專利名稱：一種山綠茶中所含總?cè)萍岸嗨豠的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥有效部位及單體的提取富集工藝及其應(yīng)用，特別是涉及山綠茶總?cè)坪投嗨谹單體提取富集方法及其心血管活性，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心血管疾病是臨床常見病癥，今年來隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、生活水平的不斷提高，特別是飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)性的改變，使得心血管疾病在全世界的發(fā)生率和死亡率不斷提高。動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈硬化的一種，表現(xiàn)為大、中動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)含膽固醇、類脂肪 等的黃色物質(zhì)，多由脂肪代謝紊亂、神經(jīng)血管功能失調(diào)引起。由動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心腦血管疾病已經(jīng)成為現(xiàn)代社會(huì)中最重要的致死和致殘的原因。目前，他汀類是臨床上降脂治療的首選藥物，關(guān)于中藥用于抗動(dòng)脈粥樣硬化藥效評價(jià)的報(bào)道較少，也尚無單體成分開發(fā)的這類藥物上市。山綠茶為冬青科冬青屬植物海南冬青Ilex hainanensis Merr.的干燥葉。具有清熱解毒，消腫止痛，活血通脈的功效。用于降血壓，降血脂，降膽固醇，冠心病，腦血管意外所致的偏癱，風(fēng)熱感冒，肺熱咳嗽，喉頭水腫，扁桃體炎，痢疾等癥，為廣西少數(shù)民族民間草藥，使用歷史悠久，已收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1990年版)。植物化學(xué)研究表明，山綠茶的主要化學(xué)成分為三萜類、黃酮類等成分。現(xiàn)已分離得到的單體化合物主要有冬青素A、熊果酸、齊墩果酸、α -香樹脂素、β -香樹脂素、冬青皂苷Al等。同時(shí)，三萜和冬青素A也是山綠茶主要的生物活性成分，冬青素A的結(jié)構(gòu)式如圖I所
/Jn ο藥理研究表明，山綠茶具有顯著的降血壓和降血脂的作用，且未見明顯毒副反應(yīng)。三萜類是山綠茶的主要活性部位，具有顯著的抗菌、抗炎以及肝臟保護(hù)作用。而冬青素A是山綠茶中主要的三萜類化合物,在山綠茶中的含量可以達(dá)到5 %以上，也具有明顯的抗菌作用，且對肝癌誘導(dǎo)的肝功能損傷具有明顯的保護(hù)作用。目前尚無山綠茶總?cè)坪投嗨谹用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的研究報(bào)道。本發(fā)明提供了山綠茶總?cè)坪投嗨谹的提取富集方法，并經(jīng)過藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了山綠茶總?cè)坪投嗨谹的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從山綠茶中得到有效成分提取物，即山綠茶總?cè)坪陀行С煞謫误w，即冬青素A的方法以及山綠茶有效成分提取物和單體在治療心血管疾病方面的應(yīng)用，具體是在治療動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用。本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題I、提取富集有效成分提取物，即山綠茶總?cè)频姆椒ㄓ幸韵虏襟E原料山綠茶用70% -95%乙醇回流提取，提取液濃縮離心后得上清液和沉淀部分；沉淀部分以30% -40%乙醇混懸，再以石油醚萃取，下層溶液減壓濃縮干燥后得總?cè)啤Ｌ崛「患偠淖顑?yōu)化技術(shù)方案為a.取原料山綠茶，加山綠茶12倍量(v/w)、濃度為90%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取2次，每次2h;b.合并提取液,濃縮得稠浸膏，以4000r/min離心IOmin,分離得到上清液和沉淀部分；c.將沉淀部分以30% -40%乙醇混懸，再以石油醚(3 :1，v/v)萃取2次脫色，下層溶液減壓濃縮后得浸膏，自然晾干，粉碎，過60目篩，得山綠茶總?cè)啤?
2、提取富集山綠茶有效成分單體，即冬青素A的方法有以下步驟原料山綠茶用70% -95%乙醇回流提取，提取液減壓回收蒸干，以水溶解；加入
5%的氫氧化鉀水解，有機(jī)溶劑萃取，有機(jī)溶劑層回收至干，上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇等梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶劑，得到冬青素A單體。提取富集山綠茶冬青素A單體的最優(yōu)化技術(shù)方案為a.取原料山綠茶，加山綠茶12倍量(v/w)、濃度為90%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取2次，每次2h，合并提取液，減壓回收蒸干，以水溶解；b.加入10%鹽酸，加熱回流3h，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層回收至干；c.取浸膏上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶齊U，得到冬青素A單體。周園等報(bào)道了毛冬青中冬青素A的制備方法，本方法與之相比，其優(yōu)勢在于由于山綠茶中除了含有冬青素A外，還含有大量的皂苷類化合物，如冬青皂苷Al，
6‘-0-乙酰冬青皂苷Al等，其中冬青皂苷Al在藥材中的含量達(dá)到3-4%，而這些皂苷類化合物都是以冬青素A為苷元的。本方法通過加入酸或堿，進(jìn)行水解，使這些皂苷類化合物都水解轉(zhuǎn)化為冬青素A，進(jìn)而極大地提高了冬青素A單體的得率(見具體實(shí)施例11)，并且該步驟的增加并不增加本方法的成本。本發(fā)明提取富集山綠茶有效成分提取物及有效成分單體的方法，在提取過程中有選擇性的富集活性成分，去除大量雜質(zhì)，得到的產(chǎn)品采用UV法測定的總?cè)坪看笥?0%, HPLC法測定冬青素A純度達(dá)到95%，同時(shí)，本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性好，從而保證了療效的穩(wěn)定；原料有效成分轉(zhuǎn)移率高，成本低，操作簡便，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了山綠茶有效成分提取物及有效成分單體在治療心血管疾病，尤其是在治療動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例Ia.取原料山綠茶5kg，加25L70%的甲醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取I次，每次
I.5h ；b.合并提取液,濃縮得稠浸膏，以4000r/min離心IOmin,分離得到上清液和沉淀部分；c.將沉淀部分以30%-40%乙醇混懸，再以石油醚(5 l,v/v)萃取3次脫色，下層溶液減壓濃縮后得浸膏，自然晾干，粉碎，過60目篩，得山綠茶總?cè)?37g，含量為50.8%。實(shí)施例2a.取原料山綠茶5kg，加35L75%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取I次，每次3h ；b.合并提取液,濃縮得稠浸膏，以4000r/min離心IOmin,分離得到上清液和沉淀部分；c.將沉淀部分以30%-40%乙醇混懸，再以石油醚(3 l,v/v)萃取2次脫色，下層溶液減壓濃縮后得浸膏，自然晾干，粉碎，過60目篩，得山綠茶總?cè)?46g，含量為53.6%。實(shí)施例3
a.取原料山綠茶5kg，加50L85%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取2次，每次
2.5h ；b.合并提取液,濃縮得稠浸膏，以4000r/min離心IOmin,分離得到上清液和沉淀部分；c.將沉淀部分以30% -40%乙醇混懸，再以二氯甲烷(6:1，v/v)萃取3次脫色，下層溶液減壓濃縮后得浸膏，自然晾干，粉碎，過60目篩，得山綠茶總?cè)?62g，含量為54. 7%。實(shí)施例4a.取原料山綠茶5kg，加55L90%的甲醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取3次，每次
0.5h ；b.合并提取液,濃縮得稠浸膏，以4000r/min離心IOmin,分離得到上清液和沉淀部分；c.將沉淀部分以30%-40%乙醇混懸，再以石油醚(4 l,v/v)萃取2次脫色，下層溶液減壓濃縮后得浸膏，自然晾干，粉碎，過60目篩，得山綠茶總?cè)?70g，含量為50.2%。實(shí)施例5a.取原料山綠茶5kg，加60L95%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取2次，每次2h ；b.合并提取液,濃縮得稠浸膏，以4000r/min離心IOmin,分離得到上清液和沉淀部分；c.將沉淀部分以30 % -40 %乙醇混懸，再以氯仿(3 :1，v/v)萃取2次脫色，上層溶液減壓濃縮后得浸膏，自然晾干，粉碎，過60目篩，得山綠茶總?cè)?80g，含量為51.6%。實(shí)施例6a.取原料山綠茶5kg，加25L70%的甲醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取I次，每次
1.5h，合并提取液，減壓回收蒸干，以水溶解；b.加入1%鹽酸，加熱回流4h，加入石油醚萃取，石油醚層回收至干；c.取浸膏上硅膠柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶劑，得到冬青素A單體120g,純度為90%。實(shí)施例7a.取原料山綠茶5kg，加35L75%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取3次，每次3h，合并提取液，減壓回收蒸干，以水溶解；
b.加入5%硫酸，加熱回流3h，加入氯仿萃取，氯仿層回收至干；c.取浸膏上硅膠柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶劑，得到冬青素A單體147g，純度為92 %。實(shí)施例8a.取原料山綠茶5kg，加50L85%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取2次，每次O. 5h，合并提取液，減壓回收蒸干，以水溶解；b.加入10%鹽酸，加熱回流2h，加入二氯甲烷萃取，氯仿層回收至干；c.取浸膏上硅膠柱，石油醚-丙酮梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶劑，得到冬青素A單體102g,純度為91 %。實(shí)施例9a.取原料山綠茶5kg，加60L90%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取I次，每次2h，合并提取液，減壓回收蒸干，以水溶解；b.加入1%氫氧化鈉，加熱回流2. 5h，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層回收至干；c.取浸膏上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶齊U，得到冬青素A單體153g，純度為93%。實(shí)施例10a.取原料山綠茶5kg，加40L90%的甲醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取3次，每次
2.5h，合并提取液，減壓回收蒸干，以水溶解；b.加入10%氫氧化鉀，加熱回流3h，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層回收至干；c.取浸膏上硅膠柱，石油醚-丙酮梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶劑，得到冬青素A單體123g,純度為91 %。實(shí)施例11對已報(bào)道方法及本發(fā)明中方法進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)本發(fā)明中方法a.取原料山綠茶5kg，加60L90%的乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取I次，每次2h，合并提取液，減壓回收蒸干，以水溶解；b.加入5%氫氧化鉀，加熱回流2. 5h，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層回收至干；c.取浸膏上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶齊U，得到冬青素A單體160g，純度為92%。已報(bào)道方法a.取原料山綠茶5kg，加60L甲醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取I次，每次2h，合并提取液，減壓回收蒸干，以水溶解；b.加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層回收至干；c.取浸膏上硅膠柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶劑，得到冬青素A單體77. 5g，純度為90 %。實(shí)施例12總?cè)萍岸嗨谹抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理實(shí)驗(yàn)載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠30只，雌雄各半，體重20g_30g，由南京大學(xué)模式動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按3只一籠分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在22±2°C,相對濕度50±5%，明暗各12小時(shí)，自由飲水、進(jìn)食。小鼠經(jīng)I周適應(yīng)性飼養(yǎng)之后隨機(jī)分為正常組、動(dòng)脈粥樣硬化模型組、山綠茶總?cè)毥M(triterpenoids-enriched extract, TEE)、冬青素A組(Ilexgenin A, IA)和陽性對照組(辛伐他汀組，Simvastatin),每組6只，雌雄各3只。正常對照組小鼠給以普通飼料，其余四組小鼠給以高脂飼料(78. 85%普通飼料+21%脂肪+0. 15%膽固醇)，其中三個(gè)給藥組高脂飼料中分別含有TEE(200mg/kg)、IA(10mg/kg)和辛伐他汀(4mg/kg)。小鼠喂養(yǎng)12周后，眼眶靜脈取血進(jìn)行各藥理學(xué)指標(biāo)的檢測，并分離胸主動(dòng)脈進(jìn)行H&E染色觀察各組小鼠主動(dòng)脈瓣形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在血脂方面，與正常對照組比較，模型組總膽固醇(TC)、甘油三酯(TGs)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著升高(P < O. 01)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)沒有顯著變化；辛伐他汀能顯著降低血清TC、TGs, LDL-C (P < O. 01)，但對HDL-C水平?jīng)]有顯著影響；TEE組血脂水平?jīng)]有顯著變化，而經(jīng)過IA治療的ApoE基因敲除小鼠與模型組比較，TGs水平顯著下降(P <0.01)，且此作用與辛伐他汀治療組無顯著區(qū)別。(表I)。表I山綠茶總?cè)坪投嗨谹對動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血清中藥理學(xué)指標(biāo)的影響
指標(biāo)正常對照組模型組TEE組IA組辛伐他汀組
TC, mM3.54±0.7217.47± 1.52##16.13 ± 1.4214.55 ± 1.4513.39± 1.31**
TGs，mM0.95 士 0.223.24*0.32##3.48 ±0.352.67 ±0.54**2.46 ±0.43*·
HDL-QmM 1.37 ±0.34 1.28 ±0.481.57 ± 0.731.53 ±0.311.46 ±0.49
LDL-C, mM0.62±0.538.47±1.35##8.52±0.687.67±0.384.56±0.32** 結(jié)果以平均值土 SEM表示；##P <0.01，與正常對照組相比ΓΡ <0.01，與模型組相比；Δ ΔΡ < O. 01，與辛伐他汀組相比。主動(dòng)脈瓣切片Η&Ε染色形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果顯示，模型組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊嚴(yán)重，可見血管內(nèi)膜出現(xiàn)纖維帽以及脂質(zhì)核心，脂質(zhì)核心伴隨巨噬細(xì)胞浸潤。斑塊面積與管腔比值為18. 42% ±2. 63%，與正常組相比P <0.01。給藥組均顯著降低了這一比值，其中總?cè)平M為12. 56% ± I. 37% ;冬青素A治療組為10. 36% ±2. 51 辛伐他汀治療組為9.94%±3. 41%，與模型組比較P值均小于O. 05，各給藥組間無顯著差異(圖2)。結(jié)果表明，山綠茶總?cè)坪投嗨谹具有不同程度的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，其中冬青素A抗動(dòng)脈粥樣硬化作用尤為顯著，具有重要的潛在產(chǎn)業(yè)化開發(fā)價(jià)值。


圖I冬青素A結(jié)構(gòu)2各組小鼠胸主動(dòng)脈瓣橫切面斑塊面積與管腔比值。Model，模型組；TTE，山綠茶總?cè)毥M；IA,冬青素A組；Simvastatin,辛伐他汀組。結(jié)果以平均值土SEM表示。*P< O. 05，與模型組相比。
權(quán)利要求
1.一種山綠茶有效成分提取物，其特征是提取物中包括的主要活性成分是三萜類成分，總?cè)频暮繛?0-70%。
2.—種山綠茶有效成分單體，其特征是冬青素A單體的含量在90%以上。
3.一種制備權(quán)利I和2所述的山綠茶有效成分提取物及單體的方法，其特征是經(jīng)過以下提取方法獲得 原料山綠茶用70% -95%低級醇回流提取，提取液濃縮，離心后得上清液和沉淀部分；沉淀部分以30% -40%低級醇混懸，再以低極性有機(jī)溶劑萃取除去色素，下層溶液減壓濃縮干燥后得山綠茶有效成分提取物，即山綠茶總?cè)疲? 低級醇提取液濃縮后，加入1% -10%的酸或堿液，加熱回流，加入低極性有機(jī)溶劑萃取，有機(jī)溶劑萃取物經(jīng)硅膠柱層析，有機(jī)溶劑梯度洗脫，得到山綠茶有效成分單體，即冬青素A單體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的山綠茶有效成分提取物及單體的制備方法，其特征是所述的提取液優(yōu)選5-12倍量的濃度為85% -95%的乙醇水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的山綠茶有效成分提取物的方法，其特征是所述的萃取液可以是石油醚、乙醚、氯仿、環(huán)己烷或二氯甲烷。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的山綠茶中有效成分單體的方法，其特征是所述的酸或堿液可以是鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸或氫氧化鈉、氫氧化鉀；其濃度為2% -10%的酸或堿液。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的山綠茶中有效成分單體的方法，其特征是所述的萃取液可以是石油醚、氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的山綠茶中有效成分單體的方法，其特征是硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇等梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶劑，得到冬青素A單體。
9.一種權(quán)利要求I和2中所述的山綠茶有效成分提取物和單體在治療心血管疾病方面的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的山綠茶有效成分提取物和單體在治療心血管疾病方面的用途，其特征是所述的心血管疾病為動(dòng)脈粥樣硬化。
全文摘要
一種提取富集山綠茶總?cè)坪蛦误w冬青素A的方法，其特征是提取的步驟為原料山綠茶用50％-95％乙醇回流提取，提取液濃縮離心后得上清液和沉淀部分，沉淀部分以30％-40％乙醇混懸，再以石油醚萃取，下層溶液減壓濃縮干燥后得總?cè)疲淮送?，將上述乙醇提取液減壓回收蒸干，以水溶解，加酸水解，有機(jī)溶劑萃取，回收至干，上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫溶劑，得到冬青素A。本發(fā)明的提取富集方法，得到的產(chǎn)品總?cè)坪砍^50％，單體冬青素A純度高，同時(shí)本方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，原料有效成分轉(zhuǎn)移率高，成本低，操作簡便，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，本發(fā)明還涉及山綠茶總?cè)坪投嗨谹在治療心血管疾病方面，特別是動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用，具有潛在的開發(fā)價(jià)值。
文檔編號C07J63/00GK102872168SQ201210397479
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者楊杰, 崔偉曦, 王強(qiáng), 陳筱清, 談景福, 白敏 , 李晶晶 申請人:中國藥科大學(xué)