改善睡眠作用的復(fù)方刺人參組合物及制備方法和用圖
【專利摘要】改善睡眠作用的復(fù)方刺人參組合物及制備方法和用途，本發(fā)明涉及一種復(fù)方刺人參組合物及制備方法和制藥用途。本發(fā)明的組合物可用于治療睡眠障礙等疾病。本發(fā)明中藥組合物的制備方法包括：將刺人參根莖經(jīng)50%乙醇加熱回流提取得到乙醇浸膏，混懸于水中進行AB?8大孔樹脂吸附，分別用水、30%乙醇、60%乙醇洗脫，將60%乙醇洗脫液濃縮、干燥后制得刺人參有效成分提取物；將刺五加經(jīng)水煎煮得浸膏，混懸于水中進行D101大孔樹脂吸附，分別用水、50%乙醇、95%乙醇洗脫，將50%乙醇洗脫液濃縮、干燥后制得刺五加有效成分提取物；將刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物按比例混合，制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、丸劑、口服液、注射劑。
【專利說明】
改善睡眠作用的復(fù)方刺人參組合物及制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種組合物，特別涉及一種具有改善睡眠作用的中藥組合物，該組合 物由刺人參和刺五加的有效成分提取物組成，其能夠用于治療睡眠障礙。
【背景技術(shù)】
[0002] 睡眠是人類所必需的生理過程，隨著社會節(jié)奏的加快，人們生活壓力越來越大，各 種原因?qū)е碌乃哒系K問題呈逐年上升的趨勢。睡眠能消除疲勞、恢復(fù)體力、增強免疫力、 康復(fù)機體、保護大腦、恢復(fù)精力，此外，研究發(fā)現(xiàn)，睡眠能增強學(xué)習(xí)記憶的能力。睡眠是消除 身體疲勞的主要形式，從瞌睡、淺睡到深睡，再經(jīng)過慢波睡眠就可以消除疲勞，這是毋庸置 疑的。睡眠障礙嚴(yán)重影響人們的日常生活、工作和身心健康，很多的研究都表明，睡眠出現(xiàn) 問題往往是心血管疾病、糖尿病和抑郁癥等多種疾病的早期危險因素，而且長期的睡眠障 礙會導(dǎo)致生理健康和心理健康受損。
[0003] 目前，藥物干預(yù)是治療睡眠障礙的重要方法之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要選用化學(xué)合成的 鎮(zhèn)靜催眠藥物治療睡眠障礙，這些化學(xué)合成藥存在著安全性低、白天殘留作用、成癮性和依 賴性等缺點，還會加重失眠引起的頭昏、精神不振等現(xiàn)象。與之相比，中醫(yī)藥在治療睡眠障 礙的過程中，積累了豐富的理論知識和臨床經(jīng)驗。近年來，運用中藥治療失眠的成功案例屢 見報道，但是現(xiàn)在臨床中使用的中藥制劑，大都藥味眾多、療效不顯著、制劑粗糙、質(zhì)量不易 控制、藥品穩(wěn)定性較差等，致使其不能長期應(yīng)用于臨床。而單味中藥中，盡管已發(fā)現(xiàn)部分藥 物具有一定的改善睡眠作用，但因為單味中藥成分的多樣性和藥效的復(fù)雜性，致使治療效 果并不顯著。所以，真正意義上改善睡眠的純中藥制劑仍處于相對缺乏狀態(tài)。刺五加 (Radix Acanthopanacis Senticosl)為五加科植物刺五加和五梗五加的干燥根及根莖或莖，主要 成分為多種刺五加苷、刺五加多糖、木栓酮、異嗪皮啶、多種微量元素等。刺五加是傳統(tǒng)中 藥，具有益氣健脾、補腎安神等功效，用于脾腎陽虛、體虛乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多 夢等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證明，刺五加具有明顯的抗疲勞和改善睡眠的作用。刺人參 (Oplopanax elatus Nakai)別名刺參、東北刺人參，系五加科刺參屬多年生落葉灌木。特異 生長在東北林區(qū)，具有補氣壯陽，止咳，通絡(luò)等功效。用于氣虛體弱，神疲乏力等癥，刺人參 在民間常被用于治療失眠，而大量的藥理實驗研究表明刺人參有明顯的改善睡眠作用。我 們研究發(fā)現(xiàn)，將刺人參和刺五加配伍可以發(fā)揮協(xié)同增效的作用，多途徑、多環(huán)節(jié)綜合改善睡 眠障礙的的各種指癥，二者有效成分的組合物用于睡眠障礙的治療還未見報道。本發(fā)明人 經(jīng)過長期和艱苦的研究實驗，最終確定了二者組合的最佳重量配比，并經(jīng)藥理活性檢測證 實其具有良好的改善睡眠作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種改善睡眠作用的復(fù)方刺人參組合物。該組合物由刺人參有效成分 提取物和刺五加有效成分提取物組成。該組合物中刺人參有效成分提取物與刺五加有效成 分提取物的重量配比為2:1、3:1、4:1和5:1，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，上述重量配比優(yōu) 選為3:1。
[0005] 刺人參(Echinopanax elatus Nakai)為五加科刺人參屬植物刺人參的干燥根及 根狀莖，又名東北刺人參。性味甘，微苦，溫。具有補氣壯陽，止咳，通絡(luò)的功效，主治氣虛體 弱，神疲乏力，畏寒肢冷，陽痿，虛咳久嗽，風(fēng)寒濕痹等。
[0006] 刺五加 （Radix Acanthopanacis Senticosl)為五加科植物刺五加和五梗五加的 干燥根及根莖或莖，主要成分為多種刺五加苷、刺五加多糖、木栓酮、異嗪皮啶、多種微量元 素等。性味辛、微苦，溫。具有益氣健脾、補腎安神等功效，用于脾腎陽虛、體虛乏力、食欲不 振、腰膝酸痛、失眠多夢等。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述復(fù)方刺人參組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0008] 將刺人參根莖經(jīng)15倍量50 %乙醇加熱回流提取2次，每次2.5小時，過濾，合并濾 液，回收乙醇得到得到乙醇浸膏，用水溶解后，經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附，分別用水、30%乙醇、 60 %乙醇洗脫，將60 %乙醇洗脫液濃縮、干燥，即得刺人參有效成分提取物。
[0009] 將刺五加用10倍量水煎煮提取2小時，過濾，重復(fù)3次，合并水煎液并濃縮到一定體 積，經(jīng)DlOl大孔樹脂吸附，分別用水、50%乙醇、95%乙醇洗脫，將50%乙醇洗脫液濃縮、干 燥，即得刺五加有效成分提取物。
[0010] 將刺人參有效成分提取物和刺五加有效成分提取物按重量配比混合，加入藥學(xué)上 可接受的輔料可進一步制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、丸劑、口服液、注射劑。
[0011] 本發(fā)明的目的之一是提供一種改善睡眠作用的復(fù)方刺人參組合物。
[0012] 本發(fā)明的目的之二是提供上述復(fù)方刺人參組合物的制備方法及提高其改善睡眠 活性。
[0013] 本發(fā)明的有益效果為:刺人參主治氣虛體弱，神疲乏力，在民間治療失眠具有顯著 的療效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示其具有明顯的中樞抑制作用，可以改善睡眠，治療睡眠障礙， 以此為君藥，配伍刺五加，發(fā)揮協(xié)同作用，增強益氣安神的功效。二藥合用較之單味藥物的 使用作用更佳，可以發(fā)揮中醫(yī)藥的配伍優(yōu)勢，綜合改善睡眠障礙的各種癥狀，實驗證明二藥 合用在增強GABA對苯二氮卓受體的作用，降低興奮性的中樞神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)、谷氨酸 (GLU)的含量，增加一氧化氮(NO)的含量等改善睡眠作用上均有獨到的優(yōu)勢，此外，二藥合 用還能夠能夠明顯改善東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本發(fā)明發(fā)掘祖國 傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)寶庫，在睡眠障礙治療基礎(chǔ)上，選用純中藥，按照中醫(yī)基礎(chǔ)理論組方，經(jīng)嚴(yán)格篩 選，結(jié)合現(xiàn)代先進工藝制法組合而成。該組合物可達到治療睡眠障礙的藥效。
【具體實施方式】
[0014] 藥理學(xué)實驗研究
[0015] 1、不同配伍比例的有效成分組合物對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間的影響
[0016] 樣品（均為重量配比）：
[0017] 組合物1(刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物2:1)、
[0018] 組合物2(刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物3:1)、
[0019] 組合物3(刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物4:1)、
[0020] 組合物4(刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物5:1)。
[0021] 陽性對照藥:地西泮片
[0022]實驗動物:健康ICR小鼠
[0023] 實驗方法:將實驗動物于實驗室適應(yīng)環(huán)境(溫度24±2°C，濕度55±15%，12:121!明 暗交替，動物自由獲取食物和水），一周后隨機分為6組，每組15只，分別為空白對照組、組合 物1組、組合物2組、組合物3組、組合物4組及陽性對照組。分別灌胃給予相應(yīng)藥液，灌胃體積 為0.4ml/20g體重，空白對照組與陽性對照組分別給予同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃7天。末次 給藥（陽性對照組在灌胃20min后先腹腔注射體積為0.2ml/20g體重地西泮2.5mg/kg)30min 后，各組均腹腔注射體積為0.2ml/20g的戊巴比妥鈉(50mg/kg)，提起小鼠尾巴，將小鼠腹部 朝上放在溫暖（37°C)的墊塊上。記錄翻正反射消失的持續(xù)睡眠時間（翻正反射消失時間至 翻正反射重復(fù)出現(xiàn)時間）和翻正反射消失的潛伏期。
[0024] 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以（r±s)表示，用組間t 檢驗進行統(tǒng)計比較，P〈〇. 05有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0025] 實驗結(jié)果：由表1可知，與空白對照組相比，陽性對照組能顯著縮短小鼠睡眠潛伏 期且顯著延長睡眠時間（P〈〇.01)，表明該試驗方法可靠。與空白對照組比，組合物3與組合 物4對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠潛伏期與睡眠時間無明顯差異，組合物1可以明顯縮短睡眠 潛伏期和延長睡眠時間，差異具有顯著性意義(P〈〇.05)。而組合物2可以明顯縮短睡眠潛伏 期和延長睡眠時間，差異具有極顯著性意義(P〈〇.01)。與其他各組合組相比，組合物2組(重 量配比3:1)延長小鼠睡眠時間效果更顯著，故本研究選取組合物2為研究對象進一步進行 考察。
[0026] 表1不同配伍比例的有效成分組合物對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 (x.±s：f n=14)
L0028J 注：與空臼對照組比，*P〈0.05，**P〈0.01;
[0029] 2、單味藥有效成分提取物與組合物2聯(lián)合氟馬西尼對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時 間的影響
[0030] 樣品：
[0031 ]組合物2(刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物3:1 (為重量配比））、 [0032]刺人參有效成分提取物(CRST)、
[0033]刺五加有效成分提取物(CWJT)。
[0034]陽性對照藥:地西泮片 [0035]實驗動物:健康ICR小鼠
[0036] 實驗方法:將實驗動物于實驗室適應(yīng)環(huán)境(溫度24±2°C，濕度55±15%，12:121!明 暗交替，動物自由獲取食物和水），一周后隨機分組，每組10只，分別為空白對照組、地西泮 組、氟馬西尼組、地西泮+氟馬西尼組、組合物2組、組合物2+氟馬西尼組、刺人參有效成分提 取物(CRST)組、CRST+氟馬西尼組、刺五加有效成分提取物(CWJT)組、CWJT+氟馬西尼組。組 合物2組、組合物2+氟馬西尼組、CRST組、CRST+氟馬西尼組、CWJT組、CWJT+氟馬西尼組分別 灌胃給藥2.4g/kg，其他各組灌胃給予蒸餾水，體積均為0.4ml/20g體重，連續(xù)灌胃7天。末次 灌胃30min后，空白對照組、組合物2組、CRST組、CWJT組、分別腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/kg， 注射體積為〇 . 2ml/20g體重；地西泮組在末次灌胃20min后先腹腔注射地西泮2.5mg/kg， 2〇min后再注射戊巴比妥鈉(濃度、體積同上）；氟馬西尼組、組合物2+氟馬西尼組、CRST+氟 馬西尼組和CWJT+氟馬西尼組在末次灌胃30min后先腹腔注射氟馬西尼3.5mg/kg，注射體積 為0.2ml/20g體重，20min后再注射戊巴比妥鈉(濃度、體積同上）；地西泮+氟馬西尼組則在 末次灌胃20min后腹腔注射地西泮，再20min后注射氟馬西尼，再20min后注射戊巴比妥鈉。 提起小鼠尾巴，將小鼠腹部朝上放在溫暖（37°C)的墊塊上。記錄翻正反射消失的持續(xù)睡眠 時間（翻正反射消失時間至翻正反射重復(fù)出現(xiàn)時間）和翻正反射消失的潛伏期。
[0037] 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以（i±s)表示，用組間t 檢驗進行統(tǒng)計比較，P〈〇. 05有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0038] 實驗結(jié)果：臨床上應(yīng)用的絕大多數(shù)的催眠藥物都是通過增強GABAa受體的功能實 現(xiàn)的，苯二氮卓類藥物作用于GABAa受體的苯二氮卓結(jié)合位點，通過增強腦內(nèi)GABA的效能而 發(fā)揮作用。氟馬西尼是苯二氮卓受體拮抗劑，主要用于逆轉(zhuǎn)苯二氮卓類藥物所致的中樞鎮(zhèn) 靜作用。因此，通過刺人參聯(lián)合氟馬西尼對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響可以判斷刺人 參改善睡眠的作用是否通過苯二氮卓受體介導(dǎo)的。實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，單獨給予 組合物2(2.4g/kg)和地西泮(2.5mg/kg)，均延長戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠持續(xù)時間并縮 短其潛伏期；組合物2與組合物2+氟馬西尼組比較，差異具有顯著性意義(P〈0.05)，表明氟 馬西尼可以明顯阻斷地西泮和組合物2與戊巴比妥鈉的協(xié)同作用。氟馬西尼可以明顯拮抗 組合物2和地西泮對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的增強作用，說明組合物2是通過增強GABA對 苯二氮卓受體的作用而改善睡眠的。CRST和CWJT有效組分也在一定程度上增強GABA對苯二 氮卓受體的作用，但在相同劑量下，組合物2的干預(yù)作用比上述二者的作用顯著。因此，以刺 人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物3:1配伍組合的組合物2改善睡眠作用優(yōu)于 單味藥的有效成分提取物。
[0039] 表2各組分聯(lián)合氟馬西尼對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間的影響Gis)
[0042] 注：與空白組比，*P〈0.05;組合物2與組合物2+氟馬西尼組比，SP〈0.05;地西泮與 地西泮+氟馬西尼組比， &P〈〇 .05;
[0043] 3、單味藥有效成分提取物與組合物2對小鼠腦內(nèi)DA、GLU和NO含量的影響
[0044] 樣品：
[0045] 組合物2(刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物3:1 (為重量配比））、
[0046] 刺人參有效成分提取物(CRST)、
[0047]刺五加有效成分提取物(CWJT)。
[0048]實驗動物:健康ICR小鼠
[0049] 實驗方法：將小鼠隨機分為空白對照組、組合物2組、刺人參有效成分提取物 (CRST)組和刺五加有效成分提取物(CWJT)組，陽性對照藥組，每組10只?？瞻讓φ战M給予同 體積的蒸餾水，組合物2組、CRST組和CWJT組分別灌胃給予刺人參有效部位2.4g/kg，灌胃體 積為0.4ml/20g體重，連續(xù)灌胃7天。末次灌胃30min后，將小鼠直接斷頭取腦組織:皮質(zhì)、下 丘腦、海馬，用冰生理鹽水沖洗表面血液，濾紙拭干。將分離好的腦組織分別加9倍量的涼生 理鹽水手動勻漿后在4°C、3000r/min下離心10min。取上清液，按試劑盒操作步驟處理后用 酶標(biāo)儀在450nm波長下測定相應(yīng)的吸光度(0D值），再將OD值代人線性回歸方程，計算各樣品 中DA、GLU、NE、5-HT、NO、NOS濃度。酶聯(lián)免疫法(ELI SA)具體步驟詳見試劑盒說明。
[0050] 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以（i±s)表示，用組間t 檢驗進行統(tǒng)計比較，P〈〇. 05有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0051 ]實驗結(jié)果：
[0052] 3.1對小鼠腦內(nèi)多巴胺(DA)含量的影響
[0053] 3.1.1 DA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
[0054]將濃度分別為0、7.5、15、30、60、120pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品按試劑盒說明書操作步驟處理 后，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定相應(yīng)的吸光度(OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值 (吸光度)作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線圖。線性回歸方程:y = O. 〇〇96x+0.0601，R2 = 0.9992
[0055] 3.1.2對小鼠腦內(nèi)DA含量的影響
[0056]多巴胺系統(tǒng)在睡眠-覺醒狀態(tài)中起重要作用，其調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌活動。覺醒效 應(yīng)主要通過強化突觸的DA傳遞，易化突觸后DA受體功能產(chǎn)生。拮抗多巴胺再攝取的藥物或 促進多巴胺釋放的藥物，都認為具有促進覺醒的作用。實驗結(jié)果顯示，組合物2 (2.4g/kg)， 連續(xù)灌胃7天，與空白組比較，能明顯降低小鼠下丘腦中DA的含量(P〈0.01)，表明組合物2是 通過DA能神經(jīng)介導(dǎo)來發(fā)揮促進睡眠作用，其作用效果優(yōu)于相同劑量的各單味藥有效成分提 取物，結(jié)果見表3。
[0057] 表3對小鼠腦內(nèi)下丘腦DA含量的影響（孓±〇
[0059] 注:與空白組比，*P〈0.05
[0060] 3.2對小鼠腦內(nèi)谷氨酸(GLU)含量的影響
[0061 ] 3.2.1 GLU含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
[0062]將濃度分別為0、3、6、12、24、48!^凡的標(biāo)準(zhǔn)品按試劑盒說明書操作步驟處理后，用 酶標(biāo)儀在450nm波長下測定相應(yīng)的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制 出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線圖。線性回歸方程:y = 0.0398x+0.1241，R2 = 0.9960 [0063] 3.2.2對小鼠腦內(nèi)GLU含量的影響
[0064] 谷氨酸屬于氨基酸類興奮性中樞神經(jīng)遞質(zhì)，是哺乳動物最重要的興奮性遞質(zhì)。按 曲線方程計算各樣本濃度值，結(jié)果見表4。實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，組合物2和CRST均 能明顯降低小鼠皮質(zhì)中GLU的含量(P〈0.05 )，其中，組合物2的抑制作用強于刺人參有效成 分提取物，表明刺人參改善小鼠睡眠作用是通過GLU能神經(jīng)介導(dǎo)的，其抑制腦內(nèi)興奮性GLU 能神經(jīng)元，減少GLU釋放，發(fā)揮促進睡眠作用，組合物2的作用效果優(yōu)于相同劑量的各單味藥 有效成分提取物。
[0065] 表4刺人參有效部位對小鼠腦內(nèi)GLU含量的影響（孓封）
[0067] 注：與空白組比，*Ρ〈0·05，*Ρ〈0·05，
[0068] 3.2對小鼠腦內(nèi)一氧化氮(NO)含量的影響
[0069] 3.2.1 NO含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
[0070]將濃度分別為0、2.5、5、10、20、40ymol/L的標(biāo)準(zhǔn)品按試劑盒說明書操作步驟處理， 后用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定相應(yīng)的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)， 繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線圖。線性回歸方程:y = 〇. 〇362x+0.0791，R2 = 0.9953 [0071] 3.2.2對小鼠腦內(nèi)NO含量的影響
[0072] NO廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，睡眠相關(guān)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)亦存在。大量研究顯示，NO具 有促進睡眠的作用。本實驗測定了小鼠全腦內(nèi)NO含量，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算各樣本濃度值， 結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，與空白組比較，組合物2能明顯增加小鼠海馬中NO的含量(P〈0.01)。 表明組合物2通過增加海馬NO含量發(fā)揮促進睡眠的作用，其作用效果優(yōu)于相同劑量的各單 味藥有效成分提取物。
[0073]表5對小鼠腦內(nèi)NO含量的影響（
[0075] 注：與空白組比，*Ρ〈0 · 05，**Ρ〈0 · 01
[0076] 4、單味藥有效成分提取物與組合物2對學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 [0077]樣品：
[0078]組合物2 (刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物3:1 (為重量配比））、 [0079]刺人參有效成分提取物(CRST)、
[0080]刺五加有效成分提取物(CWJT)。
[0081 ]實驗動物:健康ICR小鼠
[0082] 實驗方法:選用雄性小鼠，隨機分為6組，分別為空白組，模型組，哈伯因組，組合物 2組、刺人參有效成分提取物(CRST)組和刺五加有效成分提取物(CWJT)組，每組15只?？瞻?組和模型組給予蒸餾水，哈伯因組給予哈伯因溶液(0.3mg/kg )，組合物2組、CRST組和CWJT 組分別灌胃給予刺人參有效部位2.4g/kg，灌胃體積為0.4ml/20g體重，連續(xù)灌胃7天?？瞻?組在行為訓(xùn)練測試前30min腹腔注射氯化鈉注射液(0.2ml/20g);模型組、組合物2組、CRST 組、CWJT組和哈伯因組，均在行為訓(xùn)練測試前30min腹腔注射氫溴酸東莨菪堿注射液(5mg/ kg)。實驗開始前7天大鼠適應(yīng)實驗環(huán)境，每天由實驗人員撫摸，每只撫摸l-2min，以減少無 關(guān)刺激對實驗的影響。實驗開始時，把大鼠從入口放入，適應(yīng)2_3min后，先給予鈴聲刺激再 給予電刺激，大鼠會從其中一個敞開的門逃離到安全區(qū)。關(guān)閉此門重新將大鼠放入，大鼠會 繼續(xù)尋找其他出口，以此來觀察大鼠的空間探究及認知能力。每換下一只大鼠時，要用75% 醫(yī)用酒精擦拭箱體，以防止氣味對實驗動物的干擾。
[0083] 記錄下列指標(biāo):尋找時間：即大鼠找到第一個敞開的出口到找到最后一個敞開的 出口所用的時間。尋找時間反映大鼠的空間探究能力情況。尋找頻率:每分鐘大鼠尋找的次 數(shù)。按下列公式計算:尋找頻率=尋找總次數(shù)/尋找總時間。尋找總次數(shù)=正確次數(shù)+錯誤次 數(shù)。動物選擇已經(jīng)關(guān)閉的出口逃出被認為是錯誤的，選擇敞開的出口是正確的，因此在整個 實驗過程中，正確次數(shù)為6次。尋找頻率能夠反映大鼠的興奮性。
[0084] 認知率:正確次數(shù)/尋找總次數(shù)，正確次數(shù)為6次。如果大鼠一次錯誤也沒出現(xiàn)認知 率即為100%。認知率能夠反映大鼠的認知能力。通過上述三種指標(biāo)綜合考察動物的學(xué)習(xí)記 憶能力。
[0085] 統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差 土S)表示，對各組樣本均數(shù)采用t檢驗和方差分析進行處理。p〈0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著 性差異
[0086] 實驗結(jié)果：由表6結(jié)果可知，與空白組比較，模型組尋找時間、尋找頻率和認知率均 降低(P〈0.01);與模型組比較，組合物2組與哈伯因組尋找時間縮短(P〈0.01)，認知率升高 (P〈0.01)，哈伯因組尋找頻率升高(P〈0.05)，組合物2組尋找頻率有升高趨勢，但無顯著性 差異。CRST組尋找時間縮短(P〈0.05)，認知率升高(P〈0.05)，CWJT組認知率升高(P〈0.05)。 上述結(jié)果表明，組合物2能夠明顯改善東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其 作用效果優(yōu)于相同劑量的各單味藥有效成分提取物。
[0087] 表6各組小鼠行為學(xué)指標(biāo)的比較（? ± S ,
[0089] 注:與空白組比較#P〈0.01;與模型組比較#P〈0.05，##P〈0.01
[0090] 結(jié)論：
[0091] 綜上所述，與其他各組合相比，組合物2(重量配比3:1)可以顯著縮短睡眠潛伏期 和并延長睡眠時間，作用效果優(yōu)于其他各組合組。進一步研究發(fā)現(xiàn)，組合物2在增強GABA對 苯二氮卓受體的作用，降低興奮性的中樞神經(jīng)遞質(zhì)DA、GLU的含量，增加 NO含量等改善睡眠 作用上均有獨到的優(yōu)勢。此外，組合物2能夠明顯改善東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠的學(xué) 習(xí)記憶能力，其作用效果優(yōu)于相同劑量的各單味藥有效成分提取物。
[0092] 因此，刺人參有效成分提取物和刺五加有效成分提取物的組合物中二組分有效部 位的重量比3:1是最佳比例。單獨刺人參有效成分提取物、刺五加有效成分提取物也具有較 好的改善睡眠效果，但是將刺人參有效成分提取物、刺五加有效成分提取物按照上述優(yōu)選 配比得到更好的改善睡眠效果，說明兩者聯(lián)合應(yīng)用不是簡單的治療相加作用而是協(xié)同增強 作用，二藥合用較之單味藥物的使用作用更佳，可以發(fā)揮中醫(yī)藥的配伍優(yōu)勢。
【主權(quán)項】
1. 一種治療睡眠障礙的復(fù)方刺人參組合物，其特征在于它是由刺人參有效成分提取物 和刺五加有效成分提取物組成，其中刺人參有效成分提取物與刺五加有效成分提取物的重 量配比為2:1、3:1、4:1或5:1，該組合物制備方法如下：（1)將刺人參根莖經(jīng)15倍量50%乙醇 加熱回流提取2次，每次2.5小時，過濾，合并濾液，回收乙醇得到得到乙醇浸膏，用水溶解 后，經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附，分別用水、30%乙醇、60%乙醇洗脫，將60%乙醇洗脫液濃縮、干燥， 即得刺人參有效成分提取物；（2)將刺五加用10倍量水煎煮提取2小時，過濾，重復(fù)3次，合并 水煎液并濃縮到一定體積，經(jīng)D101大孔樹脂吸附，分別用水、50%乙醇、95%乙醇洗脫，將50% 乙醇洗脫液濃縮、干燥，即得刺五加有效成分提取物；（3)將刺人參有效成分提取物和刺五 加有效成分提取物按重量配比混合即得復(fù)方刺人參組合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療睡眠障礙的復(fù)方刺人參組合物，其特征在于刺人參有效 成分提取物與刺五加有效成分提取物的重量配比為3:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的治療睡眠障礙的復(fù)方刺人參組合物的制備方法，其特征在 于包括如下步驟： (1) 將刺人參根莖經(jīng)15倍量50%乙醇加熱回流提取2次，每次2.5小時，過濾，合并濾液， 回收乙醇得到得到乙醇浸膏，用水溶解后，經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附，分別用水、30%乙醇、60%乙 醇洗脫，將60%乙醇洗脫液濃縮、干燥，即得刺人參有效成分提取物； (2) 將刺五加用10倍量水煎煮提取2小時，過濾，重復(fù)3次，合并水煎液并濃縮到一定體 積，經(jīng)D101大孔樹脂吸附，分別用水、50%乙醇、95%乙醇洗脫，將50%乙醇洗脫液濃縮、干燥， 即得刺五加有效成分提取物； (3) 將刺人參有效成分提取物和刺五加有效成分提取物按重量配比混合即得復(fù)方刺人 參組合物。4. 權(quán)利要求1-2所述的復(fù)方刺人參組合物在制備治療睡眠障礙藥物中的應(yīng)用，其特征 在于在組合物中加入藥學(xué)上可接受的輔料制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、丸劑、口服液、注射 劑。
【文檔編號】A61P25/20GK106074642SQ201610428956
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】李廷利, 王艷艷, 黃莉莉, 于爽, 魏硯君, 華伊, 吳傳芳, 唐霜
【申請人】李廷利