專利名稱：一種牡蠣殼抗氧化肽的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物分離技術領域，具體涉及一種以牡蠣殼為原料制備抗氧化肽的方法。
背景技術：
牡販殼為牡販科動物長牡販(Ostrea gigas Thunberg)、大連灣牡販 (Ostreatalienwhanensis Crosse)或近江牡販(Ostrea rivularis Gould)的貝殼，是歷版 《中國藥典》收載的中醫(yī)臨床常用藥。味咸，微寒，歸肝、膽、腎經。生牡蠣重鎮(zhèn)安神，潛陽補陰，軟堅散結?，F代臨床應用集中于治療癲癇，治療失眠，治療更年期綜合癥，治療消化性潰瘍，治療多汗癥等。
近年來，隨著牡蠣養(yǎng)殖技術的推廣和市場需求的擴大，牡蠣的養(yǎng)殖規(guī)模和生產加工能力得到大幅提高。但是，牡蠣生產加工過程中殘留的大量牡蠣殼，若不能得到有效利用和妥善處理，將會嚴重污染鄉(xiāng)村環(huán)境。牡蠣殼的主要成分是碳酸鈣，并含有少量的磷酸鈣、 硫酸鈣、氧化鐵、鋁、鎂和硅等微量元素，是一種寶貴的無機鹽資源。其資源化利用，古來有之，從先秦的煅制工藝，到后來道家的“煉丹術”和洛陽橋的“種蠣固基”，無不與之相關。目前，國內外已成功開發(fā)出一系列以牡蠣殼為原料的產品，包括作為藥品原料的活性鈣粉、作為化工產品的填充料碳酸鈣粉或作為養(yǎng)殖業(yè)飼料添加劑鈣粉等。但是對牡蠣殼有機質的研究鮮見報道，這無疑阻礙了牡蠣殼資源的進一步開發(fā)和利用。因此，為了能夠更好的應用牡蠣動物藥資源，闡明其藥效的化學依據，有必要對其肽類化學成分和活性進行系統(tǒng)的研究。
生物體內正常有氧代謝過程中會形成許多活性氧物質，包括超氧陰離子自由基、 羥基自由基等；另外，生物體也可經過傳染、離子輻射、空氣污染等外源性侵入而產生活性氧。體內活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信號傳導過程。但過多的活性氧自由基就會有破壞行為。大量研究已經證明，老化以及老化相關的疾病如癌癥、心血管、自身免疫性疾病以及關節(jié)炎等的發(fā)生機理與體內自由基產生過多或清除自由基能力下降有著密切的關系。因此充分利用牡蠣殼資源，制成具有抗氧化活性且易于人體吸收的肽及附加產品具有重要意義。
目前已有從牡蠣肉中分離提取肽類物質的相關報道，由于牡蠣殼中含有較多碳酸鈣成分，從牡蠣殼中提取純度較高的抗氧化肽未見報道。發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種以牡蠣殼為原料的抗氧化肽的制備方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下
一種牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，它包括如下步驟
(I)牡蠣殼肽的提取牡蠣殼粉碎，過6(Γ100目篩，加入8 10倍重量的水 9(T10(TC回流加熱提取I小時，過濾，濾液濃縮，O. 45 μ m水膜濾過，再經凍干，得牡蠣殼肽凍干粉；
(2)離子交換層析分離將步驟(I)得到的牡蠣殼肽凍干粉溶于緩沖液A中進行離子交換層析，進樣量為O. 5mL，流速為lmL/min，S0URCE15Q強陰離子交換柱，檢測波長為 214nm,上樣完畢后繼續(xù)進100 (v/v) %緩沖液A2到3個柱床體積，洗至基線平穩(wěn)，再用50 (v/ V) %緩沖液A與50 (v/v) %緩沖液B洗脫30min，流速為lmL/min，收集主要峰，然后濃縮，凍干，得到初步純化產物；
其中，
緩沖液A為pH8. O的50mM Tris-HCl ;配制方法將500mL的O. lmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與292mL的O. lmol/L的鹽酸混勻后，加水稀釋至1L，過濾，即為緩沖液A ；
緩沖液B 為 ρΗ8· O 的 50mM Tris-HCl+lmol/LNaCl ;配制方法將 500mL 的 O.1mol/ L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與292mL的O. lmol/L的鹽酸混勻后，加NaC158. 44g，加水稀釋至1L，過濾，即為緩沖液B ；
(3)反向CS柱層析分離將步驟(2)得到的初步純化產物加入8 10倍重量的水溶解，利用反向C8柱進行柱層析,檢測波長為214nm,設置96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B走基線平穩(wěn)后，進樣量為2mL，96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B洗脫4min，然后調節(jié)流動相B的比例從4 (v/V) %至60 (v/V) %線性梯度洗脫IOmin,洗脫流速一直保持在 8mL/min,收集主要峰，濃縮，凍干，得到牡蠣殼抗氧化肽產物；
其中，流動相A為I (v/v) %。CF3COOH水溶液，流動相B為CH30H。
步驟(I)、( 2 )和(3 )中的濃縮條件為60 V旋轉蒸發(fā)濃縮。
按照上述制備方法所制得的牡蠣殼抗氧化肽也在本發(fā)明的保護范圍內。
按照上述制備方法所制得的牡蠣殼抗氧化肽在抗氧化產品中的應用也在本發(fā)明的保護范圍內。
其中，所述的抗氧化產品為抗氧化藥品、抗氧化保健品、抗氧化食品或抗氧化化妝品O
其中，本發(fā)明的牡蠣殼抗氧化肽，可以和藥學上可接受的載體混合制備成各種劑型。
有益效果本發(fā)明方法制備得到的牡蠣殼肽，具有很好的抗氧化活性；本發(fā)明提供的牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，經過大量實驗篩選，所得工藝各參數設計合理，能夠充分利用牡蠣殼豐富資源；本發(fā)明提供的牡蠣殼抗氧化肽可以用于制備成抗氧化抗衰老藥品、 保健品或食品，應用范圍廣泛，具有良好的經濟和社會效益。


圖1為離子交換層析分離譜圖。
圖2為反向C8柱層析分離譜圖。
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
實施例1:牡蠣殼抗氧化肽的制備。
實驗設備
AKTA 蛋白純化系統(tǒng)，Amersham Biosciences,瑞典；反向 C8 柱，Hamilton HxSil, 瑞士 ；Sourcel5Q強陰離子交換柱，Amersham Biosciences,瑞典；RE_52AA旋轉蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠；萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；FD-1000凍干機，東京理化株式會社；SHZ-1II型循環(huán)水真空泵；上海亞榮生化儀器廠。
實驗過程
(I)牡蠣殼肽的提取牡蠣殼粉碎，過80目篩，加入9倍重量的水100°C回流加熱提取I小時，過濾，濾液60°C旋轉蒸發(fā)濃縮，O. 45 μ m水膜濾過，得牡蠣殼肽提取物凍干粉；
(2)離子交換層析分離將步驟(I)得到的牡蠣殼肽凍干粉溶于緩沖液A中進行離子交換層析，進樣量為O. 5mL，流速為lmL/min，S0URCE15Q強陰離子交換柱，檢測波長為 214nm,上樣完畢后繼續(xù)進100 (v/v) %緩沖液A2到3個柱床體積，洗至基線平穩(wěn)，再用50 (v/ v)%緩沖液A與50 (v/v)%緩沖液B洗脫30min,流速為lmL/min,層析譜圖見圖1,收集主要峰，然后60°C旋轉蒸發(fā)濃縮，凍干，得到初步純化產物；
其中，
緩沖液A為pH8. O的50mM Tris-HCl ;配制方法將500mL的O. lmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與292mL的O. lmol/L的鹽酸混勻后，加水稀釋至1L，過濾，即為緩沖液A ；
緩沖液B 為 ρΗ8· O 的 50mM Tris-HCl+lmol/LNaCl ;配制方法將 500mL 的 O.1mol/ L的三羥 甲基氨基甲烷(Tris)溶液與292mL的O. lmol/L的鹽酸混勻后，加NaC158. 44g，加水稀釋至1L，過濾，即為緩沖液B ；
(3)反向CS柱層析分離將步驟(2)得到的初步純化產物加入8 10倍重量的水溶解，利用反向C8柱進行柱層析，檢測波長為214nm，設置96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B走基線平穩(wěn)后，進樣量為2mL，96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B洗脫4min，然后調節(jié)流動相B的比例從4 (v/V) %至60 (v/V) %線性梯度洗脫IOmin,洗脫流速一直保持在8mL/ min，收集主要峰，層析譜圖見圖2，60°C旋轉蒸發(fā)濃縮，凍干，得到牡蠣殼抗氧化肽產物；
其中，流動相A為I (v/v) %。CF3COOH水溶液，流動相B為CH30H。
實施例2 :抗氧化實驗。
1.材料及設備
實施例1制備得到的牡販殼肽；Pierce BCA蛋白定量試劑盒美國Thermo公司；二苯代苦味酰肼(DPPH) Alfa公司。BP211D電子天平德國Sartorious公司； SpectraMaxl90酶標儀美國AD公司；恒溫透視水槽，上海實驗儀器總廠；UV_1700分光光度儀，日本Shimadzu公司。
2.方法
2.1供試溶液制備
取上述實施例1制備的牡蠣殼肽，精密稱量，加蒸餾水配制成100 μ g/mL的供試溶液。
2. 2DPPH自由基清除能力測定
取供試品溶液ImL分別加入到干凈的IOmL具塞試管中，每管中再加入0. 6mmol/LDPPH甲醇溶液O. 5mL,然后以甲醇補充體積至5mL，30分鐘室溫避光反應后于517nm處測定吸光值A，空白組以等體積甲醇溶液代替DPPH溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和甲醇混合液空白調零。按下式計算
清除率SA(% ) = [1-(A1-Aj)/A0] X 100%
式中Aq為對照組吸光度，Ai為樣品組吸光度，Aj為空白組吸光度。
2. 3超氧陰離子自由基清除能力測定
采用鄰苯三酚自氧化法進行測定。量取50mmol/L、pH=8. 20的Tris-HCl緩沖液 4. 7mL,加入O.1mL的供試品溶液，置于25°C水浴保溫20分鐘，然后加入25°C預溫的3mmol/ L的鄰苯三酹溶液(用10mmol/LHCl配制)0. 2mL,迅速搖勻后倒入比色皿中，在319nm下每隔I分鐘測定吸光值一次，共反應9分鐘，用lOmmol/L HCl溶液為空白調零，對照組以等體積去離子水代替供試樣品。作吸光度隨時間變化曲線的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率V，按下式計算樣品對超氧陰離子的清除率。
清除率SA(% ) = [1-V1/V0] X 100%
式中V1為樣品組的吸光度隨時間的變化率，VO為空白對照組組吸光度隨時間的變化率。
2. 4羥自由基清除能力測定·
采用不同酶解液對Fenton體系產生的羥自由基清除率的體外實驗進行測定。 取O. 2mL的FeS04-EDTA混合液(10. OmmoI/L)于試管中，加人O. 5mL的2-脫氧核糖溶液 (10. OmmoI/L)和O. 6mL供試品溶液，用磷酸緩沖液(pH=7. 4,0. lmol/L)定容至1. 8mL，再加人0. 2mLH202 (10. OmoI/L)，混勻后置于37°C恒溫水浴中反應lh。然后加入2. 8%(w/w)三氯乙酸(TCA)溶液1. OmL，在4000rpm下離心20分鐘，取上清液2. OmL于另一支試管中，加入1.0% (w/w)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1. OmL,混勻后置沸水浴反應15分鐘,冷卻后稀釋5倍， 在532nm波長處測吸光度值。酶解液對羥自由基的清除效果用清除率(SA/% )表示，按下式計算
清除率SA(%) = [(Ac-As)/(Ac-A0)] X 100%
式中Ac為不加清除劑的吸光度，As為加入供試品后的吸光度，A0為空白的吸光度。
3、結果與討論
3.1具體實驗結果如表I所示
表I牡販殼肽的抗氧化能力(濃度100 μ g/mL, χ土SD，n=3)
權利要求
1.一種牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟(1)牡蠣殼肽的提取牡蠣殼粉碎，過6(Γ100目篩，加入8^10倍重量的水9(Γ100 回流加熱提取I小時，過濾，濾液濃縮，O. 45 μ m水膜濾過，再經凍干，得牡蠣殼肽凍干粉；(2)離子交換層析分離將步驟(I)得到的牡蠣殼肽凍干粉溶于緩沖液A中進行離子交換層析，進樣量為O. 5mL，流速為lmL/min，SOURCE 15Q強陰離子交換柱，檢測波長為214nm， 上樣完畢后繼續(xù)進100 (v/v) %緩沖液A2到3個柱床體積，洗至基線平穩(wěn)，再用50 (v/v) %緩沖液A與50 (v/v) %緩沖液B洗脫30min,流速為lmL/min,收集主要峰,然后濃縮,凍干,得到初步純化產物；其中，緩沖液 A 為 pH8. O 的 50mM Tris-HCl ;緩沖液 B 為 pH8. O 的 50mMTris-HCl+lmol/ LNaCl ；(3)反向CS柱層析分離將步驟(2)得到的初步純化產物加入8 10倍重量的水溶解， 利用反向C8柱進行柱層析，檢測波長為214nm，設置96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相 B走基線平穩(wěn)后，進樣量為2mL，96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B洗脫4min，然后調節(jié)流動相B的比例從4 (v/V) %至60 (v/V) %線性梯度洗脫IOmin,洗脫流速一直保持在8mL/ min，收集主要峰，濃縮，凍干，得到牡蠣殼抗氧化肽產物；其中，流動相A為I (v/v) %。CF3COOH水溶液，流動相B為CH30H。
2.根據權利要求1所述的牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，其特征在于，步驟(I)、(2)和(3)中的濃縮條件為60°C旋轉蒸發(fā)濃縮。
3.權利要求1或2的制備方法所制得的牡蠣殼抗氧化肽。
4.權利要求3所述的牡蠣殼抗氧化肽在抗氧化產品中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的抗氧化產品為抗氧化藥品、抗氧化保健品、抗氧化食品或抗氧化化妝品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，包括如下步驟(1)牡蠣殼肽的提取以牡蠣殼粉為原料，回流加熱提取后濾過，濃縮，凍干得牡蠣殼肽凍干粉；(2)離子交換層析分離將肽提取物通過SOURCE15Q強陰離子交換層析，收集主要峰，濃縮，凍干，得到初步純化產物；(3)反向柱層析分離將初步純化產物經反向C8柱層析分離，收集主要峰，濃縮，凍干，得到牡蠣殼抗氧化肽。本發(fā)明所得的抗氧化肽具有較強的清除自由基的能力，應用廣泛，具有顯著的社會和經濟效益。
文檔編號C07K1/18GK102993268SQ20121056669
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權日2012年12月24日
發(fā)明者邵江娟, 陳建偉, 王昱灃, 姚忠, 吳昊, 陳韜 申請人:南京中醫(yī)藥大學