一種Ⅰ型膠原蛋白單體海綿的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種醫(yī)用級(jí)Ⅰ型膠原蛋白單體海綿的制備工藝，其主要特征在于制備的膠原海綿是以三螺旋單體的形式存在的。該工藝較傳統(tǒng)工藝制備周期短，生產(chǎn)效率高以及產(chǎn)品純度高，主要采用酸復(fù)溶、酸透析和純水透析的工藝，控制海綿溶液的離子強(qiáng)度為10-100μs/cm，PH為4-6。使用該發(fā)明制備的膠原蛋白是均一透明穩(wěn)定的高粘性流體，凍干后的膠原蛋白單體海綿具有灰分含量低，膠原蛋白含量高，純度高、力學(xué)強(qiáng)度好以及親水性強(qiáng)，吸水率大等特點(diǎn)；吸水(或血)溶脹后產(chǎn)生膠原蛋白單體，具有良好的保濕作用，同時(shí)還可以與血小板黏結(jié)、聚集起到止血的作用，在臨床止血以及填充等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種I型膠原蛋白單體海綿的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型膠原蛋白單體海綿的制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的制備范疇。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原是動(dòng)物體中含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25% -30%,其廣泛存在結(jié)締組織如皮膚、腱、韌帶中。在動(dòng)物體中膠原是以不溶性的膠原纖維的形式存在的；與此同時(shí)膠原還與蛋白多糖及糖蛋白具有特異性親和性，因而使其呈不溶性；隨著生長(zhǎng)的進(jìn)行，膠原分子間及與其他成分之間形成了共價(jià)鍵，也增加了溶解的困難。
[0003]膠原的可溶和不可溶是相對(duì)而言的，與提取條件如溶劑等有關(guān)。膠原的提取一般有兩種手段，一是溶劑的化學(xué)法，二是用酶的生物化學(xué)法。根據(jù)所用的溶劑不同，化學(xué)法可分為中性鹽法和酸性法，中性鹽溶液提取組織材料中的可溶性膠原，成年動(dòng)物組織中的膠原交聯(lián)較多，可溶性膠原較少，用中性鹽提取的膠原量較少。酸法提取是針對(duì)酸溶性膠原的，稀有機(jī)酸除了可以提取可溶性膠原外，還可以使多數(shù)組織溶脹，打開其中含有醛胺類的交聯(lián)鍵，使這部分膠原即酸溶性膠原溶解出來(lái)。對(duì)于所謂的不溶性膠原，可采用交互提取法。牛跟腱中存在的I型膠原是酸不溶性的，由于膠原肽鏈間的共價(jià)交聯(lián)鏈都是通過(guò)分子末端肽里的賴氨酸或羥賴氨酸的相互作用形成的，末端肽被切下后(可通過(guò)一些蛋白酶將膠原進(jìn)行限制性降解，即將末端肽切割下來(lái))會(huì)有三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分可溶于稀有機(jī)酸而被提取出來(lái)。
[0004]膠原蛋白在酸性條件下是以膠原三螺旋單體形式存在的，膠原分子穩(wěn)定地分散在溶液中，是均一、透明的粘性流體。而當(dāng)外界條件(pH、T、1、C)改變時(shí)，如用堿液調(diào)節(jié)溶液PH值時(shí)，膠原溶液中力平衡被破壞，膠原分子之間靠非共價(jià)鍵作用力(包括靜電作用、范德華力、疏水作用力、氫鍵等)自發(fā)形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的聚集體，如膠原微纖維、原纖維、纖維等。膠原分子間作用力加強(qiáng)，而膠原與水之間的水化作用力減弱了，體系中發(fā)生相分離，由均一穩(wěn)定透明的單相體系變?yōu)榘咨胪该鞯墓桃夯旌象w系。
[0005]傳統(tǒng)制備工藝主要集中在用堿液調(diào)節(jié)PH或PBS透析使凍干前膠原溶液PH值升高，該方法缺點(diǎn)在于膠原海綿灰分高，同時(shí)PH值升高導(dǎo)致膠原纖維生成，最后得到的膠原蛋白纖維海綿力學(xué)強(qiáng)度低、吸水后易碎、吸水量小。同時(shí)也有通過(guò)交聯(lián)劑如戊二醛等對(duì)凍干前膠原蛋白溶液進(jìn)行交聯(lián)，該方法的缺陷在于交聯(lián)劑毒性大。因此尋求一種無(wú)毒性、力學(xué)強(qiáng)度大，吸水率高的膠原海綿是未來(lái)止血材料發(fā)展的方向。
[0006]發(fā)明優(yōu)點(diǎn):
[0007]1、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)效率和蛋白純度高。
[0008]2、灰分低，蛋白含量高。
[0009]3、膠原蛋白單體溶液呈均一透明狀，凍干后生物力學(xué)強(qiáng)度大，遇水膨脹后不易破碎。
[0010]4、膠原蛋白單體具有較膠原蛋白纖維更好的促血小板黏結(jié)、聚集的生物學(xué)功能。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種醫(yī)用級(jí)I型膠原蛋白單體海綿的制備工藝，其主要特點(diǎn)是制備的膠原蛋白海綿是以三螺旋單體的形式存在的，生物力學(xué)強(qiáng)度大，遇水膨脹后不易破碎；吸水率高，對(duì)傷口有保濕作用，提高臨床應(yīng)用效果。
[0012]本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說(shuō)明外均為重量份數(shù)。
[0013]I型膠原蛋白單體海綿的制備方法包括以下幾個(gè)步驟:
[0014]1、膠原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0015]將20份經(jīng)過(guò)前處理的牛跟腱碎片加入濃度為0.2-0.6mol/ml的醋酸水溶液1000-3000份，然后加入胃蛋白酶0.5-1.5份，置于10°C冰箱中放置2_5天，每天搖動(dòng)3_5次。離心取上清液，去渣。用堿溶液調(diào)節(jié)溶液PH至中性，放置半天，離心得到白色沉淀。
[0016]2、酸復(fù)溶
[0017]用濃度為0.2-0.6mol/ml的醋酸水溶液1000-3000份復(fù)溶沉淀，不斷攪拌待其完
全溶解。
[0018]3、鹽析
[0019]在上述清液中加入粉末狀氯化鈉固體100-200份，加完后置于10°C冰箱中放置過(guò)夜,離心取固體物質(zhì)用純水清洗沉淀數(shù)次,將多余的離子除去。
[0020]4、酸透析
[0021]將白色沉淀裝入透析袋中，用濃度為0.2-0.6mol/ml的醋酸水溶液作透析外液進(jìn)行酸透，直至白色沉淀完全溶解。每天可用手?jǐn)D壓透析袋兩次，使沉淀全部溶解。
[0022]5、水透析
[0023]待透析袋中的白色沉淀完全溶解后，將其放到純水中進(jìn)行水透，每天必須更換兩次外液，透析至膠原溶液的PH為4.0-6.0,離子強(qiáng)度為10-100 μ s/cm。
[0024]6、冷凍干燥
[0025]將透析好的膠原蛋白單體溶液根據(jù)所要求的濃度可作適當(dāng)?shù)南♂?，靜置達(dá)到平衡后，用凍干機(jī)冷凍干燥24-48小時(shí)，制得膠原蛋白單體海綿。
【具體實(shí)施方式】
[0026]現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0027]實(shí)施例1
[0028]1、膠原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0029]將20份經(jīng)過(guò)前處理的牛跟腱碎片加入濃度為0.2mol/ml的醋酸水溶液1000份，然后加入胃蛋白酶0.5份，置于10°C冰箱中放置2天，每天搖動(dòng)3-5次。離心取上清液，去渣。用堿溶液調(diào)節(jié)溶液PH至中性，放置半天，離心得到白色沉淀。
[0030]2、復(fù)溶
[0031]用濃度為0.2mol/ml的醋酸水溶液1000份復(fù)溶沉淀，不斷攪拌待其完全溶解。
[0032]3、鹽析
[0033]在上述上清液中加入粉末狀氯化鈉固體100份，加完后置于10°C冰箱中放置過(guò)夜,離心取固體物質(zhì)用純水清洗沉淀數(shù)次,將多余的離子除去。
[0034]4、酸透析
[0035]將白色沉淀裝入透析袋中，用濃度為0.2mol/ml的醋酸水溶液進(jìn)行酸透，直至白色沉淀完全溶解。每天可用手?jǐn)D壓透析袋兩次，使沉淀全部溶解。
[0036]5、水 透析
[0037]待透析袋中的白色沉淀完全溶解后，將其放到純水中進(jìn)行水透，每天必須更換兩次外液，透析至膠原溶液的PH為4.0-6.0,電導(dǎo)率為10-100 μ s/cm。
[0038]6、冷凍干燥
[0039]將透析好的膠原蛋白溶液根據(jù)所要求的濃度可作適當(dāng)?shù)南♂專o置達(dá)到平衡后，用凍干機(jī)冷凍干燥24-48小時(shí)，制得膠原蛋白單體海綿。
[0040]實(shí)施例2
[0041]1、膠原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0042]將20份經(jīng)過(guò)前處理的牛跟腱碎片加入濃度為0.6mol/ml的醋酸水溶液3000份，然后加入胃蛋白酶1.5份，置于10°C冰箱中放置5天，每天搖動(dòng)3-5次。離心取上清液，去渣。用堿溶液調(diào)節(jié)溶液PH至中性，放置半天，離心得到白色沉淀。
[0043]2、復(fù)溶
[0044]用濃度為0.6mol/ml的醋酸水溶液3000份復(fù)溶沉淀，不斷攪拌待其完全溶解。
[0045]3、鹽析
[0046]在上述上清液中加入粉末狀氯化鈉固體200份，加完后置于10°C冰箱中放置過(guò)夜,離心取固體物質(zhì)用純水清洗沉淀數(shù)次,將多余的離子除去。
[0047]4、酸透析
[0048]將白色沉淀裝入透析袋中，用濃度為0.6mol/ml的醋酸水溶液進(jìn)行酸透，直至白色沉淀完全溶解。每天可用手?jǐn)D壓透析袋兩次，使沉淀全部溶解。
[0049]5、水透析
[0050]待透析袋中的白色沉淀完全溶解后，將其放到純水中進(jìn)行水透，每天必須更換兩次外液，透析至膠原溶液的PH為4.0-6.0,電導(dǎo)率為10-100 μ s/cm。
[0051]6、冷凍干燥
[0052]將透析好的膠原蛋白溶液根據(jù)所要求的濃度可作適當(dāng)?shù)南♂?，靜置達(dá)到平衡后，用凍干機(jī)冷凍干燥24-48小時(shí)，制得膠原蛋白單體海綿。
[0053]實(shí)施例3
[0054]1、膠原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0055]將20份經(jīng)過(guò)前處理的牛跟腱碎片加入濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份，然后加入胃蛋白酶1.0份，置于10°C冰箱中放置3天，每天搖動(dòng)3-5次。離心取上清液，去渣。用堿溶液調(diào)節(jié)溶液PH至中性，放置半天，離心得到白色沉淀。
[0056]2、復(fù)溶
[0057]用濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份復(fù)溶沉淀，不斷攪拌待其完全溶解。
[0058]3、鹽析
[0059]在上述上清液中加入粉末狀氯化鈉固體150份，加完后置于10°C冰箱中放置過(guò)夜,離心取固體物質(zhì)用純水清洗沉淀數(shù)次,將多余的離子除去。[0060]4、酸透析
[0061]將白色沉淀裝入透析袋中，用濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液進(jìn)行酸透，直至白色沉淀完全溶解。每天可用手?jǐn)D壓透析袋兩次，使沉淀全部溶解。
[0062]5、水透析
[0063] 待透析袋中的白色沉淀完全溶解后，將其放到純水中進(jìn)行水透，每天必須更換兩次外液，透析至膠原溶液的PH為4.0-6.0,電導(dǎo)率為10-100 μ s/cm。
[0064]6、冷凍干燥
[0065]將透析好的膠原蛋白溶液根據(jù)所要求的濃度可作適當(dāng)?shù)南♂?，靜置達(dá)到平衡后，用凍干機(jī)冷凍干燥24-48小時(shí)，制得膠原蛋白單體海綿。
[0066]實(shí)施例4
[0067]1、膠原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0068]將20份經(jīng)過(guò)前處理的牛跟腱碎片加入濃度為0.3mol/ml的醋酸水溶液1000份，然后加入胃蛋白酶1.0份，置于10°C冰箱中放置3天，每天搖動(dòng)3-5次。離心取上清液，去渣。用堿溶液調(diào)節(jié)溶液PH至中性，放置半天，離心得到白色沉淀。
[0069]2、復(fù)溶
[0070]用濃度為0.3mol/ml的醋酸水溶液1000份復(fù)溶沉淀，不斷攪拌待其完全溶解。
[0071]3、鹽析
[0072]在上述上清液中加入粉末狀氯化鈉固體150份，加完后置于10°C冰箱中放置過(guò)夜,離心取固體物質(zhì)用純水清洗沉淀數(shù)次,將多余的離子除去。
[0073]4、酸透析
[0074]將白色沉淀裝入透析袋中，用濃度為0.3mol/ml的醋酸水溶液進(jìn)行酸透，直至白色沉淀完全溶解。每天可用手?jǐn)D壓透析袋兩次，使沉淀全部溶解。
[0075]5、水透析
[0076]待透析袋中的白色沉淀完全溶解后，將其放到純水中進(jìn)行水透，每天必須更換兩次外液，透析至膠原溶液的PH為4.0-6.0,電導(dǎo)率為10-100 μ s/cm。
[0077]6、冷凍干燥
[0078]將透析好的膠原蛋白溶液根據(jù)所要求的濃度可作適當(dāng)?shù)南♂?，靜置達(dá)到平衡后，用凍干機(jī)冷凍干燥24-48小時(shí)，制得膠原蛋白單體海綿。
[0079]實(shí)施例4
[0080]1、膠原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0081]將20份經(jīng)過(guò)前處理的牛跟腱碎片加入濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份，然后加入胃蛋白酶0.5份，置于10°C冰箱中放置3天，每天搖動(dòng)3-5次。離心取上清液，去渣。用堿溶液調(diào)節(jié)溶液PH至中性，放置半天，離心得到白色沉淀。
[0082]2、復(fù)溶
[0083]用濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份復(fù)溶沉淀，不斷攪拌待其完全溶解。
[0084]3、鹽析
[0085]在上述上清液中加入粉末狀氯化鈉固體150份，加完后置于10°C冰箱中放置過(guò)夜,離心取固體物質(zhì)用純水清洗沉淀數(shù)次,將多余的離子除去。
[0086]4、酸透析[0087]將白色沉淀裝入透析袋中，用濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液進(jìn)行酸透，直至白色沉淀完全溶解。每天可用手?jǐn)D壓透析袋兩次，使沉淀全部溶解。
[0088]5、水透析
[0089]待透析袋中的白色沉淀完全溶解后，將其放到純水中進(jìn)行水透，每天必須更換兩次外液，透析至膠原溶液的PH為4.0-6.0,電導(dǎo)率為10-100 μ s/cm。
[0090]6、冷凍干燥
[0091]將透析好的膠原蛋白溶液根據(jù)所要求的濃度可作適當(dāng)?shù)南♂?，靜置達(dá)到平衡后，用凍干機(jī)冷凍干燥24-48小時(shí)，制得膠原蛋白單體海綿。
[0092]實(shí)施例5
[0093]1、膠原蛋白的酸法和酶法交互提取
[0094]將20份經(jīng)過(guò)前處理的牛跟腱碎片加入濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份，然后加入胃蛋白酶1.5份，置于10°C冰箱中放置3天，每天搖動(dòng)3-5次。離心取上清液，去渣。用堿溶液調(diào)節(jié)溶液PH至中性，放置半天，離心得到白色沉淀。
[0095]2、復(fù)溶
[0096]用濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液2000份復(fù)溶沉淀，不斷攪拌待其完全溶解。
[0097]3、鹽析
[0098]在上述上清液中加入粉末狀氯化鈉固體150份，加完后置于10°C冰箱中放置過(guò)夜,離心取固體物質(zhì)用純水清洗沉淀數(shù)次,將多余的離子除去。
[0099]4、酸透析
[0100]將白色沉淀裝入透析袋中，用濃度為0.5mol/ml的醋酸水溶液進(jìn)行酸透，直至白色沉淀完全溶解。每天可用手?jǐn)D壓透析袋兩次，使沉淀全部溶解。
[0101]5、水透析
[0102]待透析袋中的白色沉淀完全溶解后，將其放到純水中進(jìn)行水透，每天必須更換兩次外液，透析至膠原溶液的PH為4.0-6.0,電導(dǎo)率為10-100 μ s/cm。
[0103]6、冷凍干燥
[0104]將透析好的膠原蛋白溶液根據(jù)所要求的濃度可作適當(dāng)?shù)南♂?，靜置達(dá)到平衡后，用凍干機(jī)冷凍干燥24-48小時(shí)，制得膠原蛋白單體海綿。
[0105]實(shí)施例6
[0106]本發(fā)明制備的膠原單體海綿和傳統(tǒng)工藝制備的膠原蛋白海綿的物理參數(shù)對(duì)比，見下表。
[0107]表1本發(fā)明制備工藝與傳統(tǒng)工藝的制備的膠原海綿的物理參數(shù)對(duì)比表
[0108]
【權(quán)利要求】
1.一種I型膠原蛋白單體海綿的制備工藝，其主要特征在于制備的單體膠原蛋白溶液為低離子強(qiáng)度并以單體的形式存在。
2.如權(quán)利要求1所述，低離子強(qiáng)度是指單體膠原蛋白溶液的電導(dǎo)率10-100μ s/cm。
3.如權(quán)利要求2所述，膠原蛋白單體的制備過(guò)程主要包括蛋白粗品的提取、復(fù)溶、鹽析和透析。
4.如權(quán)利要求3所述，膠原蛋白單體的提取條件為牛跟腱和胃蛋白酶的比為100: 1-100: 10 (w/w)。
5.如權(quán)利要求3所述，膠原蛋白單體復(fù)溶條件是指膠原蛋白單體粗品和酸溶液的比例為I: 50-1: 150 (w/v)，酸溶液是指PH為2-3的酸性溶液。
6.如權(quán)利要求3所述，鹽析條件是指氯化鈉和酸溶液比例為150: 1000-150: 3000 (w/V)。
7.如權(quán)利要求3所述，透析是指酸透析和純水透析兩個(gè)過(guò)程。
8.如權(quán)利要求7所述，膠原蛋白單體的酸透析是指將白色沉淀物直接裝到透析袋中進(jìn)行酸透析，PH為2-3，透析1-3天。
9.如權(quán)利要求8所述，膠原蛋白單體的純水透析是指用純水作透析外液透析至PH為4.0_6.0 。
【文檔編號(hào)】C07K14/78GK103923962SQ201310009433
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】李莉莉, 蔣麗霞, 魏長(zhǎng)征, 劉景
申請(qǐng)人:上海其勝生物制劑有限公司