專(zhuān)利名稱(chēng)：基于kringle域結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)骨架庫(kù)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建基于Kringle域結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)骨架庫(kù)，結(jié)合各種靶分子以調(diào)節(jié)其 生物活性的來(lái)源于Kringle域庫(kù)的蛋白質(zhì)骨架變體，構(gòu)建同源/異源低聚物的方法，其中所 述低聚物通過(guò)Kringle域結(jié)構(gòu)變體單體的串聯(lián)裝配，提供多特異性結(jié)合與多個(gè)靶。此外，本 發(fā)明涉及通過(guò)將Kringle域結(jié)構(gòu)變體的靶結(jié)合環(huán)(target-binding loop)嫁接入另一個(gè)具 有相同或不同靶結(jié)合特異性的Kringle域結(jié)構(gòu)變體的其它非結(jié)合環(huán)而制備多特異性單體 和多價(jià)單體的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、檢測(cè)、診斷、治療或緩解疾病或紊 亂，特別是癌癥以及其它免疫相關(guān)疾病的Kringle域結(jié)構(gòu)變體的方法和組合物，以及給動(dòng) 物施用有效量的Kringle域結(jié)構(gòu)變體。
背景技術(shù)：
通過(guò)蛋白質(zhì)氨基酸序列以及二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，很多蛋白質(zhì)由分隔開(kāi) 的域(或模塊)組成。對(duì)于蛋白質(zhì)，域是指一個(gè)單獨(dú)的功能和/或結(jié)構(gòu)單元。至少，一個(gè) 相同的域可分布于各種蛋白質(zhì)中，并且一個(gè)蛋白質(zhì)可由各種不同的域組成。域的具體信息 可在生物信息學(xué)的網(wǎng)站，如 Prosite (Hulo N 等，Nucleic Acids Res，36 擬45-249，2008 ； Website :http//kr. expasy. orR/prosite/)、SMART(Letunic I 等，Nucleic Acids Res., 34 :D257-D260,2006 ；Website :http://smart, embl-heidelberg. de/)上搜索到，域的代表 性例子包括免疫球蛋白樣、纖連蛋白II和III、Kringle等等。生物分子間的相互作用(例如，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸相互作用)在各 種生命現(xiàn)象如細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育，細(xì)胞間/細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及質(zhì)量運(yùn)輸中發(fā)揮 重要作用。作為已知的特異性結(jié)合靶分子以控制靶分子生物活性的分子，抗體(全長(zhǎng)抗體 或其片段)的開(kāi)發(fā)處于領(lǐng)先。然而，因?yàn)榭贵w在純化的表達(dá)和低溶解度的各種問(wèn)題，其應(yīng) 當(dāng)在動(dòng)物細(xì)胞-表達(dá)細(xì)胞株中表達(dá)，純化的費(fèi)用非常昂貴，并且在還原細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下其穩(wěn) 定性非常低。為解決上述問(wèn)題，已嘗試開(kāi)發(fā)除抗體之外的特異性結(jié)合靶分子的蛋白質(zhì)，例 如能解決關(guān)于抗體問(wèn)題的抗體(Review Article :Hey，et al.，Trends in Biotech. 23 514-522,2005 ；Skerra, Current Opin. Biotech. , 18 :295-304, 2007) 這些蛋白被稱(chēng)為蛋 白質(zhì)骨架，替換(alternative)蛋白質(zhì)骨架，替換骨架，非抗體蛋白質(zhì)骨架，或替換結(jié)合蛋 白(在下文中，被稱(chēng)為“蛋白質(zhì)骨架”)(Skerra A，F(xiàn)EBS J,275 =2677-2683,2008 ；Skerra, Current Opin. Biotech. ，18 :295-304,2007 ；Nygren P. ， et al. ， J. Immunol Method, 290 3- ，2004)。蛋白質(zhì)骨架的模型通過(guò)構(gòu)建蛋白質(zhì)庫(kù)制備，所述庫(kù)通過(guò)在蛋白質(zhì)表面暴露的 殘基或環(huán)結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)隨機(jī)或設(shè)計(jì)的誘變、由此保留賦予結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氨基酸序列以保留其結(jié) 構(gòu)骨架而構(gòu)建，分離特異性結(jié)合至靶分子的變體。Kringle域在包括人的不同物種的蛋白質(zhì)中作為分隔開(kāi)的模塊出現(xiàn)，并且，在一 個(gè)蛋白中存在幾十個(gè)或數(shù)百Kringle域(參見(jiàn)表lMCastellino，et al.，J Mol Evol, 26 :358-369,1987 ；Ikeo, et al.，J Mol Evol,40 :331-336,1995 ；Cao, et al.，Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2 :667_681，2002)。對(duì)于自然界中存在的多種生物體，從893種蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了 1663種不同的Kringle域，并39種Kringle域其氨基酸序列彼此不同的分 布于31 種人類(lèi)蛋白質(zhì)(參見(jiàn)=Prosite (Hulo N, et al. ,Nucleic Acids Res, 36 :D245-249, 2008 ·Μ ± :http://kr. expasy. org/prosite/ ；SMART (Letunic I， et al. ，Nucleic Acids Res, 34 :D257-D260,2006 ；網(wǎng)址http://smart, embl-heidelberg. de/) (Castellino, et al. , J Mol Evol，26 :358-369,1987 ;Ikeo，et al. , J Mol Evol，40 :331-336,1995)。在 Kringle域之間存在有包括約20個(gè)氨基酸的環(huán)(間-Kringle域)。Kringle域的確切功 能未知，但Kringle域在結(jié)合各種生物分子(例如蛋白、肽、碳水化合物、細(xì)胞膜、磷脂等 等)以賦予相應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)合活性并控制相應(yīng)蛋白質(zhì)的各種生物活性中起重要作用(Cao， et al. , Curr Med Chem-Anti-Cancer agents，2 :667-681，2002) 。 Kringle 于生長(zhǎng)因子、蛋白酶、凝血因子、橫跨膜受體等等(Castellino，et al. , J Mol Evol, 26 358-369,1987)。特別地，Kringle域獨(dú)立于其它蛋白質(zhì)而存在，或與其它蛋白質(zhì)(例如內(nèi) 皮抑素、血管抑素)一同存在，還可以用于抑制血管生成(抗血管生成)。血管抑素具有4 個(gè)Kringle域，并且血管抑素的這種結(jié)構(gòu)是用于抑制血管生成所必需的(Cao，et al. ,Curr Med Chem-Anti-Cancer agents，2 :667_681，200 。與纖維蛋白溶解相關(guān)的血纖維蛋白溶 酶原和血纖維蛋白溶酶中Kringle域的賴(lài)氨酸結(jié)合位點(diǎn)，已被認(rèn)定為兩個(gè)蛋白的細(xì)胞外基 質(zhì)分子和細(xì)胞受體之間的結(jié)合位點(diǎn)，并且Kringle域的賴(lài)氨酸結(jié)合位點(diǎn)因而被認(rèn)為對(duì)于兩 個(gè)蛋白的纖維蛋白溶解功能重要(Cao，et al.，Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2 667-681，2002)。表 權(quán)利要求
1.制備基于Kringle域結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)骨架庫(kù)的方法，所述方法包括在除了對(duì)保持 Kringle域的結(jié)構(gòu)骨架重要的保守氨基酸殘基外的氨基酸殘基上導(dǎo)入人工突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)保持Kringle域的骨架結(jié)構(gòu)重要的保守 氨基酸殘基包含至少一個(gè)選自 C1、G6、Y9、D10、G11、T16、G19、C22、Q23、W25、P30、H31、H33、 G34、K48、N49、Y50、C51、R52、N53、P54、D55、P61、W62、C63、F64、T65、E73、L74、C75、P78、 R79和C80中的殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，人工突變?cè)谥辽僖粋€(gè)選自氨基酸殘基2、 3、4、5、7、8、12、13、14、15、17、18、20、21、24、26、27、28、29、32、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、56、57、58、59、66、67、68、69、70、71、72、76 和 77 中的殘基上發(fā)生，并且所述氨基酸殘基被缺失或被一個(gè)選自絲氨酸、酪氨酸、脯氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、 天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸和甘氨酸中的殘基取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包含通過(guò)應(yīng)用作為模板和引物的存在于自然 界的Kringle域基因上進(jìn)行PCR，在除了對(duì)保持Kringle域的結(jié)構(gòu)骨架重要的保守氨基酸殘 基外的氨基酸殘基上導(dǎo)入人工突變，使得所述Kringle域具有不存在于自然界的氨基酸序 列其中來(lái)源于蛋白質(zhì)骨架庫(kù)的變體是基于Kringle域結(jié)構(gòu)的蛋白變體，具有以下氨基酸 序列CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELC XxPRC (序列號(hào)19)其中X代表一個(gè)選自絲氨酸、酪氨酸、脯氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、丙氨酸或天 冬氨酸中的殘基，并且X代表谷氨酰胺、精氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸和甘氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物選自序列號(hào)1至序列號(hào)8所組 成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述Kringle域是人類(lèi)血纖維蛋白溶酶原 Kringle 域。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述Kringle域的人類(lèi)血纖維蛋白溶酶原 具有序列號(hào)49所述的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述人類(lèi)血纖維蛋白溶酶原Kringle域具有序 列號(hào)50所述的DNA序列。
9.基于Kringle域結(jié)構(gòu)構(gòu)建的蛋白質(zhì)骨架庫(kù)，通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述 的方法制備。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)骨架庫(kù)，包含序列號(hào)13所述的庫(kù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)骨架庫(kù)，包含選自序列號(hào)14至序列號(hào)18所組成 的庫(kù)組中的庫(kù)。
12.基于Kringle域結(jié)構(gòu)分離和選擇對(duì)靶分子具有高特異親和力的蛋白質(zhì)骨架變體的 方法，所述方法包括從根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)骨架庫(kù)分離靶特異性 結(jié)合Kringle域變體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，靶分子包括至少一個(gè)選自死亡受體 (DR)4、死亡受體(DR)5、腫瘤壞死因子α、糖蛋白II β IIIa受體或糖蛋白II β IIIa、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、酪氨酸激酶抑制劑、表皮生長(zhǎng)因 子受體、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)、干細(xì)胞因子受體 (c-kit) ,Fms樣酪氨酸激酶3 (Flt-3)、白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素32、白細(xì)胞 介素 2 受體、CD3、CDlla, CD14、CD15、CD16、CD20、CD32、CD64 和 Raf 的分子。
14.基于Kringle域結(jié)構(gòu)的具有對(duì)靶分子有高特異親和力的蛋白質(zhì)骨架變體，根據(jù)權(quán) 利要求12或13所述的方法制備。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)骨架變體，其特征在于，所述變體具有至少一個(gè)選自序 列號(hào)20至序列號(hào)32的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)骨架變體，其特征在于，所述變體具有至少一個(gè)選自序 列號(hào)33至序列號(hào)43的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)骨架變體，其特征在于，所述變體具有至少一個(gè)選自序 列號(hào)44至序列號(hào)48的氨基酸序列。
18.利用權(quán)利要求12或13所述的方法制備的蛋白質(zhì)骨架變體單體來(lái)制備同源低聚物 或異源低聚物的方法，所述蛋白質(zhì)骨架變體單體結(jié)合相同或不同的靶分子。
19.制備能同時(shí)結(jié)合多個(gè)靶分子的同源或異源低聚物的方法，所述方法包括分離根 據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法制備的蛋白質(zhì)骨架單體，所述蛋白質(zhì)骨架單體分別結(jié)合兩 個(gè)或多個(gè)不同靶分子，并通過(guò)連接子組合所述單體以制備低聚物。
20.制備多價(jià)單體或多特異性單體的方法，所述方法包括將來(lái)源于根據(jù)權(quán)利要求12 或13所述的方法制備的蛋白質(zhì)骨架變體單體的靶結(jié)合環(huán)，嫁接入具有相同或不同單體的 另一單體的其它環(huán)，其中所述蛋白質(zhì)骨架變體單體結(jié)合相同靶分子或兩個(gè)或多個(gè)不同靶分 子的不同位點(diǎn)。
21.用于治療或預(yù)防癌癥的組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法制備的蛋白 質(zhì)骨架變體以作為活性成分。
22.用于治療或預(yù)防TNFa過(guò)表達(dá)或過(guò)量所導(dǎo)致的自身免疫疾病的組合物，包含權(quán)利 要求17所述的蛋白質(zhì)骨架變體以作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明提供了Kringle域結(jié)構(gòu)，包括除對(duì)保持Kringle域的骨架構(gòu)造重要的保守氨基酸殘基，在氨基酸殘基上誘導(dǎo)人工突變；基于Kringle域結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)骨架變體，通過(guò)特異性結(jié)合靶分子，調(diào)節(jié)來(lái)源于Kringle域庫(kù)的蛋白質(zhì)骨架靶分子的生物活性。本發(fā)明而且還提供了構(gòu)建同源/異源低聚物的方法，其用連接子通過(guò)Kringle域變體單體的串聯(lián)裝配，提供多特異性結(jié)合與多個(gè)靶。另外，本發(fā)明提供通過(guò)將Kringle域變體的靶結(jié)合環(huán)嫁接入另一個(gè)具有相同或不同靶結(jié)合特異性的Kringle域變體的其它非結(jié)合環(huán)而制備多特異性單體和多價(jià)單體的方法。此外，基于Kringle域結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)骨架變體特異性結(jié)合靶分子，DNA編碼蛋白質(zhì)骨架變體，或用于預(yù)防、檢測(cè)、診斷、治療或緩解疾病或紊亂，特別是癌癥以及其它免疫相關(guān)疾病的方法和組合物，包括給動(dòng)物更優(yōu)選給人類(lèi)施用有效量的相關(guān)分子。
文檔編號(hào)C40B40/10GK102149858SQ200980131306
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月11日
發(fā)明者權(quán)明姬, 李昌翰, 金容星 申請(qǐng)人:亞州大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)