專利名稱：制造包含vl結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白的小鼠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
提供了免疫球蛋白樣結(jié)合蛋白，其包含與免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，還提供了結(jié)合蛋白，其具有與輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，以及與重鏈恒定結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。還提供了表達(dá)此類結(jié)合蛋白的細(xì)胞，制造它們的小鼠，以及相關(guān)的方法和組合物。背景抗體通常包含四聚體結(jié)構(gòu)，其具有兩條相同的重鏈，每條重鏈包含與重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)相融合的重鏈恒定區(qū)(Ch)，所述重鏈與同輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(')相融合的輕鏈恒定區(qū)(CJ相締合。對于典型的人IgG，抗體分子大小大致為約150kDa至約170kDa(例如，對于IgG3，其包含較長的鉸鏈區(qū))，這取決于IgG的亞類(例如，IgGl，IgG3，IgG4)和可變區(qū)的(變化的)長度。在典型的抗體中，Vh與\結(jié)構(gòu)域相締 合以形成結(jié)合靶抗原的結(jié)合位點(diǎn)。因此，關(guān)于親和力和特異性的抗體的特點(diǎn)可大部分地取決于Vh和\結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)。在人和小鼠中的典型抗體中，Vh結(jié)構(gòu)域與λ或K'結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。然而，也已知的是可制造這樣的'結(jié)構(gòu)域:其在沒有同源Vh結(jié)構(gòu)域(例如，在抗體的情境中天然表達(dá)且與特定\結(jié)構(gòu)域相締合的Vh結(jié)構(gòu)域)的情況下特異性結(jié)合靶抗原，而且可以分離這樣的Vh結(jié)構(gòu)域:其在沒有同源'結(jié)構(gòu)域的情況下特異性結(jié)合靶抗原。因此，基于免疫球蛋白的結(jié)合蛋白的有用的多樣性通常是由產(chǎn)生特定％或'(以及體細(xì)胞超突變，在其發(fā)生的程度上)的重組以及同源Vh/'對的組合所賦予的。開發(fā)組合物和方法來開拓其它的多樣性來源將是有用的。本領(lǐng)域中需要基于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白，這包括免疫球蛋白可變區(qū)例如輕鏈可變區(qū)，且包括相對于傳統(tǒng)抗體顯示出提高的多樣性的結(jié)合蛋白。也存在對于制造有用的結(jié)合蛋白的其它方法和動物的需求，所述結(jié)合蛋白包括:包含多種輕鏈免疫球蛋白可變區(qū)序列的結(jié)合蛋白。還需要用于基于免疫球蛋白的結(jié)合蛋白的有用形式，其提供用于從中選擇的結(jié)合蛋白的增強(qiáng)的多樣性，以及免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的增強(qiáng)的多樣性，這包括用于產(chǎn)生體細(xì)胞突變的和克隆選擇的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的組合物和方法，所述免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域用于例如制造人治療劑。
發(fā)明概要一方面，描述了結(jié)合蛋白，其包含免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域衍生自輕鏈(即kappa(K)和/或lambda ( λ ))免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域,但不是來自全長重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。還提供了用于制造結(jié)合蛋白的組合物和方法，包括經(jīng)遺傳修飾的小鼠。一方面，提供了核酸構(gòu)建體，細(xì)胞，胚胎，小鼠和方法，用于制造包含一個或多個K和/或λ輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白序列及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列的蛋白，其中包括包含人λ或K輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列的蛋白。一方面，提供了小鼠，其包含免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座包括用一個或多個輕鏈可變區(qū)(')基因區(qū)段以及一個或多個輕鏈連接區(qū)(Jj基因區(qū)段替代內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白重鏈基因座處的一個或多個免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(Vh)基因區(qū)段，重鏈多樣性(Dh)基因區(qū)段，和重鏈連接(Jh)基因區(qū)段。一方面，提供了小鼠，其包括免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座包含用一個或多個\基因區(qū)段以及一個或多個I基因區(qū)段替代全部或基本上全部VH，Dh及Jh基因區(qū)段，以在內(nèi)源重鏈基因座(VLh基因座)處形成'基因區(qū)段序列，其中所述VLh基因座能夠與內(nèi)源小鼠Ch基因重組以形成重排的基因，其衍生自'基因區(qū)段，叉基因區(qū)段和內(nèi)源小鼠Ch基因。在一個實(shí)施方案中，所述\區(qū)段是人在一個實(shí)施方案中，所述叉區(qū)段為人叉。在具體的實(shí)施方案中，所述\和叉區(qū)段是人\和人叉區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，用至少六個人VK基因區(qū)段和至少一個Jk基因區(qū)段替代全部或基本上全部％，011以及Jh基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，用至少16個人Vk基因區(qū)段(人Vk)和至少一個Jk基因區(qū)段替代全部或基本上全部Vh，D1^P Jh基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，用至少30個人Vk基因區(qū)段和至少一個Jk基因區(qū)段替代全部或基本上全部VH，D1^P Jh基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，用至少40個人V K基因區(qū)段和至少一個Jk基因區(qū)段替代全部或基本上全部VH，Dh和Jh基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述至少一個J K基因區(qū)段包含兩個、三個、四個或五個人J K基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述'區(qū)段為人Vk區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述人Vk區(qū)段包含4-1，5-2，7-3，2-4，1-5和1-6。在一個實(shí)施方案中，所述κ '包含3-7，1-8，1-9，2-10,3-11,1-12,1-13,2-14,3-15,1-160 在一個實(shí)施方案中，所述人 V κ 區(qū)段包含 1-17，
2-18，2-19，3-20，6-21，1-22,1-23，2-24，3-25，2-26，1-27，2-28，2-29和 2-30 在一個實(shí)施方案中，所述人 Vk 區(qū)段包含 3-31，1-32，1-33,3-34,1-35,2-36,1-37,2-38,1-39 和 2-40 在一個實(shí)施方案中，所述Vl區(qū)`段為人V K區(qū)段且包含4-1，5-2，7-3，2-4，1-5，1-6，
3-7，1-8，1-9，2-10，3-11，1-12，1-13，2-14，3-15和 1-16。在一個實(shí)施方案中，所述 V κ 區(qū)段還包含 1-17，2-18，2-19，3-20，6-21，1-22,1-23，2-24，3-25，2-26，1-27，2-28，2-29 和2-30。在一個實(shí)施方案中，所述 Vk 區(qū)段還包含 3-31，1-32，1-33，3-34，1-35，2-36，1-37，2-38，1-39 和 2-40。在一個實(shí)施方案中，所述'區(qū)段為人VX區(qū)段且包含人λ輕鏈基因座的簇(Cluster)A的片段。在具體的實(shí)施方案中，所述人λ輕鏈基因座的簇A的片段從hV λ 3_27延伸至hV λ 3-1 ο在一個實(shí)施方案中，所述'區(qū)段包含人λ輕鏈基因座的簇B的片段。在具體的實(shí)施方案中，所述人λ輕鏈基因座的簇B的片段從hV λ 5-52延伸至hV λ 1-40。在一個實(shí)施方案中，所述' 區(qū)段包含人λ輕鏈可變區(qū)序列，其包含簇A的基因組片段和簇B的基因組片段。在一個實(shí)施方案中，所述人λ輕鏈可變區(qū)序列包含簇A的至少一個基因區(qū)段和簇B的至少一個基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述\區(qū)段包含簇B的至少一個基因區(qū)段和簇C的至少一個基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述Vl 區(qū)段包含 hV λ 3-1，4-3，2-8, 3-9, 3-10, 2-11 和 3-12。在具體的實(shí)施方案中，所述'區(qū)段包含從νλ 3-12跨至νλ 3-1的人λ輕鏈基因座的連續(xù)序列。在一個實(shí)施方案中，所述連續(xù)序列包含至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12個hV λ。在具體的實(shí)施方案中，所述hVA包括3-1，4-3，2-8，3-9，3-10，2-11和3-12。在具體的實(shí)施方案中，所述hV λ包含從V λ 3-12跨至V λ 3-1的人λ基因座的連續(xù)序列。在一個實(shí)施方案中，所述hV λ包含13至28個或更多的hV λ。在具體的實(shí)施方案中，所述 hV λ 包括 2-14，3-16，2-18，3-19, 3-21,3-22, 2-23, 3-25 和 3-27 在具體的實(shí)施方案中，所述hVA包含從V λ 3-27跨至V λ 3-1的人λ基因座的連續(xù)序列。在一個實(shí)施方案中，所述'區(qū)段包含29至40個hV λ。在具體的實(shí)施方案中，所述'區(qū)段包含從V λ 3-29跨至V λ 3-1的人λ基因座的連續(xù)序列，以及從V λ 5-52跨至VA 1-40的人λ基因座的連續(xù)序列。在具體的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠中hVA 1-40和hVX 3-29之間的全部或基本上全部序列基本上由下列組成:在自然界中(例如在人類群體中)被發(fā)現(xiàn)在hV λ 1-40基因區(qū)段下游(3’未翻譯部分的下游)的約959bp的人λ序列，限制性酶切位點(diǎn)(例如P1-SceI)，后跟在自然界中被發(fā)現(xiàn)在hV λ 3-29基因區(qū)段上游的約343Ibp的人λ序列。在一個實(shí)施方案中，所述Jk是人的并且選自Jk 1，Jk 2，Jk 3，Jk 4，Jk 5及其組合。在具體的實(shí)施方案中，所述Jk包含Jk I至Jk 5。在一個實(shí)施方案中，所述'區(qū)段為人νλ區(qū)段，且所述Jk基因區(qū)段包含具有12-111虹間隔子的1 5，其中所述1 5被并置于11^基因區(qū)段的上游末端。在一個實(shí)施方案中，所述'基因區(qū)段為人νλ且所述VLh基因座包含兩個或更多個J κ基因區(qū)段，其中每個都包含具有12-mer間隔子的RSS，其中所述RSS被并置于每個J κ基因區(qū)段的上游末端。在具體的實(shí)施方案中，所述'區(qū)段包含從Vk 4-1至Vk 2-40跨越人κ基因座的連續(xù)人κ基因區(qū)段，且所述叉區(qū)段包含從Jk I至Jk 5跨越人κ基因座的連續(xù)基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，其中所述\區(qū)段為νλ區(qū)段且沒有DHg段存在于所述'區(qū)段和J區(qū)段之間，所述'區(qū)段的下游側(cè)翼(即并置于下游一側(cè))是23-merRSS，且Jk區(qū)段(如果存在的話)或JX區(qū)段(如果存在的話)的上游側(cè)翼(即并置于上游一側(cè))是12-merRSS。在一個實(shí)施方案中，其中所述V基因區(qū)段為Vk基因區(qū)段且沒有Dh基因區(qū)段存在于所述V基因區(qū)段和J基因區(qū)段之間，其中每個所述V K基因區(qū)段的的下游一側(cè)并置了12-1^1'1 5，且每個11^區(qū)段(如果存在的話)或JX區(qū)段(如果存在的話)的上游一側(cè)并置了 23-merRSS。在一個實(shí)施方案中，小鼠包含重排的基因，其衍生自\基因區(qū)段，Jl基因區(qū)段和內(nèi)源小鼠Ch基因。在一個實(shí)施方案中，所述重排的基因是經(jīng)體細(xì)胞突變的。在一個實(shí)施方案中，所述重排的基因包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多個N添加。在一個實(shí)施方案中，在所述重排的基因中所觀察到的衍生自\區(qū)段和I區(qū)段的N添加和/或體細(xì)胞突變是在內(nèi)源輕鏈基因座處重排的重排輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(衍生自相同的'基因區(qū)段和相同的叉基因區(qū)段)中所觀察到的N添加和/或體細(xì)胞突變數(shù)目的1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，
4.5倍或至少5倍。在一個實(shí)施方案中，所述重排的基因是特異性結(jié)合目的抗原的B細(xì)胞，其中所述B細(xì)胞以低納摩爾范圍內(nèi)或更低的Kd (例如10納摩爾或或更低的Kd)結(jié)合目的抗原。在具體的實(shí)施方案中，所述'區(qū)段、叉區(qū)段或二者為人基因區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述'和叉區(qū)段為 人κ基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述小鼠Ch基因選自IgM，IgD, IgG，IgA和IgE0在具體的實(shí)施方案中，所述小鼠IgG選自IgGl，IgG2A，IgG2B, IgG2C和IgG3。在另一個具體實(shí)施方案中，所述小鼠IgG為IgGl。
在一個實(shí)施方案中，所述小鼠包含B細(xì)胞，其中所述B細(xì)胞從B細(xì)胞染色體上的基因座制造結(jié)合蛋白，其基本上由四條多肽鏈組成，其中所述四條多肽鏈基本上由下列組成:(a)兩條相同的多肽，其包含與\相融合的內(nèi)源小鼠Ch區(qū)；和(b)兩條相同的多肽，其包含與\區(qū)相融合的內(nèi)源小鼠Q區(qū)，其中所述' 區(qū)相關(guān)于與小鼠Ch區(qū)相融合的\區(qū)是同源的，并且在一個實(shí)施方案中為人(例如人K)'區(qū)。在一個實(shí)施方案中，與內(nèi)源小鼠Ch區(qū)相融合的'區(qū)為人'區(qū)。在具體的實(shí)施方案中，與小鼠Ch區(qū)相融合的人'區(qū)為Vk區(qū)。在具體的實(shí)施方案中，與小鼠(^區(qū)相融合的人'區(qū)與由經(jīng)重排的人種系輕鏈核苷酸序列編碼的V區(qū)相同。在具體的實(shí)施方案中，與小鼠Ch區(qū)相融合的人\區(qū)包含兩個、三個、四個、五個、六個或更多個體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，與小鼠Ch區(qū)相融合的人\區(qū)是由包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添加的重排的基因編碼的。在一個實(shí)施方案中，小鼠制造的所有IgG分子中的至少50%包含這樣的多肽:其包含IgG同種型Ch區(qū)和Vl區(qū)，其中所述多肽的長度不長于535，530，525,520或515氨基酸。在一個實(shí)施方案中，所有IgG分子中的至少75%包含本段落中所述的多肽。在一個實(shí)施方案中，所有IgG分子中的至少80%，85%，90%或95%包含本段落中所述的多肽。在具體的實(shí)施方案中，由小鼠制造的所有IgG分子都包含這樣的多肽:其不長于本段落中所述的多肽的長度。在一個實(shí)施方案中，小鼠制造結(jié)合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含與由重排的人V基因區(qū)段及J基因區(qū)段但不是011基因區(qū)段編碼的可變結(jié)構(gòu)域相融合的內(nèi)源小鼠Ch區(qū)，所述第二多肽包含與由重排的人V基因區(qū)段及J基因區(qū)段但不是Dh基因區(qū)段編碼的V結(jié)構(gòu)域相融合的內(nèi)源小鼠Q區(qū)，并且所述結(jié)合蛋白以微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的親和力特異性結(jié)合抗原。在一個實(shí)施方案中，所述J區(qū)段為人J區(qū)段(例如人K基因區(qū)段)。在一個實(shí)施方案中，所述人V區(qū)段是人V K區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，與內(nèi)源小鼠C0區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域包含比與內(nèi)源小鼠Q區(qū)相融合的可變區(qū)數(shù)目更多的體細(xì)胞超突變；在具體的實(shí)施方案中，同與內(nèi)源小鼠Q區(qū)相融合的V區(qū)相比，與內(nèi)源小鼠Ch區(qū)相融合的可變區(qū)包含約1.5，2_，3_，4-或5倍或更多的體細(xì)胞超突變；在具體的實(shí)施方案中，同與小鼠Q區(qū)相融合 的V區(qū)相比，與小鼠Ch區(qū)相融合的V區(qū)包含至少6，7，8，9，10，11，12，13，14或15或更多的體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，與小鼠Ch區(qū)相融合的V區(qū)是由包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添加的經(jīng)重排的基因編碼的。在一個實(shí)施方案中，小鼠表達(dá)結(jié)合蛋白，其包含:與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列相融合的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域('I)，和與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)相融合的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域('2)，其中'I包含的體細(xì)胞超突變數(shù)目是'2中存在的體細(xì)胞超突變數(shù)目的約1.5至約5倍或者更多。在一個實(shí)施方案中，VlI中的體細(xì)胞超突變數(shù)目是'2中的約2至約4倍。在一個實(shí)施方案中，'I中的體細(xì)胞超突變數(shù)目是'2中的約2至約3倍。在一個實(shí)施方案中，'I是由包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添加的序列編碼的。一方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其表達(dá)基本上由下列多肽組成的免疫球蛋白:兩個相同的第一多肽，其中每個都基本上由與可變結(jié)構(gòu)域相融合的Ch區(qū)組成，所述可變結(jié)構(gòu)域衍生自基本上由'基因區(qū)段和叉基因區(qū)段組成的基因區(qū)段；以及兩個相同的第二多肽，其中每個都基本上由與可變結(jié)構(gòu)域相融合的Q區(qū)組成，所述可變結(jié)構(gòu)域衍生自基本上由\區(qū)段和叉區(qū)段組成的基因區(qū)段。
在具體的實(shí)施方案中，具有Ch區(qū)的所述兩個相同的多肽具有小鼠Ch區(qū)。在具體的實(shí)施方案中，具有Q區(qū)的所述兩個相同的多肽具有小鼠Q區(qū)。在一個實(shí)施方案中，與Q區(qū)融合的可變結(jié)構(gòu)域是同與Ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域同源的可變結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，與內(nèi)源小鼠Ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域包含比與內(nèi)源小鼠Q區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域數(shù)目更多的體細(xì)胞超突變；在具體的實(shí)施方案中，同與內(nèi)源小鼠Q區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域相比，與內(nèi)源小鼠Ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域包含約1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍或5倍或更多的體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，與內(nèi)源小鼠Q區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域是由包含I，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多個N添加的基因編碼的。在一個實(shí)施方案中，一個或多個所述V區(qū)段和J區(qū)段是人基因區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述V區(qū)段和J區(qū)段·都是人K基因區(qū)段。在另一個具體實(shí)施方案中，所述V區(qū)段和J區(qū)段都是人λ基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述V區(qū)段和J區(qū)段獨(dú)立地選自人K和人λ基因區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述V區(qū)段為Vk區(qū)段且J區(qū)段為區(qū)段。在另一個具體實(shí)施方案中，所述V區(qū)段為V λ區(qū)段且所述J區(qū)段為J K區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，與Q區(qū)相融合的一個或多個可變結(jié)構(gòu)域以及與Ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿丝勺兘Y(jié)構(gòu)域。在具體的實(shí)施方案中，所述人可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薞k結(jié)構(gòu)域。在另一個具體實(shí)施方案中，所述人可變結(jié)構(gòu)域?yàn)閂 λ結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，所述人結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自人VK和人Vλ結(jié)構(gòu)域。在具體的實(shí)施方案中，與Q區(qū)相融合的所述人可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薞 λ結(jié)構(gòu)域且與Ch區(qū)相融合的人可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薞 K結(jié)構(gòu)域。在另一個實(shí)施方案中，與Q區(qū)相融合的人可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薞 K結(jié)構(gòu)域且與Ch相融合的人可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薞A結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，所述兩個相同的第一多肽的'基因區(qū)段選自人νλ區(qū)段和人Vk區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述兩個相同的第二多肽的'區(qū)段選自人νλ區(qū)段和人Vk區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述兩個相同的第一多肽的'區(qū)段是人Vk區(qū)段且所述兩個相同的第二多肽的'區(qū)段選自人Vk區(qū)段和人νλ區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述兩個相同的第一多肽的\區(qū)段是人V λ區(qū)段且所述兩個相同的第二多肽的\區(qū)段選自人V λ區(qū)段和人Vk區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述兩個相同的第一多肽的人\區(qū)段是人Vk區(qū)段，且所述兩個相同的第二多肽的人\區(qū)段是人V K區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，小鼠的IgG包括響應(yīng)于抗原而制造的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含基本上由可變結(jié)構(gòu)域和Ch區(qū)組成的多肽，其中所述可變結(jié)構(gòu)域是由基本上由經(jīng)重排的\區(qū)段和經(jīng)重排的J區(qū)段組成的核苷酸序列編碼的，并且其中所述結(jié)合蛋白以微摩爾，納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的Kd特異性結(jié)合抗原的表位。一方面，提供了小鼠，其中小鼠響應(yīng)于抗原而制造的全部或基本上全部IgG都包含含有可變結(jié)構(gòu)域的重鏈，其中所述可變結(jié)構(gòu)域是由衍生自基本上由V基因區(qū)段和J基因區(qū)段組成的基因區(qū)段的重排的基因編碼的。在一個實(shí)施方案中，所述重排的基因包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添加。在一個實(shí)施方案中，所述V區(qū)段是輕鏈的V區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述輕鏈選自K輕鏈和λ輕鏈。在具體的實(shí)施方案中，所述輕鏈為K輕鏈。在具體的實(shí)施方案中，所述V區(qū)段為人V區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述V區(qū)段為人VK區(qū)段且所述J區(qū)段為人J κ區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述J區(qū)段為輕鏈的J區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述輕鏈選自κ輕鏈和λ輕鏈。在具體的實(shí)施方案中，所述輕鏈為κ輕鏈。在具體的實(shí)施方案中，所述J區(qū)段為人J區(qū)段。在另一個實(shí)施方案中，所述J區(qū)段為重鏈的J區(qū)段(即Jh)。在具體的實(shí)施方案中，所述重鏈為小鼠來源的。在另一個具體實(shí)施方案中，所述重鏈為人來源的。在一個實(shí)施方案中，由不超過V區(qū)段和J區(qū)段構(gòu)成的重鏈的可變結(jié)構(gòu)域是體細(xì)胞突變的可變結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，由不超過V區(qū)段和J區(qū)段構(gòu)成的重鏈的可變結(jié)構(gòu)域與小鼠Ch區(qū)融合。在具體的實(shí)施方案中，由小鼠響應(yīng)于抗原而制造的全部或基本上全部IgG都包含衍生自不超過一個人V區(qū)段和不超過一個人J區(qū)段的可變結(jié)構(gòu)域，并且所述可變結(jié)構(gòu)域與小鼠IgG恒定區(qū)相融合，且其中IgG還包含含有與小鼠Q區(qū)相融合的人'結(jié)構(gòu)域的輕鏈。在具體的實(shí)施方案中，與小鼠Q區(qū)相融合的'結(jié)構(gòu)域衍生自人V κ區(qū)段和人J κ區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，與小鼠Q區(qū)相融合的'結(jié)構(gòu)域衍生自人V λ區(qū)段和人J λ區(qū)段。—方面，提供了小鼠，其制造在包含Ch區(qū)的多肽上含有第一⑶R3且在包含Q區(qū)的多肽上含有第二⑶R3的IgG，其中所述第一⑶R3和第二⑶R3各自獨(dú)立地衍生自不超過兩個基因區(qū)段，其中所述兩個基因區(qū)段基本上由\基因區(qū)段和I基因區(qū)段組成。在一個實(shí)施方案中，包含Ch區(qū)的多肽上的⑶R3含有下列序列:所述序列衍生自包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添加的⑶R3核苷酸序列。

在一個實(shí)施方案中，所述'區(qū)段和叉區(qū)段為人基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述\區(qū)段和叉區(qū)段為κ基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述'區(qū)段和叉區(qū)段為λ基因區(qū)段。—方面,提供了小鼠,其制造在含有Ch區(qū)的第一多肽上包含第一⑶R3且在含有Clj區(qū)的第二多肽上包含第二⑶R3的IgG，其中所述第一⑶R3和第二⑶R3 二者每個都包含這樣的氨基酸序列:其中超過75%的所述氨基酸衍生自V基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，包含Ch區(qū)的所述多肽上的⑶R3含有這樣的序列:其衍生自包含I，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添加的CDR3核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，超過80%，超過90%或超過95%的所述第一⑶R3的氨基酸，以及超過80%，超過90%或超過95%的所述第二⑶R3的氨基酸衍生自輕鏈V區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述第一 CDR3的不超過兩個氨基酸衍生自除輕鏈V區(qū)段之外的基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述第二 CDR3的不超過兩個氨基酸衍生自除輕鏈V區(qū)段之外的基因區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述第一 CDR3的不超過兩個氨基酸和所述第二CDR3的不超過兩個氨基酸衍生自除輕鏈V區(qū)段之外的基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，沒有所述IgG的CDR3包含衍生自D基因區(qū)段的氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，所述第一多肽的⑶R3不包含衍生自D區(qū)段的序列。在一個實(shí)施方案中，所述V區(qū)段是人V基因區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述V區(qū)段是人Vk基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述第一和/或第二⑶R3具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，所述第一⑶R3是由包含I，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添加的核酸序列編碼的。在一個實(shí)施方案中，所述第一⑶R3基本上由衍生自人輕鏈V基因區(qū)段和人輕鏈J基因區(qū)段的氨基酸組成，且所述第二 CDR3基本上由衍生自人輕鏈V基因區(qū)段和人輕鏈J基因區(qū)段的氨基酸組成。在一個實(shí)施方案中，所述第一⑶R3衍生自包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多N添加的核酸序列。在一個實(shí)施方案中，所述第一 CDR3衍生自不超過兩個基因區(qū)段，其中所述不超過兩個基因區(qū)段是人Vk基因區(qū)段和人Jk基因區(qū)段；且所述第二CDR3衍生自不超過兩個基因區(qū)段，其中所述不超過兩個基因區(qū)段是人V κ基因區(qū)段和選自人Jk區(qū)段、人JX區(qū)段和人Jh區(qū)段的J基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述第一 CDR3衍生自不超過兩個基因區(qū)段，其中所述不超過兩個基因區(qū)段為人νλ區(qū)段和選自人Jk區(qū)段、人區(qū)段及人Jh區(qū)段的J區(qū)段。一方面，提供了小鼠，其制造不含衍生自Dh基因區(qū)段的氨基酸序列的IgG，其中所述IgG包含具有與小鼠Q區(qū)融合的第一 \結(jié)構(gòu)域的第一多肽和具有與小鼠Ch區(qū)融合的第二 \結(jié)構(gòu)域的第二多肽，其中所述第一 \結(jié)構(gòu)域和所述第二 \結(jié)構(gòu)域不是相同的。在一個實(shí)施方案中，所述 第一和第二'結(jié)構(gòu)域衍生自不同的V區(qū)段。在另一個實(shí)施方案中，所述第一和第二 \結(jié)構(gòu)域衍生自不同的J區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述第一和第二 \結(jié)構(gòu)域衍生自相同的V和J區(qū)段，其中與所述第一 \結(jié)構(gòu)域相比，所述第二 \結(jié)構(gòu)域包含更多數(shù)目的體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，所述第一和第二'結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自人和小鼠'結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，所述第一和第二'結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自Vk和νλ結(jié)構(gòu)域。在具體的實(shí)施方案中，所述第一'結(jié)構(gòu)域選自Vk結(jié)構(gòu)域和V λ結(jié)構(gòu)域，且所述第二'結(jié)構(gòu)域?yàn)閂k結(jié)構(gòu)域。在另一個具體實(shí)施方案中，所述V κ結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薞 κ結(jié)構(gòu)域。一方面，提供了小鼠，其中由所述小鼠制造的全部或基本上全部IgG都基本上由下列組成:具有與小鼠Q結(jié)構(gòu)域融合的第一人'結(jié)構(gòu)域的輕鏈，以及具有與小鼠Ch結(jié)構(gòu)域融合的第二人\結(jié)構(gòu)域的重鏈。在一個實(shí)施方案中，與小鼠Ch結(jié)構(gòu)域融合的所述人'結(jié)構(gòu)域是人V κ結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，所述第一和第二人\結(jié)構(gòu)域不是相同的。一方面，提供了小鼠，其中至少 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 或約100%的由所述小鼠制造的免疫球蛋白G基本上由二聚體組成:(a)第一多肽，其基本上由免疫球蛋白\結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白Q區(qū)組成；和(b)長度不超過535個氨基酸的第二多肽，其中所述第二多肽基本上由Ch區(qū)和缺少衍生自Dh基因區(qū)段的序列的V結(jié)構(gòu)域組成。在一個實(shí)施方案中，所述第二多肽的長度為約435-535個氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，所述第二多肽的長度為約435-530個氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，所述第二多肽的長度為約435-525個氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，所述第二多肽的長度為約435-520個氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，所述第二多肽的長度為約435-515個氨基酸。在一個實(shí)施方案中，在約90%或更多由所述小鼠制造的IgG中，所述第二多肽的長度為不超過約535個氨基酸。在一個實(shí)施方案中，在約50%或更多由所述小鼠制造的IgG中，所述第二多肽的長度不超過約535個氨基酸。在一個實(shí)施方案中，在約50%或更多由所述小鼠制造的免疫球蛋白G中，所述第二多肽的長度為不超過約530,525,520,515,510,505,500,495,490,485,480，475，470，465，460，455 或 450 個氨基酸。在一個實(shí)施方案中，約 60%, 70%, 80%, 90% 或95%或更多由所述小鼠制造的IgG是所述的長度。在具體的實(shí)施方案中，由所述小鼠制造的全部或基本上全部IgG是所述的長度。在一個實(shí)施方案中，所述第二多肽的V結(jié)構(gòu)域?yàn)?結(jié)構(gòu)域。在具體的實(shí)施方案中，所述第二多肽的V結(jié)構(gòu)域選自Vk和νλ結(jié)構(gòu)域。在具體的實(shí)施方案中，所述第二多肽的V結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薞 κ或νλ結(jié)構(gòu)域。一方面，提供了小鼠，其從其種系中的核苷酸序列表達(dá)包含輕鏈可變序列(例如V和/或J序列)，Dh序列以及重鏈恒定區(qū)的多肽。在一個實(shí)施方案中，所述小鼠從內(nèi)源小鼠重鏈基因座表達(dá)所述多肽，所述基因座包含用所述內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的多個人基因區(qū)段替代全部或基本上全部功能性內(nèi)源小鼠重鏈可變基因座基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述多肽包含衍生自VA或Vk基因區(qū)段的八序列，所述多肽包含衍生自Dh基因區(qū)段的⑶R3，且所述多肽包含衍生自Jh或JX *JK基因區(qū)段的序列。在一個實(shí)施方案中，所述小鼠包含內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白基因座，所述基因座包含用一個或多個人輕鏈V λ基因區(qū)段替代所有功能性Vh基因區(qū)段，其中所述一個或多個人VA區(qū)段中的每一個都在下游一側(cè)并置了 23-mer間隔的重組信號序列(RSS)，其中所述VA區(qū)段與上游和下游并置了 12-mer間隔的RSS的人或小鼠Dh區(qū)段可操作地連接；所述Dh基因區(qū)段與上游并置了 23-mer間隔的RSS的J區(qū)段可操作地連接，所述RSS適于與并置于Dh基因區(qū)段的12-mer間隔的RSS重組；其中所述V，Dh和J區(qū)段與編碼重鏈恒定區(qū)的核酸序列可操作地連接。在一個實(shí)施方案中，所述 小鼠包含內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白基因座，所述基因座包含用一個或多個人Vk基因區(qū)段替代所有功能性￥11基因區(qū)段，每個所述Vk基因區(qū)段下游都并置了 12-mer間隔的重組信號序列(RSS)，其中所述V區(qū)段與上游和下游都并置了23-mer間隔的RSS的人或小鼠Dh區(qū)段可操作地連接；所述Dh區(qū)段與上游并置了 12-mer間隔的RSS的J區(qū)段可操作地連接，所述RSS適于與并置于所述Dh區(qū)段的23-mer間隔的RSS重組；其中所述V，D1^P J基因區(qū)段與編碼重鏈恒定區(qū)的核酸序列可操作地連接。在一個實(shí)施方案中，所述重鏈恒定區(qū)為內(nèi)源小鼠重鏈恒定區(qū)。在一個實(shí)施方案中，核酸序列編碼選自CH1，鉸鏈，CH2，CH3及其組合的序列。在一個實(shí)施方案中，所述ChI，鉸鏈，Ch2和Ch3中的一個或多個為人的。在一個實(shí)施方案中，所述小鼠包含內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白基因座，所述基因座包含用多個人νλ基因區(qū)段(其中每個人νλ基因區(qū)段的下游都并置了23-mer間隔的RSS)、上游和下游都并置了 12-mer間隔的RSS的多個人Dh區(qū)段、上游和下游都并置了 23-mer間隔的RSS的多個人J區(qū)段(Jh或J λ或J κ )替代所有功能性Vh基因區(qū)段，其中所述基因座包含選自CH1，鉸鏈，Ch2，Ch3及其組合的內(nèi)源小鼠恒定區(qū)序列。在具體的實(shí)施方案中，所述小鼠包含全部或基本上全部功能性人V λ或Vk區(qū)段，全部或基本上全部功能性人Dh區(qū)段以及全部或基本上全部Jh或JX *JK區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，小鼠表達(dá)抗原結(jié)合蛋白，其包含:(a)多肽，所述多肽包含與包含小鼠序列的重鏈恒定序列相連接的人輕鏈序列；和(b)多肽，其包含與人或小鼠輕鏈恒定序列相連接的人輕鏈可變區(qū)。在具體的實(shí)施方案中，所述輕鏈序列為人輕鏈序列，并且在暴露于能夠?qū)⒖贵w切割為Fe和Fab的蛋白酶時，形成包含至少四個輕鏈CDR的全人Fab，其中所述至少四個輕鏈⑶R選自λ序列，Κ序列及其組合。在一個實(shí)施方案中，所述Fab包含至少五個輕鏈CDR。在一個實(shí)施方案中，所述Fab包含六個輕鏈CDR。在一個實(shí)施方案中，所述Fab的至少一個⑶R包含衍生自VA區(qū)段或Vk區(qū)段的序列，且所述至少一個⑶R還包含衍生自D區(qū)段的序列。在一個實(shí)施方案中，所述至少一個⑶R為⑶R3且所述⑶R衍生自人Vk區(qū)段，人D區(qū)段和人Jk區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述多肽包含衍生自人VA基因區(qū)段，人011基因區(qū)段和人Jh或JX或Jk基因區(qū)段的可變區(qū)。在具體的實(shí)施方案中，所述重鏈恒定序列衍生自人ChI和小鼠Ch2以及小鼠Ch3序列?！矫?，提供了小鼠，其在其種系中包含與人J基因區(qū)段以及重鏈恒定區(qū)序列可操作連接的未重排的人Vk或νλ基因區(qū)段，其中所述小鼠表達(dá)包含與重鏈恒定區(qū)相融合的人V κ結(jié)構(gòu)域的\結(jié)合蛋白，并且其中所述小鼠顯示出在CD19+B細(xì)胞中表達(dá)\結(jié)合蛋白的脾臟B細(xì)胞群，其中所述⑶19+Β細(xì)胞包括過渡性B細(xì)胞(CD19+IgMhiIgDint)和成熟B細(xì)胞(CD19+IgMintIgDhi)。一方面，提供了小鼠，其在其種系中包含與人J基因區(qū)段和重鏈恒定區(qū)序列可操作連接的未重排的人V κ或νλ基因區(qū)段，其中所述小鼠在B細(xì)胞上表達(dá)包含與重鏈恒定區(qū)相融合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白，其中所述小鼠骨髓中的淋巴細(xì)胞群顯示出數(shù)目與野生型小鼠中的原/前B細(xì)胞群(骨髓中的淋巴細(xì)胞)數(shù)目大致相同的原/前B細(xì)胞群。在一個實(shí)施方案中，小鼠包含至少6個未重排的hV κ基因區(qū)段和一個或多個未重排的hjK基因區(qū)段，并且所述小鼠包含表達(dá)\結(jié)合蛋白的淋巴細(xì)胞-門控的且IgM+的脾細(xì)胞群，其中所述群體至少為野生型小鼠中淋巴細(xì)胞-門控的且IgM+的脾細(xì)胞群的75%大。在一個實(shí)施方 案中，小鼠顯示出總計(jì)約90%的IgD+細(xì)胞和IgM+細(xì)胞的成熟B細(xì)胞-門控的(CD19+)脾細(xì)胞群；在一個實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的小鼠的IgD+細(xì)胞和IgM+細(xì)胞的成熟B細(xì)胞-門控的(CD19+)脾細(xì)胞群與野生型小鼠的總IgD+細(xì)胞和IgM+細(xì)胞中為成熟B細(xì)胞-門控的(CD19+)脾細(xì)胞大致相同(例如在10%之內(nèi)，或5%之內(nèi))。一方面，提供了小鼠，其從其種系內(nèi)經(jīng)修飾的內(nèi)源重鏈基因座表達(dá)免疫球蛋白，其中所述經(jīng)修飾的內(nèi)源重鏈基因座缺少功能性小鼠重鏈V基因區(qū)段且所述基因座包含未經(jīng)重排的輕鏈V基因區(qū)段和未經(jīng)重排的J基因區(qū)段，其中所述未經(jīng)重排的輕鏈V基因區(qū)段和未經(jīng)重排的J基因區(qū)段與重鏈恒定區(qū)序列可操作地連接；其中所述免疫球蛋白基本上由第一多肽和第二多肽組成，其中所述第一多肽包含免疫球蛋白輕鏈序列和免疫球蛋白重鏈恒定序列，且所述第二多肽包含免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)。一方面，提供了小鼠，其表達(dá)免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白缺少重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，且所述免疫球蛋白包含衍生自輕鏈基因的第一可變結(jié)構(gòu)域，和衍生自輕鏈基因的第二可變結(jié)構(gòu)域，其中所述第一可變結(jié)構(gòu)域和所述第二可變結(jié)構(gòu)域相對于彼此是同源的，其中所述第一和第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域不是相同的，并且其中所述第一和第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域締合，且當(dāng)它們締合時特異性結(jié)合目的抗原。—方面，提供了小鼠，其從其種系中的未重排基因區(qū)段制造免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含完全衍生自基本上由未重排的人基因區(qū)段組成的基因區(qū)段的可變區(qū)，其中所述免疫球蛋白包含選自ChI，鉸鏈，Ch2,Ch3及其組合的免疫球蛋白輕鏈恒定序列和免疫球蛋白重鏈恒定序列。一方面，提供了小鼠，其從其種系中未經(jīng)重排的基因區(qū)段制造免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含可變區(qū)和任選地一個或多個體細(xì)胞超突變(例如一個或多個N添加)，其中所有可變區(qū)的所有CDR3都是完全從輕鏈V和J基因區(qū)段產(chǎn)生的。一方面，提供了小鼠，其制造衍生自所述小鼠的種系中未經(jīng)重排的人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的體細(xì)胞突變的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白缺少包含衍生自D基因區(qū)段的序列的CDR，其中所述免疫球蛋白在與輕鏈恒定區(qū)融合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域上包含第一⑶R3，在與重鏈恒定區(qū)融合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域上包含第二⑶R3，并且其中所述第二⑶R3衍生自包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添加的經(jīng)重排的輕鏈可變區(qū)序列。一方面，提供了本文中所述的小鼠，其中所述小鼠包含選自λ基因座、Κ基因座及其組合的功能上被沉默的輕鏈基因座。在一個實(shí)施方案中，所述小鼠包含λ和/或K基因座的完全或部分缺失，從而所述λ和/或Κ基因座是無功能的。一方面，提供了小鼠胚胎，其包含含有如本文中所描述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座的細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，所述小鼠為嵌合體且所述胚胎的細(xì)胞的至少10%，20%，30%，40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%或95%包含如本文中所述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座。在一個實(shí)施方案中，所述胚胎的細(xì)胞的至少96%，97%，98%，99%或99.8%包含本文中所述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座。在一個實(shí)施方案中，所述胚胎包含宿主細(xì)胞和衍生自供體ES細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述衍生自供體ES細(xì)胞的細(xì)胞包含如本文中所描述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座。在一個實(shí)施方案中，所述胚胎為2_，4_，8_，16-，32-或64-細(xì)胞階段的宿主胚胎，或胚泡，并且還包含含有如本文中所描述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座的供體ES細(xì)胞。一方面，提供了用本文中所描述的核酸構(gòu)建體制造的小鼠或細(xì)胞。一方面，提供了用本文中所描述的細(xì)胞制造的小鼠。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為小鼠ES細(xì)胞。一方面，提供了使用本文中所描述的小鼠來制造編碼與第二人輕鏈免疫球蛋白可變序列('2)同源的第一人輕鏈免疫球蛋白可變序列('I)的核酸序列的用途，其中與人免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(多肽I)融合的'I同與人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(多肽2)融合的Vl2 一起作為多肽I/多肽2的二聚體表達(dá)，以形成VJ-VJ抗體。一方面，提供了使用本文中所描述的小鼠來制造編碼與人免疫球蛋白重鏈序列相融合的人免疫球蛋白輕鏈可變序列的核酸序列的用途，其中所述核酸序列編碼人\_CH多肽，其中所述人'-Ch多肽作為二聚體表達(dá)，并且其中所述二聚體在沒有免疫球蛋白輕鏈(例如沒有人λ或人κ輕鏈)時表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，所述\-CH 二聚體在沒有λ輕鏈和沒有κ輕鏈時特異性結(jié)合目的抗原。一方面，提供了用如本文中所描述的小鼠來制造編碼全部或一部分免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列的用途。在一個實(shí)施方案中 ，所述免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薞 λ或人Vk結(jié)構(gòu)域。一方面，提供了用如本文中所描述的小鼠來制造全人Fab(包含與人輕鏈恒定區(qū)融合的第一人'，以及與人重鏈恒定區(qū)序列融合的第二人')或全人F(ab)2的用途。
一方面，提供了用如本文中所描述的小鼠來制造永生細(xì)胞系的用途。在一個實(shí)施方案中，所述永生細(xì)胞系包含這樣的核酸序列:其編碼與包含小鼠恒定區(qū)核酸序列的核酸序列可操作連接的人V λ或VK結(jié)構(gòu)域。一方面，提供了用本文中所描述的小鼠來制造雜交瘤或四價體瘤(quadroma)的用途。一方面，提供了細(xì)胞，其包含如本文中所描述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自全能細(xì)胞、多能細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)和ES細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為小鼠細(xì)胞，例如小鼠ES細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞對于經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座為純合的。一方面，提供了細(xì)胞，其包含編碼第一多肽的核酸序列，所述第一多肽包含與人重鏈恒定區(qū)序列相融合的第一體細(xì)胞突變的人Vκ或νλ序列。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還包含第二多肽鏈，其包含與人輕鏈恒定區(qū)序列相融合的第二體細(xì)胞突變的人V κ或νλ序列。在一個實(shí)施方案中，所述第一多肽的人Vk或νλ序列與所述第二多肽的人V κ或νλ序列同源。在一個實(shí)施方案中，所述第一多肽的Vk或νλ和所述第二多肽的人Vk或νλ在締合時特異性地結(jié)合目的抗原。在具體的實(shí)施方案中，所述第一多肽包含基本上由人V κ組成的可變結(jié)構(gòu)域，所述第二多肽包含由與所述第一多肽的人Vk同源的人Vk組成的可變結(jié)構(gòu)域，且所述人恒定區(qū)序列為IgG序列。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，293細(xì)胞，HeLa細(xì)胞和表達(dá)病毒核酸序列的人視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如PERC.6 細(xì)胞)。

一方面，提供了小鼠體細(xì)胞，其包含含有如本文所述的遺傳修飾的染色體。一方面，提供了小鼠生殖細(xì)胞，其包含含有如本文所述的遺傳修飾的核酸序列。一方面，提供了衍生自如本文中所描述的小鼠的多能、誘導(dǎo)的多能或全能細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞。一方面，提供了本文所描述的細(xì)胞用于生產(chǎn)小鼠，細(xì)胞或治療性蛋白(例如抗體或其它抗原結(jié)合蛋白)的用途。一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含上游和下游并置了 23-mer間隔的RSS的人Dh基因區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含:與包含人Vk基因區(qū)段的人基因組序列同源的同源臂。在一個實(shí)施方案中，靶向構(gòu)建體包含全部或基本上全部的人Dh基因區(qū)段，每個都在上游和下游并置了 23-mer間隔的RSS。一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含上游并置了 12-mer間隔的RSS的人Jk基因區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第一同源臂，其含有與上游和下游并置了23-mer間隔的RSS的人基因組Dh基因序列的同源性。在一個實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第二同源臂，其含有與人基因組J基因序列的同源性、或含有與小鼠重鏈恒定區(qū)序列的同源性或含有與小鼠恒定區(qū)重鏈序列上游的J-C基因間序列的同源性。一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含下游并置了 23-mer間隔的RSS的人V λ區(qū)段、上游和下游并置了 12-mer間隔的RSS的人Dh區(qū)段、以及人J區(qū)段，所述J區(qū)段選自上游并置了 23-mer間隔的RSS的Jk區(qū)段，上游并置于23-mer間隔的RSS的人J λ區(qū)段以及上游并置了 23-mer間隔的RSS的人Jh區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含同源臂，其含有與小鼠恒定區(qū)序列、J-C基因間小鼠序列和/或人V λ序列的同源性。在一個實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含人λ輕鏈可變區(qū)序列，其含有人λ輕鏈基因座的簇A的片段。在具體的實(shí)施方案中，所述人λ輕鏈基因座簇A的片段從hV λ 3-27延伸至hV λ 3-1 ο在一個實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含人λ輕鏈可變區(qū)序列，其含有人λ輕鏈基因座的簇B的片段。在具體的實(shí)施方案中，所述人λ輕鏈基因座的簇B的片段從hV λ 5-52 延伸至 hV λ 1-40。在一個實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含人λ輕鏈可變區(qū)序列，其含有簇A的基因組片段和簇B的基因組片段。在一個實(shí)施方案中，所述人λ輕鏈可變區(qū)序列包含簇A的至少一個基因區(qū)段和簇B的至少一個基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述人λ輕鏈可變區(qū)序列包含簇B的至少一個基因區(qū)段和簇C的至少一個基因區(qū)段。一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含上游和下游并置了 23-mer間隔的RSS的人Dh區(qū)段，所述23-mer間隔的RSS通常在自然界中被發(fā)現(xiàn)位于J κ，JH，VA *VH區(qū)段的側(cè)翼。在一個實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第一同源臂，其與人V-J基因間區(qū)同源或與包含人V基因區(qū)段的人基因組序列同源。在一個實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第二同源臂，其與人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列同源。在具體的實(shí)施方案中，所述人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列選自CJ，鉸鏈，Ch2，Ch3及它們的組合。在一個實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含上游側(cè)接了 12-mer RSS的人J基因區(qū)段。在一個實(shí)施`方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第二同源臂，其含有與上游側(cè)接了 12-mer RSS的J基因區(qū)段的同源性。在一個實(shí)施方案中，所述J基因區(qū)段選自人Jk，人JX和人JH。一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含上游和下游并置了 23-mer間隔的RSS的人Dh區(qū)段，以及位點(diǎn)特異性重組酶識別序列，例如被位點(diǎn)特異性重組酶(例如Cre，F(xiàn)lp或Dre蛋白)識別的序列。一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含人νλ或人VK區(qū)段，上游和下游并置了12-mer或23-mer間隔的RSS的Dh區(qū)段，以及具有12-mer或23-mer間隔的RSS的人J區(qū)段，其中所述12-mer或23-mer間隔的RSS位于緊鄰人J區(qū)段5’處(即相對于轉(zhuǎn)錄的方向)。在一個實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含與3’23-mer間隔的RSS并置的人V λ、上游和下游并置了 12-mer間隔的RSS的人Dh區(qū)段，和并置了 5’ 23-mer間隔的RSS的人Jk區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含并置了 3’ 12-mer間隔的RSS的人Vk，上游和下游并置了 23-mer間隔的RSS的人Dh區(qū)段以及并置了 5’ 12-mer間隔的RSS的人JX區(qū)段。一方面，提供了靶向載體，其包含:(a)第一靶向臂和第二靶向臂，其中所述第一和第二靶向臂獨(dú)立地選自人和小鼠靶向臂，其中所述靶向臂將載體導(dǎo)向內(nèi)源或經(jīng)修飾的免疫球蛋白V區(qū)基因基因座；和(b)人'基因區(qū)段的連續(xù)序列或人'基因區(qū)段的連續(xù)序列以及至少一個人J κ基因區(qū)段，其中所述連續(xù)序列選自⑴hVK4-l至hVK 1-6以及JkI，
(ii)hVK 4-1 至 hVK 1-6 以及 Jk I 至 Jk 2，(iii)hVK 4-1 至 hV κ 1-6 以及 Jk I 至 Jk 3，(iv) hV κ 4-1 至 hV κ 1-6 以及 J κ I 至 J κ 4，(v) hV κ 4-1 至 hV κ 1-6 以及 Jk I 至 J κ 5，(vi)hVK 3-7 至 hVK 1-16，(vii)hVK 1-17 至 hV κ 2-30, (viii)hVK 3-31 至 hV κ 2-40，和(ix)它們的組合。在一個實(shí)施方案中，將載體導(dǎo)向內(nèi)源或經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座的靶向臂與內(nèi)源或經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座處的序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同。一方面，提供了本文所描述的核酸構(gòu)建體用于制造小鼠、細(xì)胞或治療性蛋白(例如抗體或其它抗原結(jié)合蛋白)的用途。一方面，提供了來自本文所描述的小鼠的核酸序列用于制造細(xì)胞系的用途，所述細(xì)胞系用于制造人治療劑。在一個實(shí)施方案中，所述人治療劑為結(jié)合蛋白，其包含與人重鏈恒定序列相融合的人輕鏈可變序列(例如衍生自人Vλ或人VK區(qū)段)。在一個實(shí)施方案中，所述人治療劑包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽為人λ或κ免疫球蛋白輕鏈，所述第二多肽包含與人重鏈恒定序列相融合的人V λ或人V κ可變序列。一方面，提供了表達(dá)系統(tǒng)，其包含以DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞，所述構(gòu)建體編碼包含與人Ch結(jié)構(gòu)域相融合的經(jīng)體細(xì)胞突變的人\結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個實(shí)施方案中，所述表達(dá)系統(tǒng)還包含核苷酸序列，其編碼與人Q結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白\結(jié)構(gòu)域，其中所述與人Q結(jié)構(gòu)域相融合的\結(jié)構(gòu)域是與人Ch結(jié)構(gòu)域相融合的'結(jié)構(gòu)域的同源輕鏈。在一個實(shí)施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞選自CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，Vero細(xì)胞，293細(xì)胞以及表達(dá)病毒基因的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如PER.C6 細(xì)胞)。一方面，提供了用于制造結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括:從來自本文所描述的小鼠的細(xì)胞的、編碼與C0區(qū)相融合的 '區(qū)的基因獲得編碼\結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；將所述編碼'區(qū)序列的核苷酸序列與編碼人Ch區(qū)的基因同框克隆以形成人結(jié)合蛋白序列；在合適的細(xì)胞中表達(dá)所述人結(jié)合蛋白序列。在一個實(shí)施方案中，小鼠經(jīng)過了目的抗原免疫接種，且所述與Ch區(qū)融合的\區(qū)特異性結(jié)合(例如以微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的Kd)所述目的抗原的表位。在一個實(shí)施方案中，編碼與Ch區(qū)融合的\區(qū)的核苷酸序列是在小鼠中經(jīng)體細(xì)胞突變的。在一個實(shí)施方案中，所述合適的細(xì)胞選自B細(xì)胞，雜交瘤，四價體瘤，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，293細(xì)胞，HeLa細(xì)胞和表達(dá)病毒核酸序列的人視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如PERC.6 細(xì)胞)。在一個實(shí)施方案中，所述Ch區(qū)包含人IgG同種型。在具體的實(shí)施方案中，所述人IgG選自IgGl，IgG2和IgG4。在另一個具體實(shí)施方案中，所述人IgG為IgGl。在另一個具體實(shí)施方案中，所述人IgG為IgG4。在另一個具體實(shí)施方案中，所述人IgG4是經(jīng)修飾的IgG4。在一個實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的IgG4在鉸鏈區(qū)包含取代。在具體的實(shí)施方案中，相對于野生型人IgG4，所述經(jīng)修飾的IgG4在氨基酸殘基228處包含取代，編號是根據(jù)Kabat的EU編號索引。在具體的實(shí)施方案中，在氨基酸殘基228處的取代為S228P取代，編號是根據(jù)Kabat的EU編號索引。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還包含編碼\結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，所述\結(jié)構(gòu)域來自同與Ch區(qū)相融合的\結(jié)構(gòu)域同源的輕鏈，并且所述方法還包括表達(dá)編碼與人C κ或Cλ結(jié)構(gòu)域相融合的同 源\結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。一方面，提供了制造經(jīng)遺傳修飾的小鼠的方法，所述方法包括用一個或多個人免疫球蛋白輕鏈基因區(qū)段替代內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的一個或多個小鼠免疫球蛋白重鏈基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述替代是用一個或多個功能性人輕鏈區(qū)段(即'和叉區(qū)段)替代全部或基本上全部功能性小鼠免疫球蛋白重鏈區(qū)段(即VH，Dh和Jh區(qū)段)。在一個實(shí)施方案中，所述替代是用全部或基本上全部人V λ 區(qū)段以及至少一個JX或Jk區(qū)段替代全部或基本上全部功能性小鼠重鏈VH、D1^P Jh區(qū)段。在具體的實(shí)施方案中，所述替代包括全部或基本上全部功能性人J λ或J K區(qū)段。一方面，提供了用于制造表達(dá)多肽的小鼠的方法，所述多肽包含衍生自與小鼠重鏈恒定區(qū)相融合的人免疫球蛋白V λ 和/或JX *JK區(qū)段的序列，其包含用至少一個人νλ 區(qū)段以及至少一個人*JK區(qū)段替代內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白可變區(qū)段(VH，D1^p Jh)，其中所述替代在多能、誘導(dǎo)的多能或全能小鼠細(xì)胞中以形成經(jīng)遺傳修飾的小鼠祖細(xì)胞；所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠祖細(xì)胞被引入小鼠宿主中；并且包含經(jīng)遺傳修飾的祖細(xì)胞的所述小鼠宿主經(jīng)受孕以形成包含衍生自經(jīng)遺傳修飾的小鼠祖細(xì)胞的基因組的小鼠。在一個實(shí)施方案中，所述宿主為胚胎。在具體的實(shí)施方案中，所述宿主選自小鼠前-桑葚胚(例如8-或4-細(xì)胞階段)，四倍體胚胎，胚胎細(xì)胞聚集物或胚泡。一方面，提供了用于制造如本文所述的經(jīng)遺傳修飾的小鼠的方法，所述方法包括通過核轉(zhuǎn)移將含有本文所述的修飾的核酸引入細(xì)胞中，以及在合適的條件下(例如包括培養(yǎng)所述細(xì)胞和在代孕母親中孕育包含所述細(xì)胞的胚胎)維持所述細(xì)胞以發(fā)育成為如本文所述的小鼠。一方面，提供了用于制造經(jīng)修飾的小鼠的方法，所述方法包括如本文所述的修飾小鼠ES細(xì)胞或多能或全能或誘導(dǎo)的多能小鼠細(xì)胞以包括與免疫球蛋白重鏈恒定序列可操作連接的一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變基因區(qū)段，培養(yǎng)所述ES細(xì)胞，將所培養(yǎng)的ES細(xì)胞引入宿主胚胎中以形成嵌合胚胎，以及將所述嵌合胚胎引入合適的宿主小鼠中以發(fā)育成為經(jīng)修飾的小鼠。在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段為人λ或人κ基因區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段包含人V λ或人Vk區(qū)段和一個或多個JX，Jk或Jh區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述重鏈恒定基因序列為人序列，其選自CH1，鉸鏈，Ch2，Ch3以及它們的組合。在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變基因區(qū)段替代內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的全部或基本上全部功能性內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因區(qū)段，并且所述重鏈恒定序列為包含ChI，鉸鏈，Ch2和Ch3的小鼠序列。一方面，提供了在本文所述的小鼠中制造的免疫球蛋白可變區(qū)(VR)(例如包含與人叉或Jh或Dh和Jh或Dh和叉相融合的人\序列)。在具體的實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白VR衍生自選自Vk區(qū)段和νλ區(qū)段的種系人基因區(qū)段，其中所述VR是由小鼠的經(jīng)重排的序列編碼的，其中所述經(jīng)重排的序列是經(jīng)體細(xì)胞超突變的。在一個實(shí)施方案中，所述經(jīng)重排的序列包含I至5個體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，所述經(jīng)重排的序列包含至少6，7，8，9或10個體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，所述經(jīng)重排的序列包含超過10個體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，所述經(jīng)重排的序列與一個或多個人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列(例如選自人或小鼠ChI，鉸鏈，Ch2，Ch3以及它們的組合)相融合。一方面，提供了在本文所述的小鼠中制造的結(jié)合蛋白的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，所述VR與一個或多個人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列(例如選自人或小鼠CH1，鉸鏈，Ch2，Ch3以及它們的組合)相融合。一方面，提供了輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其由衍生自本文所述的小鼠的核酸序列編碼。
一方面，提供了抗體或其抗原結(jié)合片段(例如Fab，F(xiàn)(ab)2，scFv)，其在本文所述的小鼠中制造，或衍生自在本文所述的小鼠中制造的序列。


圖1A描繪了小鼠重鏈基因座的圖示(不按比例)。所述小鼠重鏈基因座長度為約3Mb并且含有約200個重鏈可變(Vh)基因區(qū)段，13個重鏈多樣性(Dh)基因區(qū)段和4個重鏈連接(Jh)基因區(qū)段以及增強(qiáng)子(Enh)和重鏈恒定(Ch)區(qū)。圖1B描繪了人κ輕鏈基因座的圖示(不按比例)。所述人κ輕鏈基因座被復(fù)制成為相反極性的遠(yuǎn)端和近端片段重疊群(contig)，分別跨越約440kb和600kb。在所述兩個片段重疊群之間為約SOOkb的DNA，其被認(rèn)為不含V κ基因區(qū)段。人κ輕鏈基因座包含約76個Vk基因區(qū)段，5個Jk基因區(qū)段和內(nèi)含子增強(qiáng)子(Enh)以及單一恒定區(qū)(CO。圖2顯示了將40個人Vk和5個人J κ基因區(qū)段逐步插入小鼠重鏈基因座中的靶向策略。顯示了帶有重組酶識別位點(diǎn)(Rl，R2等)的潮霉素(HYG)和新霉素(NEO)選擇盒。圖3顯示了經(jīng)修飾的小鼠重鏈基因座，其包含與小鼠Ch區(qū)可操作連接的人Vk和Jk基因區(qū)段。

圖4Α顯不了用于將人νλ和單一人基因區(qū)段逐步插入小鼠重鏈基因座中的示例性靶向策略。顯示了帶有重組酶識別位點(diǎn)(R1，R2等)的潮霉素(HYG)和新霉素(NEO)選擇盒。圖4B顯示了用于將人VA和四個人JA基因區(qū)段逐步插入小鼠重鏈基因座中的示例性靶向策略。顯示了帶有重組酶識別位點(diǎn)(R1，R2等)的潮霉素(HYG)和新霉素(NEO)選擇盒。圖5A顯不了將人V λ ,人Dh和人Jh基因區(qū)段逐步插入小鼠重鏈基因座中的不例性靶向策略。顯示了帶有重組酶識別位點(diǎn)(Rl，R2等)的潮霉素(HYG)和新霉素(NEO)選擇盒。圖5Β顯示了將人νλ，ADh和人Jk基因區(qū)段逐步插入小鼠重鏈基因座中的示例性靶向策略。顯示了帶有重組酶識別位點(diǎn)(Rl，R2等)的潮霉素(HYG)和新霉素(NEO)選擇盒。圖6A顯示了就B220和IgM的表面表達(dá)染色的脾細(xì)胞的等高線圖，所述細(xì)胞來自代表性野生型(WT)和對置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人V K和五個人Jk基因區(qū)段為純合的代表性小鼠(6hV κ -5hJ κ HO)。圖6B顯示了⑶19+B細(xì)胞上的脾細(xì)胞門控的等高線圖，所述⑶19+B細(xì)胞就免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色，所述CD19+B細(xì)胞來自代表性野生型(WT)和對置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人Vk和五個人Jk基因區(qū)段為純合的代表性小鼠(6hVκ -5hJκ HO)。圖6C顯示了在來自從野生型(WT)和對于置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人Vk和五個人J κ基因區(qū)段為純合的小鼠(6hV κ-5hJ κ HO)收獲的脾臟中⑶19+B細(xì)胞、過渡性B細(xì)胞(CD19+IgMhiIgDint)和成熟 B 細(xì)胞(CD19+IgMintIgDhi)的總數(shù)。圖7A顯示了來自野生型小鼠(WT)和對于置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人Vk和五個人J K基因區(qū)段為純合的小鼠(6hV K-5hJ K HO)的、就免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的對單態(tài)(singlet)門控的骨髓的等高線圖。在每幅點(diǎn)圖上標(biāo)記了不成熟的、成熟的和原/前B細(xì)胞。圖7B顯示了從野生型小鼠(WT)和對于置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人Vk和五個人Jk基因區(qū)段為純合的小鼠(6hV K-5hJ K HO)的股骨中分離的骨髓中前/原(B220+IgM_)，不成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+) B 細(xì)胞的總數(shù)。圖7C顯示了來自野生型小鼠(WT)和對于置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人Vk和五個人J K基因區(qū)段為純合的小鼠(6hV K-5hJ K HO)的、就ckit+和⑶43+染色的對⑶19+門控的骨髓的等高線圖。在每幅點(diǎn)圖上標(biāo)記了原和前B細(xì)胞。圖7D顯示了在從野生型小鼠(WT)和對于置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人V K和五個人Jk基因區(qū)段為純合的小鼠(6hV K-5hJ K HO)的股骨收獲的骨髓中，原B(CD19+CD43+ckit+)和前 B (CD19+CD43- ckit-)細(xì)胞的數(shù)目。圖7E顯示了來自野生型小鼠(WT)和對于置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人Vk和五個人Jk基因區(qū)段為純合的小鼠(6hV K-5hJ K HO)的、就⑶19和⑶43染色的對單態(tài)門控的骨髓的等高線圖。在每幅點(diǎn)圖上標(biāo)記了不成熟的、前和原B細(xì)胞。圖7F顯示了來自野生型小鼠(WT)和對于置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人Vk和五個人Jk基因區(qū)段為純合的小鼠(6hVk-5hJk HO)的、表達(dá)免疫球蛋白M(IgM)的、對前B細(xì)胞(CD19+CD43int)門控的骨髓的直方圖。

圖7G顯示了在從野生型(WT)和對于置于內(nèi)源重鏈基因座處的六個人V K和五個人J K基因區(qū)段為純合的小鼠(6hV K-5hJ K HO)的股骨中收獲的骨髓中，IgM+前B細(xì)胞(CD19+IgM+CD43int)和不成熟的 B 細(xì)胞(CD19+IgM+CD43_)的數(shù)目。圖8A顯示了來自下列小鼠的、就IgX +和IgK +的表達(dá)染色的、對⑶19+門控的脾細(xì)胞的等高線圖，所述小鼠為含有野生型重鏈基因座和用人Vk &JK基因區(qū)段替代內(nèi)源Vk和Jk基因區(qū)段的小鼠(WT)和對于內(nèi)源重鏈基因座處的三十個hV κ和五個Jk基因區(qū)段為純合并且以人Vk和!^基因區(qū)段對內(nèi)源Vk和!^基因區(qū)段的替代的小鼠(30hVK -5hJκ HO)。圖8B顯示了從下列小鼠的股骨中分離的、就IgX和IgK的表達(dá)染色的、對不成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B細(xì)胞門控的骨髓等高線圖，所述小鼠為含有野生型重鏈基因座和用人Vk及Jk基因區(qū)段替代內(nèi)源Vk及Jk基因區(qū)段的小鼠(WT)和對于內(nèi)源重鏈基因座處的三十個hV κ和五個J κ基因區(qū)段為純合并且以人V κ和!^基因區(qū)段對內(nèi)源V κ和Jk基因區(qū)段的替代的小鼠(30hV κ-5hJ κ HO)。圖9顯示了從對于小鼠重鏈基因座處的三十個hVK和五個Jk基因區(qū)段為純合并且以人Vk和!^基因區(qū)段對內(nèi)源Vk和!^基因區(qū)段的替代的幼稚小鼠的脾細(xì)胞RNA擴(kuò)增的十二個獨(dú)立的RT-PCR克隆的V κ -J κ -mlgG連接的核苷酸序列比對。小寫堿基表示由重組過程中的突變和/或N添加產(chǎn)生的非種系堿基。包括了人為的間隔(句點(diǎn))來恰當(dāng)?shù)乇葘蚣?區(qū)以及顯示對IgGl，IgG2a/c和IgG3引發(fā)的克隆的小鼠重鏈IgG核苷酸序列的比對。發(fā)明詳述詞語“雙特異性結(jié)合蛋白”包括能夠選擇性結(jié)合兩種或更多種表位的結(jié)合蛋白。雙特異性結(jié)合蛋白包含兩種不同的多肽，所述多肽包括與第一 Ch區(qū)融合的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域('I)和與第二 Ch區(qū)融合的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域('2)。一般地，所述第一和第二 Ch區(qū)是相同的，或者它們僅以一個或多個氨基酸取代(例如如本文中所述的)而不同。和'2特異性地結(jié)合不同的表位一在兩個不同的分子(例如抗原)上或者在同一分子上(例如在相同的抗原上)。如果雙特異性結(jié)合蛋白選擇性地結(jié)合兩個不同的表位(第一表位和第二表位)，則'I對于所述第一表位的親和力一般將比'I對所述第二表位的親和力低至少一個至兩個或三個或四個數(shù)量級，對于'2反之亦然。雙特異性結(jié)合蛋白所識別的表位可在相同或不同的靶標(biāo)上(例如在相同或不同的抗原上)?？赏ㄟ^例如組合識別相同抗原的不同表位的'I和'2來制備雙特異性結(jié)合蛋白。例如，可將編碼識別相同抗原的不同表位的\序列的核酸序列與編碼不同Ch區(qū)的核酸序列相融合，并且此類序列可被表達(dá)在表達(dá)免疫球蛋白輕鏈的細(xì)胞中，或者可被表達(dá)在不表達(dá)免疫球蛋白輕鏈的細(xì)胞中。典型的雙特異性結(jié)合蛋白具有兩條重鏈，每條具有三個輕鏈CDR，后跟(N-末端至C-末端)ChI結(jié)構(gòu)域，鉸鏈，CH2結(jié)構(gòu)域和(^3結(jié)構(gòu)域，以及免疫球蛋白輕鏈，所述免疫球蛋白輕鏈:不賦予抗原結(jié)合特異性但是能夠與每條重鏈相締合；或者，能夠與每條重鏈相締合且能夠結(jié)合'I和/或'2所結(jié)合的一個 或多個表位；或者能夠與每條重鏈相締合并且使得所述重鏈中的一條或兩條能夠與一個或兩個表位相結(jié)合或輔助這種結(jié)合。因此，兩種一般類型的雙特異性結(jié)合蛋白為(I)VJ-Ch(二聚體)，和(2)'1_Ch:輕鏈+VJ-Ch:輕鏈，其中所述輕鏈?zhǔn)窍嗤虿煌?。在任一種情形中，所述Ch(即所述重鏈恒定區(qū))可如本文中所述地被差異化地修飾(例如，以便有差異地結(jié)合A，以便增加血清半衰期等)，或者可以是相同的。當(dāng)與表達(dá)序列相關(guān)使用時，術(shù)語“細(xì)胞”包括適于表達(dá)重組核酸序列的任何細(xì)胞。所述細(xì)胞包括:原核生物和真核生物(單細(xì)胞或多細(xì)胞)的那些，細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌菌株，芽孢桿菌菌株，鏈霉菌菌株等)，分枝桿菌細(xì)胞，真菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母，裂殖酵母，畢赤酵母，甲醇型酵母等)，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞(例如SF-9，SF-21，桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞，粉紋夜蛾等，非人動物細(xì)胞，人細(xì)胞，B細(xì)胞,或細(xì)胞融合物例如,雜交瘤或四價體瘤。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為人，猴，猿，倉鼠，大鼠或小鼠細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為真核的并且選自下列細(xì)胞:CH0(例如CHO Kl, DXB-1ICHO, Veggie-CHO)，COS (例如 C0S-7)，視網(wǎng)膜細(xì)胞，Vero, CVl,腎(例如 HEK293, 293EBNA, MSR293, MDCK, HaK,BHK)，HeLa, H印G2，WI38, MRC5, Colo205, HB8065, HL-60 (例如 BHK21)，Jurkat, Daudi,A431 (表皮)，CV-1, U937, 3T3, L 細(xì)胞，C127 細(xì)胞，SP2/0, NS-O, MMT060562, Sertoli 細(xì)胞，BRL3A細(xì)胞，HT1080細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，以及源自前述細(xì)胞的細(xì)胞系。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含一個或多個病毒基因，例如表達(dá)病毒基因的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如PER.C6 細(xì)胞)。當(dāng)以“與…同源”的意思使用時(例如與第二 \結(jié)構(gòu)域“同源”的第一 \結(jié)構(gòu)域)，術(shù)語“同源”意在包括指根據(jù)本發(fā)明的小鼠所制造的同一結(jié)合蛋白的兩個\結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系。例如，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案經(jīng)遺傳修飾的小鼠(例如具有重鏈基因座的小鼠，在所述重鏈基因座中VipD1^P Jh區(qū)被'和叉區(qū)替代)制造抗體樣結(jié)合蛋白，其具有兩條相同的、由與第一人'結(jié)構(gòu)域相融合的相同的小鼠CHg (例如IgG同種型)構(gòu)成的多肽鏈，以及兩條相同的、由與第二人\結(jié)構(gòu)域相融合的相同的小鼠Q區(qū)構(gòu)成的多肽鏈。在于小鼠中進(jìn)行克隆選擇的過程中，通過克隆選擇過程選擇所述第一和第二人\結(jié)構(gòu)域使得其在單一抗體樣結(jié)合蛋白的情境中一起出現(xiàn)。因此，作為克隆選擇過程的結(jié)果而一起出現(xiàn)在單一抗體樣分子中的第一和第二 \結(jié)構(gòu)域被稱為是“同源”的。相反，出現(xiàn)在第一抗體樣分子中的\結(jié)構(gòu)域和出現(xiàn)在第二抗體樣分子中的\結(jié)構(gòu)域是非同源的，除非所述第一和第二抗體樣分子具有相同的重鏈(即除非與所述第一人重鏈區(qū)融合的'結(jié)構(gòu)域和與所述第二人重鏈區(qū)融合的\結(jié)構(gòu)域是相同的)。詞語“互補(bǔ)決定區(qū)”或術(shù)語“⑶R”包括由生物體的免疫球蛋白基因的核酸序列所編碼的氨基酸序列，其通常 (即在野生型動物中)出現(xiàn)在免疫球蛋白分子(例如抗體或T細(xì)胞受體)的輕鏈或重鏈的可變區(qū)中的兩個框架區(qū)之間。CDR可被例如種系序列或者經(jīng)重排或未經(jīng)重排的序列編碼，并且例如可被幼稚或成熟B細(xì)胞或T細(xì)胞編碼。在某些情形中(例如對于CDR3)，CDR可被不連續(xù)(例如在未重排的核酸序列中)但在B細(xì)胞核酸序列中是連續(xù)的兩個或更多個序列(例如種系序列)編碼，例如作為剪接或連接序列(例如V-D-J重組以形成重鏈⑶R3)的結(jié)果。詞語“基因區(qū)段”或“區(qū)段”包括指V (輕或重)或D或J (輕或重)免疫球蛋白基因區(qū)段，其包括免疫球蛋白基因座(在例如人和小鼠中)處的未重排序列，其可參與重排(由例如內(nèi)源重組酶介導(dǎo)的)以形成經(jīng)重排的V/J或V/D/J序列。除非另行指出，所述V，D和J區(qū)段包括允許根據(jù)12/23規(guī)則進(jìn)行V/J重組或V/D/J重組的重組信號序列(RSS)。除非另行指出，所述區(qū)段還包括它們在自然界中與之相關(guān)聯(lián)的序列，或者其功能性等同體(例如對于V區(qū)段，啟動子和前導(dǎo)子)。詞語“重鏈”或“免疫球蛋白重鏈”包括來自任何生物體的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列，并且除非另外指出，其包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)。除非另外指出，Vh結(jié)構(gòu)域包括三個重鏈⑶R和四個框架(FR)區(qū)。重鏈片段包括⑶R，⑶R和FR，以及它們的組合。典型的重鏈基本上由下列組成:在可變結(jié)構(gòu)域之后(從N-末端至C-末端)，SCH1結(jié)構(gòu)域，鉸鏈，Ch2結(jié)構(gòu)域，Ch3結(jié)構(gòu)域，以及任選地Ch4結(jié)構(gòu)域(例如在IgM或IgE的情形中)和跨膜(M)結(jié)構(gòu)域(例如在淋巴細(xì)胞上的膜結(jié)合免疫球蛋白的情形中)。重鏈恒定區(qū)是從重鏈的FR4之外延伸至C-末端的重鏈區(qū)(從N-末端側(cè)至C-末端側(cè))。具有小偏差(例如從C-末端重鏈恒定區(qū)截短一個、兩個、三個或數(shù)個氨基酸)的重鏈恒定區(qū)以及具有序列修飾的重鏈恒定區(qū)(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個氨基酸取代)將被詞語“重鏈恒定區(qū)”所涵蓋。可在一個或多個位置進(jìn)行氨基酸取代，所述位置為例如(參照免疫球蛋白恒定區(qū)(例如人IgG恒定區(qū))的 EU 編號)228，233，234，235，236，237，238，239，241，248，249，250，252，254，255，256，258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295,296，297，298，301，303，305，307，308，309，311，312，315，318，320，322，324，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，337，338，339，340，342，344，356，358，359，360，361，362，373，375，376，378，380，382，383，384，386，388，389，398，414，416，419，428，430，433，434，435，437，438 和 439。例如(而不是通過限制的方式)，可修飾重鏈恒定區(qū)以展現(xiàn)出增強(qiáng)的血清半衰期(與沒有所述修飾的相同重鏈恒定區(qū)相比)且在下列位置具有修飾:250(例如E或Q) ; 250和428 (例如L或F) ; 252 (例如L/Y/F/W或T)，254 (例如S或T)，以及256 (例如S/R/Q/E/D或T);或者428和/或433 (例如L/R/SI/P/Q或K)和/或434 (例如H/F或Y)處的修飾；或者250和/或428處的修飾；或者307或308 (例如308F，V308F)以及434處的修飾。在另一個實(shí)例中，所述修飾可包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L，2591 (例如 V259I)和 308F(例如 V308F)修飾；433K(例如 Η433Κ)和 434(例如 434Υ)修飾;252，254 和 256 (例如 252Υ, 254Τ 和 256Ε)修飾;250Q 和 428L 修飾(例如 T250Q 和M428L) ; 307 和 / 或 308 修飾(例如 308F 或 308Ρ)。詞語“輕鏈”包括來自任何生物體的免疫球蛋白輕鏈恒定(CJ區(qū)序列，并且除非另外指出包括人κ和λ輕鏈。除非另外指出，輕鏈可變(')結(jié)構(gòu)域通常包括三個輕鏈CDR和四個框架(FR)區(qū)。一般地，全長輕鏈('+CJ從氨基末端至羧基末端包括'結(jié)構(gòu)域(其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)和Cl區(qū)?？膳c本發(fā)明一起使用的輕鏈(Vl+CJ包括例如那些:不與結(jié)合蛋白所選擇性結(jié)合的第一或第二 (在雙特異性結(jié)合蛋白的情形中)表位(例如與Ch結(jié)構(gòu)域融合的\結(jié)構(gòu)域所選擇性結(jié)合的表位)選擇性結(jié)合的。不選擇性結(jié)合與Ch結(jié)構(gòu)域相融合的\所結(jié)合的表位的\結(jié)構(gòu)域包括在現(xiàn)有抗體文庫(濕文庫或生物信息學(xué)的)中就最常采用的輕鏈進(jìn)行篩·選時可被鑒別出的那些，其中所述輕鏈不實(shí)質(zhì)上干擾結(jié)合蛋白的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力和/或選擇性。合適的輕鏈包括能夠結(jié)合(單獨(dú)地或者與同C0區(qū)相融合的其同源\相組合)與Ch區(qū)相融合的\所特異性結(jié)合的表位的那些。詞語“微摩爾范圍”意在指1-999微摩爾；詞語“納摩爾范圍”意在指1-999納摩爾；詞語“皮摩爾范圍”意在指1-999皮摩爾。術(shù)語〃非人動物〃意在包括任何脊椎動物，例如圓口類，硬骨魚，軟骨魚(例如鯊魚和鰩魚)，兩棲動物，爬行動物，哺乳動物和鳥類。合適的非人動物包括哺乳動物。合適的哺乳動物包括非人靈長類，山羊，綿羊，豬，狗，母牛和嚙齒類動物。合適的非人動物選自包括大鼠和小鼠的嚙齒類動物。在一個實(shí)施方案中，所述非人動物為小鼠。小鼠，核苷酸序列和結(jié)合蛋白提供了由免疫球蛋白基因座的元件編碼的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含與免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。此外，提供了多種策略來遺傳修飾小鼠中的免疫球蛋白重鏈基因座，以編碼含有由免疫球蛋白輕鏈基因座所編碼的元件的結(jié)合蛋白。此類經(jīng)遺傳修飾的小鼠代表用于產(chǎn)生下列獨(dú)特的結(jié)合蛋白群體的來源:所述結(jié)合蛋白具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)但與傳統(tǒng)抗體相比顯示出增強(qiáng)的多樣性。本文中所描述的結(jié)合蛋白方面包括由經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座所編碼的結(jié)合蛋白，所述基因座經(jīng)修飾從而通常(即在野生型動物中)編碼免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(或其部分)的基因區(qū)段與編碼重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列可操作地連接。在輕鏈基因區(qū)段重排之后，獲得了經(jīng)重排的核苷酸序列，其包含編碼與編碼重鏈恒定區(qū)的序列相融合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列。此序列編碼具有與重鏈恒定區(qū)相融合的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的多肽。因此，在一個實(shí)施方案中，所述多肽基本上由下列組成(從N-末端至C-末端):'結(jié)構(gòu)域，ChI區(qū)，鉸鏈，Ch2區(qū)，Ch3區(qū)以及任選地Ch4區(qū)。在本文中所描述的經(jīng)修飾的小鼠中，制造了也包含同源輕鏈的此類結(jié)合蛋白，其中在一個實(shí)施方案中，所述同源輕鏈與上文所述的多肽配對以制造為抗體樣的結(jié)合蛋白，但是所述結(jié)合蛋白包含與C0區(qū)相融合的\區(qū)一而非Vh區(qū)。在多種實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的小鼠制造結(jié)合蛋白，其包含與Ch區(qū)相融合的\區(qū)(雜合重鏈)，其中所述雜合重鏈的'區(qū)展現(xiàn)出增強(qiáng)的體細(xì)胞超突變程度。在這些實(shí)施方案中，所述增強(qiáng)是在與(^區(qū)(輕鏈)相融合的'區(qū)。在某些實(shí)施方案中，與同Q區(qū)相融合的\區(qū)相比，雜合重鏈的\區(qū)展現(xiàn)出約1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍或5倍或更多的體細(xì)胞超突變。在某些實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的小鼠響應(yīng)于抗原而展現(xiàn)出包含雜合重鏈的'區(qū)的結(jié)合蛋白群體，其中與在響應(yīng)于相同抗原的野生型小鼠中所觀察到的相比，所述結(jié)合蛋白群體展現(xiàn)出平均約1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍，5倍或更多的所述雜合重鏈的\區(qū)中的體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，所述雜合重鏈的\區(qū)中的體細(xì)胞超突變包括CDR3中的一個或多個、或者兩個或更多個N添加。在多種實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白包含由下述免疫球蛋白輕鏈序列編碼的可變結(jié)構(gòu)域:與對于在自然界中從內(nèi)源輕鏈基因座重排的輕鏈所觀察到的相比，其包含更大數(shù)目的N添加，例如包含與源自人輕鏈V基因區(qū)段和人(輕鏈或重鏈)J基因區(qū)段的可變結(jié)構(gòu)域相融合的小鼠重鏈恒定區(qū)的結(jié)合蛋白，其中所述人V和人J區(qū)段重排以形成包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10或更多N添加的重排的基因。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的小鼠制造這樣的結(jié)合蛋白:其平均小于野生型抗體(即具有Vh結(jié)構(gòu)域的抗體)并且具有與更小的大小相關(guān)的優(yōu)勢。更小的大小至少部分是通過缺少由Dh區(qū)編碼的氨基酸序列(通常存在于Vh結(jié)構(gòu)域中)而實(shí)現(xiàn)的。更小的大小也可在⑶R3的形成中實(shí)現(xiàn)，所述⑶R3源自例如Vk區(qū)和J κ區(qū)。另一方面，提供了用于提供下列結(jié)合蛋白群體的小鼠和方法，所述結(jié)合蛋白具有經(jīng)體細(xì)胞超突變的\結(jié)構(gòu)域，例如經(jīng)體細(xì)胞突變的人V κ結(jié)構(gòu)域，和例如由包含1-10個或更多個N添加的經(jīng)重排的κ可變基因編碼的人Vκ結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，在沒有用于產(chǎn)生抗體多樣性的Vh區(qū)時，本發(fā)明的小鼠將產(chǎn)生下述結(jié)合蛋白(例如響應(yīng)于抗原的刺激):其V結(jié)構(gòu)域僅為或基本上為\結(jié)構(gòu)域。因此，所述小鼠的克隆選擇過程限于僅從或基本上從具有'結(jié)構(gòu)域而非Vh結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白中選擇。與野生型小鼠(也以某種頻率突變'結(jié)構(gòu)域)中的相比，所述'結(jié)構(gòu)域的體細(xì)胞超突變將同樣頻繁地或?qū)嵸|(zhì)上更頻繁地(例如2至5倍更高，或者更多)。本發(fā)明小鼠中的克隆選擇過程將從經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座產(chǎn)生高親和力結(jié)合蛋白，包括以納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的親和力特異性結(jié)合表位的結(jié)合蛋白。可使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系 統(tǒng)，將編碼此類結(jié)合蛋白的序列用于制作含有人可變區(qū)和人恒定區(qū)的治療性結(jié)合蛋白。在其它實(shí)施方案中，可制作根據(jù)本發(fā)明的小鼠，其中所述小鼠重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因座是失能的，成為無功能的，或者被敲除，且可將全人或嵌合人-小鼠轉(zhuǎn)基因置于所述小鼠中，其中所述轉(zhuǎn)基因中的至少一個含有經(jīng)修飾的重鏈基因座(例如具有與一個或多個重鏈基因序列可操作連接的輕鏈基因區(qū)段)。此類小鼠也可制作如本文所述的結(jié)合蛋白。一方面，提供了用于增加多樣性的方法，包括通過體細(xì)胞超突變或通過\結(jié)構(gòu)域中的N添加，所述方法包括使未重排的輕鏈V基因區(qū)段和未重排的J基因區(qū)段與小鼠C0基因序列可操作連接，使動物暴露于目的抗原，以及從所述動物中分離所述動物的經(jīng)重排和經(jīng)體細(xì)胞超突變的V(輕鏈)/J基因序列，其中所述經(jīng)重排的V(輕鏈)/J基因序列與編碼免疫球蛋白Ch區(qū)的核苷酸序列相融合。在一個實(shí)施方案中，與所述超突變的 '相融合的所述免疫球蛋白重鏈為IgM;在另一個實(shí)施方案中，為IgG;在另一個實(shí)施方案中，為IgE;在另一個實(shí)施方案中，為IgA。
在一個實(shí)施方案中，與對于具有與Q序列可操作地連接的\序列的經(jīng)重排和類別轉(zhuǎn)換的抗體所觀察到的相比，所述經(jīng)體細(xì)胞超突變且經(jīng)類別轉(zhuǎn)換的\結(jié)構(gòu)域含有約2至5倍或更多的體細(xì)胞超突變。在一個實(shí)施方案中，與從同Ch區(qū)相融合的Vh基因表達(dá)的Vh結(jié)構(gòu)域中所觀察到的體細(xì)胞超突變相比，在經(jīng)體細(xì)胞超突變的\結(jié)構(gòu)域中所觀察到的體細(xì)胞超突變數(shù)目大致相同。一方面，提供了用于制造高親和力人'結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括使本發(fā)明的小鼠暴露于目的抗原，允許所述小鼠產(chǎn)生對所述目的抗原的免疫應(yīng)答，以及從所述小鼠分離以高親和力特異性結(jié)合所述目的抗原的、經(jīng)體細(xì)胞突變、類別轉(zhuǎn)換的人\結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，所述包含所述經(jīng)體細(xì)胞突變、經(jīng)類別轉(zhuǎn)換的人'結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白的Kd在納摩爾或皮摩爾的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白基本上由多肽二聚體組成，其中所述多肽基本上由包含與人Ch區(qū)相融合的人'結(jié)構(gòu)域的經(jīng)體細(xì)胞突變、類別轉(zhuǎn)換的結(jié)合蛋白組成。在一個實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白基本上由多肽二聚體和兩條輕鏈組成，其中所述多肽基本上由具有與人Ch區(qū)相融合的人'結(jié)構(gòu)域的經(jīng)體細(xì)胞突變、類別轉(zhuǎn)換的結(jié)合蛋白組成；并且其中所述二聚體的每個多肽都與包含同源輕鏈'結(jié)構(gòu)域及人Q區(qū)的同源輕鏈相締合。一方面，提供了用于體細(xì)胞超突變?nèi)薥基因序列的方法，所述方法包括使人\基因區(qū)段和人I基因區(qū)段與內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白基因座處的內(nèi)源小鼠Ch基因可操作連接，使所述小鼠暴露于目的抗原，以及從所述小鼠獲得結(jié)合所述目的抗原的經(jīng)體細(xì)胞超突變的人\基因序列。在一個實(shí)施方案中，所述方法還包括從所述小鼠獲得'基因序列，所述\基因序列來自與結(jié)合目的抗原的人體細(xì)胞超突變的人八基因序列同源的輕鏈。具有Dh序列 的Vl結(jié)合蛋白在各個方面，包含未重排的免疫球蛋白輕鏈V基因區(qū)段和未重排的(例如輕鏈或重鏈)J基因區(qū)段的小鼠也包含能夠與J區(qū)段重組以形成經(jīng)重排的D/J序列的未重排的DH基因區(qū)段，所述經(jīng)重排的D/J序列繼而能夠與輕鏈V區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的可變序列，其衍生自(a)輕鏈V區(qū)段，(b)DH區(qū)段和(c)(例如輕鏈或重鏈)J區(qū)段；其中所述經(jīng)重排的可變序列可操作地與重鏈恒定序列(例如選自CH1，鉸鏈，CH2，CH3以及它們的組合)相連接；例如可操作地連接小鼠或人CHl，鉸鏈，CH2和CH3。在各個方面，還包含人D區(qū)段的、包含未經(jīng)重排的人輕鏈V區(qū)段和J區(qū)段的小鼠可用于，例如作為⑶R3序列的增加的多樣性的來源。通常，⑶R3序列出現(xiàn)在來自V/J重組的輕鏈以及來自V/D/J重組的重鏈中。其它的多樣性由重組過程中發(fā)生的核苷酸添加(例如N添加)提供，并且也作為體細(xì)胞超突變的結(jié)果。由CDR3序列所賦予的結(jié)合特性一般限于由輕鏈⑶R3序列、重鏈⑶R3序列、以及輕鏈和重鏈⑶R3序列的組合所賦予的那些，視情況而定。然而，在本文所述的小鼠中，由于第一輕鏈⑶R3(在重鏈多肽上)和第二輕鏈⑶R3(在輕鏈多肽上)的組合所賦予的結(jié)合特性，可有附加的多樣性來源。其它的多樣性是可能的，其中所述第一輕鏈CDR3可含有源自D基因區(qū)段的序列，如同來自本文所描述的下列小鼠的:其包含來自輕鏈V區(qū)的未重排的V區(qū)段，其與D區(qū)段可操作連接并且與J區(qū)段(輕鏈或重鏈)可操作連接，其中采用本文中所教導(dǎo)的RSS工程化。
另一個多樣性的來源是N和/或P添加，其可在V (輕鏈)/J或V (輕鏈)/D/J重組中(在所述的小鼠中是可能的)發(fā)生。因此，本文所述的小鼠不僅提供不同的多樣性(輕鏈-輕鏈)來源還提供其它的多樣性來源，這是由于本文所述的小鼠中經(jīng)重排的V (輕鏈)/J或經(jīng)重排的V (輕鏈)/D/J基因中的添加(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個N添力口 )。在各個方面，使用與J基因區(qū)段和輕鏈V基因區(qū)段可操作連接的D基因區(qū)段提供了增強(qiáng)的多樣性。在這種情況下，Dh區(qū)段的可操作連接將要求所述D區(qū)段能夠與同其一起列出的J區(qū)段重組。因此，所述D區(qū)段將要求在下游并置的、與并置在J區(qū)段上游的RSS相匹配的RSS，從而D區(qū)段和J區(qū)段可重排。此外，D區(qū)段將需要在上游并置的、與并置于V區(qū)段下游的RSS相匹配的適當(dāng)?shù)腞SS，從而經(jīng)重排的D/J區(qū)段和V區(qū)段可重排以形成編碼可變結(jié)構(gòu)域的基因。RSS或重組信號序列包含保守的核酸七聚物序列，其通過12個堿基對(bp)或23個堿基對(bp)的不保守序列與保守的核酸九聚物序列分隔開。RSS被重組酶用于在重排過程中按照12/23規(guī)則實(shí)現(xiàn)免疫球蛋白基因區(qū)段的連接。根據(jù)12/23規(guī)則，并置了具有12bp (不保守的)間隔子的RSS的基因區(qū)段同并置了具有23bp (不保守的)間隔子的RSS的基因區(qū)段重排；即一般觀察不到每個都具有12bp間隔子的RSS的基因區(qū)段之間的重排，或每個都具有23bp間隔子的RSS的基因區(qū)段之間的重排。在λ輕鏈基因座的情形中，可變基因區(qū)段(νλ基因區(qū)段)下游側(cè)接具有23-mer間隔子的RSS(相對于V序列的轉(zhuǎn)錄方向)，且連接基因區(qū)段(JX基因區(qū)段)在上游側(cè)接具有12-mer間隔子的RSS(相對于J序列的轉(zhuǎn)錄方向)。因此，νλ和區(qū)段側(cè)接在12/23規(guī)則下相容的RSS并因此能夠在重排過程中重組。然而，在野生型生物體的κ基因座處，每個功能性V κ區(qū)段都在下游側(cè)接具有12-mer間隔子的RSS。因此，Jk區(qū)段具有并置于Jk區(qū)段上游側(cè)的23-mer間隔。在重鏈基因座處，Vh基因區(qū)段在下 游并置具有23-mer間隔子的RSS，后跟在上游和下游并置了12-mer間隔子的Dh區(qū)段，以及每個都具有并置于Jh區(qū)段上游側(cè)的23-mer區(qū)段的Jh區(qū)段。在重鏈基因座處，D/J重組首先通過具有12-mer間隔子的下游Dh RSS和具有23_mer間隔子的上游Jh RSS介導(dǎo)而發(fā)生，以產(chǎn)生中間的經(jīng)重排的D-J序列，其具有并置于上游側(cè)的RSS，所述上游側(cè)具有12-mer間隔子的RSS。然后，所述具有并置于上游側(cè)的12-merRSS的經(jīng)重排的D-J區(qū)段與具有并置于Vh區(qū)段下游側(cè)的23-merRSS的所述Vh區(qū)段重排以形成經(jīng)重排的V/D/J序列。在一個實(shí)施方案中，在重鏈基因座處與具有為J λ區(qū)段的J基因區(qū)段一起采用νλ區(qū)段，其中所述V λ區(qū)段包含并置于V λ序列下游側(cè)的RSS，且所述RSS包含23-mer間隔子，且所述J區(qū)段為具有并置于其上游側(cè)且具有12-mer間隔子的RSS的J λ區(qū)段(例如，如在自然界中發(fā)現(xiàn)的)。在一個實(shí)施方案中，在重鏈基因座處與為Jk或Jh基因區(qū)段的J基因區(qū)段一起采用νλ區(qū)段，其中所述V λ序列具有并置于其下游側(cè)的包含23-mer間隔子的RSS，且所述Jk或Jh區(qū)段具有并置于其上游側(cè)的包含12-mer間隔子的RSS。在一個實(shí)施方案中，在重鏈基因座處與Dh基因區(qū)段和J基因區(qū)段一起采用V λ區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述νλ區(qū)段包含并置于νλ序列下游側(cè)的RSS且?guī)в芯哂?3-mer間隔子的RSS;所述Dh區(qū)段包含并置于Dh序列的上游側(cè)和下游側(cè)的RSS且?guī)в芯哂?2-mer間隔子的RSS;以及J區(qū)段具有并置于其上游側(cè)的具有23-mer間隔子的RSS，其中所述J區(qū)段選自J λ，J κ和JH。在一個實(shí)施方案中，在重鏈基因座處與J基因區(qū)段(沒有介于中間的D區(qū)段)一起采用V κ區(qū)段，其中所述V κ區(qū)段具有并置于所述V κ區(qū)段下游側(cè)的RSS且具包含12-mer間隔的RSS，所述J區(qū)段具有并置于其上游側(cè)的23-mer間隔的RSS，且所述Jk區(qū)段選自Jk區(qū)段，JX區(qū)段和Jh區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述V區(qū)段和/或J區(qū)段為人的。在一個實(shí)施方案中，在重鏈基因座處與D區(qū)段和J區(qū)段一起采用Vk區(qū)段，其中所述V κ區(qū)段具有并置于所述V κ區(qū)段下游側(cè)的RSS且包含12-mer間隔的RSS，所述D區(qū)段具有并置于其上游和下游側(cè)的23-mer間隔的RSS，且所述J區(qū)段具有并置于其上游側(cè)的12-mer間隔的RSS。在一個實(shí)施方案中，所述J區(qū)段選自J κ區(qū)段，區(qū)段和Jh區(qū)段。在一個實(shí)施方案中，所述V區(qū)段和/或J區(qū)段為人的。使用本領(lǐng)域已知的用于制造核酸序列的任何合適的方法來制造具有并置于其上游端且具有23-mer間隔子的RSS的JX區(qū)段，或者具有并置于其上游端且具有12-mer間隔子的RSS的Jk或Jh區(qū)段。制造具有并置于上游的RSS的J區(qū)段(其中所述RSS具有所選的間隔子，例如12-mer或23-mer)的合適的方法是化學(xué)合成包含七聚物、九聚物和所選間隔子的核酸并使其與經(jīng)化學(xué)合成或從合適的來源(例如人序列來源)克隆的J區(qū)段序列相融合，并且在靶向載體中采用所述融合的J區(qū)段序列和RSS來將RSS-J靶向合適的位點(diǎn)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法來制造具有并置于上游和下游的23-mer間隔的RSS的D區(qū)段。一種方法包括化學(xué)合成上游23-merRSS和D區(qū)段序列以及下游23-merRSS，并將所述側(cè)翼接有RSS的D區(qū)段置于合適的載體中?？梢龑?dǎo)所述載體以用具有并置于上游和下游側(cè)的12-merRSS序列的人D區(qū)段替代一個或多個小鼠D區(qū)段，或者可引導(dǎo)所述載體插入例如人V區(qū)段和人或小鼠J區(qū)段之間處的人源化基因座中。用于RSS構(gòu)建的合適的九聚物和七聚物是本領(lǐng)域已知的(例如見Janeway’ sImmunobiology, 7th ed., Murphy 等人，(2008, Garland Science, Taylor&Francis Group,LLC)第148頁，圖4.5，通過引用而并入)。合適的非保守間隔子序列包括，例如在人或小鼠免疫球蛋白基因座處的RSS序列中觀察到的間隔子序列。雙特異性-結(jié)合蛋白本文中所描述的結(jié)合蛋白以及編碼它們的核苷酸序列可被用于制造多特異性結(jié)合蛋白，例如雙特異性結(jié)合蛋白。在這方面，基本上由與Ch區(qū)相融合的第一 \結(jié)構(gòu)域組成的第一多肽可與基本上由與Ch區(qū)相融合的第二 \結(jié)構(gòu)域組成的第二多肽相締合。當(dāng)所述第一 \結(jié)構(gòu)域和所述第二 \結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合不同的表位時，可使用所述兩種\結(jié)構(gòu)域來制造雙特異性-結(jié)合分子。所述Ch區(qū)可以是相同或不同的。在一個實(shí)施方案中，例如所述Ch區(qū)之一可以是經(jīng)修飾的從而清除蛋白A結(jié)合決定子，而另一個重鏈恒定區(qū)不是經(jīng)這樣修飾的。這種特定的安排簡化了從例如同源 二聚體的混合物(例如所述第一或所述第二多肽的同源二聚體)中分離所述雙特異性結(jié)合蛋白。一方面，本文所述的方法和組合物用于制作雙特異性-結(jié)合蛋白。在這個方面，各自獨(dú)立地、與相同同種型的人IgG序列(例如人IgGl，IgG2，IgG3或IgG4)同框地克隆與Ch區(qū)相融合的第一 \和與Ch區(qū)相融合的第二 \。所述第一 \特異性地結(jié)合第一表位，且所述第二 Vl特異性地結(jié)合第二表位。所述第一和第二表位可以在不同的抗原上，或者在相同的抗原上。在一個實(shí)施方案中，與所述第一'相融合的Ch區(qū)的IgG同種型和與所述第二'相融合的Ch區(qū)的IgG同種型是相同的同種型，但是在以下方面有差異:一種IgG同種型包含至少一個氨基酸取代。在一個實(shí)施方案中，與缺少所述取代的重鏈相比，所述至少一個氨基酸取代使得攜帶所述取代的重鏈不能或?qū)嵸|(zhì)上不能結(jié)合蛋白A。在一個實(shí)施方案中，所述第一 Ch區(qū)包含選自IgGl，IgG2和IgG4的人IgG的第一Ch3結(jié)構(gòu)域；所述第二 Ch區(qū)包含選自IgGl，IgG2和IgG4的人IgG的第二 CH3結(jié)構(gòu)域，其中所述第二 Ch3結(jié)構(gòu)域包含減少或清除所述第二 Ch3結(jié)構(gòu)域與蛋白A的結(jié)合的修飾。在一個實(shí)施方案中，所述第二 Ch3結(jié)構(gòu)域包含435R修飾，其根據(jù)Kabat的EU索引而編號。在另一個實(shí)施方案中，所述第二 Ch3結(jié)構(gòu)域還包含436F修飾，其根據(jù)Kabat的EU索引而編號。在一個實(shí)施方案中，所述第二 CH3結(jié)構(gòu)域是人IgGl的，其包含選自下組的修飾:D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 和 V422I，其根據(jù) Kabat 的 EU 索引而編號。在一個實(shí)施方案中，所述第二 Ch3結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薎gG2的，其包含選自下組的修飾:N384S, K392N和V422I，其根據(jù)Kabat的EU索引而編號。在一個實(shí)施方案中，所述第二 Ch3結(jié)構(gòu)域是人IgG4的，其包含選自下組的修飾:Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 和 V422I，其根據(jù) Kabat 的 EU 索引而編號。在一個實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白包含具有一個或多個本文所述的修飾的Ch區(qū)，其中所述結(jié)合蛋白的恒定區(qū)在人中為非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在具體的實(shí)施方案中，所述Ch區(qū)包含在人中不呈遞免疫原性表位的氨基酸序列。在另一個具體實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白包含在野生型人重鏈中沒`有發(fā)現(xiàn)的Ch區(qū)，且所述Ch區(qū)不包含產(chǎn)生T-細(xì)胞表位的序列。
實(shí)施例提供了下列實(shí)施例來描述如何制作和使用本發(fā)明的方法和組合物，而不意在限制發(fā)明人所認(rèn)為是其發(fā)明的范圍。除非另行指出，所示的溫度是攝氏度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。實(shí)施例1將輕鏈基因區(qū)段導(dǎo)入重鏈基因座中使用VELOCIGENE 遺傳工程化技術(shù)制造了多種靶向構(gòu)建體(見，例如美國專利號 6, 586, 251 和 Valenzuela, D.Μ.，Murphy, A.J.，F(xiàn)rendewey, D.，Gale, N.ff.，Economides，A.N.，Auerbach，W.，Poueymirou, W.T.，Adams，N.C.，Rojas, J.，Yasenchak，J.，Chernomorsky, R.，Boucher，M.，Elsasser, A.L，Esau, L，Zheng, J.，Griffiths，J.A.，Wang, X.，Su, H.，Xue, Y.，Dominguez, M.G.，Noguera，1.，Torres，R.，Macdonald，L E.，Stewart, A.F.，DeChiara，T.M.，Yancopoulos，G.D.(2003).High-throughput engineeringof the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.NatBiotechnol21，652-659)，以修飾小鼠基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫。通過同源重組修飾小鼠BAC DNA以通過靶向缺失VH，1基因區(qū)段來滅活內(nèi)源小鼠重鏈基因座，用于繼而插入未重排人種系K輕鏈基因序列(圖2上部)。簡要地，使用重組酶介導(dǎo)的重組在兩個連續(xù)的靶向事件中缺失小鼠重鏈基因座。第一靶向事件包括使用從5’至3’包含5’小鼠同源臂、重組酶識別位點(diǎn)、新霉素盒和3’同源臂的靶向載體來在小鼠重鏈基因座的5’端進(jìn)行靶向。所述5’和3’同源臂包含小鼠重鏈基因座的5’的序列。第二靶向事件包括使用從5’至3’包含5’小鼠同源臂、5’重組酶識別位點(diǎn)、第二重組酶識別位點(diǎn)、潮霉素盒、第三重組酶識別位點(diǎn)，和3’小鼠同源臂的第二靶向載體來在小鼠重鏈基因座的3’端、在Jh基因區(qū)段的區(qū)域中進(jìn)行靶向。所述5’和3’同源臂含有側(cè)接小鼠Jh基因區(qū)段及在內(nèi)含子增強(qiáng)子和恒定區(qū)5’的序列。通過染色體核型分析證實(shí)了用兩種靶向載體(如上文所述)都靶向的含有經(jīng)修飾的重鏈基因座的陽性ES細(xì)胞。然后從所述雙靶向ES細(xì)胞中分離DNA并使其經(jīng)受用重組酶進(jìn)行的處理，從而介導(dǎo)第一靶向載體中5’重組酶識別位點(diǎn)與第二靶向載體中5’重組酶識別位點(diǎn)之間的小鼠重鏈基因座的基因組DNA的缺失，留下單一的重組酶識別位點(diǎn)和側(cè)翼為兩個重組酶識別位點(diǎn)的潮霉素盒(見圖2上部)。因此，創(chuàng)造了含有完整Ch基因的經(jīng)修飾的小鼠重鏈基因座，用于使用下文所述的靶向載體以精確的方式逐步插入人κ種系基因區(qū)段。工程化了四種單獨(dú)的靶向載體以使用本領(lǐng)域中所認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)來將40種人Vk基因區(qū)段和五種人Jk基因區(qū)段逐步插入滅活的小鼠重鏈基因座中(上文所述的)(圖2)。用于工程化所述四種靶向構(gòu)建體的人κ基因區(qū)段是在種系人κ輕鏈基因座的近端重疊群中天然發(fā)現(xiàn)的(圖1B和表I)。將含有第一六個人Vk基因區(qū)段和五個人Jk基因區(qū)段的約110，499bp的人基因組片段工程化以在人Jk5基因區(qū)段的下游(3’)431bp含有P1-SceI位點(diǎn)。在含有小鼠重鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子、IgM轉(zhuǎn)換區(qū)(Sy)及小鼠重鏈基因座的IgM基因的約7，852bp基因組片段的5’端工程化另一個P1-SceI位點(diǎn)。通過與約110.5kb的人片段連接而將這種小鼠片段用作3’同源臂，這產(chǎn)生了 3’連接，其從5’至3’含有約110.5kb的人κ輕鏈基因座的基因組序列，其含有第一六個連續(xù)Vk基因區(qū)段和五個Jk基因區(qū)段，P1-SceI位點(diǎn)，約7，852bp的含有小鼠內(nèi)含子增強(qiáng)子、Sy和小鼠IgM恒定基因的小鼠重鏈序列。在5’小鼠同源臂起始點(diǎn)之前，在人Vk 1-6基因區(qū)段的上游(5，)是另外的3，710bp人κ序列，所述5’小鼠同源臂含有相應(yīng)于小鼠重鏈基因座5’的序列的19，752bp的小鼠基因組DNA。在所述5’同源臂與人κ序列的起始點(diǎn)之間是新霉素盒，其側(cè)翼是三個重組酶識別位點(diǎn)(見靶向載體1，圖2)。用于人κ序列的第一插入的最終靶向載體從5’至3’包括5’同源臂(其含有重鏈基因座5’的約20kb的小鼠基因組序列)，第一重組酶識別位點(diǎn)(Rl)，新霉素盒，第二重組酶識別位點(diǎn)(R2)，第三重組酶識別位點(diǎn)(R3)，約110.5kb的人基因組κ序列(含有第一六個連續(xù)的人V κ基因區(qū)段和五個人J κ基因區(qū)段)，P1-SceI位點(diǎn)和3’同源臂(含有約8kb的小鼠基因組序列，包括內(nèi)含子增強(qiáng)子、Sy和小鼠IgM恒定基因)(見圖2，靶向載體I)。與這一靶向載體的同源重組產(chǎn)生了經(jīng)修飾的小鼠重鏈基因座，其含有與內(nèi)源小鼠重鏈恒定基因可操作連接的六個人Vκ基因區(qū)段和五個人Jk基因區(qū)段，其在重組后引起形成雜合重鏈(即人Vk結(jié)構(gòu)域和小鼠C0區(qū))。表I
權(quán)利要求
1.小鼠，其在其種系中包括可操作地連接于重鏈恒定區(qū)核酸序列的未重排的輕鏈V區(qū)段和未重排的J區(qū)段。
2.權(quán)利要求1的小鼠，其中所述未重排的輕鏈V區(qū)段選自 人K區(qū)段，人λ區(qū)段，以及它們的組合。
3.權(quán)利要求1的小鼠，其中所述重鏈恒定區(qū)核酸序列選自:CH1序列，鉸鏈序列，CH2序列，Ch3序列，以及它們的組合。
4.權(quán)利要求1的小鼠，其中所述未重排的輕鏈V區(qū)段和所述未重排的J區(qū)段在內(nèi)源小鼠重鏈基因座處替代內(nèi)源小鼠重鏈V區(qū)段和內(nèi)源小鼠重鏈J區(qū)段。
5.權(quán)利要求4的小鼠，其中所述未重排的輕鏈V區(qū)段替代內(nèi)源小鼠重鏈基因座的全部或基本上全部功能性小鼠重鏈V區(qū)段。
6.權(quán)利要求4的小鼠，其中所述未重排的J區(qū)段包括輕鏈J區(qū)段，且所述輕鏈J區(qū)段替代內(nèi)源小鼠重鏈基因座的全部或基本上全部功能性小鼠重鏈J區(qū)段。
7.權(quán)利要求6的小鼠，其中所述未重排的輕鏈V區(qū)段和未重排的輕鏈J區(qū)段可操作地連接，且所述小鼠在所述未重排的輕鏈V區(qū)段和未重排的輕鏈J區(qū)段之間缺少功能性D區(qū)段。
8.權(quán)利要求7的小鼠，其中所述未重排的輕鏈V區(qū)段為人K區(qū)段且所述未重排的輕鏈J區(qū)段為人K區(qū)段。
9.權(quán)利要求1的小鼠，其包含B細(xì)胞，所述B細(xì)胞在其基因組中包括含有可操作地連接于小鼠恒定區(qū)基因的人K可變區(qū)的經(jīng)重排的免疫球蛋白基因。
10.權(quán)利要求1的小鼠，其中所述經(jīng)重排的免疫球蛋白基因位于內(nèi)源小鼠免疫球蛋白重鏈基因座處。
11.權(quán)利要求1的小鼠，其還在其種系中包括可操作地連接于輕鏈恒定基因的人輕鏈V區(qū)段和人輕鏈J區(qū)段。
12.權(quán)利要求11的小鼠，其中所述輕鏈恒定基因?yàn)樾∈筝p鏈恒定基因。
13.權(quán)利要求12的小鼠，其中所述人輕鏈V區(qū)段為人KV區(qū)段。
14.權(quán)利要求13的小鼠，其中所述小鼠輕鏈恒定基因?yàn)樾∈驥輕鏈恒定基因。
15.從其種系表達(dá)免疫球蛋白的小鼠，所述免疫球蛋白包含:含有與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)相融合的第一人輕鏈可變區(qū)序列的第一多肽，以及，含有與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)相融合的第二人輕鏈可變區(qū)的第二多肽。
16.權(quán)利要求15的小鼠，其中所述第一人輕鏈可變區(qū)序列包含人K可變區(qū)序列，且所述第二人輕鏈可變區(qū)選自人K可變區(qū)和人λ可變區(qū)。
17.權(quán)利要求16的小鼠，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)選自人重鏈恒定區(qū)和小鼠重鏈恒定區(qū)。
18.權(quán)利要求16的小鼠，其中所述免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)選自人輕鏈恒定區(qū)和小鼠輕鏈恒定區(qū)。
19.權(quán)利要求16的小鼠，其中所述第一多肽從缺少功能性內(nèi)源重鏈V基因區(qū)段的經(jīng)修飾的內(nèi)源小鼠免疫球蛋白重鏈基因座表達(dá)。
20.權(quán)利要求19的小鼠，其中所述第二多肽從缺少功能性內(nèi)源輕鏈V基因區(qū)段的經(jīng)修飾的內(nèi)源小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座表達(dá)。
21.小鼠，其在所述小鼠的種系的內(nèi)源小鼠免疫球蛋白重鏈基因座處包括用至少六個或更多個未重排的輕鏈V基因區(qū)段和一個或多個未重排的J基因區(qū)段替代全部或基本上全部功能性內(nèi)源小鼠重鏈可變基因區(qū)段，其中所述未重排的輕鏈V基因區(qū)段與所述J基因區(qū)段可操作地連接，其中所述小鼠不能表達(dá)源自重鏈V基因區(qū)段的免疫球蛋白重鏈，并且其中所述小鼠包含脾臟B細(xì)胞群(B220+/IgM+)，其為野生型小鼠脾臟B細(xì)胞群(B220+/IgM+)的大小的至少約75%。
22.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的小鼠用于產(chǎn)生包含人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的小鼠用于產(chǎn)生抗體的用途。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述抗體為人抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的小鼠用于產(chǎn)生雙特異性抗體的用途。
26.細(xì)胞或組織，其源自根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的小鼠。
27.權(quán)利要求26 的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自ES細(xì)胞、B細(xì)胞和雜交瘤。
全文摘要
提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠和用于制造和使用它們的方法，其中所述小鼠包括用至少一個輕鏈V基因區(qū)段和至少一個輕鏈J基因區(qū)段替代全部或基本上全部免疫球蛋白重鏈V基因區(qū)段、D基因區(qū)段和J基因區(qū)段。提供了小鼠，其制造包含與重鏈恒定區(qū)可操作連接的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白。提供了結(jié)合蛋白，其含有免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括與重鏈恒定區(qū)相融合的、經(jīng)體細(xì)胞超突變的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。提供了經(jīng)修飾的細(xì)胞，胚胎和小鼠，其編碼用于制造所述結(jié)合蛋白的序列。
文檔編號C07K16/00GK103154255SQ201180045609
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月2日
發(fā)明者L·麥克唐納德, S·史蒂文斯, C·古爾, K·A·霍西阿瓦, A·J·莫菲 申請人:瑞澤恩制藥公司