專利名稱：一種蘋果總?cè)频闹苽浞椒坝迷摲椒ㄖ苽涞奶O果總?cè)频闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥及保健食品技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種活性三萜物質(zhì)的制備方法及用該方法制備的產(chǎn)品。

背景技術(shù)：
長期以來，蘋果大量用于鮮食和果汁生產(chǎn)，隨著我國果汁加工業(yè)的迅猛發(fā)展，蘋果汁加工的主要副產(chǎn)品-蘋果皮和蘋果渣大量產(chǎn)生，而它們正是活性三萜物質(zhì)的良好來源。但是目前這些資源除少量的被加工成飼料和用于提取蘋果多酚外，絕大部分都被當做垃圾扔掉，尤其是生產(chǎn)旺季，大量的蘋果皮和蘋果渣堆積腐爛，這不僅造成資源的巨大浪費，還嚴重污染了環(huán)境，因此充分利用這些廢棄資源不僅具有良好的經(jīng)濟效益還具有社會效益。
目前已報導的蘋果總?cè)祁惢衔锏奶崛》椒ㄓ谐曁崛》?，此法提取總?cè)祁惢衔锬壳拔茨軕?yīng)用于大批量生產(chǎn)，同時此法所選用的化學溶劑相對較多，其應(yīng)用受到一定的限制。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述背景技術(shù)的狀況而提供一種工藝簡單且大批量制備可行的蘋果總?cè)频闹苽浞椒ê陀迷摲椒ǐ@得的高品質(zhì)的蘋果總?cè)??！?br> 本發(fā)明方法采用的技術(shù)方案是以蘋果為原料通過提取和純化制備蘋果總?cè)?。其特征在于純化是對蘋果提取物依次進行 1、大孔樹脂吸附和解析； 2、不同濃度的洗脫溶劑洗脫； 3、收集富含三萜類化合物的洗脫液。
其中大孔樹脂可以是極性、中等極性、弱極性或非極性大孔樹脂；洗脫溶劑包含有無水或含水乙醇、無水或含水甲醇。
本發(fā)明方法的具體步驟可以是 一、提取 1、對原料用濃度≥0的醇液進行回流提取，收集提取液； 2、對提取液進行減壓濃縮，獲取蘋果提取物； 其中，醇液包含有無水或含水乙醇、無水或含水甲醇。
二、純化 1、用醇液對蘋果提取物進行溶解，并將所得溶解液滴加到裝有大孔樹脂的柱床中后進行靜止吸附； 2、用水和不同濃度的醇液對靜止吸附樣品后的大孔樹脂柱進行梯度洗脫分離，收集富含三萜類化合物的洗脫液； 3、對上步收集到的洗脫液進行濃縮，獲取蘋果總?cè)啤?br> 為了進一步提高蘋果總?cè)频男阅芎唾|(zhì)量 1、提取時 1)醇液選擇濃度為70％的乙醇溶液； 2)醇液和原料的重量比值在3-10的范圍內(nèi)進行選擇； 2、純化時 1)用濃度95％的乙醇溶液對蘋果提取物進行加熱超聲溶解； 2)蘋果提取物溶解液滴加到大孔樹脂柱中后的靜止吸咐時間≥2小時； 3)對靜止吸附樣品后的大孔樹脂柱進行梯度洗脫的醇液選擇為乙醇溶液，其組成梯度的濃度選擇為50％、70％、95％，且每一濃度洗脫4個保留體積； 4)收集95％乙醇濃度的洗脫液。
本發(fā)明的產(chǎn)品是根據(jù)本發(fā)明的方法制得的，本發(fā)明的產(chǎn)品中的主要成分含量為總?cè)啤?5％；烏蘇酸≥44％；齊墩果酸≥6％。
經(jīng)高效液相色譜分析利用本發(fā)明方法制備的蘋果總?cè)瓢ǘ喾N三萜類成分，其中尤以烏蘇酸(Ursolic acid)和齊墩果酸(Oleanolic acid)兩個三萜類成分為主要成分，兩者的含量之和在蘋果總?cè)浦写笥?0％。利用比色法對本發(fā)明制備的蘋果總?cè)七M行含量測定，以烏蘇酸為對照品，其總?cè)坪看笥?5％。
經(jīng)DPPH烷自由基測定方法測試表明本發(fā)明的產(chǎn)品具有很強的清除烷自由基能力，具有抗氧化作用；經(jīng)MTT法測試表明本發(fā)明的產(chǎn)品具有很強的抑制人癌細胞增殖活性，具有預(yù)防和治療癌癥作用；不僅如此，還具有較強的抗炎、抗過敏、抗糖尿病、降脂護肝作用?？蓮V泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品及化妝品等領(lǐng)域。
本發(fā)明不僅工藝簡單、可大規(guī)模生產(chǎn)而且可直接利用蘋果產(chǎn)業(yè)的廢棄原料(蘋果皮和蘋果渣)，從中提取蘋果總?cè)?，變廢為寶。



圖1為本發(fā)明所述蘋果總?cè)频腍PLC圖譜； 圖2為相同條件下烏蘇酸的HPLC圖譜； 圖3為相同條件下齊墩果酸的HPLC圖譜； 圖4為本發(fā)明所述蘋果總?cè)祁惢衔锏腍PLC指紋圖譜。

具體實施例方式 以下通過具體實施例來進一步闡述本發(fā)明。
實施例一 一、制備蘋果總?cè)? 取未經(jīng)加工處理的新鮮紅富士蘋果皮，經(jīng)充分清洗干凈后，置于70℃鼓風干燥箱中充分干燥后用3倍量的70％乙醇回流提取，提取4次，每次提取2h，合并提取液，減壓濃縮得蘋果浸膏。取浸膏3.0g用20ml 95％乙醇加熱超聲溶解，以5ml/min的速度將樣品溶液滴加在已裝好的D-101大孔樹脂上，靜止吸附2h，依次用水、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇進行梯度洗脫分離，每個比例洗脫4個保留體積，收集95％乙醇洗脫液濃縮得所述蘋果總?cè)?.14g。
二、含量測定及指紋圖譜分析 一)含量測定 1、總?cè)坪繙y定 1)溶液配制 a、5％香草酸-冰醋酸溶液精確稱取香草醛0.5g，迅速用適量冰醋酸溶解并轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，冰醋酸定溶，搖勻，以備當日使用。
b、烏蘇酸對照品溶液精密稱取烏蘇酸10.2mg，色譜甲醇定容于25ml容量瓶中，即得0.408mg/ml的烏蘇酸標準溶液。
c、樣品溶液準確稱取實施例一中所得總?cè)祁惢衔?0.0mg，用甲醇定容于25ml容量瓶中，即得0.40mg/ml的樣品溶液。
2)測定含量 使用分光光度法測定樣品中總?cè)坪烤芪跆K酸對照品溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8ml，分別加入新鮮配制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml和1ml高氯酸，搖勻，在60℃恒溫水浴下反應(yīng)20min后，冰水冷卻，再加入5ml冰醋酸，搖勻，以試劑空白為參比，在550nm波長下測定體系的吸光度，以烏蘇酸對照品的質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，作圖得標準工作曲線，測得總?cè)频暮繛?3.0％±4.2％。
2、主要成分烏蘇酸和齊墩果酸含量測定 精密稱取實施例一中所得總?cè)祁惢衔?2.5mg，用流動相(甲醇∶水∶三氟乙酸＝900∶100∶1)溶解定容到25ml容量瓶中，過0.45μm微孔濾膜，即得所述總?cè)祁惢衔锶芤海? 取烏蘇酸對照品12.5mg，以流動相(甲醇∶水∶三氟乙酸＝900∶100∶1)溶解定容，制成0.5mg/ml的標準品溶液；將其配成系列0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mg/ml的梯度溶液，制備標準曲線。
分別精密吸取上述梯度標準品溶液和總?cè)祁惢衔锶芤?0μl，參照2010版《中國藥典》一部附錄中規(guī)定的高效液相含量測定方法，注入高效液相色譜儀進行色譜分析，測定條件為色譜柱

100RP-100e(5μm)；檢測波長210nm；流動相CH3OH-H2O-CF3COOH＝900∶100∶1；流速0.6ml/min；柱溫40℃。記錄色譜圖，計算烏蘇酸含量為45.1％。
取齊墩果酸對照品2.6mg，以流動相溶解定容，制成0.26mg/ml的標準品溶液；將其配成系列0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg/ml的梯度溶液，制備標準曲線。
分別精密吸取上述梯度標準品溶液和總?cè)祁惢衔锶芤?0μl，參照2010版《中國藥典》一部附錄中規(guī)定的高效液相含量測定方法，用高效液相色譜儀進行色譜分析，測定條件色譜柱

100RP-100e(5μm)；檢測波長210nm；流動相CH3OH-H2O-CF3COOH＝900∶100∶1；流速0.6ml/min；柱溫40℃。記錄色譜圖，計算齊墩果酸含量為6.5％。
結(jié)果表明本實施例制備的蘋果總?cè)浦袨跆K酸和齊墩果酸的總含量占51.6％。
二)指紋圖譜分析 樣品的指紋圖譜分析條件為色譜柱

100RP-100e(5μm)；檢測波長210nm；流動相CH3OH-H2O-CF3COOH＝800∶200∶1；流速0.6ml/min；柱溫40℃。
蘋果總?cè)频闹讣y圖譜見附圖4。
三、抗氧化活性測試(對烷自由基DPPH·影響試驗) 一)溶液及樣品配置 1、DPPH儲備液稱5mg DPPH，用甲醇溶解至濃度約100mg/L。
2、樣品用DMSO溶解成不同濃度 二)實驗過程 1、取995μl DPPH儲備液，加入5μl樣品溶液，混勻，室溫避光20min后在546nm測OD值。
2、調(diào)零組以甲醇+DMSO代替DPPH+藥物 3、空白組以甲醇代替DPPH 4、對照組以DMSO代替藥物 5、
三)實驗結(jié)果 實驗結(jié)果表明，本實施例制備的蘋果總?cè)凭哂泻軓姷那宄樽杂苫鵇PPH·的活性。其中的烏蘇酸和齊墩果酸均表現(xiàn)出很強的作用，蘋果總?cè)坪蜑跆K酸清除烷自由基DPPH·的活性強于槲皮素。
四、抗癌活性測試 一)MTT法 在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200μl(含有2.5×104個腫瘤細胞)含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基的細胞懸液，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，實驗組分別加入最終濃度100、50、25、12.5和6.25μg/ml實施例一中所述的化合物，對照組則加入等體積溶劑，每組4孔，重復4次。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天后，棄去上清液，加入200μl/孔新鮮配制的含50mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液，加入200μl DMSO，震蕩混勻后，在酶標儀上以波長為492nm，參比波長為450nm測定OD值。計算結(jié)果并利用CalcuSyn軟件計算出IC50值。
按下式計算藥物對腫瘤細胞生長得抑制率
二)、實驗結(jié)果
結(jié)果表明，本實施例制備的蘋果總?cè)茖θ烁伟┘毎鸋epG2、人乳腺癌細胞MCF-7及人結(jié)腸癌細胞Caco-2等增殖有很強的抑制作用。其中的烏蘇酸和齊墩果酸均表現(xiàn)出很強的作用，他們的抑制作用比順鉑更強或接近。
實施例二 一、制備蘋果總?cè)? 新鮮紅富士蘋果榨汁后的蘋果渣，放于70℃鼓風干燥箱中充分干燥后用5倍量的70％甲醇回流提取，提取3次，每次提取2h，合并提取液，減壓濃縮得蘋果浸膏。取浸膏5.0g用50ml 95％乙醇加熱超聲溶解，以5ml/min的速度將樣品溶液滴加在已裝好的D-101大孔樹脂上，靜止吸附2h，依次用水、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇進行梯度洗脫分離，每個比例洗脫4個保留體積，收集95％乙醇洗脫液濃縮得所述總?cè)祁惢衔锍煞?.19g。
二、含量測定 1、總?cè)坪繙y定 總含量測定過程同實施例1，測定總?cè)频暮繛?1.2％±6.0％。
2、主要成分烏蘇酸和齊墩果酸含量測定 精密稱取實施例二中所得總?cè)祁惢衔?2.7mg，用流動相(甲醇∶水∶三氟乙酸＝900∶100∶1)溶解定容到25ml容量瓶中，過0.45μm微孔濾膜，即得所述總?cè)祁惢衔锶芤骸?br> 烏蘇酸和齊墩果酸的含量測定過程同實施例1，測得烏蘇酸含量為44.7％，齊墩果酸含量為6.1％。
結(jié)果表明本實施例制備的蘋果總?cè)浦袨跆K酸和齊墩果酸的總含量占50.8％. 三、抗氧化活性測試(對烷自由基DPPH·影響試驗) 按照實施例一中的抗氧化測定方法，對實施例二中的蘋果總?cè)萍捌渲饕煞譃跆K酸和齊墩果酸進行了測定，測定結(jié)果如下 實驗結(jié)果表明，本實施例制備的蘋果總?cè)凭哂泻軓姷那宄樽杂苫鵇PPH·的活性。其中的烏蘇酸和齊墩果酸均表現(xiàn)出很強的作用，蘋果總?cè)坪蜑跆K酸清除烷自由基DPPH·的活性強于槲皮素。
四、抗癌活性測試 按照實施例一中的抗癌活性測定方法，對實施例二中的蘋果總?cè)萍捌渲饕煞譃跆K酸和齊墩果酸進行了測定，測定結(jié)果如下
實驗結(jié)果表明，本實施例制備的蘋果總?cè)茖θ烁伟┘毎鸋epG2、人乳腺癌細胞MCF-7及人結(jié)腸癌細胞Caco-2等增殖有很強的抑制作用。其中的烏蘇酸和齊墩果酸均表現(xiàn)出很強的作用，他們的抑制作用比順鉑更強或接近。
實施例三 一、制備蘋果總?cè)? 取未經(jīng)加工處理的紅富士蘋果皮，經(jīng)充分清洗干凈后，放于70℃鼓風干燥箱中充分干燥后用10倍量的70％乙醇回流提取，提取3次，每次提取2h，合并提取液，減壓濃縮得蘋果浸膏。取浸膏2.36g用20ml 95％乙醇加熱超聲溶解，以5ml/min的速度將樣品溶液滴加在已裝好的LXAB-8大孔樹脂上，靜止吸附2h，依次用水、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇進行梯度洗脫分離，每個比例洗脫4個保留體積，收集95％乙醇洗脫液濃縮得所述總?cè)祁惢衔锍煞?.15g。
二、含量測定 1、總?cè)坪繙y定 總含量測定過程同實施例1，測定總含量為93.5％±5.1％。
2、主要成分烏蘇酸和齊墩果酸含量測定 精密稱取實施例三中所得總?cè)祁惢衔?2.7mg，用流動相(甲醇∶水∶三氟乙酸＝900∶100∶1)溶解定容到25ml容量瓶中，過0.45μm微孔濾膜，即得所述總?cè)祁惢衔锶芤海? 烏蘇酸和齊墩果酸的含量測定過程同實施例1，測得烏蘇酸含量為46.7％，齊墩果酸含量為6.2％。
結(jié)果表明本實施例制備的蘋果總?cè)浦袨跆K酸和齊墩果酸的總含量占52.9％。
三、抗氧化活性測試(對烷自由基DPPH·影響試驗) 按照實施例一中的抗氧化測定方法，對實施例三中的蘋果總?cè)萍捌渲饕煞譃跆K酸和齊墩果酸進行了測定，測定結(jié)果如下 實驗結(jié)果表明，本實施例制備的蘋果總?cè)凭哂泻軓姷那宄樽杂苫鵇PPH·的活性。其中的烏蘇酸和齊墩果酸均表現(xiàn)出很強的作用，蘋果總?cè)坪蜑跆K酸清除烷自由基DPPH·的活性強于槲皮素。
4、抗癌活性測試 按照實施例一中的抗癌活性測定方法，對實施例三中的蘋果總?cè)萍捌渲饕煞譃跆K酸和齊墩果酸進行了測定，測定結(jié)果如下
實驗結(jié)果表明，本實施例制備的蘋果總?cè)茖θ烁伟┘毎鸋epG2、人乳腺癌細胞MCF-7及人結(jié)腸癌細胞Caco-2等增殖有很強的抑制作用。其中的烏蘇酸和齊墩果酸均表現(xiàn)出很強的作用，他們的抑制作用比順鉑更強或接近。
權(quán)利要求
1.一種蘋果總?cè)频闹苽浞椒ǎ蕴O果為原料進行提取和純化，其特征在于
所述的純化是對蘋果提取物依次進行
1)大孔樹脂吸附和解析；
2)不同濃度的洗脫溶劑洗脫；
3)收集富含三萜類的化合物的洗脫液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蘋果總?cè)频闹苽浞椒?，其特征在?br> 1)所述提取的步驟是
a、對原料用濃度≥0的醇液進行回流提取，收集提取液；
b、對提取液進行濃縮，獲取蘋果提取物；
2)所述純化的步驟是
a、用醇液對蘋果提取物進行溶解并將所得溶解液滴加到裝有大孔樹脂的柱床中進行靜止吸附；
b、用水和不同濃度的醇液對靜止吸附樣品后的大孔樹脂柱進行梯度洗脫分離，收集富含三萜類化合物的洗脫液；
c、對上步收集到的洗脫液進行濃縮，獲取蘋果總?cè)啤?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種蘋果總?cè)频闹苽浞椒?，其特征在?br> 1)所述的提取中
a、醇液為濃度70％的乙醇溶液；
b、醇液和原料的重量比值為3-10；
2)所述的純化中
a、用濃度95％的乙醇對蘋果提取物進行加熱超聲溶解；
b、蘋果提取物溶解液滴加到大孔樹脂柱中后的靜止吸咐時間≥2小時；
c、對靜止吸附樣品后的大孔樹脂柱進行梯度洗脫的醇液為乙醇溶液，其組成梯度的濃度分別為50％、70％、95％，且每一濃度洗脫4個保留體積；
d、收集95％乙醇濃度的洗脫液。
4.一種利用權(quán)利要求1所述方法制備的蘋果總?cè)?，其特征在于主要成分含?br> 1)總?cè)啤?5％；
2)烏蘇酸≥44％；
3)齊墩果酸≥6％。
全文摘要
本發(fā)明為一種蘋果總?cè)频闹苽浞椒坝迷摲椒ㄖ苽涞漠a(chǎn)品。以蘋果為原料，采用醇或含水醇為提取溶劑，提取的浸膏經(jīng)大孔樹脂純化，得到總?cè)坪看笥?5％的蘋果總?cè)疲渲兄饕煞譃闉跆K酸和齊墩果酸，兩者的含量之和經(jīng)HPLC檢測大于50％。本發(fā)明具有制備工藝簡單、可大規(guī)模制備且總?cè)坪扛叩葍?yōu)點。本發(fā)明制備的蘋果總?cè)破焚|(zhì)優(yōu)良，具有很強的抑制人癌細胞增殖活性，具有預(yù)防和治療癌癥作用和較強的抗炎、抗過敏、抗糖尿病、降脂護肝作用?？蓮V泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品等領(lǐng)域。本發(fā)明可直接以蘋果皮和蘋果渣為原料，是典型的利廢環(huán)保產(chǎn)品。
文檔編號A61K131/00GK101810696SQ20101016352
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者何祥久, 胡慧, 吳意軒 申請人:武漢大學