專利名稱：一種Cdc42抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化合物，具體地涉及一種Cdc42抑制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞分裂周期蛋白Cdc42是小G蛋白的Rho GTP酶家族的一個亞類，是許多細(xì)胞生物學(xué)功能的重要調(diào)控蛋白。首次在Saccharomyces cerevisiae中發(fā)現(xiàn),參與細(xì)胞極化,隨后認(rèn)識到其在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞的胞吞運輸途徑、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中都發(fā)揮著重要作用。與多數(shù)GTP酶一樣，通過⑶P交換為GTP結(jié)合實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活Cdc42。Rho GTP酶家族的這種核苷酸限制型構(gòu)象之間的循環(huán)由3類重要蛋白調(diào)節(jié)鳥嘌呤交換因子(GEF)，催化⑶P的釋放和GTP的結(jié)合；GTP酶激活蛋白(GAP)，作為負(fù)向調(diào)節(jié)因子加速Rho GTP酶的水解，使Rho GTP酶由活性狀態(tài)變?yōu)闊o活性狀態(tài)；OTP解離抑制因子(⑶I)，阻止⑶P從Rho GTP酶上分離，抑制Rho GTP酶活性。近年的研究揭示Cdc42的異?；钚詮V泛參與了包括腫瘤和神經(jīng)退行性疾病等人·類疾病的病理生理。有趣的是在人類腫瘤中沒有發(fā)現(xiàn)Cdc42的突變基因，它的異常形式主要表現(xiàn)為在組織和依賴的微環(huán)境中失調(diào)或過表達，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。作為關(guān)鍵的神經(jīng)元形態(tài)形成的調(diào)控器，Cdc42掌控著正常大腦發(fā)育的命運，Cdc42敲除的小鼠不能活至出生并表現(xiàn)明顯的大腦畸形。既往不同的研究顯示Cdc42的活化對上皮細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(EMT)和因此發(fā)生的胞內(nèi)物質(zhì)運輸十分重要，這對腫瘤細(xì)胞的侵襲是非常必要的。但是，在三大典型的Rho超家族亞類中，對于Cdc42的研究遠(yuǎn)滯后于RhoA和Racl。這部分是由于Cdc42的活化/失活形式的轉(zhuǎn)換非?？焖伲踩狈x擇性的小分子研究工具來幫助直接了解這個過程。Rho GTP酶家族參與的信號通路調(diào)控細(xì)胞多種生化功能，諸如細(xì)胞膜的物質(zhì)運輸、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞骨架的組織，這關(guān)乎細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運動以及細(xì)胞命運。近年的研究顯示很多疾病的病理發(fā)生和進程與Rho GTP酶家族功能蛋白的失?；蚴Э赜嘘P(guān)，因此成為藥物開發(fā)的重要靶點。同時，Rho GTP酶家族的小分子調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用也促進了對其中功能蛋白的研究。例如，新型腦、心血管活性藥——法舒地爾和小分子化合物Y27632是公認(rèn)的RhoA下游效應(yīng)信號分子Rho/pieO-K強效抑制劑。作為Racl蛋白的選擇性抑制劑，近來對靶向Racl-GEF連接的小分子化合物NSC23766的研究也大大促進了對Racl蛋白功能的認(rèn)識。但是，卻幾乎沒有有效的Cdc42選擇性抑制劑。Secramine，天然產(chǎn)物加蘭他敏的類似物，近來認(rèn)為它通過Rho⑶Il可抑制依賴于Cdc42的高爾基體-細(xì)胞膜間物質(zhì)轉(zhuǎn)運。不同于廣泛應(yīng)用的Y27632(1903篇相關(guān)文獻)和NSC23766(115篇相關(guān)文獻)，Secramine的獲得十分有限，研究甚少(僅有9篇相關(guān)文獻)。Cdc42的失調(diào)在很多方面與腫瘤發(fā)生相關(guān)，包括腫瘤的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移；另外神經(jīng)元的發(fā)展與維持也嚴(yán)重依賴于正常的Cdc42活性。NSC23766是一個基于計算機模擬的結(jié)構(gòu)篩選的化合物，與Racl分子的表面結(jié)構(gòu)契合，而已知Racl對GEF的結(jié)合至關(guān)重要(Gao, Y., J. B. Dickerson, et al. (2004).Rational design and characterization of a Rac GTPase-specific small moleculeinhibitor. Proc Natl Acad Sci USA. 101(20) :7618-7623)。NSC23766 可以抑制血清中或生長因子誘導(dǎo)的Racl活化和Racl片狀偽的形成。NSC23766作用于人類前列腺癌細(xì)胞株，能抑制細(xì)胞增殖，抑制非停泊性生長，并且降低細(xì)胞的侵襲表型，而腫瘤細(xì)胞的這些表型均依賴于內(nèi)源性Racl的活性。此外，新的研究表明，NSC23766可以改善由Racl所介導(dǎo)的脊髓損傷(SCI)誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛(Tan, A.M.，S. Stambouli an, et al. (2008). Neuropathicpain memory is maintained by Raci-regulated dendritic spine remodeling afterspinal cord injury. J Neurosci. 28(49) : 13173-13183)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種化合物，其具有下式I的結(jié)構(gòu)為式I，其名稱為4-(3-(2-(4-Bromo-2-chlorophenoxy)acetyl)thioureido)-N-(4，6-dimethylpyrimidin-2-yl) benzene sulfonamide,即 4- (3- (2- (4-溴 ~2~ 氯-苯氧基)-乙酸基)-硫服基)_氮-(4，6_ 二甲基嘧啶-2-基)苯磺酰胺。為了簡便起見，本申請文件中將其命名為ZCL278。本發(fā)明提供的ZCL278，能夠抑制Cdc42參與的所有過程，有效抑制Cdc42的作用。因為Cdc42在細(xì)胞周期、運動、黏附、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)戎卸季哂兄匾淖饔?。同時在癌癥的發(fā)展和侵襲，心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及其它許多疾病中均有重要的作用。所以本發(fā)明提供的ZCL278可以制備用于治療惡性腫瘤的藥物，具體說，可以制備用于防治惡性腫瘤的發(fā)展和侵襲的藥物。上述的化合物還可以制備用于治療心血管系統(tǒng)疾病的藥物。上述的化合物還可以制備用于治療呼吸系統(tǒng)疾病的藥物。上述的化合物還可以制備用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。其中，上述的化合物可以通過抑制Cdc42的功能發(fā)揮上述作用。本發(fā)明的另一目的是提供一種Cdc42抑制劑，其包含上述式I所示的化合物。本發(fā)明提供的化合物ZCL278能夠有效抑制GTP結(jié)合Cdc42的活性。在小鼠成纖維細(xì)胞Swiss 3T3中，化合物ZCL278影響Cdc42調(diào)控亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的兩個最主要的效應(yīng)表現(xiàn)消除細(xì)胞微棘的形成，破壞GM130對接高爾基體的結(jié)構(gòu)。相比Rac的選擇性抑制劑NSC23766，ZCL278可減少細(xì)胞核外緣活性Cdc42的積聚。ZCL278抑制Cdc42介導(dǎo)的神經(jīng)元分支及其生長錐動力學(xué)，同時發(fā)現(xiàn)其在不破壞細(xì)胞活率的條件下即可抑制轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞PC-3的actin為基礎(chǔ)的細(xì)胞運動及遷移。所以，ZCL278能夠有效抑制Cdc42對細(xì)胞形態(tài)及行為學(xué)的調(diào)控，在癌癥的發(fā)展和侵襲，心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病，以及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病中均能發(fā)揮重要的作用。為讓本發(fā)明之上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖IA-圖IC :ZCL靶向Cdc42_ITSN(交叉蛋白)連接的結(jié)構(gòu)鑒定。其中，圖IA為計算機模擬ZCL278結(jié)合Cdc42分子(實際試驗中生成的為彩色圖):灰色表面(如圖中的箭頭I)所示為蛋白質(zhì)，綠色棒(如圖中的箭頭2)所示為配基。圖IB為ZCL278與Cdc42氨基酸殘基的結(jié)合綠色棒為ZCL278分子(如圖中的箭頭3)，灰色(如圖中的箭頭4)示意Cdc42結(jié)構(gòu)，橙色線條(如圖中的箭頭5)示意兩分子間形成氫鍵。圖IC表示將Cdc42-ZCL278復(fù)合物與GMP-PCP蛋白質(zhì)分子(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫2QRZ)的結(jié)構(gòu)進行疊合綠色棒為ZCL278分子，灰色示意Cdc42結(jié)構(gòu)，青色棒示意GMP-PCP結(jié)構(gòu)(GMP-PCP是GTP類似物，￠, Y-亞甲基二磷酸鳥苷酸)。圖2A-圖2C表示ZCL278的活性特性。其中圖2A表示ZCL278抑制Cdc42介導(dǎo)的細(xì)胞微棘形成。圖2B表示ZCL278抑制內(nèi)生型Rac/Cdc42的活化。圖2C表示ZCL278抑制刺激型Cdc42的活化。圖3A-圖3C表示活化Cdc42/磷酸化RhoA的免疫熒光染色。圖4表示ZCL278破壞細(xì)胞內(nèi)GM130蛋白對接高爾基體的組織。圖5A-圖5C表示ZCL278阻礙細(xì)胞遷移，但不影響細(xì)胞活率。圖6A-圖6C表示ZCL278抑制神經(jīng)元分支和生長錐動力學(xué)。
具體實施例方式實施例I :Cdc42抑制劑的虛擬篩選分析Cdc42_ITSN復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)介于兩分子之間一個主要的結(jié)合域，ITSN分子中Glnl380殘基和Argl384殘基之間以及Cdc42上Asn39和Phe37之間的氫鍵，ITSN 分子中 Leul376、Metl379 殘基和 Thrl383 殘基之間以及 Cdc42 上 Phe56、Tyr64、Leu67和Leu70之間的兩個疏水簇。為篩選Cdc42抑制劑，推定Cdc42分子上結(jié)合口袋為ITSN蛋白表面與Cdc42結(jié)合的半徑距離在7A內(nèi)的氨基酸殘基形成的結(jié)構(gòu)。這其中含有Cdc42蛋白分子中Thr35，Val36，Asn39，Phe56和Asp57等16個氨基酸殘基，如圖IA-圖IC所示。用Glide程序篩選SPECS數(shù)據(jù)庫中能破壞Cdc42與ITSN連接的小分子化合物。Cdc42-ITSN復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，ID號1KI1.占據(jù)Cdc42結(jié)合位點的ISTN中氨基酸殘基為Leu376, Met379, Glnl380, Thrl383, Argl384.距離這五個氨基酸中心在7A內(nèi)的Cdc42氨基酸殘基形成Cdc42的結(jié)合口袋。運用蛋白準(zhǔn)備模塊ProteinPreparation Wizard 處理模型的初始結(jié)構(gòu)，使用 Glide/Receptor Grid Generation 模塊分子對接，使用配體準(zhǔn)備模塊Ligprep將對Specs數(shù)據(jù)庫中197000個化合物進行進行高通量虛擬篩選，按照以下標(biāo)準(zhǔn)篩選出來的排名前100位的化合物將入選ITSN樣的結(jié)合態(tài)，可占據(jù)ITSN上Leul376, Glnl380, Argl384, Metl379和Thrl383殘基的空間結(jié)構(gòu)；至少形成3個氫鍵；與Cdc42分子中保守的Asn39或Phe37殘基能形成氫鍵；分子骨架的多樣性。排名前50000個分子再進行標(biāo)準(zhǔn)精度計算排出前100個分子，最后選出30個化合物測試它們對Cdc42的活性和/或功能的影響。Cdc42分子上ZCL278鍵合的電腦模擬模式如圖IA所示，ZCL278嵌合Cdc42蛋白中 Thr35, Val36, Asp38, Asn39, Phe56, Tyr64, Leu67 和 Leu70 殘基順序形成的口袋結(jié)構(gòu)。如圖IB所示，兩分子之間還發(fā)現(xiàn)外延的良性相互作用。與涉及Thr35，Asn39和Asp57殘基在內(nèi)的氨基酸殘基形成5個氫鍵，同時與Val36和Phe56殘基形成有疏水作用的結(jié)構(gòu)。如圖IC所示，分子中的溴苯環(huán)插入到⑶P/GTP的結(jié)合口袋里。電腦模擬的ZCL278與Cdc42的結(jié)合可破壞Cdc42-ISTN的⑶P/GTP轉(zhuǎn)換態(tài)結(jié)合。實施例2 :化合物ZCL278的合成ZCL278可以通過下述合成方法合成，以下合成方法僅用于示例，而非對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解并想到可采用其它合成方法來合成ZCL278，其也屬于本發(fā)明的保護范圍。反應(yīng)試劑和條件(a)K2CO3, DMF (N，N- 二甲基甲酰胺)，70 °C ; (b)NaOH，dioxane ( 二氧雜環(huán)乙焼)/H2O ； (c) SOCl2 ( 二氯亞砜),DMF, reflux (回流);(d) NaSCN (硫氰酸鈉)，acetone (丙酮)，0 V -rt ； (e) 4-amino-N- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)benzene-sulfonamide (4-氨基-N_(4,6- 二甲基 _2_ 卩密唳基)苯橫酸胺)，0°C -r. t.反應(yīng)式如下
權(quán)利要求
1.一種化合物，其特征在于，具有下式I的結(jié)構(gòu) Is OOl 式I。
2.權(quán)利要求I所述的化合物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物用于防治惡性腫瘤的發(fā)展和侵
4.權(quán)利要求I所述的化合物在制備用于治療心血管系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的化合物在制備用于治療呼吸系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述的化合物在制備用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的化合物抑制Cdc42的功能。
8.—種Cdc42抑制劑，其特征在于，包含權(quán)利要求I所述的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有式I結(jié)構(gòu)的化合物，該化合物能夠用于制備Cdc42抑制劑。絲狀偽足的形態(tài)學(xué)分析，Western blot Cdc42磷酸化及下游效應(yīng)蛋白WASP的分析，以及細(xì)胞傷口愈合試驗和生長錐的形成試驗，均表明本發(fā)明提供的化合物能夠抑制Cdc42參與的所有過程，有效抑制Cdc42的作用。有效抑制actin參與的細(xì)胞功能，如高爾基體組織和細(xì)胞運動。
文檔編號C07D239/69GK102796050SQ20121015827
公開日2012年11月28日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者陸群, 周虎臣, 陳燕華 申請人:昂科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(蘇州)有限公司