肽的脾細胞相對應(yīng)的群體的相對消耗，并且表示為％特異性裂解。圖30的結(jié)果表明當類似物取代天然肽作為加強劑時細胞毒性的保守誘導。這一趨勢表明所述類似物可以改善細胞毒性免疫性的誘導。實施例45體內(nèi)細胞毒性和四聚體染色在第0，3，14和17天，將7組HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(r^4)用表達PRAME425.433的質(zhì)粒pCTLR2免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)中，每個淋巴結(jié)施用在25nlPBS中的25嗎質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行兩次肽加強(2.5嗎)，應(yīng)用天然肽，陰性對照(EAAGIGILTV肽(SEQIDNO.IOO))或在一級和/或二級錨定殘基攜帶突變的PRAME425-433表位類似物—S425F，L426NvaL433Nle，S425TL433Nle，和S425TL426NvaL433Nle。為了評估針對天然肽的體內(nèi)應(yīng)答，將脾細胞從同窩生的對照HHD小鼠分離，并且與0.2嗎/ml或20嗎/ml的天然肽一起溫育2小時。然后，將這些細胞用CFSE熒光(分別為1和2.5pM，15分鐘)染色，并且與用CFSE'。熒光(0.4pM)染色的等數(shù)目的對照脾細胞一起靜脈內(nèi)共同注射到免疫小鼠中。18小時后，通過從受激發(fā)的動物移除脾，而測定靶細胞的特異性消除，并且通過流式細胞術(shù)測定所獲得的細胞懸浮液中的CFSE熒光。相對于對照(未負荷的)群體，計算與負荷肽的脾細胞相對應(yīng)的群體的相對消耗，并且表示為％特異性裂解。另外，PRAME425—433-特異性T細胞的頻率，通過四聚體/CD8共染色而進行評估?；隗w內(nèi)細胞毒性和四聚體染色，當與天然肽相比較時，用包括一級或二級錨定殘基的突變的類似物加強表現(xiàn)出相當?shù)拿庖呋钚浴Ｋ鲱愃莆锬軌蛟鰪娒庖邞?yīng)答，如通過與用不相關(guān)的肽加強的"EAA"組相比較所顯示的那樣。在這方面，如通過體內(nèi)細胞毒性所評估的，包括S425F，L33Nle，L426NvaL433Nle,S425TL433Nle,或S425TL426NvaL433Nle的類似物都能夠擴大針對天然表位的免疫性。然而，只有L433Nle，L426NvaL433Nle,和S425TL426NvaL433Nle類似物以顯著高于用質(zhì)粒激活并且用陰性對照肽加強的小鼠的水平擴大了針對天然表位特異性的T細胞的亞組(圖31)。實施例46離體細胞因子產(chǎn)生在第0，3，14和17天，將3組HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(n-4)用表達PRAME425—433的質(zhì)粒pCTLR2免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)中，每個淋巴結(jié)施用在25plPBS中的25嗎質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行兩次肽加強(2.5pg)，應(yīng)用PRAME表位類似物L426NvaL433Nle和S425TL426NvaL433Nle或陰性對照肽MelanA(EAAGIGILTV(SEQIDNO.100))而進行。在最后一次加強后IO天將小鼠處死，制備脾細胞，并且在與10嗎/ml天然肽溫育后48小時，通過ELISA評估IFN-Y的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)在圖32中描述為以pg/ml單位的細胞因子濃度(一式三份的平均值士SD)。所述數(shù)據(jù)表明，用兩種類似物加強的小鼠的脾細胞離體產(chǎn)生細胞因子，并且針對L426NvaL433Nle的應(yīng)答大于針對S425TL426NvaL433Nle的應(yīng)答。實施例47在用類似物肽加強后針對人腫瘤細胞系的離體細胞毒性在第0，3，14和17天，將HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(11=4)用表達PRAME425.433的質(zhì)粒pCTLR2免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)中，每個淋巴結(jié)施用在25^1PBS中的25嗎質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行兩次肽加強(2.5嗎)，其應(yīng)用類似物L426NvaL433Nle。加強后一周，用天然肽離體剌激脾細胞，并且在不同E:T比例針對"Cr-標記的人腫瘤細胞(用或沒用IFN-y預(yù)處理的PRAME+624.38黑素瘤細胞；或HLA-A2表達缺陷的陰性對照624.38細胞)進行檢測。類似物L426NvaL433Nle激發(fā)介導針對表達A2(624.38)的人腫瘤細胞的顯著的細胞毒性的免疫應(yīng)答，當它們用IFN-Y預(yù)處理時，其稍微地升高。相反，針對A2-624.28對照細胞沒有測量到顯著的活性。參見圖33。實施例48針對PRAMEj，^m的體外免疫體外免疫按照圖34中列出的通用方案進行。通過Ficoll-分離，從健康的供體(HLA-A"201+)獲得外周血單核細胞(PBMCs)。將新鮮的PBMCs(2.5X106)，與5ng/mlPRAME425.433或肽類似物一起接種到T細胞培養(yǎng)基中。隨后，在72和96小時后，每孔加入20IU/ml的白介素-2，并且在第7天加入額外的肽(5ng/ml)。在收集效應(yīng)細胞并且將其用于四聚體染色之前，將培養(yǎng)物繼續(xù)維持10天。將IVSPBMCs用PRAME425_433四聚體標記，并且在FACSCalibur(BD,圣何塞，加利福尼亞)上進行分析?；谟貌幌嚓P(guān)的HBV四聚體和SSX2四聚體染色的陰性對照，建立象限，并且捕獲了最少的10,000的門控事件(gatedevents)。將四聚體-陽性細胞表示為淋巴細胞群體的百分數(shù)。與天然肽相比較，在用肽類似物IVS之后，PRAME425.433-特異性四聚體被顯著地增強了。參見圖35。這證明所述類似物可以是優(yōu)選的免疫原。實施例49PCTLR2，一種表達PRAME^^m表位的質(zhì)粒pCTLR2是一種重組DNA質(zhì)粒疫苗，其編碼這樣一種多肽，即，所述多肽具有來自PRAME的HLAA2-特異性CTL表位，即氨基酸殘基425-433SLLQHLIGL(SEQIDNO.71)，和PRAME的表位簇區(qū)域，即氨基酸422-509。對于質(zhì)粒中多肽的cDNA序列受控于巨細胞病毒(CMVp)的啟動子/增強子序列，當被抗原呈遞細胞攝取時，其允許所述多肽的信使的充分轉(zhuǎn)錄。在所述編碼序列3'端的牛生長激素多聚腺苷酸化信號(BGHpolyA)提供用于信使多聚腺苷酸化的信號，以增加其穩(wěn)定性以及從核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移。為了促進質(zhì)粒轉(zhuǎn)運到核，將來自猿猴空泡病毒40的核輸入序列(NIS)插入到質(zhì)粒主鏈中。將一個拷貝的CpG免疫刺激基序構(gòu)建到質(zhì)粒中，以進一步加強免疫應(yīng)答。最后，質(zhì)粒中的兩種原核遺傳元件負責在大腸桿菌(E.coli)中的擴增，卡那霉素抗性基因(KanR)和pMB細菌復制起點(參見圖36)。免疫原翻譯產(chǎn)物序列所編碼的多肽的氨基酸序列(長度上為150個氨基酸殘基)在下文給出。malqsllqhliglsnlthvlypvplesyediligtlhleriaylharlrellcelgrpsmvwlsanpcphcgdrtfydpepilcpcfeipiikrsllqhHglgdaays!!(iMigl/^A:eegy/。sHqhiMglkrpsikrsMqliligl(SEQIDNO:196).前89個氨基酸殘基是代表PRAME422-509的表位簇區(qū)域。在這一表位簇區(qū)域，應(yīng)用各種表位預(yù)測運算法則，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多潛在的HLAA2-特異性CTL表位。氨基酸殘基90-150是表位釋放(Synchrotope)序列，具有嵌入的4個拷貝的PRAME425-433CTL表位(黑體)。在定義的PRAMECTL表位兩側(cè)的是短的氨基酸序列，已表明其在處理PRAMECTL表位中起著重要作用。另外，將氨基酸序列ispekeeqyia(SEQIDN0.197)(與PRAME氨基酸276-286相對應(yīng)，，斜沐)構(gòu)建到串珠(sting-of-beads)區(qū)域，以幫助所編碼的多肽表達的檢測。應(yīng)用各種免疫學測定，包括四聚體、ELISPOT、ELISA、和細胞毒性，從用pCTLR2質(zhì)粒免疫的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中已經(jīng)檢測到對表位PRAME425.433特異的強CTL應(yīng)答，這表明pCTLR2的免疫原性功效。這些數(shù)據(jù)表明，所述質(zhì)粒被抗原呈遞細胞攝取，所編碼的多肽被合成，并且被蛋白水解處理，以產(chǎn)生九聚體表位肽，和結(jié)合HLA-A2用于呈遞的九聚體表位肽。質(zhì)粒構(gòu)建長的互補寡聚核苷酸系列的逐步連接導致產(chǎn)生編碼"串珠"("String-of-Beads")表位釋放序列(氨基酸90-150)中的氨基酸殘基的cDNA。這些cDNA產(chǎn)生用于限制性酶的適當?shù)恼承阅┒?，其可以用于同編碼PRAME表位簇區(qū)域(氨基酸1-89)的cDNA的進一步連接，所述cDNA通過在作為模板的編碼PRAME的cDNA上進行PCR而擴增。然后，將完整的插入片段連接到4/7II和&o^I位點之間的載體主鏈中。完整的編碼序列通過DNA測序而進行驗證。實施例50抗原特異性T細胞應(yīng)答的產(chǎn)生在沒有病原體的條件下，籠養(yǎng)H-2I類-陰性、HLA-A2.1-轉(zhuǎn)基因HHD小鼠，并且用于評估HLA-A2.1-限制性人腫瘤相關(guān)的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位的免疫原性。將8-12周齡的雌性小鼠用于淋巴內(nèi)免疫，并且用于脾細胞的分離，以用于體內(nèi)細胞毒性研究。小鼠通過兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)注射而進行免疫。通過吸入異熒烷而將小鼠麻醉，并且在無菌條件下進行手術(shù)。手術(shù)準備之后，在腹股溝褶處切開長度為0.5cm的切口，并且暴露出腹股溝淋巴結(jié)。應(yīng)用0.5mL胰島素注射器，將最大體積25pl(25pg)的質(zhì)粒DNA疫苗或肽直接注射到所述淋巴結(jié)內(nèi)。傷口用無菌的6-0尼龍皮膚縫線閉合。實施例51針對人腫瘤細胞的離體細胞毒性在第0，3，14和17天，將HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(n-4/組)用表達melan-A26.35A27L表位類似物的質(zhì)粒pSEM(在美國專利申請?zhí)?0/292,413(公開號20030228634Al)中更充分地描述，其通過引用完全結(jié)合于此)進行免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)，每淋巴結(jié)施用在25^1PBS中的25昭質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行兩次額外的肽加強(相同用量)，使用類似物A27L、A27Nva、或A27LV35Nva進行。加強后一周，將脾細胞離體用天然melan-A26.35肽進行刺激，并且在不同的E:T比例針對510標記的人腫瘤細胞(624.38細胞)進行檢測。在用A27L或A27Nva類似物加強后獲得的免疫性相當于和比天然肽EAAGIGILTV(SEQIDNO.100)更加有效(圖37)。由于所述激活質(zhì)粒表達A27L類似物，所以本實驗對所述肽具有潛在的偏愛。因此，如果激活是利用相同的序列的話，那么用A27Nva類似物獲得的基本的細胞毒性可能被低估了其功效。實施例52四聚體分析CD8+抗原-特異性T細胞的計數(shù)需要I類MHC/肽復合體同源識別T細胞受體(TCR)。這可以應(yīng)用I類MHC四聚體進行，其由4個I類HLAMHC分子的復合體組成，每個分子結(jié)合到特定的肽上并且與熒光蛋白綴合。因此，四聚體檢測允許對給定的與具體的MHC分子復合的肽特異的總T細胞群體的量化。并且，由于結(jié)合不依賴功能途徑，這一群體包括所有特異的CD8+T細胞，而不論功能狀態(tài)。通過用HLA-A*0201MARTI(ELAGIGILTV(SEQIDNO.100))-PEMHC四聚體(貝克曼庫爾特(BeckmanCoulter)，TO1008)或酪氨酸酶369-377(YMDGTMSQV(SEQIDN0.94))特異的四聚體試劑(HLA-AM201酪氨酸酶-PE,貝克曼庫爾特)和FITC綴合的大鼠抗小鼠CD8a(Ly-2)單克隆抗體(BD生物科學(Biosciences))，將密度離心(哺乳動物淋巴細胞分離液(LympholyteMammal)，Cedarlane實驗室)后從外周血分離的單核細胞共染，而測定免疫動物的CTL應(yīng)答。應(yīng)用BDFACSCalibur流式細胞儀收集數(shù)據(jù)，并且應(yīng)用cellquest軟件通過門控淋巴細胞群體進行分析，并且計算CD8+CTL群體內(nèi)四聚體+細胞的百分數(shù)。實施例53四聚體染色(質(zhì)粒激活，肽加強一一天然相對類似物)在第0，3，14和17天，將兩組HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(n-8)用表達酪氨酸酶369-377的質(zhì)粒免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)，每個淋巴結(jié)施用在25^1PBS中的25嗎質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行兩次額外的肽加強(相似用量)，使用天然肽或377Nva類似物進行。10天后，應(yīng)用酪氨酸酶369.377特異的四聚體試劑(HLA-A"201酪氨酸酶-PE，貝克曼庫爾特)，而監(jiān)測免疫應(yīng)答。將個體小鼠通過眼眶后竇靜脈采血，并且應(yīng)用2000rpm持續(xù)25分鐘的密度離心(哺乳動物淋巴細胞分離液，Cedarlane實驗室)分離PBMC。將PBMC用小鼠對CD8特異的抗體(BD生物科學(Biosciences))和酪氨酸酶四聚體試劑一起共染色，并且通過應(yīng)用FACS口徑流式細胞儀(BD生物科學(Biosciences))的流式細胞術(shù)確定具體的百分數(shù)。酪氨酸酶特異的CD8+細胞百分數(shù)，表明用類似物代替天然肽保持了酪氨酸酶特異的亞組的擴展。所述趨勢表明所述類似物可以改善酪氨酸特異的T細胞的擴展(圖38)。實施例54體內(nèi)細胞毒性和四聚體染色(天然肽和全體類似物候選物之間的逐一比較)在第0，3，14和17天，將4組HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(n-6)用表達酪氨酸酶369-377禾卩Melan-A26.35A27L表位的質(zhì)粒(pSEM)免疫，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)，每個淋巴結(jié)施用在25plPBS中的25昭質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行兩次肽加強(相似用量)，將Melan-A26.35A27L加入到左側(cè)腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)，并且將攜帶在一級和/或二級錨定殘基的取代的酪氨酸酶369-377類似物接種到右側(cè)淋巴結(jié)內(nèi)。將僅用質(zhì)粒免疫的小鼠或首次用于實驗的小鼠用作對照。為了評估針對天然酪氨酸酶和MdanA表位的體內(nèi)應(yīng)答，將脾細胞從同窩生的對照HHD小鼠分離，并且分別獨立地與20昭/ml的天然肽(Melan-A26.35或酪氨酸酶369.377)—起溫育2小時，溫育在沒有HL-1血清的培養(yǎng)基(Cambrex)中進行，濃度為20X106細胞/mL。然后，將這些細胞用CFSE(VybrantCFDASE細胞示蹤試劑盒，分子探針(MolecularProbes))(分別為1和2.5jiM，15分鐘)染色，并且與用CFSE"熒光(0.4(iM)染色的等數(shù)目的對照沒有肽包被的脾細胞一起靜脈內(nèi)共同注射到免疫小鼠或首次用于實驗的對照HHD小鼠中。18小時后，通過從激發(fā)的動物移除脾，并且通過流式細胞術(shù)測定所獲得的細胞懸浮液中的CFSE熒光，而測定靶細胞的特異性消除。相對于對照(未負荷的)群體，計算與負荷肽的脾細胞相對應(yīng)的群體的相對消耗，并且將其表示為％特異性裂解。另外，酪氨酸酶369.377和Melan-A26.35-特異性T細胞的頻率，通過四聚體/CD8共染色(HLA-AW201-四聚體，貝克曼庫爾特(BeckmanCoulter))而進行評估。酪氨酸酶類似物V377Nva能夠擴增酪氨酸酶-特異的T細胞群體，并且增強細胞毒性免疫性，與天然肽相似并且大于酪氨酸酶類似物M370VV377Nva(圖39)。實施例55針對人腫瘤細胞的離體細胞毒性在第0，3，14和17天，將HHD轉(zhuǎn)基因小鼠(『4溜)用表達酪氨酸酶369.377表位的質(zhì)粒(pSEM)免疫(按照圖40的一般流程)，通過直接接種到腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)，每個淋巴結(jié)施用在25^1PBS中的25嗎質(zhì)粒而進行。這之后在第28和31天進行兩次肽加強(相同用量)，使用天然肽或攜帶在一級錨定殘基P2和PQ(370和377)取代的類似物。加強后一周，將脾細胞離體用天然酪氨酸酶369-377肽刺激，并且在不同的E:T比例針對"Cr-標記的人腫瘤細胞(624.38細胞)進行檢測。天然肽和M370VV377Nva類似物都產(chǎn)生了針對624.38細胞的強細胞毒性(圖41)。盡管對于天然肽存在某些稀釋的細胞溶解活性，但是對于所述類似物不存在這樣的活性，這進一步證實了從實施例52的四聚體結(jié)果所獲得的更大的免疫原性的指示。與前述實施例綜合來看，這一觀察闡明了用更靈敏的檢測(體外刺激后離體細胞毒性)補充更嚴謹?shù)臋z測(體內(nèi)細胞毒性和四聚體染色)對提出潛在有效的類似物的有效性。實施例56通過ITOPIA系統(tǒng)表征天然肽和類似物的結(jié)合和穩(wěn)定性(半衰期)由于與MHC1復合體結(jié)合的肽的結(jié)合和穩(wěn)定性是獲得良好的免疫應(yīng)答所必要的，所以應(yīng)用iTopia表位發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)(還在實施例31中討論)檢測天然表位及其類似物與A0201限制性1類MHC分子的結(jié)合和穩(wěn)定性(T1/2)。對于6種天然表位和設(shè)計成增強免疫應(yīng)答的它們的類似物確定結(jié)合和解離率(offrate)(T1/2)。所示天然肽和類似物如下NY-ESO-l157-165,NY-ESO-l157_165(LI58Nva,C165V)，Melan-A26.35,Melan-A26.35(A27Nva),SSX-24M9,SSX-241.49(A42V)，Prame425.433，Prame425.433(L426Nva，L433Nle),酪氨酸酶369.377，酪氨酸酶369.377(V377Nva)，PSMA288-297和PSMA288-297(I297V)。表10(下述)顯示六種類似物及它們的天然肽的肽結(jié)合和穩(wěn)定性或半衰期的平均值。與天然肽相比，SSX-241.4"PNY-ESO+5"65的類似物表現(xiàn)出結(jié)合百分數(shù)的顯著增加。與天然肽相比，Melan-A26_35、Psma288-297、Pmme425.433和酪氨酸酶369.377的類似物表現(xiàn)出肽的結(jié)合百分數(shù)的少量增力口。與天然肽相比，MelanA26.35(A27Nva)表現(xiàn)出穩(wěn)定性(半衰期)的顯著增加。對于其它類似物Psma288_297(I297V),NY-ESO-l157_165(L158Nva,C165V)，Prame425.433(L236Nva,L433Nle)和SSX-24M7(A42V)觀察到穩(wěn)定性的顯著增加。與天然肽相比，在類似物酪氨酸酶369-377(V377Nva)的半衰期沒有觀察到顯著的不同。在類似物的半衰期中觀察到的不同可能是由于每種類似物與MHC1分子結(jié)合的機制的差異。表IO.天然肽及其類似物的結(jié)合百分數(shù)和穩(wěn)定性(半衰期)的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>上文所述的各種方法和技術(shù)提供了許多實行本發(fā)明的方法。當然，應(yīng)該理解，按照本申請所述的任何具體的實施方案，沒有必要實現(xiàn)所述所有的目的或益處。因此，例如，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該意識到，所述方法可以以實現(xiàn)或優(yōu)化本申請所教導的一種益處或一組益處而不必實現(xiàn)本申請教導或提示的其它目的或益處的方式進行。許多有益的和不利的備選方案在本文提及。應(yīng)該理解，一些優(yōu)選的實施方案特異性地包括一個、另一個、或一些有利的特征，而其它實施方案特異性地排除一個、另一個或一些不利特征，而其它實施方案通過包括一個、另一個或一些有利特征而特異性地減少不利特征的出現(xiàn)。并且，熟練的技術(shù)人員應(yīng)該意識到不同的實施方案的各種特征的適應(yīng)性。類似地，上文所討論的各種組成部分、特征和步驟，以及每種這樣的組成部分、特征或步驟的其它已知的等價物，可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員混合并且匹配，以按照本申請所述的原理實行方法。在各種組成部分、特征和步驟中，在不同的實施方案中，一些將被特異性地包含在內(nèi)，而另一些將被特異性地排除在外。盡管己經(jīng)在某些實施方案和實施例中公開了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明超出具體公開的實施方案延伸到其它備選的實施方案和/或應(yīng)用及其改進和等價物。已經(jīng)公開了許多本發(fā)明的變化和備選的組成部分。其它變化和備選的組成部分對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該是顯而易見的。在這些變化中，沒有限制，為在篩選全體中或由治療產(chǎn)品耙向的抗原的具體數(shù)目、抗原的類型、癌癥的類型、和指定的具體抗原。本發(fā)明的各種實施方案可以特異性地包括或排除任何這些變化或組成部分。在一些實施方案中，應(yīng)該理解，用來描述并且要求本發(fā)明的特定的實施方案的表示成分的量的數(shù)目、特性諸如分子量、反應(yīng)條件等在一些實例中通過術(shù)語"大約"而修正。因此，在一些實施方案中，在撰寫的描述和后附的權(quán)利要求中列出的數(shù)字參數(shù)是可以依據(jù)具體的實施方案尋找要獲得的需要的特性而變化的近似值。在一些實施方案中，所述數(shù)字參數(shù)應(yīng)該依據(jù)所報道的顯著數(shù)字的數(shù)目并且通過應(yīng)用常規(guī)湊整技術(shù)進行解釋。盡管在本發(fā)明的一些實施方案的寬范圍中列出的數(shù)字范圍和參數(shù)是近似的，但是在具體實施例中列出的數(shù)值同實際一樣精確地報道。在本發(fā)明的一些實施方案中描述的數(shù)值可以含有由在它們各自的檢測測定中發(fā)現(xiàn)的標準偏差導致的必要的某些錯誤。在一些實施方案中，在描述本發(fā)明的具體的實施方案的上下文中(特別是在特定的下述權(quán)利要求的上下文中)的術(shù)語"一個"和"一種"和"所述"以及類似的指示物可以解釋為包括單數(shù)和復數(shù)。在本文中值的范圍的引用僅僅是意欲作為單獨提及落入所述范圍的每一個單獨的值的速記方法。除非在本文另外指明，每一單獨的值如同它單獨在本文中引用一樣而結(jié)合在說明書中。除非本文另外指明或者與上下文另外明顯地相抵觸，本文所述的所有方法可以以任何適當?shù)捻樞驅(qū)嵭?。關(guān)于本文某些實施方案提供的任何以及所有實施例、或示例性語言(例如，"諸如")的應(yīng)用只是意欲更好地舉例說明本發(fā)明，而不是對另外要求的本發(fā)明的范圍造成限制。說明書中沒有語言應(yīng)該被解釋為指示任何未要求的對實施本發(fā)明重要的組成部分。本文所公開的發(fā)明的備選組成部分或?qū)嵤┓桨傅慕M合不應(yīng)該被解釋為限制。每一組成員可以單獨或與本文發(fā)現(xiàn)的組的其它成員或其它組成部分任何組合地提及并且要求。由于便利和/或可專利性的緣故，預(yù)計組的一個或多個成員可以包含在組內(nèi)或者從組刪除。當發(fā)生任意所述包含或刪除時，此處認為本說明書包含改進的組，因此滿足在后附的權(quán)利要求中所用的所有Markush組的撰寫描述。在本文中描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，包括本發(fā)明人己知的實行本發(fā)明的最好的模式。當閱讀前述描述時，關(guān)于這些優(yōu)選的實施方案的變化對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的。應(yīng)該考慮到，熟練的技術(shù)人員可以適當?shù)貞?yīng)用所述變化，并且本發(fā)明可以以與本文特異描述不同地實行。因此，按照適用的法律允許，本發(fā)明的許多實施方案包括在其后附的權(quán)利要求中引用的主題的所有改進和等價物。并且，在其所有可能的變化中的上述組成部分的任何組合包含在本發(fā)明中，除非本文另外指明或者通過上下文另外明顯地抵觸。此外，在貫串本說明書中，許多參考參見專利和印刷的出版物。上文引用的參考文獻和印刷的出版物的每一個分別通過引用完全并入本申請中。最后，應(yīng)該理解，本文公開的發(fā)明的實施方案是舉例說明本發(fā)明的原理?？梢詰?yīng)用的其它改進可以在本發(fā)明范圍之內(nèi)。因此，通過舉例的方式，但是不限于此，可以按照本文的教導應(yīng)用本發(fā)明的備選配置。因此，本發(fā)明不限于精確所示和所描述的那些。權(quán)利要求1.一種分離的肽，其基本上由下述序列組成，其中P0是X，XX，或XXX，其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸；和P1是S，K，F(xiàn)，Y，T，Orn，或Hse；和P2是L，V，M，I，Nva，Nle或Abu；和P3是L，Nva，Nle或Abu；和P4是Q；和P5是H；和P6是L，Nva，Nle或Abu；和P7是I；和P8是G，A，S，或Sar；和在P9的PΩ是L，V，I，A，Nle，Nva，Abu，或L-NH2；并且PΩ+1是X，XX，或XXX，其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸；并且其中所述序列不是SLLQHLIGL(SEQIDNO71)。2.權(quán)利要求l的分離的肽，其基本上由下述序列組成(K,F,Y,T，0m,或Hse}LLQHLIGL(SEQIDNO:72);或S(V,M,I,Nva,Nle,或Abu}LQHLIGL(SEQIDNO:73);或SL(Nva,Nle或Abu}QHLIGL(SEQIDNO:74);或SLLQH(Nva,Nle或Abu}IGL(SEQIDNO:75);或SLLQHLI(A，S,或Sar)L(SEQIDNO:76);或SLLQHLIG{V，I,A,Nle，Nva,Abu,或L-NH^(SEQIDNO:77);或{F,Y,T，Orn,或Hse}{Nva,Nle,M,或I〉LQHLIGL(SEQIDNO:78);或S{Nva,Nle,或M}LQHLIG{Nva,Nle,或V〉(SEQIDNO:79);或{K,F,Y，T，Om，或Hse}LLQHLIGV(SEQIDNO:80);或{F或T}LLQHLIG{Nle}(SEQIDNO:81);或{F或T}{Nva或M}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO:82)。3.權(quán)利要求2的分離的肽，其基本上由下述序列組成{F,Y,T，Om,或Hse}LLQHLIGL(SEQIDNO:83);或S(Nva,Nle,或M)LQHLIGL(SEQIDNO:84);或SLLQHLIG{Ne，Nva，或L-NH2}(SEQIDNO:85);或SLLQH{Nva或Abu}IGL(SEQIDNO:86);或S{Nva}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO:87);或{F或T}{L或Nva}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO:88)。4.權(quán)利要求3的分離的肽，其基本上由下述序列組成S{L或Nva}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO:89);或T{Nva}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO:90)。5.權(quán)利要求4的分離的肽，其基本上由下述序列組成S{Nva}LQHLIG{Nle}(SEQIDNO:87)。6.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽具有對于I類MHC肽結(jié)合裂口的親和力。7.權(quán)利要求6的分離的肽，其中所述I類MHC是HLA-A2。8.—種分離的肽，其包括在序列SLLQHLIGL(SEQIDNO:71)中的1至3個取代，具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于SLLQHLIGL(SEQIDNO:71)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。9.權(quán)利要求8的分離的肽，其中半解離時間相似于或者大于SLLQHLIGL(SEQIDNO:71)從所述I類MHC結(jié)合裂口的半解離時間。10.權(quán)利要求8的分離的肽，其被具有對于肽SLLQHLIGL(SEQIDNO:71)的特異性的T細胞識別。11.I類MHC/肽復合體，其中所述肽具有權(quán)利要求l的肽的序列。12.權(quán)利要求11的I類MHC/肽復合體，其與識別I類MHC/PRAME425.433復合體的TCR交叉反應(yīng)。13.權(quán)利要求12的I類MHC/肽復合體，其中所述I類MHC/復合體是HLA-A2/PRAME425_433復合體。14.一種多肽，其包括包埋在釋放序列內(nèi)的權(quán)利要求l的肽序列。15.—種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求l的肽。16.—種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求14的多肽。17.編碼權(quán)利要求14的多肽的核酸。18.用于表達權(quán)利要求1的肽的核酸工具。19.一種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求17或18的核酸。20.—種誘導、維持、或增強CTL應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求15的組合物。21.—種引發(fā)I類MHC-限制性T細胞應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求15的組合物和免疫強化劑。22.—種誘導、維持、或引發(fā)CTL應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求19的組合物。23.—種分離的肽，其基本上由下述序列組成，其中P0是X,XX，或XXX，其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸；和P1是G,A,S，Abu,或Sar;禾口P2是L，M，I,Q,V,Nva，Me,或Abu;和P3是P或W;和P4是S;和P5是I;和P6是P;和P7是V;和P8是H;和P9是P,A，L,S,或T;和在P10的PQ是I，L,V,Nva,或Nle;和PQ+1是X，XX,或XXX，其中X指定任何氨基酸或沒有氨基酸；并且其中所述序列不是GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)。24.—種分離的肽，其基本上由下述序列組成(S，Sar,或Abu}LPSIPVHPI(SEQIDNO,43);或G{M或Nle}PSIPVHPI(SEQIDN0.44);或G(L，I,Nva,或Nle}WSIPVHPI(SEQIDNO.45);或GLWSIPVHP(Nva或V}(SEQIDNO.46);或GLPSIPVH(A或S}I(SEQIDNO.47);或GLPSIPVHP(V，L,Nva,或Nle)(SEQIDNO.48);或G{Nle}PSIPVHP{Nva，或Nle}(SEQIDNO.49);或G{Nva}PSIPVHP{Nva}(SEQIDNO.50);或G(V,Nva,或Nle}PSIPVHPV(SEQIDN0.51);或{Sar或Abu}LPSIPVHP{V或Nva}(SEQIDNO.52);或A(V,I，Nva，或Nle}WSIPVHPI(SEQIDNO.53);或AVPSIPVHP(V或Nva)(SEQIDNO.54);或A{Nva}PSIPVHPV(SEQIDNO.55);或ALWSIPVHP(V或Nva}(SEQIDNO.56);或GVWSIPVHP(V或Nva》(SEQIDNO.57);或G{Nva}WSIPVHPV(SEQIDNO.58)。25.—種分離的肽，其基本上由下述序列組成(Abu)LPSIPVHPI(SEQIDNO.59);或G(V,Nva，或Abu}PSIPVHPI(SEQIDNO.60);或GLPSIPVHP{V或Nva}(SEQIDNO,61);或GLWSIPVHP(I或Nva}(SEQIDNO.62);或G{Nle}PSIPVHP{Nva}(SEQIDNO.63);或G{Nle或Nva}PSIPVHPV(SEQIDNO,64);或{A或Abu}LPSIPVHP{V或Nva}(SEQIDNO.65);或G{Nva}WPSIPVHP{I或V}(SEQIDNO.66);或A{Nva或Nle}WSIPVHPI(SEQIDNO.67);或A{V或Nva}PSIPVHPV(SEQIDNO.68)。26.權(quán)利要求25的分離的肽，其基本上由下述序列組成{Abu}LPSIPVHPI(SEQIDNO.59);或GLPSIPVHP(V或Nva}(SEQIDNO.61);或GLWSIPVHPI(SEQIDNO.69);或G{Nle}PSIPVHP{Nva}(SEQIDNO.63)。27.權(quán)利要求26的分離的肽，其基本上由下述序列組成GLPSIPVHPV(SEQIDNO.70)。28.權(quán)利要求23的分離的肽，其中所述肽具有對于I類MHC肽結(jié)合裂口的親和力。29.權(quán)利要求28的分離的肽，其中所述I類MHC是HLA-A2。30.1類MHC/肽復合體，其中所述肽具有權(quán)利要求23的肽的序列。31.權(quán)利要求30的I類MHC/肽復合體，其與識別I類MHC/PSMA288.297復合體的TCR交叉反應(yīng)。32.權(quán)利要求31的I類MHC/肽復合體，其中所述I類MHC/復合體是HLA-A2/PSMA288.297復合體。33.—種多肽，其包括包埋在釋放序列內(nèi)的權(quán)利要求23的肽序列。34.—種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求23的肽。35.—種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求33的多肽。36.編碼權(quán)利要求33的多肽的核酸。37.用于表達權(quán)利要求23的肽的核酸工具。38.—種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求36或37的核酸。39.—種誘導、維持、或增強CTL應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求34的組合物。40.—種引發(fā)I類MHC-限制性T細胞應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求33的組合物和免疫強化劑。41.一種誘導、維持、或引發(fā)CTL應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求38的組合物。42.—種分離的肽，其包括在序列GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)中的l至3個取代，具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。43.權(quán)利要求42的分離的肽，其中所述半解離時間相似于或者大于GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)從所述I類MHC結(jié)合裂口的半解離時間。44.權(quán)利要求42的分離的肽，其被具有對于肽GLPSIPVHPI(SEQIDNO.42)的特異性的T細胞識別。45.由pSEM質(zhì)粒表達的免疫原性肽的分離的肽類似物，其基本上由下述序列組成E{A，L,Nva,Nle}AGIGILT{V,Nva,Me}(SEQIDNO:91);或Y{M,V，Nva,Nle}DGTMSQ{V,Nva,Nle}(SEQIDNO:92);并且其中所述序列不是E(A,L}AGIGILTV(SEQIDNO:93)或YMDGTMSQV(SEQIDNO:94)。46.權(quán)利要求45的分離的肽類似物，其中所述肽類似物選自由下列各項組成的組ELAGIGILTNva(SEQIDNO:95),ENvaAGIGILTV(SEQIDNO:96)，YVDGTMSQNva(SEQIDNO:97)，YVDGTMSQV(SEQIDNO:98)和YMDGTMSQNva(SEQIDNO:99)。47.權(quán)利要求46的分離的肽類似物，其基本上由氨基酸序列ENvaAGIGILTV(SEQIDNO:96)組成。48.權(quán)利要求46的分離的肽類似物，其基本上由序列YMDGTMSQNva(SEQIDNO:99)組成。49.權(quán)利要求45的分離的肽類似物，其中所述肽具有對于I類MHC肽結(jié)合裂口的親和力。50.權(quán)利要求49的分離的肽類似物，其中所述I類MHC是HLA-A2。51.—種分離的肽類似物，其包括在序列EAAGIGILTV(SEQIDNO:IOO)中的1至3個取代，具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于EAAGIGILTV(SEQIDNO:100)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。52.權(quán)利要求51的分離的肽，其中所述半解離時間相似于或者大于EAAGIGILTV(SEQIDNO:100)從所述I類MHC結(jié)合裂口的半解離時間。53.權(quán)利要求51的分離的肽，其被具有對于肽EAAGIGILTV(SEQIDNO:100)的特異性的T細胞識別。54.—種分離的肽類似物，其包括在序列YMDGTMSQV(SEQIDNO:94)中的1至3個取代，具有對于I類MHC結(jié)合裂口的親和力，所述親和力相似于或大于YMDGTMSQV(SEQIDNO:94)對于所述I類MHC結(jié)合裂口的親和力。55.權(quán)利要求54的分離的肽，其中所述半解離時間相似于或者大于YMDGTMSQV(SEQIDNO:94)從所述I類MHC結(jié)合裂口的半解離時間。56.權(quán)利要求54的分離的肽，其被具有對于肽YMDGTMSQV(SEQIDNO:94)的特異性的T細胞識別。57.—種I類畫C服復合體，其中所述肽具有權(quán)利要求1的肽的序列。58.權(quán)利要求57的I類MHC/肽復合體，其與識別I類MHC/Melan-A26.35復合體的TCR交叉反應(yīng)。59.權(quán)利要求58的I類MHC/肽復合體，其中所述I類MHC/復合體是HLA-A2/Melan-A26.35復合體。60.權(quán)利要求57的I類MHC/肽復合體，其與識別I類MHC/酪氨酸酶369-377復合體的TCR交叉反應(yīng)。61.權(quán)利要求60的I類MHC/肽復合體，其中所述I類MHC/復合體是HLA-A2/酪氨酸酶369-377復合體。62.—種多肽，其包括包埋在釋放序列內(nèi)的權(quán)利要求45的肽序列。63.—種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求45的任一種肽。64.—種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求62的多肽。65.編碼權(quán)利要求62的多肽的核酸。66.—種免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求65的核酸。67.—種誘導、維持、或增強CTL應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求63的組合物。68.—種引發(fā)I類MHC-限制性T細胞應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求63的組合物和免疫強化劑。69.—種誘導、維持、或引發(fā)CTL應(yīng)答的方法，其包括結(jié)節(jié)內(nèi)施用權(quán)利要求66的組合物。全文摘要一些實施方案涉及與I類MHC-限制性T細胞表位相對應(yīng)的肽的類似物以及產(chǎn)生它們的方法。這些類似物可以含有在直接與MHC分子相互作用的殘基的氨基酸取代，并且可以賦予提高的、改進的或有用的免疫學特性。另外，本發(fā)明公開了各種類似物，其中各種取代包括非標準殘基正亮氨酸和/或正纈氨酸。文檔編號C07K14/47GK101273056SQ200680030009公開日2008年9月24日申請日期2006年6月16日優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日發(fā)明者劉利平,戴維·C·戴蒙德,阿德里安·博特,劍龔申請人:曼康公司