專利名稱：一種新型穿膜肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種新型穿膜肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著生物工程學(xué)，基因組學(xué)，生物和有機(jī)化學(xué)的發(fā)展，各種類型的新型藥物分子，如:短肽(peptides),單克隆抗體蛋白(monoclonal antibodies),反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides),核酶(ribozymes),催化 DNA (catalytic DNA)等紛紛被開(kāi)發(fā)出來(lái)。這些具有極大生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義的分子(當(dāng)然也包括傳統(tǒng)的質(zhì)粒和融合蛋白)往往由于其過(guò)大的分子量和本身的親水性質(zhì)，限制了他們的在體應(yīng)用。由于生物膜系統(tǒng)的阻礙，這些分子很難進(jìn)入到靶向器官和組織的細(xì)胞中去發(fā)揮作用。針對(duì)這些問(wèn)題，不同的技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，他們都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。也有人采用物理透膜方式如電穿孔、微管注射、穿孔蛋白法等。這些方式雖然各有優(yōu)勢(shì)，但是也存在一些缺點(diǎn):導(dǎo)入率低、對(duì)細(xì)胞刺激大甚至可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡、靶向性不強(qiáng)。因此很多研究者致力于尋求更具高效的透膜方式。20世紀(jì)中期人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到的一類具特殊功能的多肽分子，這些肽能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且多種運(yùn)載物分子(如蛋白、多肽、核苷酸)也可以與這些肽連接并易位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這些肽載體構(gòu)成一種新的很有潛力的物質(zhì)運(yùn)輸載體，即細(xì)胞穿膜肽(cellpenetrating peptides, CPP)。它是一大類由30個(gè)以下氨基酸殘基組成的短肽。這種多肽介導(dǎo)的生物活性分子透膜技術(shù)，在許多方面優(yōu)于常用的透膜方式。另外在合成上多肽具有高產(chǎn)率，對(duì)細(xì)胞毒性低，而且肽骨架能夠進(jìn)行不同的修飾，這樣的多肽在未來(lái)的給藥平臺(tái)具有很大潛在的利用價(jià)值。細(xì)胞穿膜 肽均為帶有正電荷的長(zhǎng)短不等的多肽片段，富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，具有正電性或者兩親性。穿膜肽不僅可以轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽和蛋白質(zhì)，也可以將與穿膜肽偶聯(lián)的小分子有機(jī)化合物、寡核苷酸、DNA、噬菌體、脂質(zhì)體、納米級(jí)的鐵珠等多種不同大小的其他物質(zhì)導(dǎo)人細(xì)胞，并且大部分多肽和蛋白導(dǎo)入后依然保持其生物活性。但是穿膜肽應(yīng)用依然存在一些問(wèn)題:I)細(xì)胞毒性:穿膜肽富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，帶正電荷，容易引起細(xì)胞毒性。2)免疫原性:隨著肽鏈的增長(zhǎng)，免疫原性也隨之增加。大部分的穿膜肽都在10-30個(gè)氨基酸殘基之間，對(duì)身體造成免疫反應(yīng)的可能性大。3)穿膜效率:大部分穿膜肽具有長(zhǎng)的肽鏈，主要通過(guò)內(nèi)吞作用介導(dǎo)載物進(jìn)入細(xì)胞膜，其穿膜效率受pH、離子濃度等影響。4)穿膜后載物活性:大部分的穿膜肽通過(guò)共價(jià)鍵與載物連接，進(jìn)入細(xì)胞膜后無(wú)法分離，影響載物進(jìn)入細(xì)胞后的活性。因此，本領(lǐng)域中需要細(xì)胞毒性低、免疫原性小、穿膜效率高并且對(duì)穿膜后載物活性影響較小的穿膜肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有6-9個(gè)氨基酸殘的穿膜肽及其應(yīng)用。在第一方面，本發(fā)明提供了一種穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽具有如下結(jié)構(gòu)特征，其序列如下:NH2-X-Y-COOH其中，XSn個(gè)精氨酸殘基(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，Y由m個(gè)色氨酸(Trp)殘基和/或組氨酸(His)殘基組成，且4 < n < 6，2 < m < 4，6 < m+n < 9。本發(fā)明的穿膜肽中，X可以由n個(gè)精氨酸殘基組成，優(yōu)選地可以由5個(gè)精氨酸殘基組成。本發(fā)明的穿膜肽中，Y可以由m個(gè)色氨酸殘基組成，優(yōu)選地可以由3個(gè)色氨酸殘基組成。根據(jù)本發(fā)明的穿膜肽的序列可以為SEQ ID NO:1_20:RRRRffffff (SEQ ID NO:1)、KKKKffffff (SEQ ID NO:2)、KRRKHHW (SEQ ID NO:3)、RKKKffffff (SEQ ID NO:4),KRRRHWff (SEQ ID NO:5)、RRRRHHH (SEQ ID NO:6)、KKKKHHH (SEQID NO:7),RRRRffHW (SEQ ID NO:8),KRKRffHH (SEQ ID NO:9), =RRKKffHH (SEQ ID N0:10)、KRKRffffH (SEQ ID NO: 11), KRKRffHW (SEQ ID NO: 12), RRKKffHW (SEQ ID NO: 13), RKKKffHW(SEQ ID NO:14), KRRKffHW (SEQ ID NO: 15)、KRRKffffH (SEQ ID NO: 16)、RKKKffffH (SEQ IDNO:17),RRKKffHW (SEQ ID NO: 18),KRRKffHH (SEQ ID NO:19)和 RKKKWHH (SEQ ID NO:20)。根據(jù)本發(fā)明的穿膜 肽可以是藥學(xué)上可接受的鹽形式。本發(fā)明的穿膜肽中，所述穿膜肽可以與生物小分子非共價(jià)作用相互結(jié)合，并攜帶生物小分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明的穿膜肽中，所述的穿膜肽在C端共價(jià)或非共價(jià)連接標(biāo)記物或載物分子，并攜帶標(biāo)記物或貨物分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，優(yōu)選地所述標(biāo)記物選自由熒光素、生物素、特定的親和基團(tuán)所組成的組；優(yōu)選地所述貨物分子選自由糖類、多肽、蛋白、藥物分子前體、納米粒子、納米微球所組成的組。在第二方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其特征在于，包含根據(jù)第一方面所述的穿膜肽。在第三方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的穿膜肽在用于需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)完成診斷和/或治療的藥物的制備中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:I)低毒安全:該穿膜肽分子量小，氨基酸殘基個(gè)數(shù)控制在10個(gè)以內(nèi)，免疫原性低；含有4-6個(gè)堿性氨基酸殘基，1-3個(gè)酸性氨基酸殘基，陽(yáng)離子性低；其殘基序列取自20種必
需氨基酸，安全無(wú)毒。2)經(jīng)濟(jì):該穿膜肽由固相合成而得，成本較低且便于質(zhì)量管控。3)高效:該穿膜肽區(qū)別于以往的穿膜肽的最大特點(diǎn)在于，其能夠攜帶糖類等小分子生物物質(zhì)高效的進(jìn)入細(xì)胞。


圖1為本發(fā)明穿膜肽MEF細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示圖；圖2為本發(fā)明中的穿膜肽FITC熒光標(biāo)記后，孵育MEF細(xì)胞，熒光顯微實(shí)驗(yàn)成像圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:穿膜肽合成I)活化樹(shù)脂:稱取 IOOOmg Fmoc-Trp wang Resin 或 Fmoc-His wang Resin,加入10-15ml (浸沒(méi)全部樹(shù)脂)DMF浸泡30min，使其充分溶脹。2)脫保護(hù):浸泡樹(shù)脂的DMF壓濾除去，加入IOml含有20%哌啶的DMF溶液，氮?dú)獯捣蟹磻?yīng)15min，然后壓濾除去，脫除氨基的FMOC基團(tuán)，用IOml異丙醇洗滌樹(shù)脂三次，再用IOml DMF洗滌三次，而后用茚三酮法檢測(cè)樹(shù)脂應(yīng)成黑色或紫色。3)縮合反應(yīng):連接下一個(gè)氨基酸，稱取FMOC-氨基酸的用量是1.4mm0l/g樹(shù)脂，91Omg TBTU,加入IOml DMF和0.45g HOBt混和均勻后，加入0.52mlDIEA配成反應(yīng)液，室溫下氮?dú)獯捣蟹磻?yīng)2h。反應(yīng)完畢后，用異丙醇洗滌樹(shù)脂三次，然后用DMF洗滌樹(shù)脂三次。檢測(cè)氨基。4)重復(fù)步驟2)-3)過(guò)程:按多肽的順序自C端向N端延伸多肽。重復(fù)脫保護(hù).洗滌.縮合的過(guò)程至剩余的氨基酸連接完畢，完成多肽的連接。5)多肽切割:用氮?dú)鈱⒍嚯?樹(shù)脂復(fù)合物吹干，按TFA/phenol/IEO/thioanisole/EDT/TIS (80/5/5/5/3/2)的比例配成混和切割試劑。將肽樹(shù)脂置于圓底燒瓶中，加入切割液磁力攪拌3小時(shí)，用200目砂芯過(guò)濾器除去樹(shù)脂，濾液直接抽入冷凍乙醚中，3000r/min離心使粗肽沉淀，凍干至恒重即得粗肽，干燥稱重。

6)粗肽用HPLC純化至95%以上，質(zhì)譜鑒定。根據(jù)上文方法共合成SEQ ID NO:1_10的共10種穿膜肽。實(shí)施例2:細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)I)接種細(xì)胞:取96孔板，每孔加入含有7X IO3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。2)培養(yǎng)細(xì)胞:配置不同濃度的穿膜肽SEQ ID NO:1，同時(shí)設(shè)三個(gè)陰性對(duì)照孔，37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)l_5h。3)顯色:貼壁細(xì)胞每孔加入20 ii I MTT，繼續(xù)孵育4_6h之后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 u I DMSO (二甲基亞砜)，震蕩 lOmin。4)比色:選擇490nm或570nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀免疫檢測(cè)儀上測(cè)定光吸收值，處理數(shù)據(jù)得到細(xì)胞存活率。結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例3:細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)I)加入含有一定濃度FITC熒光標(biāo)記的穿膜肽的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，以含有FITC的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，孵育30min-4h后小心吸去培養(yǎng)基，并PBS洗滌貼壁細(xì)胞三次。2)加入固定液，10min-20min,固定細(xì)胞后PBS洗滌細(xì)胞2_3次。3)加入DAPI染色液染色5min-10min后PBS洗滌2-3次。4)分別在488nm和543nm的激發(fā)光下用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)施例4 =MEF細(xì)胞負(fù)載海藻糖實(shí)驗(yàn)I)培養(yǎng)基中加入一定量的海藻糖和肽(SEQ ID N0:l_10，使得培養(yǎng)基中海藻糖的終濃度為8mM，加入肽的終濃度為ImM。2)細(xì)胞貼壁后，加入上述培養(yǎng)基，培養(yǎng)30min_4h。孵育后小心吸去培養(yǎng)基，并PBS洗滌貼壁細(xì)胞三次。3)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，500-1500r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。PBS洗滌I次。4)在收集的洗滌后細(xì)胞中加入3倍于其體積的0.5mol/L三氯乙酸或甲醇，室溫放置30-60min，離心后重復(fù)提取I次，取2次上清。5)取純蒽酮0.2g加稀釋后硫酸溶液(體積分?jǐn)?shù)80%) IOOml使之溶解，臨用前配制。6)取待測(cè)提取液適量 ，加入4倍體積的硫酸-蒽酮溶液，搖勻冷卻，沸水浴精確煮沸2-10min，冷水冷卻后置室溫lOmin。7)同樣方法以水為空白，通過(guò)紫外吸收法計(jì)算海藻糖導(dǎo)入量。結(jié)果如表I (以未與肽連接時(shí)的導(dǎo)入效率為I)。表權(quán)利要求
1.一種穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽具有如下結(jié)構(gòu)特征，其序列如下:NH2-X-Y-COOH 其中，X由n個(gè)精氨酸殘基(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，Y由m個(gè)色氨酸(Trp)殘基和/或組氨酸(His)殘基組成，且4彡n彡6，2彡m彡4，6彡m+n彡9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穿膜肽，其特征在于，XSn個(gè)精氨基酸殘基組成，優(yōu)選地4個(gè)精氨基殘基組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穿膜肽，其特征在于，Y由m個(gè)色氨酸殘基組成，優(yōu)選地3個(gè)色氨酸殘基組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的穿膜肽，其特征在于，其序列為SEQID NO:1-20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽是藥學(xué)上可接受的鹽形式。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽與糖生物小分子非共價(jià)作用相互結(jié)合，并攜帶生物小分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求 1至5中任一項(xiàng)所述的穿膜肽，其特征在于，所述的穿膜肽在C端共價(jià)或非共價(jià)連接標(biāo)記物或載物分子，并攜帶標(biāo)記物或貨物分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，優(yōu)選地所述標(biāo)記物選自由熒光素、生物素、特定的親和基團(tuán)所組成的組；優(yōu)選地所述貨物分子選自由糖類、多肽、蛋白、藥物分子前體、納米粒子、納米微球所組成的組。
8.—種藥物組合物，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的穿膜肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的穿膜肽在用于需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)完成診斷和/或治療的藥物的制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型穿膜肽及其應(yīng)用，所述穿膜肽細(xì)胞毒性低、免疫原性小、穿膜效率高并且對(duì)穿膜后載物活性影響較小。
文檔編號(hào)C07K7/06GK103172701SQ201310085250
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者徐霞, 李春龍, 韋宇平, 張良 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所