用于制備3,5-二碘-o-[3-碘苯基]-l-酪氨酸的硫酸化衍生物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種通過在作為溶劑的氯磺酸和二甲基乙酰胺的存在下，由相應(yīng)酚化合物開始來制備衍生物3，5-二碘-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸(T3S)的單鈉鹽的方法。如此得到的T3S化合物可以方便地以良好產(chǎn)率、作為固體以純形式分離。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于T3S的制備方法，其中起始試劑為T2，并且進(jìn)一步包括片劑形式的該化合物的制劑。進(jìn)一步，本發(fā)明公開了基于T3S衍生物的非放射性免疫分析法。
【專利說明】用于制備3, 5- 二碘-O- [3-碘苯基]-L-酪氨酸的硫酸化衍
生物的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明的領(lǐng)域涉及用于制備甲狀腺激素的硫酸化衍生物或其鹽的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸(3，5_ 二碘-0-[3-碘苯基]-L-酪氨酸或T3)是代謝的最有活性的甲狀腺激素。如同甲狀腺素(T4)，其是甲狀腺生理學(xué)生成的，且與其甲狀腺球蛋白形式(一種糖蛋白前體)一起被貯存。平均而言，一個甲狀腺球蛋白分子包含三或四個T4殘基和至多一個T3殘基。TSH生成通過酶組織蛋白酶D、B和L活化甲狀腺球蛋白蛋白水解，釋放甲狀腺激素T3和T4。然而，T3生成不限于該機制:實際上，在外周組織中，甲狀腺素轉(zhuǎn)化成三碘甲狀腺原氨酸(80%的三碘甲狀腺原氨酸是由甲狀腺素外周生成的，20%是由內(nèi)部甲狀腺生成的)。
[0004]T3的重要性不僅在于其是唯一最有活性的甲狀腺激素的事實。實際地，在這方面，已知由于其不足可引起多種病理學(xué)病癥。特別地，例如，在胚胎發(fā)育期間和童年期的神經(jīng)組織中，T3缺乏會導(dǎo)致腦和 小腦皮層生長、軸突增殖、細(xì)胞遷移、髓鞘形成、樹突分支和突觸形成的減少。由于在生命初期T3缺乏，觀察到神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育延遲，接著觀察到認(rèn)知缺陷和運動缺陷，其可引起一種稱為白癡病的臨床現(xiàn)象。而且，在成年人中，已經(jīng)通過腦PET證實，當(dāng)三碘甲狀腺原氨酸水平降低時，大腦內(nèi)血流量和大腦葡萄糖代謝較低。這些數(shù)據(jù)可以解釋甲狀腺機能減退的個體中心理運動性缺陷。
[0005]除了在神經(jīng)組織中觀察到的影響之外，也已知在骨組織中觀察到影響，其中三碘甲狀腺原氨酸刺激軟骨內(nèi)成骨，因而經(jīng)由骨骺骨中心成熟產(chǎn)生線性更長的骨。即使三碘甲狀腺原氨酸不是出生后骨線性生長所必需的，其也是適宜的胎兒骨發(fā)育必不可少的。
[0006]而且，已經(jīng)證實了 T3在表皮組織中的作用，其中三碘甲狀腺原氨酸不僅參與皮附件的成熟，而且參與其分解從而促進(jìn)細(xì)胞再生。因此，該激素的過量和不足都可引起皮膚病學(xué)問題。
[0007]因此，T3甲狀腺激素可以肯定地被認(rèn)為是一種多效激素，其除了具有上述作用之外還具有已確證的作用，在血液組織中，其增加紅細(xì)胞生成素生成，并因而促進(jìn)血生成；在脂肪組織中，其促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的成熟，增加脂肪酸脂解，最后還調(diào)節(jié)膽固醇代謝。
[0008]通過自身免疫病理學(xué)非常頻繁地產(chǎn)生的甲狀腺機能減退相當(dāng)普遍:實際地，在意大利人中的患病率，女性為約1.5%，男性為1%。通過替代療法以令人滿意地方式對其進(jìn)行藥理學(xué)治療，所述替代療法主要是基于合成性左旋甲狀腺素(T4)，選擇該藥物是因為其更有活性的形式即T3的半衰期非常短，為此通常不能使用。
[0009]然而，采用左旋甲狀腺素治療還顯示出一些與如下事實相關(guān)的缺點:雖然血漿的甲狀腺得到恢復(fù)，組織的卻不一定得到恢復(fù)。藥理學(xué)替代物的研究，比如在EP1560575B中描述的基于擬甲狀腺素T3活性可提出的替代物，可能代表目前選擇治療的期望替代物。
[0010]然而，就涉及的T3S而言，主要障礙似乎表現(xiàn)為難于實現(xiàn)大規(guī)模合成。實際地，迄今為止，僅僅以實驗室規(guī)模制備T3S是可能的。
[0011]在這點上，已經(jīng)描述了利用大量過量的硫酸化試劑例如濃硫酸(H2SO4)或氯磺酸(CSA)由 T3 制備 T3S,例如在 US2970165 和 Biochim.Biophys.Acta, 33，461 (1959)中，其描述了在低溫下，利用直接加入濃硫酸由固體形式的T3制備T3S。
[0012]Endocrinology, Vol.117，N0.1,1-7(1985)和 Endocrinology, Vol.117，N0.1，8-12(1985)預(yù)期利用在冷卻下在二甲基甲酰胺中加入氯磺酸(CSA)溶液，接著通過Sephadex LH-20的純化步驟，由T3合成T3S。
[0013]然而，迄今為止，沒有任何現(xiàn)有技術(shù)的方法可以放大用于于純形式的最終產(chǎn)物的克計產(chǎn)出，主要是因為報道的純化方步需要極大體積。
[0014]有利地，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在DMAC的存在下，用氯磺酸(CSA)作為硫酸化試劑由三碘甲狀腺原氨酸開始硫酸化反應(yīng)得到高轉(zhuǎn)化率。而且，可以采用比已知的現(xiàn)有技術(shù)方法報道的更小體積進(jìn)行純化。最終，產(chǎn)物T3S可以以必需的數(shù)量和質(zhì)量(數(shù)百克)被純化至其臨床用途所需的水平，并且是在工業(yè)規(guī)?？蛇m用的情況下。
[0015]此外，因為迄今為止，只描述檢測血清中T3S水平的放射性分析，比如在Chopra etal.(J.Clin.Endocrinol.Metab.，1992，75:189-194)中描述的 RIA，需要基于例如非放射性試劑的更安全的免疫分析法。使用這類試劑也允許臨床和/或研究機構(gòu)進(jìn)行這些測量。為此目的，開發(fā)了非放射性免疫分析法，并且其屬于本發(fā)明的一部分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1.圖面a)競爭性ELISA的T3S校正曲線；圖面b) DELFIA校正曲線。T3S是以33.6,56,93.3,155.5、`259、432、720、1200、2000pg/ml 分析的。
[0017]圖2.DTPA-T3S單酰胺合成的示意圖。
[0018]發(fā)明簡述
[0019]本發(fā)明涉及一種由式I的3，5-二碘-O-(4-羥基-3-碘苯基)-L-酪氨酸或其鹽開始，制備3，5- 二碘-0-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸的單陽離子鹽的方法，其按照下述方案:
[0020]
【權(quán)利要求】
1.一種按照下述反應(yīng)制備具有式II (T3S)的甲狀腺激素的硫酸化形式的方法:
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述無機鹽為鈉鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項的方法，其中CSA和式I的化合物之間的摩爾比為4至10，優(yōu)選7至9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中在步驟a)中，式I的化合物在DMAC中的濃度為 0.060-0.090mol/L 的 DMAC0
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中步驟a)中的硫酸化反應(yīng)是在低于10°C的溫度，優(yōu)選-10°C至8°C的溫度下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中使步驟a)中的硫酸化進(jìn)行至少2小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中根據(jù)步驟b)的鹽化是在NaHCO3水溶液中進(jìn)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其進(jìn)一步包括步驟c)通過在聚合吸附劑固相上、用水和有機溶劑的極性遞減混合物洗脫的色譜純化式II的化合物，其中所述步驟c)任選地在過濾步驟之后。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述極性遞減的混合物是比例為1.0:0至0.7:0.3的水和極性溶劑的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8-9中任一項的方法，其中在洗脫之后，將該溶液濃縮至至少IOg的式II化合物/kg，并且使溶液pH值達(dá)到5.5至6.5。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項的方法，其中在用有機極性溶劑處理之后，獲得呈固體的式II的化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述極性有機溶劑選自:丙酮、乙醇、異丙醇和乙腈。
13.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項的方法，其中將固體形式的式II的化合物進(jìn)一步微粉化。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項的方法，其包括進(jìn)一步混合任選地與左旋甲狀腺素(T4)組合的式II的化合物的固體和/或微粉化形式與至少一種選自下述的稀釋劑:纖維素或其衍生物、高嶺土、淀粉和選自碳酸鈣和碳酸鎂的無機堿性鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中將式II的化合物和其中稀釋劑為微晶纖維素的稀釋劑的混合物進(jìn)一步與至少一種助流劑、至少一種崩解劑、和任選的潤滑劑混合，然后通過直接壓制該混合物配制成片劑，其中，所述助流劑選自二山崳酸甘油酯、磷酸三鈣、滑石、淀粉及其衍生物；所述崩解劑選自交聯(lián)羧甲纖維素或其衍生物、交聚維酮、聚甲基丙烯酸甲酯、麥芽糖糊精、乙醇酸淀粉鈉、預(yù)膠化淀粉、海藻酸鈉；所述潤滑劑選自硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、水合膠體二氧化硅和膠體二氧化硅。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中式I的試劑是通過在水介質(zhì)中且在脂族胺的存在下，用碘化劑，優(yōu)選包括I2/Nal的混合物碘化3’，5 二-碘甲腺原氨酸(T2)獲得的。
17.藥物組合物，包括I至1000μ g的量的作為活性成分的T3S,任選地與T4、以及與下述成分一起組合:碳酸鈣、二山崳酸甘油酯、交聯(lián)羧甲纖維素鈉鹽、水合膠體二氧化硅、硬脂酸鎂、微晶纖維素。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中T3S的量為2.5到500 μ g，更優(yōu)選5-250 μ g。
19.權(quán)利要求17-18中任一項的組合物，包括下述量的作為活性成分的T3S和T4，2.5-500 μ g 的 T3S 和 I 至 800 μ g 的 T4, 5-250 μ g 的 T3S 和 5-400 μ g 的 T4,10-100 μ g 的 T3S和 10-200 μ g 的 T4。
20.一種用于T3S檢測和定量的非放射性免疫分析法，包括非放射性T3S-綴合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的非放射性免疫分析法，其中所述非放射性T3S-綴合物具有式A:
22.權(quán)利要求21的免疫分析法，其中所述非放射性綴合物為式A’的T3S-生物素或T3S-HRP,
23.權(quán)利要求20-22的免疫分析法，其中所述免疫分析法為競爭性ELISA。
24.權(quán)利要求21的免疫分析法，包括鑭系元素?zé)晒鈾z測系統(tǒng)。
25.權(quán)利要求24的免疫分析法，其中所述式A的非放射性T3S-綴合物為式IV的化合物，并且為鑭系元素螯合劑，
26.根據(jù)權(quán)利要求21、23-25中任一項的免疫分析法,其中所述螯合的鑭系兀素金屬選自:釤、鋪、鏑和銪。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的免疫分析法，包括式V的銪螯合物
28.試劑盒，包括含有如在權(quán)利要求21-27的任一項中定義的式A的非放射性T3S-綴合物的容器，和具有用于制備T3S校正曲線的試劑和選自下述的任選的試劑或其組合的容器:稀釋劑、染料分子、緩沖劑、防腐劑、抗-T3S抗體、說明書小冊子。
【文檔編號】C07C309/42GK103534232SQ201280023319
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日
【發(fā)明者】P·L·阿內(nèi)力, M·阿爾格賽, V·波爾, L·卡瓦雷力, L·嘉禮姆波蒂, S·加澤多, L·拉圖阿達(dá), F·麥薩諾, G·利沃爾塔, F·韋拉 申請人:伯拉考成像股份公司