專利名稱：具有修飾的ns3結(jié)構(gòu)域的hcv融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙肝病毒(HCV)構(gòu)建物。更具體地，本發(fā)明涉及具有修飾的NS3結(jié)構(gòu)域的HCV融合蛋白。該蛋白能刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，如促進(jìn)和/或激活HCV-特異性T細(xì)胞。
本發(fā)明背景丙肝病毒(HCV)感染是重大的健康問題，約1％的世界人口感染此病毒。超過75％的急性感染個(gè)體最終發(fā)展成慢性攜帶狀態(tài)，能導(dǎo)致硬化、肝功能衰竭和肝癌。參見Alter等(1992)N.Engl.J.Med.3271899-1905；Resnick和Koff.(1993)Arch.Intem.Med.1531672-1677；Seeff(1995)Gastrointest.Dis.620-27；Tong等(1995)N.Engl.J.Med.3321463-1466。
Houghton等首先鑒定HCV并確定其為HANBH的病因。HCV病毒基因組序列已知，獲得序列的方法也已知。參見例如國際公開號(hào)WO 89/04669；WO 90/11089和WO 90/14436。HCV有9.5kb的正義、單鏈RNA基因組且是黃病毒(Flaviridae)家族成員。在系統(tǒng)發(fā)育分析的基礎(chǔ)上，鑒定了至少6種不同但相關(guān)的HCV基因型。(Simmonds等，J.Gen.Virol.(1993)742391-2399)。病毒編碼的單個(gè)多蛋白有超過3000個(gè)的氨基酸殘基(Choo等，Science.(1989)244359-362；Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)882451-2455；Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)881711-1715)。多蛋白共翻譯和翻譯后加工成結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。
特別如

圖1所示，一些蛋白由HCV基因組編碼。HCV多蛋白酶剪切產(chǎn)物的順序和命名如下NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。多蛋白的初始切割由宿主蛋白酶催化，釋放3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白以及含病毒酶的非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白，這3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白是N-末端核殼蛋白(命名為“核心”)和2個(gè)包膜糖蛋白“E1”(也稱為E)及“E2”(也稱為E2/NS1)。NS區(qū)命名為NS2、NS3、NS4和NS5。NS2是有蛋白裂解活性的整合膜蛋白，與NS3結(jié)合，切割NS2-NS3 sissle鍵會(huì)隨之產(chǎn)生NS3 N-末端并釋放含絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的大多蛋白。NS3蛋白酶用于加工剩余多蛋白。在這些反應(yīng)中，NS3釋放NS3輔因子(NS4a)、2種蛋白(NS4b和NS5a)和RNA-依賴性RNA聚合酶(NS5b)。多蛋白成熟的完成由NS3-NS4a連接處的自催化切割起始，這由NS3絲氨酸蛋白酶催化。
盡管抗某些病毒像HIV的藥物發(fā)展取得了廣泛的進(jìn)步，控制急性和慢性HCV感染成果有限(Hoofnagle和di Bisceglie(1997)N.Engl.J.Med.336347-356)。特別認(rèn)為產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答如強(qiáng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)對(duì)控制和根除HCV感染重要。因此，本領(lǐng)域需要刺激對(duì)HCV的細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效方法。
本發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供試劑和方法用于刺激對(duì)HCV的細(xì)胞免疫應(yīng)答，如致敏和/或激活識(shí)別HCV多肽抗原表位的T細(xì)胞。本發(fā)明的這個(gè)和其它目標(biāo)由下述一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案完成。
本發(fā)明提供用于刺激這類反應(yīng)的HCV融合蛋白。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及含修飾的NS3多肽的HCV融合蛋白，修飾的NS3多肽以抑制蛋白酶活性，如抑制切割融合。除修飾的NS3多肽之外，融合蛋白包括一個(gè)或多個(gè)來自HCV多蛋白其它區(qū)域的多肽，進(jìn)一步詳細(xì)描述于下。這些多肽來自與NS3多肽相同的HCV分離物，或來自不同菌株和分離物，包括有任意不同HCV基因型的分離物，用于增強(qiáng)保護(hù)抗廣泛范圍的HCV基因型。
在一些實(shí)施方案中，對(duì)NS3的修飾包括取代對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白。
在其它實(shí)施方案中，所述蛋白包括修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和任選的核心多肽。
在另外的實(shí)施方案中，所述蛋白進(jìn)一步包括NS5b多肽和任選的核心多肽。
在另一些實(shí)施方案中，所述蛋白進(jìn)一步包括E2多肽、p7多肽、NS2多肽和任選的核心多肽。
在其它實(shí)施方案中，所述蛋白進(jìn)一步包括E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽和任選的核心多肽。
在另外的實(shí)施方案中，所述蛋白進(jìn)一步包括E2多肽和任選的核心多肽。
在另一些實(shí)施方案中，所述蛋白進(jìn)一步包括E1多肽、E2多肽和任選的核心多肽。
在其它實(shí)施方案中，所述蛋白包括E2多肽、修飾的NS3多肽和任選的核心多肽。
在另外的實(shí)施方案中，所述蛋白包括E1多肽、E2多肽、修飾的NS3多肽和任選的核心多肽。
另一個(gè)實(shí)施方案提供的融合蛋白主要由修飾的NS3、NS4、NS5a和任選的HCV核心多肽組成。在一些實(shí)施方案中，NS5b多肽也存在。
在上面的實(shí)施方案中，融合蛋白的不同區(qū)域不需采用天然HCV多蛋白中正常出現(xiàn)的順序。因此，例如，核心多肽如果存在，可位于融合的N-和/或C-末端。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及免疫原性融合蛋白，其組成從氨基末端到羧基末端方向主要是(a)修飾的NS3多肽、NS4多肽和NS5a多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(b)修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和NS5b多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(c)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽和NS5a多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(d)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽和NS5a多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(e)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和NS5b多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(f)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和NS5b多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(g)E2多肽和修飾的NS3多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(h)E1多肽、E2多肽和修飾的NS3多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(i)E2多肽、p7多肽、NS2多肽和修飾的NS3多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(j)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽和修飾的NS3多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及免疫原性融合蛋白，其組成從氨基末端到羧基末端方向主要是(a)修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(b)修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽、NS5b多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(c)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(d)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(e)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽、NS5b多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(f)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽、NS5b多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(g)E2多肽、修飾的NS3多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(h)E1多肽、E2多肽、修飾的NS3多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(i)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(j)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的修飾的NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，因而當(dāng)修飾的NS3多肽存在于HCV融合蛋白中時(shí)，蛋白酶活性被抑制。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供編碼上述任意蛋白的分離多核苷酸、組成相同的重組載體、轉(zhuǎn)化載體的宿主細(xì)胞和重組生成融合蛋白的方法。
本發(fā)明也提供含任意這些融合蛋白的組合物、編碼融合的多核苷酸、或包括多核苷酸的重組載體、藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案提供在脊椎動(dòng)物受試者中刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，這是通過施用本文所述組合物。在一些實(shí)施方案中，組合物致敏和/或激活識(shí)別HCV多肽抗原表位的T細(xì)胞。T細(xì)胞接觸融合蛋白，融合蛋白包括修飾的NS3多肽和至少一種另外的HCV多肽?；罨腡細(xì)胞群識(shí)別NS3和/或另外HCV多肽的抗原表位。
因此本發(fā)明提供方法和試劑用于刺激對(duì)HCV的細(xì)胞免疫應(yīng)答，如致敏和/或激活識(shí)別HCV多肽抗原表位的T細(xì)胞。這些方法和試劑特別有利于鑒定與強(qiáng)CTL反應(yīng)相關(guān)的HCV多肽抗原表位和免疫人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物抗HCV。
附圖簡述圖1是HCV基因組的圖示，描述HCV多蛋白的不同區(qū)域。
圖2描述了代表性的天然、未修飾的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的DNA和對(duì)應(yīng)氨基酸序列(SEQ ID NOS3-4)。
圖3顯示了代表性的修飾的融合蛋白的DNA和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(SEQ IDNOS5-6)，N-末端缺失的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域且包括C-末端上核心的氨基酸1-121。
發(fā)明詳述除非另有說明，本發(fā)明實(shí)踐使用化學(xué)、生化、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法，在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中詳細(xì)說明。參見例如Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第2版)；《酶學(xué)方法》(Methods In Enzymologyl)(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)；《DNA克隆》(DNA cloning)卷I和II(D.N.Glover編)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait編)；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames & S.J.Higgins編)；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(Animal Cell Culture)(R.K.Freshney編)；Perbal，B.，《分子克隆實(shí)踐指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)。
必須指出，如本說明書和附加權(quán)利要求所用，單數(shù)“一個(gè)”、“一種”和“這種”包括復(fù)數(shù)指示物，除非內(nèi)容明確另有所指。因此，例如當(dāng)提及“抗原”時(shí)包括2種或多種抗原的混合物，等等。
下列氨基酸縮寫在文中使用丙氨酸Ala(A) 精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E) 甘氨酸Gly(G)組氨酸His(H) 異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L) 賴氨酸Lys(K)甲硫氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P) 絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T) 色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y) 纈氨酸Val(V)I.定義描述本發(fā)明時(shí)，使用下列術(shù)語，術(shù)語如下所示定義。
術(shù)語“多肽”和“蛋白”指氨基酸殘基聚合物，沒有最小產(chǎn)物長度限制。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體等包括在定義內(nèi)。全長蛋白和其片段都包含在定義內(nèi)。術(shù)語也包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。此外，為了本發(fā)明目的，“多肽”所指蛋白包括對(duì)天然序列的修飾，如缺失、插入和取代(一般在性質(zhì)上保守)，只要蛋白維持所需活性。這些修飾可以是人為的，如通過定點(diǎn)突變，或可以是偶然的，如通過生成蛋白的宿主突變或PCR擴(kuò)增導(dǎo)致的差錯(cuò)。
HCV多肽是上面定義的多肽，來自HCV多蛋白。多肽不需物理來自HCV，但可合成或重組生成。此外，多肽可來自任意不同HCV菌株和分離物，包括有Simmonds等，J.Gen.Virol.(1993)742391-2399所述任意6種HCV基因型的分離物(如菌株1、2、3、4等)以及新鑒定的分離物和這些分離物亞型如HCV1a、HCV1b等。已知這些菌株中有一些保守和可變區(qū)，一般，當(dāng)排列2種序列時(shí)，來自這些區(qū)域的抗原表位的氨基酸序列有高度的序列同源性，如大于30％的氨基酸序列同源性，優(yōu)選大于40％，因此例如，術(shù)語“NS4”多肽指來自任意不同HCV菌株的天然NS4以及NS4類似物、突變蛋白和免疫原性片段，如下面進(jìn)一步定義。
術(shù)語“類似物”和“突變蛋白”指參考分子的生物活性衍生物或這些衍生物片段，片段保持所需活性，例如刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力，如下定義。在修飾的NS3的情況中，“類似物”或“突變蛋白”指缺乏其天然蛋白裂解活性的NS3分子。通常，術(shù)語“類似物”所指化合物有天然多肽序列且結(jié)構(gòu)相對(duì)天然分子有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、取代(一般性質(zhì)保守，或在修飾的NS3的情況中在活性蛋白裂解位點(diǎn)性質(zhì)不保守)和/或缺失，只要修飾不破壞免疫活性。術(shù)語“突變蛋白”所指肽有一個(gè)或多個(gè)肽模擬物(“肽類似物”)，如國際公開號(hào)WO 91/04282所述。類似物或突變蛋白優(yōu)選至少免疫活性與天然分子相同。產(chǎn)生多肽類似物和突變蛋白的方法在本領(lǐng)域已知并在下面進(jìn)一步描述。
如上所述，類似物一般包括性質(zhì)保守的取代，即取代發(fā)生在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)。氨基酸通常特定分成4個(gè)家族(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性-賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電、極性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)分類為芳族氨基酸。例如，合理預(yù)測異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)取代亮氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、絲氨酸取代蘇氨酸或結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸類似保守取代氨基酸對(duì)生物活性沒有大作用。例如，感興趣多肽可包括多至約5-10個(gè)保守或非保守氨基酸取代，或甚至多至約15-25個(gè)保守或非保守氨基酸取代，或5-25間任意整數(shù)，只要所需分子功能保持完整。本領(lǐng)域技術(shù)人員易確定感興趣分子可容忍變化的區(qū)域，參考本領(lǐng)域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle圖。
“修飾的NS3”指NS3多肽具有的修飾破壞NS3多肽的蛋白酶活性。修飾能包括一個(gè)或多個(gè)相對(duì)天然分子的氨基酸插入、取代(一般性質(zhì)非保守)和/或缺失，其中NS3多肽的蛋白酶活性被破壞。測量蛋白酶活性的方法在下面進(jìn)一步討論。
“片段”指僅由完整全長多肽序列和結(jié)構(gòu)一部分組成的多肽。片段可包括天然多肽的C-末端缺失和/或N-末端缺失。特定HCV蛋白的“免疫原性片段”通常包括全長分子的至少約5-10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，優(yōu)選全長分子的至少約15-25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，更優(yōu)選全長分子的至少約20-50個(gè)或更多連續(xù)氨基酸殘基，它們定義一個(gè)抗原表位，或者是5個(gè)氨基酸與全長序列間的任意整數(shù)，只要討論的片段保持免疫活性，由本文所述測定測量。
術(shù)語“抗原表位”在這里所指序列有至少約3到5個(gè)氨基酸，優(yōu)選約5到10或15個(gè)且不超過約1,000個(gè)(或之間的任意整數(shù))，它們定義自身序列或作為更大序列的部分，序列結(jié)合抗體，抗體在對(duì)這些序列的應(yīng)答中產(chǎn)生。片段長度沒有關(guān)鍵上限，可包括進(jìn)全長的蛋白序列或甚至融合蛋白，融合蛋白含2個(gè)或多個(gè)來自HCV多蛋白的抗原表位。用于試驗(yàn)本發(fā)明的抗原表位不限于序列與親代蛋白部分精確一致的多肽，多肽來自親代蛋白。確實(shí)，病毒基因組處于恒定流出的狀態(tài)且包含一些可變結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出相對(duì)高程度的分離物間可變性。因此術(shù)語“抗原表位”涵蓋與天然序列相同的序列以及對(duì)天然序列的修飾，如缺失、插入和取代(一般性質(zhì)保守)。
含抗原表位的特定多肽區(qū)能用一些本領(lǐng)域熟知的抗原表位圖譜技術(shù)鑒定。參見例如《分子生物學(xué)方法》(Methods in Molecular Biology)66卷中的“抗原表位圖譜操作”(Epitope Mapping Protocols)(Glenn E.Morris編，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，確定線性抗原表位可通過如同時(shí)合成大量固體支持物上的肽、對(duì)應(yīng)于蛋白分子部分的肽，使肽與抗體反應(yīng)而肽仍附于支持物。這些技術(shù)在本領(lǐng)域已知并描述于例如美國專利號(hào)4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA813998-4002；Geysen等(1986)Molec.Immunol.23709-715。類似的，易鑒定構(gòu)象抗原表位，通過確定氨基酸空間構(gòu)象如用例如x-射線晶體分析法和2維核磁共振。參見例如抗原表位圖譜操作，同上。也能鑒定蛋白的抗原區(qū)，使用標(biāo)準(zhǔn)抗原性和親水性圖，如用例如來自O(shè)xford Molecular Group的Omiga 1.0版軟件程序計(jì)算的圖。此計(jì)算機(jī)程序使用確定抗原性分布的Hopp/Wood方法，Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)783824-3828和用于親水性圖的Kyte-Doolittle技術(shù)，Kyte等，J.Mol.Biol.(1982)157105-132。
為描述不同HCV抗原表位，參見例如Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)8910011-10015；Chien等，J.Gastroent.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等，國際公開號(hào)WO 93/00365；Chien，D.Y，國際公開號(hào)WO 94/01778；美國專利號(hào)6,280,927和6,150,087。
術(shù)語“T細(xì)胞抗原表位”在這里指能誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫趨向肽結(jié)構(gòu)或相關(guān)半抗原的肽結(jié)構(gòu)特征。T細(xì)胞抗原表位通常包括線性肽決定簇，肽決定簇呈現(xiàn)MHC分子肽結(jié)合裂縫內(nèi)的延伸構(gòu)象(Unanue等，Science.(1987)236551-557)。多肽到MHCII型相關(guān)線性肽決定簇(通常長度在5-14個(gè)氨基酸間)的轉(zhuǎn)變定義為“抗原加工”，這由抗原呈遞細(xì)胞(APCs)完成。T細(xì)胞抗原表位更特定由短肽結(jié)構(gòu)的局部特征定義，如一級(jí)氨基酸序列性質(zhì)，包括電荷和疏水性，某些不取決于全部多肽折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型如螺旋度。此外，認(rèn)為輔助T細(xì)胞能識(shí)別的短肽通常是兩性結(jié)構(gòu)，包括疏水側(cè)(用于和MHC分子相互作用)和親水側(cè)(用于和T細(xì)胞受體相互作用)，(Margalit等，“計(jì)算機(jī)預(yù)測T細(xì)胞抗原表位”(Computer Prediction of T-cell Epitiopes)，《新生代疫苗》(New Generation Vaccines)Marcel Dekker，Inc，G.C.Woodrow等編，(1990)109-116頁)且兩性結(jié)構(gòu)有α-螺旋構(gòu)象(參見例如Spouge等，J.Immunol.(1987)138204-121；Berkower等，J.Immunol.(1986)1362498-2503)。
因此，易預(yù)測含T細(xì)胞抗原表位的蛋白區(qū)段，使用許多計(jì)算機(jī)程序。(參見例如Margalit等，“計(jì)算機(jī)預(yù)測T細(xì)胞抗原表位”，《新生代疫苗》Marcel Dekker，Inc，G.C.Woodrow等編，(1990)109-116頁)。這些程序通常比較肽的氨基酸序列和已知序列以誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)，搜索認(rèn)為T細(xì)胞抗原所需的氨基酸模式。
對(duì)HCV抗原(包括多肽和編碼體內(nèi)表達(dá)多肽的多核苷酸)或組合物的“免疫應(yīng)答”是受試者對(duì)感興趣組合物中所存在分子的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)展。為了本發(fā)明目的，“體液免疫應(yīng)答”指抗體分子調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答，而“細(xì)胞免疫應(yīng)答”是受T淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫的一個(gè)重要方面包括細(xì)胞毒T細(xì)胞(“CTL”)的抗原特異反應(yīng)。CTL對(duì)肽抗原有特異性，肽抗原呈遞與蛋白相聯(lián)，這些蛋白由主要組織相容性復(fù)合體(MHC)編碼并在細(xì)胞表面表達(dá)。CTL有助于誘導(dǎo)和促進(jìn)胞內(nèi)微生物的胞內(nèi)破壞或感染這些微生物的細(xì)胞裂解。細(xì)胞免疫的另一方面包括輔助T細(xì)胞的抗原特異反應(yīng)。輔助T細(xì)胞作用于協(xié)助刺激功能，集中非特異效應(yīng)細(xì)胞活性抗呈現(xiàn)肽抗原的細(xì)胞，肽抗原與細(xì)胞表面的MHC分子相聯(lián)。“細(xì)胞免疫應(yīng)答”也指生成抗病毒細(xì)胞因子、化學(xué)因子和其它這類由活化的T細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞產(chǎn)生的分子，包括來自CD4+和CD8+T細(xì)胞的，包括但不限于IFN-γ和TNF-α。
引起細(xì)胞免疫應(yīng)答的組合物或疫苗可用于致敏脊椎動(dòng)物受試者，這是通過呈遞抗原與細(xì)胞表面的MHC分子相聯(lián)。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答針對(duì)或接近細(xì)胞表面的細(xì)胞呈遞抗原。另外，能生成抗原特異T淋巴細(xì)胞以進(jìn)一步保護(hù)免疫宿主。
特定抗原刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力可通過一些測定確定，如淋巴增生(淋巴細(xì)胞激活)測定、CTL細(xì)胞毒細(xì)胞測定或測定敏化受試者中抗原特異的T淋巴細(xì)胞。這些測定在本領(lǐng)域熟知。參見例如Erickson等，J.Immunol.(1993)1514189-4199；Doe等，Eur.J.Immunol.(1994)242369-2376和下面的例子。
因此，本文所用的免疫應(yīng)答可以是刺激CTL生成和/或輔助T細(xì)胞生成或激活的反應(yīng)。感興趣抗原也能引起抗體調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答。因而，免疫應(yīng)答可包括下列作用中的一種或多種B細(xì)胞生成抗體；和/或激活抑制性T細(xì)胞和/或γδT細(xì)胞，這些T細(xì)胞特異針對(duì)組合物或感興趣疫苗中存在的一種或幾種抗原。這些反應(yīng)可用于中和傳染性和/或調(diào)節(jié)抗體-補(bǔ)體或抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒(ADCC)以保護(hù)或緩解免疫宿主癥狀。能確定這些反應(yīng)，使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測定和中和測定。
“等價(jià)抗原決定簇”指來自HCV不同亞類或菌株的抗原決定簇，如來自HCV菌株1、2、3等，由于序列變化，抗原決定簇不必須相同，但在所討論HCV序列中出現(xiàn)在相同位置。通常，當(dāng)排列2種序列時(shí)，等價(jià)抗原決定簇的氨基酸序列有高度序列同源性，例如大于30％的氨基酸序列同源性，通常大于40％，如大于60％，甚至大于80-90％同源性。
“編碼序列”或“編碼”所選多肽的序列是核酸分子，當(dāng)置于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列控制下時(shí)，核酸分子體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(在DNA的情況中)和翻譯(mRNA的情況中)成多肽。編碼序列邊界由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。轉(zhuǎn)錄終止序列可位于編碼序列3’。
“核酸”分子或“多核苷酸”能包括雙鏈和單鏈序列，涉及且不限于來自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、來自病毒(如DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)或原核DNA的基因組DNA序列和特定的合成DNA序列。術(shù)語也包括含任意已知DNA和RNA堿基類似物的序列。
“操作性連接的”指元件排列，其中所述組成構(gòu)型用于行使其所需功能。因此，當(dāng)適當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子等存在時(shí)，操作性連接于編碼序列的特定啟動(dòng)子能影響編碼序列表達(dá)。啟動(dòng)子不需與編碼序列連續(xù)，只要它能指導(dǎo)其表達(dá)。因而例如，未翻譯但已轉(zhuǎn)錄的干擾序列可存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列間，如轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子，仍能認(rèn)為啟動(dòng)子序列“操作性連接于”于編碼序列。
本文所用描述核酸分子的“重組子”指基因組、cDNA、病毒、半合成或合成起點(diǎn)的多核苷酸，其起點(diǎn)或操作與全部或部分天然相關(guān)的多核苷酸不相聯(lián)。所用關(guān)于蛋白或多肽的術(shù)語“重組子”指通過重組多核苷酸表達(dá)生成的多肽。通常，克隆感興趣基因，隨后在轉(zhuǎn)化生物體中表達(dá)，如下面進(jìn)一步所述。宿主生物體表達(dá)外源基因以在表達(dá)條件下生成蛋白。
“控制元件”指協(xié)助相連編碼序列表達(dá)的多核苷酸序列。術(shù)語包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、多腺苷酸化信號(hào)、非翻譯區(qū)，包括5’-UTRs和3’-UTRs，適當(dāng)時(shí)前導(dǎo)序列和增強(qiáng)子共同提供宿主細(xì)胞中編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯。
“啟動(dòng)子”在這里是能結(jié)合宿主細(xì)胞中RNA聚合酶并起始下游(3’方向)操作性連接于編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。為了本發(fā)明目的，啟動(dòng)子序列包括以背景基礎(chǔ)上可檢測水平起始感興趣基因轉(zhuǎn)錄所需的最小數(shù)量堿基或元件。啟動(dòng)子序列內(nèi)有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及用于結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合域(共有序列)。真核啟動(dòng)子通常不總包含“TATA”盒和“CAT”盒。
當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子序列且將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA時(shí)，控制序列在細(xì)胞中“指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄”編碼序列，mRNA隨后翻譯成編碼序列編碼的多肽。
“表達(dá)盒”或“表達(dá)構(gòu)建物”指能指導(dǎo)感興趣序列或基因表達(dá)的集合。表達(dá)盒包括上述控制元件，如操作性連接于(以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄)感興趣序列或基因的啟動(dòng)子，通常也包括多腺苷酸序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本文所述表達(dá)盒可包含于質(zhì)粒構(gòu)建物中。除了表達(dá)盒組成外，質(zhì)粒構(gòu)建物也能包括一個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)記、允許質(zhì)粒構(gòu)建物作為單鏈DNA存在的信號(hào)(如M13復(fù)制起點(diǎn))、至少1個(gè)多克隆位點(diǎn)和“哺乳動(dòng)物”復(fù)制起點(diǎn)(如SV40或腺病毒復(fù)制起點(diǎn))。
“轉(zhuǎn)化”在這里指插入外源多核苷酸到宿主細(xì)胞，無論插入所用方法例如，通過直接吸收、轉(zhuǎn)染、感染等來轉(zhuǎn)化。對(duì)于特定轉(zhuǎn)染方法，進(jìn)一步參見下面。外源多核苷酸可作為非整合載體維持，例如游離體，或另外可整合入宿主基因組。
“宿主細(xì)胞”是轉(zhuǎn)化外源DNA序列的細(xì)胞，或能轉(zhuǎn)化。
當(dāng)提及多肽時(shí)，“分離”指所示分子與完整生物體分開且不連續(xù)，分子天然發(fā)現(xiàn)于生物體中或在幾乎缺乏其它相同類型生物大分子時(shí)存在。關(guān)于多核苷酸的術(shù)語“分離”是缺乏全部或部分天然相關(guān)序列的核酸分子；或天然存在的序列，但有與其相關(guān)的異源序列；或與染色體分離的分子。
術(shù)語“純化”在這里優(yōu)選指存在至少75％重量的相同類型生物大分子，更優(yōu)選至少85％重量，更加優(yōu)選至少95％重量，最優(yōu)選至少98％重量。
“同源性”指2種多核苷酸或2個(gè)多肽部分間的百分比同一性。當(dāng)序列相對(duì)固定分子長度表現(xiàn)出至少約50％序列同一性，優(yōu)選至少約75％，更優(yōu)選至少約80-85％，優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95-98％或更高，則2種DNA或2種多肽序列彼此“基本同源”。基本同源在這里也指與特定DNA或多肽序列完全相同的序列。
通常，“同一性”分別指2種多核苷酸或多肽序列的精確核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸對(duì)應(yīng)。直接比較2個(gè)分子間的序列信息能確定百分比同一性，這是通過排列序列，計(jì)算2個(gè)排列序列間的確切匹配數(shù)，除以較短序列長度，結(jié)果乘以100?？色@得的計(jì)算機(jī)程序能用于協(xié)助分析，如ALIGN，Dayhoff，M.O.，《蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)M.O.Dayhoff編，5 Suppl.3353-358，National biomedical Research Foundation，Washington，DC，它修改Smith和Waterman局部同源性算法用于肽分析，Advances in Appl.Math.2482-489，1981。確定核苷酸序列同一性的程序可獲得于Wisconsin序列分析包，第8版(來自Genetics Computer Group，Madison，WI)，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，它們也取決于Smith和Waterman算法。這些程序容易使用，所用默認(rèn)參數(shù)由廠商推薦且描述于上示W(wǎng)isconsin序列分析包。例如，特定核苷酸序列與參考序列的百分比同一性能用Smith和Waterman同源性算法確定，用6個(gè)核苷酸位置的默認(rèn)記錄表和缺口罰分(gap penalty)。
另一種確定本發(fā)明百分比同一性的方法是使用MPSRCH程序包，其版權(quán)歸愛丁堡大學(xué)(Univeristy of Edinburgh)所有，由John F.Collins和Shane S.Sturrok開發(fā)，IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)銷售?！捌ヅ洹敝诞a(chǎn)生的數(shù)據(jù)反映“序列同一性”。其它計(jì)算序列間百分比同一性或相似性的適當(dāng)程序通常在本領(lǐng)域已知，例如另一種排列程序是BLAST，使用默認(rèn)參數(shù)。例如，BLASTN和BLASTP能使用下列默認(rèn)參數(shù)遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；過濾＝無；鏈＝兩條；截?cái)啵?0；預(yù)期＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50種序列；分類＝高分；數(shù)據(jù)庫＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。這些程序細(xì)節(jié)可發(fā)現(xiàn)于下列因特網(wǎng)地址http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
另外，可通過在同源區(qū)間形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下雜交多核苷酸，接著單鏈特異核酸酶消化，確定消化片段大小來能確定同源性。基本同源的DNA序列能在DNA雜交實(shí)驗(yàn)中鑒定，在例如特定系統(tǒng)定義的嚴(yán)謹(jǐn)條件下。定義的適當(dāng)雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。參見例如Sambrook等，同上；《DNA克隆》，同上；《核酸雜交》，同上。
“核酸免疫”指將編碼一個(gè)或多個(gè)所選免疫原的核酸分子導(dǎo)入宿主分子，用于體內(nèi)表達(dá)一種或幾種免疫原。核酸分子能直接導(dǎo)入受體受試者，如通過注射、吸入、口頭、鼻內(nèi)和粘膜施用等，或能活體內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞，細(xì)胞從宿主中取出。在后一種情況中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞再導(dǎo)入受試者，其中能促進(jìn)免疫應(yīng)答抗核酸分子編碼的抗原。
“處理”在這里指(I)防止常規(guī)疫苗中的感染或再感染，(ii)減少或取出癥狀，(iii)基本或完全去除所討論病原。處理可有效預(yù)防(感染前)或治療(感染后)。
“脊椎動(dòng)物受試者”指cordata亞門的任何成員，無限制地包括人和其他靈長類動(dòng)物，包括非人靈長類動(dòng)物如黑猩猩和其他猿和候?qū)?；農(nóng)場動(dòng)物如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物如狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥，包括家養(yǎng)、野生和獵禽如雞、火雞和其他鶉雞、鴨、鵝等。術(shù)語不指示特定年齡。因此，涵蓋成年和新生個(gè)體。本文所述本發(fā)明用于上面任意脊椎動(dòng)物屬，因?yàn)樗羞@些脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)類似。
II.完成本發(fā)明的模式詳細(xì)描述本發(fā)明前，要理解本發(fā)明不限于特定制劑或加工參數(shù)，這些當(dāng)然可變化。也要理解本文所用術(shù)語僅用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案，而不想要限制。
盡管一些與本文所述類似或相同的組合物和方法能用于實(shí)踐本發(fā)明，本文描述優(yōu)選材料和方法。
本發(fā)明涉及融合蛋白和編碼相同的多核苷酸，包括修飾的NS3多肽和至少一種來自HCV多蛋白的其它HCV多肽。本發(fā)明的融合蛋白能用于刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，如激活HCV-特異性T細(xì)胞，即識(shí)別這些多肽抗原表位和/或引起輔助T細(xì)胞生成和/或刺激抗病毒細(xì)胞因子、化學(xué)因子等生成的T細(xì)胞。這些融合蛋白激活HCV-特異性T細(xì)胞，提供體外和體內(nèi)模型系統(tǒng)用于發(fā)展HCV疫苗，特定用于鑒定與反應(yīng)相關(guān)的HCV多肽抗原表位。融合蛋白也能用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗HCV的免疫應(yīng)答，例如CTL反應(yīng)，和/或致敏CD8+和CD4+T細(xì)胞以生成抗病毒劑，用于治療或預(yù)防用途。
為進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面提供更詳細(xì)討論關(guān)于受試組合物使用的融合蛋白以及生成蛋白、組成相同的組合物和使用蛋白的方法。
融合蛋白HCV菌株基因組包含約9,000到12,000個(gè)核苷酸的單獨(dú)可讀框，它轉(zhuǎn)錄成多蛋白。如圖1和表1所示，HCV多蛋白在裂解時(shí)，生成至少10個(gè)不同產(chǎn)物，順序?yàn)镹H2-核心-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。核心多肽出現(xiàn)在位置1-191，編號(hào)是相對(duì)于HCV-1(參見Choo等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA882451-2455；用于HCV-1基因組)。進(jìn)一步加工此多肽以生成約1-173個(gè)氨基酸的HCV多肽。包膜多肽E1和E2分別出現(xiàn)在約位置192-383和384-746。P7結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)于約位置747-809。NS2是有蛋白裂解活性的整合膜蛋白且發(fā)現(xiàn)于約多蛋白位置810-1026。NS2結(jié)合NS3(發(fā)現(xiàn)于約位置1027-1657)切割NS2-NS3 sissle鍵，隨之產(chǎn)生NS3 N末端并釋放含絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的大多蛋白。發(fā)現(xiàn)于約位置1027-1207的NS3蛋白酶用于加工剩余多蛋白。解旋酶活性發(fā)現(xiàn)于約位置1193-1657。NS3釋放NS3輔因子(發(fā)現(xiàn)于約位置1658-1711的NS4a)、2種蛋白(發(fā)現(xiàn)于約位置1712-1972的NS4b和發(fā)現(xiàn)于約位置1973-2420的NS5a)和RNA-依賴性RNA聚合酶(發(fā)現(xiàn)于約位置2421-3011的NS5b)。多蛋白成熟的完成由NS3-NS4a連接處的自催化切割起始，這由NS3絲氨酸蛋白酶催化。

*u相對(duì)于HCV-1進(jìn)行編號(hào)。參見Choo等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA882451-2455。
本發(fā)明的融合蛋白包括NS3多肽，修飾的NS3多肽以抑制蛋白酶活性，從而抑制融合的進(jìn)一步切割。修飾的NS3多肽可通過缺失所有或部分NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域。另外，取代蛋白酶結(jié)構(gòu)域活性區(qū)內(nèi)的氨基酸能抑制蛋白裂解活性。最后，插入氨基酸到結(jié)構(gòu)域活性區(qū)，從而修飾催化位點(diǎn)，這也用于抑制蛋白裂解活性。
如上所述，蛋白裂解活性發(fā)現(xiàn)于約氨基酸位置1027-1207，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白(參見Choo等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)882451-2455)，圖2(SEQ ID NO4)的位置2-182。NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)和活性位置已知。參見例如DeFrancesco等，Antivir.Ther.(1998)399-109；Koch等，Biochemistry(2001)40631-640。因此，天然序列的缺失或修飾通常在分子活性位置或附近發(fā)生。特別需要修飾或缺失圖2(SEQ ID NO4)的位置1-或2-182出現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，優(yōu)選1-或2-170，或1-或2-155。優(yōu)選修飾是蛋白酶活性位置的三重催化，即H、D和/或S殘基，用于滅活蛋白酶。這些殘基分別出現(xiàn)在位置1083、1105和1165，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV多蛋白(分別為圖2(SEQ ID NO4)的位置58、80和140)。這些修飾會(huì)抑制蛋白裂解且同時(shí)維持T細(xì)胞抗原表位。
本領(lǐng)域技術(shù)人員易確定用于破壞活性的NS3蛋白酶缺失部分。活性的存在或缺乏能用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法確定。
例如，確定蛋白酶活性或缺乏活性可用下面例子所述過程以及用本領(lǐng)域熟知測定。參見例如Takeshita等，Anal.Biochem.(1997)247242-246；Kakiuchi等，J.Biochem.(1997)122749-755；Sali等，Biochemistry(1998)373392-3401；Cho等，J.Virol.Meth.(1998)72109-115；Cerretani等，Anal.Biochem.(1999)266192-197；Zhang等，Anal.Biochem.(1999)270268-275；Kakiuchi等，J.Virol.Meth.(1999)8077-84；Fowler等，J.Biomol.Screen.(2000)5153-158和Kim等，Anal.Biochem.(2000)28442-48。
除了修飾的NS3多肽外，本發(fā)明的融合蛋白包括一個(gè)或多個(gè)來自HCV多蛋白一個(gè)或多個(gè)其它區(qū)域的多肽。事實(shí)上，融合能包括HCV多蛋白的所有區(qū)域。這些多肽可來自與NS3多肽相同的HCV分離物，或來自不同菌株和分離物，包括有不同HCV基因型的分離物，用于增強(qiáng)保護(hù)抗廣泛范圍的HCV基因型。另外，選擇多肽可在特定地理區(qū)中特定病毒地方性進(jìn)化枝基礎(chǔ)上，其中使用含融合的疫苗組合物。顯然受試融合提供在多種情況下治療HCV感染的有效方法。
在一些實(shí)施方案中，融合蛋白包括修飾的NS3(本文也稱為NS3*)、NS4(NS4a和NS4b)、NS5a和任選的HCV核心多肽(NS3*NS4NS5a或NS3*NS4NS5a核心融合蛋白，本文也稱為“NS3*45a”和“NS3*45a核心”)。這些區(qū)域不需采用天然HCV多蛋白中正常出現(xiàn)的順序。因此，例如，核心多肽可位于融合的N-和/或C-末端。
另一個(gè)實(shí)施方案提供的融合蛋白包括NS3*、NS4、NS5a、NS5b和任選的HCV核心多肽(NS3*NS4NS5aNS5b或NS3*NS4NS5aNS5b核心融合蛋白，本文也稱為“NS3*45ab”和“NS3*45ab核心”)。這些區(qū)域不需采用天然HCV多蛋白中正常出現(xiàn)的順序。因此，例如，核心多肽可位于融合的N-和/或C-末端。
另外一個(gè)實(shí)施方案涉及的融合蛋白包括結(jié)合NS2的NS3*，結(jié)合NS2、p7和E2的NS3*，結(jié)合NS2、p7和E1的NS3*，結(jié)合NS2、p7、E1和E2的NS3*，結(jié)合E2的NS3*，結(jié)合E1和E2的NS3*，它們都有或沒有核心多肽。如上述融合，這些區(qū)域不需采用其天然出現(xiàn)的順序。此外，各個(gè)這些區(qū)域可來自相同或不同HCV分離物。
圖3(SEQ ID NOS5-6)顯示了代表性的修飾的融合蛋白，N-末端缺失NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域且包括C-末端上核心的氨基酸1-121。
上述多種融合中存在的不同HCV多肽可以是全長多肽或其部分。構(gòu)成融合蛋白的HCV多肽部分包括至少1個(gè)抗原表位，它由活化的T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體識(shí)別，如2152-HEYPVGSQL-2160(SEQ ID NO1)和/或2224-AELIEANLLWRQEMG-2238(SEQ ID NO2)。能用一些方法鑒定NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4(NS4a和NS4b)、NS5a、NS5b、NS3NS4NS5a和NS3NS4NS5aNS5b的抗原表位。例如，能分離單獨(dú)多肽或含上面任意組合的融合蛋白，通過例如蛋白免疫親和純化，用多肽或蛋白的單克隆抗體。隨后篩選分離的蛋白序列，通過蛋白酶剪切純化蛋白來制備一系列短肽，它們一起橫跨完整蛋白序列。開始時(shí)用例如100聚體多肽，能測試各多肽是否存在由HCV-活化的T細(xì)胞上T細(xì)胞受體識(shí)別的抗原表位，然后從鑒定的100聚體開始測試逐級(jí)更小和重疊片段以作出感興趣抗原表位的圖譜。
能鑒定HCV-活化的T細(xì)胞上T細(xì)胞受體識(shí)別的抗原表位，例如通過51Cr釋放測定(見實(shí)施例4)或淋巴增生測定(見實(shí)施例6)。在51Cr釋放測定中，能構(gòu)建展示感興趣抗原表位的靶細(xì)胞，這是通過克隆編碼抗原表位的多核苷酸到表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到靶細(xì)胞中。HCV-特異性CD8+T細(xì)胞裂解的靶細(xì)胞展示例如融合中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)HCV多蛋白區(qū)，此T細(xì)胞不裂解不顯示這種抗原表位的細(xì)胞。在淋巴增生測定中，當(dāng)用例如來自融合中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)HCV多蛋白區(qū)的一個(gè)或多個(gè)抗原表位培養(yǎng)但沒有缺乏HCV抗原表位肽時(shí)，HCV-活化CD4+T細(xì)胞增殖。
不同HCV多肽可以任何順序出現(xiàn)在融合蛋白中。如果需要，一種或多種多肽中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)或更多可出現(xiàn)在融合蛋白中。出現(xiàn)多種病毒HCV菌株，任何這些菌株的HCV多肽能用于融合蛋白。
確定一些HCV菌株和分離物的核酸和氨基酸序列，包括HCV多蛋白不同區(qū)的核酸和氨基酸序列，含核心、NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a、NS5b基因和多肽。例如，分離物HCV J1.1描述于Kubo等(1989)Japan.Nucl.Acids Res.1710367-10372；Takeuchi等(1990)Gene 91287-291；Takeuchi等(1990)J.Gen.Virol.713027-3033；Takeuchi等(1990)Nucl.Acids Res.184626。2種單獨(dú)分離物HCV-J和BK的完整編碼序列分別描述于Kato等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 879524-9528和Takamizawa等，(1991)J.Virol.651105-1113。
描述HCV-1分離物的出版物包括Choo等(1990)Brit.Med.Bull.46423-441；Choo等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882451-2455和Han等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881711-1715。HCV分離物HC-J1和HC-J4描述于Okamoto等(1991)Japan J.Exp.Med.60167-177。HCV分離物HCT 18～、HCT23、Th、HCT27、EC1和EC10描述于Weiner等(1991)Virol.180842-848。HCV分離物Pt-1、HCV-K1和HCV-K2描述于Enomoto等(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.1701021-1025。HCV分離物A、C、D&E描述于Tsukiyama-Kohara等(1991)Virus Genes 5243-254。
融合蛋白各組成可來自相同HCV菌株或分離物或者來自不同HCV菌株或分離物。含來自例如NS3多肽的HCV多肽的融合蛋白可來自HCV的第一個(gè)菌株，其它現(xiàn)有HCV多肽能來自HCV的第二個(gè)菌株。另外，一個(gè)或多個(gè)其它HCV多肽例如NS2、NS4、核心、p7、E1和/或E2如果存在，可來自HCV的第一個(gè)菌株，剩余HCV多肽能來自HCV的第二個(gè)菌株。此外，現(xiàn)有的各HCV多肽可來自不同HCV菌株。
如上所述，本發(fā)明的融合需要包括來自HCV多蛋白核心區(qū)的多肽。此區(qū)域出現(xiàn)在HCV多蛋白的氨基酸位置1-191，編號(hào)是相對(duì)于HCV-1。全長蛋白、其片段如氨基酸1-160，例如氨基酸1-150、1-140、1-130、1-120，例如氨基酸1-121、1-122、1-123...1-151等，或含全長蛋白抗原表位的更小片段可用于受試融合，如發(fā)現(xiàn)于氨基酸10-53、氨基酸10-45、氨基酸67-88、氨基酸120-130間的抗原表位，或所鑒定任意核心抗原表位，例如鑒定于Houghton等，美國專利號(hào)5,350,671；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)8910011-10015；Chien等，J.Gastroent.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等，國際公開號(hào)WO 93/00365；Chien，D.Y，國際公開號(hào)WO 94/01778；美國專利號(hào)6,280,927和6,150,087。此外，可使用多蛋白核心區(qū)移框產(chǎn)生的蛋白，如國際公開號(hào)WO 99/63941所述。
如果存在核心多肽，它能出現(xiàn)在融合的N-末端、C-末端和/或內(nèi)部。特定優(yōu)選C-末端上的核心多肽，這使它能與一些佐劑如ISCOMs形成復(fù)合體，如下進(jìn)一步所述。
如上所述，HCV融合中有用的多肽包括來自多蛋白任意不同區(qū)域的T細(xì)胞抗原表位。在此方面，已知E1、E2、p7和NS2包含人T細(xì)胞抗原表位(CD4+和CD8+)且包括一個(gè)或多個(gè)這些抗原表位用于增加疫苗效率以及增強(qiáng)抗多種HCV基因型的保護(hù)水平。此外，多拷貝的特異、保守T細(xì)胞抗原表位也能用于融合，如來自不同基因型的抗原表位復(fù)合物。
例如，來自HCV E1和/或E2區(qū)的多肽能用于本發(fā)明的融合。E2以多種類型存在(Spaete等，Virol.(1992)188819-830；Selby等，J.Virol.(1996)705177-5182；Grakoui等，J.Virol.(1993)671385-1395；Tomei等，J.Virol.(1993)674017-4026)，剪切和蛋白裂解可發(fā)生于E2多肽的N-末端和C-末端。因此，本文所用E2多肽可包括HCV多蛋白的氨基酸405-661，例如400、401、402...到661，如383或384-661、383或384-715、383或384-764、383或384-749或者383或384-809或者383或384到661-908間的任意C-末端，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白。類似的，本文所用E1多肽能包括HCV多蛋白的氨基酸192-326、192-330、192-333、192-360、192-363、192-383或192到326-383間的任意C-末端。
含抗原表位的E1和/或E2免疫原性片段可用于受試融合。例如，E1多肽片段可包括從約5個(gè)E1多肽氨基酸到近全長分子，如6、10、25、50、75、100、125、150、175、185個(gè)或更多氨基酸，或所定數(shù)字中的任意整數(shù)。類似的，E2多肽片段能包括6、10、25、50、75、100、150、200、250、300或350個(gè)E2多肽氨基酸，或所定數(shù)字中的任意整數(shù)。
例如，融合能包括來自例如E2高變區(qū)的抗原表位，例如橫跨氨基酸383-410或390-410的區(qū)。結(jié)合到E2多肽序列的特定有效E2抗原表位包括來自此區(qū)域的共有序列，如共有序列Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn(SEQ ID NO7)，代表HCV1類基因組氨基酸390-410的共有序列。另外的E1和E2抗原表位已知并描述于如Chien等，國際公開號(hào)WO 93/00365。
此外，E1和/或E2多肽可能缺乏所有或部分跨膜結(jié)構(gòu)域。E1通常是終止于約氨基酸位置370和更高(以HCV-1 E1編號(hào)為基礎(chǔ))的多肽，它由ER保持，因而不分泌到生長培養(yǎng)基中。E1是終止于約氨基酸位置731和更高(也以HCV-1 E2序列編號(hào)為基礎(chǔ))的多肽，它由ER保持且不分泌。(參見例如1996年2月15日發(fā)表的國際公開號(hào)WO 96/04301)。應(yīng)指出這些氨基酸位置不絕對(duì)且可一定程度變化。因此，本發(fā)明計(jì)劃使用保留跨膜結(jié)合域的E1和/或E2多肽以及缺乏所有或部分跨膜結(jié)構(gòu)域的多肽，包括終止于約氨基酸369和更低的E1多肽及終止于約氨基酸730和更低的E2多肽。另外，C-末端截?cái)嗄苴呄騈-末端延伸到跨膜結(jié)合域。因而例如，本發(fā)明也包括出現(xiàn)在位置低于如360的E1截?cái)嗪统霈F(xiàn)在位置低于如715的E2截?cái)?。平截的E1和E2多肽必須保留功能以用于指定用途。然而，特定優(yōu)選的平截E1構(gòu)建物不延伸超過約氨基酸300。最優(yōu)選終止于位置360的E1構(gòu)建物。優(yōu)選的平截E2構(gòu)建物具有C-末端截?cái)?，不延伸超過約氨基酸位置715。特定優(yōu)選的E2截?cái)嗍窃诎被?15-730中任意一個(gè)之后平截的分子，如725。
為描述來自這些和其它HCV區(qū)的不同HCV抗原表位，參見例如Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)8910011-10015；Chien等，J.Gastroent.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等，國際公開號(hào)WO 93/00365；Chien，D.Y.，國際公開號(hào)WO94/01778；美國專利號(hào)6,280,927和6,150,087。
上述融合蛋白以及這些蛋白的單獨(dú)組成優(yōu)選重組生成。編碼這些蛋白的多核苷酸能導(dǎo)入表達(dá)載體，表達(dá)載體可在適當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。本領(lǐng)域有多種細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，可使用任意這類表達(dá)系統(tǒng)。編碼這些蛋白的多核苷酸能任選在無細(xì)胞翻譯體系中翻譯。這種方法在本領(lǐng)域熟知。蛋白也可通過固相蛋白合成構(gòu)建。
如果需要，融合蛋白或這些蛋白的單獨(dú)組成也能包含其它氨基酸序列如氨基酸接頭或信號(hào)序列，以及用于蛋白純化的配基如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和葡萄球菌A蛋白。
編碼融合蛋白的多核苷酸多核苷酸包含少于完整HCV基因組，或另外可包括上述有突變的NS3結(jié)構(gòu)域的完整多蛋白序列。多核苷酸可以是RNA或者單或雙鏈DNA。優(yōu)選分離多核苷酸沒有其它成分，如蛋白和脂類。多核苷酸編碼上述融合蛋白，因此包括NS3*編碼序列和至少一種來自HCV多蛋白不同區(qū)域的其它HCV多肽，如來自NS2、p7、E1、E2、NS4、NS5a、NS5b、核心等的多肽。本發(fā)明的多核苷酸也能包括其它核苷酸序列，如編碼接頭、信號(hào)序列的序列或用于蛋白純化的配基如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和葡萄球菌A蛋白。
為有助于表達(dá)產(chǎn)量，需要將多蛋白裂成片段用于表達(dá)。這些片段能用于結(jié)合本文所述組合物。另外，這些片段可在表達(dá)后連接。因此例如，NS3*NS4核心能作為一種構(gòu)建物表達(dá)且NS5aNS5b核心能作為第二種構(gòu)建物表達(dá)。類似的，NS3*NS4NS5a能作為一種構(gòu)建物表達(dá)且具有如NS3*NS4NS5aNS5b核心的第二種構(gòu)建物可作為第二個(gè)構(gòu)建物表達(dá)。例如，NS2p7E2 NS3*NS4能作為單個(gè)構(gòu)建物表達(dá)，NS3(未修飾)NS4NS5b可作為另外構(gòu)建物表達(dá)用于受試組合物。要理解上面的組合僅作為代表，可單獨(dú)表達(dá)任何融合組合。
編碼不同HCV多肽的多核苷酸能分離自基因組文庫，文庫來自存在于例如HCV感染個(gè)體的血漿、血清或肝勻漿中的核酸序列，或者多核苷酸可在實(shí)驗(yàn)室中合成，例如用自動(dòng)合成儀。擴(kuò)增方法如PCR能用于從HCV基因組DNA或其編碼cDNA中擴(kuò)增多核苷酸。
多核苷酸可包括這些多肽的編碼序列，它們天然產(chǎn)生或者可以是不天然產(chǎn)生的人工序列。能連接這些多核苷酸以形成融合蛋白編碼序列，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)。如果需要，多核苷酸能克隆到表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化入例如細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，從而本發(fā)明的融合蛋白能在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)并從中分離。
包括所需融合的本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建物或含這些融合單獨(dú)成分的單獨(dú)表達(dá)構(gòu)建物可用于核酸免疫以刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，使用標(biāo)準(zhǔn)基因傳遞操作。基因傳遞方法在本領(lǐng)域已知。參見例如美國專利號(hào)5,399,346、5,580,859、5,589,466。基因能直接傳遞到脊椎動(dòng)物受試者，或另外活體內(nèi)傳遞到來自受試者的細(xì)胞，細(xì)胞再植入受試者。例如，構(gòu)建物能作為質(zhì)粒DNA傳遞，例如包含于質(zhì)粒如pBR322、pUC或ColE1。
另外，表達(dá)構(gòu)建物可包裝于脂質(zhì)體，然后傳遞到細(xì)胞。脂封裝通常用脂質(zhì)體完成，脂質(zhì)體能穩(wěn)定結(jié)合或截留核酸。濃縮DNA與脂制品的比例可變化，但通常約1∶1(mg DNA微摩爾脂)或更多脂類。對(duì)于使用脂質(zhì)體作為傳遞核酸載體的綜述，參見Hug和Sleight，Biochim.Biophys.Acta.(1991)10971-17；Straubinger等，《酶學(xué)方法》(1983)，101卷，512-527頁。
本發(fā)明所用脂質(zhì)體制品包括陽離子(帶正電)、陰離子(帶負(fù)電)和中性制品，特定優(yōu)選陽離子脂質(zhì)體。陽離子脂質(zhì)體易獲得。例如，N[1-2，3-二油氧基]丙基]-N，N，N-三乙銨(N[1-2，3-dioleyloxy]propyl)-N，N，N-triethyl-ammonium)(DOTMA)脂質(zhì)體可來自GIBCO BRL，Grand Island，NY，商品名Lipofectin(也參見Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)847413-7416)。其它可商業(yè)購買的脂類包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它陽離子脂質(zhì)體可從易獲得的材料制備，使用本領(lǐng)域熟知技術(shù)。參見例如Szoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)754194-4198；PCT出版號(hào)WO 90/11092關(guān)于描述DOTAP(1，2-二(油氧基)-3-(三乙銨)丙烷)脂質(zhì)體合成。不同脂質(zhì)體-核酸復(fù)合體用本領(lǐng)域已知方法制備。參見例如Straubinger等，《酶學(xué)方法》(1983)，101卷，512-527頁；Szoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)754194-4198；Papahadjopoulos等，Biochim.Biophys.Acta(1975)394483；Wilson等，Cell(1979)1777)；Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta(1976)443629；Ostro等，Biochim.Biophys.Res.Commun.(1977)76836；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)763348)；Enoch和Strittmatter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76145)；Fraley等，J.Biol.Chem.(1980)25510431；Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75145；Schaefer-Ridder等，Science(1982)215166。
DNA也能在螺旋形脂類組合物中傳遞，類似于Papahadjopoulos等，Biochim.Biophys.Acta(1975)394483-491所述。也參見美國專利號(hào)4,663,161和4,871,488。
發(fā)展了一些以病毒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)用于將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供便利平臺(tái)用于基因傳遞系統(tǒng)，如鼠肉瘤病毒、小鼠乳癌病毒、莫洛尼鼠類白血病毒和勞氏肉瘤病毒。所選基因能插入載體并包裝于逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)。隨后可分離重組病毒，體內(nèi)或活體內(nèi)傳遞到受試者細(xì)胞。描述了一些逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(美國專利號(hào)5,219,740；Miller和Rosman，BioTechniques(1989)7980-990；Miller，A.D.，Human Gene Therapy(1990)15-14；Scarpa等，Virology(1991)180849-852；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)908033-8037；Boris-Lawrie和Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)3102-109。簡要地，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞載體易從多種逆轉(zhuǎn)錄病毒中構(gòu)建，包括例如B、C和D類逆轉(zhuǎn)錄病毒以及spumaviruses和慢病毒如FIV、HIV、HIV-1、HIV-2和SIV(參見《RNA腫瘤病毒》(RNA Tumor Viruses)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，1985)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒易來自儲(chǔ)藏所或保藏所，如美國模式培養(yǎng)物保藏所(“ATCC”；10801 Univeristy Blvd.，Manassas，VA20110-2209)，或用常規(guī)技術(shù)從已知來源分離。
也描述一些腺病毒載體，如腺病毒2和5類載體。不像整合到宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒保持在染色體外，因此最小化與插入突變相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)(Haj-Ahmad和Graham，J.Virol.(1986)57267-274；Bett等，J.Virol.(1993)675911-5921；Mittereder等，Human Gene Therapy(1994)5717-729；Seth等，J.Virol.(1994)68933-940；Barr等，Gene Therapy(1994)151-58；Berkner，K.L.BioTechniques(1988)6616-629；Rich等，Human Gene Therapy(1993)4461-476)。
分子綴合載體如腺病毒嵌合載體也能用于基因傳遞，此載體描述于Michael等，J.Biol.Chem.(1993)2686866-6869和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)896099-6103。
α病毒屬成員也可用作病毒載體以傳遞感興趣基因，例如但不限于來自辛德比斯病毒和Semliki森林病毒、VEE的載體。對(duì)于本方法實(shí)踐所用來自辛德比斯病毒的載體的描述，參見Dubensky等，J.Virol.(1996)70508-519；國際公開號(hào)WO95/07995和WO 96/17072。
能使用其它載體，包括但不限于猿猴病毒40和細(xì)胞巨化病毒?？墒褂眉?xì)菌載體，如沙門氏菌屬、結(jié)腸耶爾森氏桿菌(Yersinia enterocolitica)、志賀氏菌屬、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、分枝桿菌菌株BCG和單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。也能使用微型染色體，如MC、MC1、噬菌體、粘粒(插入噬菌體λcos位點(diǎn)的質(zhì)粒)和復(fù)制子(能在自身控制下于細(xì)胞中復(fù)制的遺傳元件)。
表達(dá)構(gòu)建物也可用微粒載體包裝、吸收或與之相聯(lián)。這些載體將多拷貝的所選分子呈遞給免疫系統(tǒng)并促進(jìn)截留和保持分子于局部淋巴結(jié)。粒子可由巨噬細(xì)胞吞噬且能通過細(xì)胞因子釋放增強(qiáng)抗原呈遞。微粒載體的例子包括來自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的微粒載體以及來自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的微粒，此微粒稱為PLG。參見例如Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10362-368；McGee等，J.Microencap.(1996)。
多種其它方法能用于將表達(dá)構(gòu)建物傳遞到細(xì)胞。這種方法包括DEAE葡聚糖-調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚賴氨酸-或聚鳥氨酸-調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染、或使用其它不溶性無機(jī)鹽的沉淀，如磷酸鍶、含斑脫土和瓷土的硅酸鋁、氧化鉻、硅酸鎂、滑石等。其它有用的轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、超聲波穿孔、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、肽類似物傳遞或微注射。參見例如Sambrook等，同上關(guān)于轉(zhuǎn)化感興趣細(xì)胞的技術(shù)討論；Felgner，P.L，《高級(jí)藥物傳遞綜述》(Advanced Drug Delivery Reviews)(1990)5163-187關(guān)于基因轉(zhuǎn)移所用傳遞系統(tǒng)的綜述。一種用電穿孔傳遞DNA的特定有效方法描述于國際公開號(hào)WO/0045823。
另外，biolistic傳遞系統(tǒng)使用微粒載體如金和鎢，此系統(tǒng)對(duì)傳遞本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建物特別有用。粒子包被待傳遞構(gòu)建物并加速到高速，這通常在大氣降低的情況下，使用來自“基因槍”的火藥釋放。對(duì)于這些技術(shù)和其有用設(shè)備的描述，參見例如美國專利號(hào)4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,179,022；5,371,015和5,478,744。包括融合蛋白或多核苷酸的組合物本發(fā)明也提供含融合蛋白或多核苷酸的組合物。組合物可包括一種或多種融合，只要融合之一包含本文所述突變的NS3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的組合物也可包括藥學(xué)上可接受載體。載體本身不應(yīng)誘導(dǎo)對(duì)宿主有害的抗體生成。藥學(xué)上可接受載體在本領(lǐng)域熟知。這些載體包括但不限于大、緩慢代謝的大分子，如蛋白、多糖例如乳膠功能化的瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠等，聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸如聚谷氨酸和聚賴氨酸等，氨基酸共聚物以及滅活的病毒粒子。
藥學(xué)上可接受鹽也能用于本發(fā)明的組合物，例如無機(jī)鹽如氫氯化物、氫溴酸物、磷酸鹽或硫酸鹽，以及有機(jī)酸的鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或安息香酸鹽。特別有用的蛋白底物是血清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、破傷風(fēng)類毒素和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白。本發(fā)明的組合物也能包含脂類或賦形劑，如水、鹽水、甘油、右旋糖、乙醇等，它們單獨(dú)或組合，以及包含物質(zhì)如潤濕劑、乳化劑或pH緩沖劑。本發(fā)明的蛋白也能用脂質(zhì)體和微粒載體如PLG吸收、包裝或另外與之相聯(lián)。脂質(zhì)體和其它微粒載體描述于上。
如果需要，組合物可包括改善免疫原呈遞到淋巴細(xì)胞的共刺激分子，如B7-1或B7-2或細(xì)胞因子、淋巴因子和化學(xué)因子，包括但不限于細(xì)胞因子如IL-2、修飾的IL-2(cys125→ser125)、GM-CSF、IL-12、γ-干擾素、IP-10、MIP1β、FLP-3、病毒唑和RANTES。佐劑也能任選包含于組合物?？墒褂玫淖魟┌ǖ幌抻?1)鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、正磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水中油乳劑制品(有或沒有其它特異免疫刺激劑如胞壁酰肽(見下)或細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，例如(a)MF59(PCT出版號(hào)WO 90/14837)，含5％鯊烯、0.5％土溫80和0.5％Span 85(任選含不同量的MTP-PE)，用顯微流化劑如110Y型顯微流化劑(Microfluidics，Newton，MA)制成亞微粒，(b)SAF，含10％鯊烯、0.4％土溫80、5％ pluronic-阻斷聚合物L(fēng)121和thr-MDP(見下)，微流化入亞微粒乳劑或渦旋以產(chǎn)生更大顆粒大小的乳劑，(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，含2％鯊烯、0.2％土溫80、一種或多種選自單磷酰脂質(zhì)質(zhì)A(MPL)、海藻糖dimycolate(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)的細(xì)菌細(xì)胞壁成分，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)；(3)可使用皂角苷佐劑如QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或者由此產(chǎn)生的顆粒如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合體)，ISCOMs可能缺乏另外的去垢劑(參見例如國際公開號(hào)WO 00/07621)；(4)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；(5)細(xì)胞因子，如白介素，例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等(參見例如國際公開號(hào)WO 99/446636)，干擾素例如γ干擾素、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素的去毒突變體如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定毒素(LT)，特定是LT-K63(其中賴氨酸取代位置63的野生型氨基酸)、LT-R72(其中精氨酸取代位置72的野生型氨基酸)、CT-S109(其中絲氨酸取代位置109的野生型氨基酸)和PT-K9/G129(其中賴氨酸取代位置9的野生型氨基酸且甘氨酸在位置129取代)(參見例如國際公開號(hào)WO93/13202和WO92/19265)；(7)單磷酰脂質(zhì)A(MPL)或3-O-脫酰化MPL(3dMPL)(參見例如GB 2220221；EPA 0689454)，任選在幾乎沒有明礬的條件下(參見例如國際公開號(hào)WO 00/56358)；(8)3d MPL與例如QS21和/或水中油乳劑的組合(參見例如EPA0835318；EPA0735898；EPA0761231)；(9)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(參見例如國際公開號(hào)WO 99/52549)；(10)免疫刺激寡核苷酸如CpG寡核苷酸，或皂角苷和免疫刺激寡核苷酸，如CpG寡核苷酸(參見例如國際公開號(hào)WO00/62800)；(11)免疫刺激劑和金屬鹽粒子(參見例如國際公開號(hào)WO 00/23105)；(12)皂角苷和水中油乳劑(參見例如國際公開號(hào)WO 99/11241)；(13)皂角苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)(參見例如國際公開號(hào)WO 98/57659)；(14)MPL衍生物RC529；(15)其它物質(zhì)，作為免疫刺激劑用于提高組合物有效性。優(yōu)選明礬和MF59。
如上所示，胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP 11637，稱為nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)等。
此外，融合蛋白能吸收或截留于ISCOM內(nèi)。經(jīng)典ISCOMs通過膽固醇、皂角苷、磷脂和免疫原如病毒包膜蛋白的組合來形成。通常，免疫原(通常由疏水區(qū))可溶于去垢劑且加入反應(yīng)混合物，ISCOMs用其中所含免疫原形成。ISCOM基質(zhì)組合物相同形成，但沒有病毒蛋白。帶高正電荷的蛋白靜電結(jié)合于ISCOM粒子，而不是通過疏水作用力。對(duì)于更詳細(xì)的皂角苷和ISCOMs綜合討論以及制成ISCOMs的方法，參見Barr等(1998)Adv.Drug Delivery Reviews32247-271(1998)。
本發(fā)明所用ISCOMs用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成，且描述于例如美國專利號(hào)4,981,684、5,178,860、5,679,354和6,027,732；歐洲出版號(hào)EPA 109,942、180,564和231,039；Coulter等(1998)Vaccine161243。通常，術(shù)語“ISCOM”指在糖苷如三萜皂角苷(特定是QuilA)與含疏水區(qū)的抗原之間形成的免疫原性復(fù)合體。參見例如歐洲出版號(hào)EPA 109,942和180,564。在此實(shí)施方案中，HCV融合(通常有疏水區(qū))溶于去垢劑并加入反應(yīng)混合物，ISCOMs用其中所含融合形成。HCV多肽ISCOMs易用表現(xiàn)出兩親性質(zhì)的HCV多肽制成。然而，缺乏所需疏水性質(zhì)的蛋白和肽偶聯(lián)具有疏水氨基酸、脂肪酸自由基、烷基自由基等的肽之后，可納入免疫原性復(fù)合體。
如歐洲出版號(hào)EPA 231,039所說明，形成基本ISCOM結(jié)構(gòu)(稱為基質(zhì)或ISCOMATRIX)不必須要存在抗原，此結(jié)構(gòu)可形成自固醇如膽固醇、磷脂例如磷脂酰乙醇胺以及糖苷如Quil A。因此，感興趣的HCV融合存在于基質(zhì)外，而不是結(jié)合到基質(zhì)中，例如經(jīng)靜電相互作用吸收到基質(zhì)中。例如，帶高正電荷的HCV融合可靜電結(jié)合于ISCOM粒子，而不是通過疏水作用力。對(duì)于更詳細(xì)的皂角苷和ISCOMs綜合討論以及制成ISCOMs的方法，參見Barr等(1998)Adv.Drug DeliveryReviews32247-271(1998)。
可制備ISCOM基質(zhì)，例如通過將溶解的固醇、糖苷和(任選)磷脂混合一起。如果不用磷脂，形成2維結(jié)構(gòu)。參見例如歐洲出版號(hào)EPA231,039。術(shù)語“ISCOM基質(zhì)”用于指3維和2維結(jié)構(gòu)。待使用的糖苷通常表現(xiàn)出兩親性質(zhì)且包括分子中的疏水和親水區(qū)。優(yōu)選使用皂角苷，如來自Quillaja saponaria Molina和Quil A的皂角苷提取物。其它優(yōu)選皂角苷是來自七葉樹栗(Aesculus)的七葉角苷(Patt等(1960)Arzneimittelforschung10273-275和來自Gypsophilla struthium的sapoalbin(Vochten等(1968)J.Pharm.Belg.42213-226。
為制備ISCOMs，糖苷以至少關(guān)鍵膠束形成濃度使用。在Quil A的情況中，此濃度約為0.03％重量。用于生成ISCOMs的固醇可以是動(dòng)物或植物來源的固醇，如膽固醇、羊毛甾醇、光甾醇、豆固醇和谷甾醇。適當(dāng)磷脂包括磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。通常，對(duì)于各圖，糖苷(尤其當(dāng)它是Quil A時(shí))與固醇(尤其當(dāng)它是膽固醇時(shí))與磷脂的摩爾比例是1∶1∶0-1，±20％(優(yōu)選不超過10％)。這與約5∶1的QuilA膽固醇重量比例相當(dāng)。
增溶劑也可存在且可以是例如去垢劑、尿素或胍。通常，非離子、離子或兩性離子去垢劑或基于膽酸的去垢劑如脫氧膽酸鈉、膽酸鹽和CTAB(鯨蠟基溴化三銨)能用于此目的。適當(dāng)去垢劑的例子包括但不限于辛基葡糖苷、壬基N-甲基葡糖酰胺(nonyl N-methyl glucamide)或癸?；鵑-甲基葡糖酰胺、烷基苯基聚氧乙烯醚如有9到10個(gè)乙氧烯基(oxyethylene)的聚乙二醇p-異辛基-苯乙醚(商業(yè)購買的商品名為TRITON X-100RTM)、?；垩跻蚁ト珲；垩跻蚁┥嚼嫣酋?商業(yè)購買的商品名為土溫20TM、土溫80TM等)。通常去除增溶劑以形成ISCOMs，如通過超濾、透析、超離心或?qū)游?，然而，在一些方案中，此步驟不必需。(參見例如美國專利號(hào)4,981,684)。
通常，糖苷如Quil A與HCV融合的重量比例在5∶1到0.5∶1的范圍內(nèi)。重量比例優(yōu)選約為3∶1到1∶1，比例更優(yōu)0選為2∶1。
一旦形成ISCOMs，它們可制成組合物并施用給動(dòng)物，如本文所述。如果需要，所得免疫原性復(fù)合體溶液可凍干，隨后在使用前復(fù)水。
生成HCV-特異抗體的方法HCV融合蛋白能用于生成HCV-特異性多克隆和單克隆抗體。HCV-特異性多克隆和單克隆抗體特異結(jié)合HCV抗原。生成多克隆抗體可通過施用融合蛋白給哺乳動(dòng)物，如小鼠、兔、山羊或馬。收集來自免疫動(dòng)物的血清，從血漿中純化抗體，通過例如硫酸銨沉淀，接著層析，優(yōu)選親和層析。生成和加工多克隆抗血清的技術(shù)在本領(lǐng)域已知。
同樣易生成單克隆抗體，它定向抗融合蛋白中存在的HCV-特異性抗原表位。來自哺乳動(dòng)物如HCV融合蛋白免疫小鼠的正常B細(xì)胞能融合例如HAT-敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞以生成雜交瘤。產(chǎn)生HCV-特異抗體的雜交瘤能用RIA或ELISA鑒定并通過在半固體瓊脂中克隆或有限稀釋來分離。生成HCV-特異抗體的克隆通過另一輪篩選來分離。
定向抗HCV抗原表位的抗體，無論單克隆或多克隆，對(duì)檢測樣品中HCV或HCV抗原的存在特別有用，如來自HCV感染人的血清樣品。用于HCV抗原的免疫測定可使用一種抗體或幾種抗體。用于HCV抗原的免疫測定可使用例如定向抗HCV抗原表位的單克隆抗體、定向抗一種HCV多肽抗原表位的單克隆抗體組合、定向抗不同HCV多肽抗原表位的單克隆抗體、定向抗相同HCV抗原的多克隆抗體、定向抗不同HCV抗原的多克隆抗體、或單克隆和多克隆抗體的組合。免疫測定操作可在例如競爭、直接反應(yīng)或三明治型測定的基礎(chǔ)上，使用例如標(biāo)記抗體。標(biāo)記可以是例如熒光、化學(xué)發(fā)光或放射性。
多克隆或單克隆抗體可進(jìn)一步用于分離HCV粒子或抗原，使用免疫親和柱?？贵w能通過例如吸收或共價(jià)鍵附于固體支持物，從而抗體保持其免疫選擇活性?？扇芜x包括間隔基團(tuán)，從而能接近抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。隨后固定抗體能用于結(jié)合來自生物樣品的HCV粒子或抗原，生物樣品如血液或血漿。從柱基質(zhì)中回收結(jié)合的HCV粒子或抗原，通過例如pH變化。
HCV-特異性T細(xì)胞上述融合包括NS3*NS4NS5a融合蛋白或NS3*NS4NS5aNS5b融合蛋白，有或沒有核心多肽，以及本文所述其它任意不同融合，體內(nèi)或體外表達(dá)，這些融合激活的HCV-特異性T細(xì)胞優(yōu)選識(shí)別HCV多肽如NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a或NS5b多肽的抗原表位，包括一種或多種這些肽與NS3*融合的抗原表位，融合有或沒有核心多肽。HCV-特異性T細(xì)胞可以是CD8+或CD4+。
HCV-特異性CD8+T細(xì)胞可以是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)，它能殺死HCV-感染細(xì)胞，感染細(xì)胞顯示出任意這些與MHC I型分子形成復(fù)合體的抗原表位。能檢測HCV-特異性CD8+T細(xì)胞，通過例如51Cr釋放測定(見實(shí)施例4)。51Cr釋放測定測量HCV-特異性CD8+T細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的能力，靶細(xì)胞展示一種或多種這些抗原表位。本文也考慮表達(dá)抗病毒劑如IFN-γ的HCV-特異性CD8+T細(xì)胞，該T細(xì)胞也能通過免疫學(xué)方法檢測，優(yōu)選在用一種或多種HCV多肽體外刺激后胞內(nèi)染色I(xiàn)FN-γ或細(xì)胞因子，HCV多肽例如但不限于NS3、NS4、NS5a或NS5b多肽(見實(shí)施例5)。
上述融合例如但不限于NS3*NS4NS5a或NS3*NS4NS5aNS5b融合蛋白，有或沒有核心多肽，體內(nèi)或體外表達(dá)，這些融合激活的HCV-特異性CD4+T細(xì)胞優(yōu)選識(shí)別HCV多肽抗原表位，HCV多肽例如但不限于NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a或NS5b多肽，抗原表位包括其融合的抗原表位，例如但不限于NS3NS4NS5a或NS3NS4NS5aNS5b融合蛋白，抗原表位結(jié)合HCV感染細(xì)胞上的MHC II型分子且響應(yīng)刺激而增殖，刺激用例如NS3*NS4NS5a或NS3*NS4NS5aNS5b肽，有或沒有核心多肽。
HCV-特異性CD4+T細(xì)胞能通過淋巴增生測定(見實(shí)施例6)檢測。淋巴增生測定測量HCV-特異性CD4+T細(xì)胞響應(yīng)例如NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a和/或NS5b抗原表位而增殖的能力。
激活HCV-特異性T細(xì)胞的方法HCV融合蛋白或多核苷酸能用于體外或體內(nèi)激活HCV-特異性T細(xì)胞?？墒褂肏CV-特異性T細(xì)胞激活，用于提供模型系統(tǒng)以最優(yōu)化CTL對(duì)HCV的反應(yīng)和提供抗HCV感染的預(yù)防或治療處理。對(duì)于體外激活，蛋白優(yōu)選經(jīng)質(zhì)?；虿《据d體提供給T細(xì)胞，如上述腺病毒載體。
T細(xì)胞多克隆群能來自血液，優(yōu)選來自感染HCV哺乳動(dòng)物的外周淋巴器官，如淋巴結(jié)、脾或胸腺。優(yōu)選哺乳動(dòng)物包括小鼠、黑猩猩、狒狒和人。HCV用于增加哺乳動(dòng)物中的活化HCV-特異性T細(xì)胞數(shù)量。來自哺乳動(dòng)物的HCV-特異性T細(xì)胞隨后可體外再刺激，這是通過加入本文所述HCV融合蛋白到T細(xì)胞，融合蛋白例如但不限于HCV NS3NS4NS5a或NS3NS4NS5aNS5b抗原表位肽，有或沒有核心多肽。然后能測試HCV-特異性T細(xì)胞的增殖、IFN-γ生成和體外裂解靶細(xì)胞的能力，靶細(xì)胞展示例如NS3NS4NS5a或NS3NS4NS5aNS5b抗原表位。
在淋巴增生測定(見實(shí)施例6)中，當(dāng)用HCV多肽培養(yǎng)但沒有缺乏HCV抗原表位肽時(shí)，HCV-活化CD4+T細(xì)胞增殖，HCV多肽例如但不限于NS3、NS4、NS5a、NS5b、NS3NS4NS5a或NS3NS4NS5aNS5b抗原表位肽。因此，能用淋巴增生測定鑒定特定HCV抗原表位如NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a、NS5b以及這些抗原表位的融合，例如但不限于NS3NS4NS5a和NS3NS4NS5aNS5b抗原表位，這些抗原表位由HCV-特異性CD4+T細(xì)胞識(shí)別。
類似的，在上述融合蛋白體外刺激后檢測HCV-特異性CD4+和/或CD8+T細(xì)胞中的IFN-γ，能用于鑒定如融合蛋白抗原表位，例如但不限于NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a、NS5b，以及鑒定這些抗原表位的融合，例如但不限于NS3NS4NS5a和NS3NS4NS5aNS5b抗原表位，它們對(duì)刺激CD4+和/或CD8+T細(xì)胞生成IFN-γ特別有效(實(shí)施例5)。
此外，51Cr釋放測定用于確定CTL對(duì)HCV反應(yīng)的水平。參見Cooper等Immunity 10439-449。例如，HCV-特異性CD8+T細(xì)胞能來自HCV感染哺乳動(dòng)物的肝。這些T細(xì)胞可在51Cr釋放測定中測試，抗展示例如NS3NS4NS5a或NS3NS4NS5aNS5b抗原表位的靶細(xì)胞。能夠建一些表達(dá)不同NS3NS4NS5a或NS3NS4NS5aNS5b抗原表位的靶細(xì)胞群，從而各靶細(xì)胞群顯示NS3NS4NS5a或NS3NS4NS5aNS5b的不同抗原表位。能測定抗各個(gè)這些靶細(xì)胞群的HCV-特異性CD8+細(xì)胞。51Cr釋放測定結(jié)果可用于確定是NS3NS4NS5a還是NS3NS4NS5aNS5b的抗原表位引起最強(qiáng)的CTL對(duì)HCV反應(yīng)。隨后用來自51Cr釋放測定的信息構(gòu)建NS3*NS4NS5a融合蛋白或NS3*NS4NS5aNS5b融合蛋白，有或沒有核心多肽，它們包含引起最強(qiáng)CTL反應(yīng)的抗原表位。
上述HCV融合蛋白或編碼這種融合蛋白的多核苷酸能施用給哺乳動(dòng)物，如小鼠、狒狒、黑猩猩或人，用于體內(nèi)激活HCV-特異性T細(xì)胞。施用可通過本領(lǐng)域已知的任意方法，包括腸胃外、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射，包含用彈道槍(“基因槍”)的注射，如上所討論。
HCV多核苷酸注射優(yōu)選用于激活T細(xì)胞。除了構(gòu)建和修飾簡單的實(shí)踐優(yōu)勢(shì)外，注射多核苷酸導(dǎo)致宿主中合成融合蛋白。因此，呈遞這些有天然的翻譯后修飾、結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的免疫原給宿主免疫系統(tǒng)。多核苷酸優(yōu)選肌肉內(nèi)注射給大型哺乳動(dòng)物如人，劑量為0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5或10mg/kg。
本發(fā)明的組合物包括HCV融合蛋白或多核苷酸，施用方式與所用特定組合物相容，施用量有效激活HCV-特異性T細(xì)胞，通過51Cr釋放測定、淋巴增生測定或IFN-γ胞內(nèi)染色測量。蛋白和/或多核苷酸能施用給未感染HCV的哺乳動(dòng)物或能施用給感染HCV的哺乳動(dòng)物。組合物中多核苷酸或融合蛋白的特定劑量取決于許多因素，包括但不限于種類、年齡、施用組合物的哺乳動(dòng)物綜合情況、組合物施用模式。本發(fā)明組合物的有效量容易確定，僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)。上述體外和體內(nèi)模型能用于鑒定適當(dāng)劑量。下述例子中所用多核苷酸量提供的綜合指南可用于最優(yōu)化HCV-特異性T細(xì)胞的體內(nèi)或體外激活。通常，0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5或10mg/kg HCV融合蛋白或多核苷酸施用給大型哺乳動(dòng)物如狒狒、黑猩猩或人，融合蛋白或多核苷酸有或沒有核心多肽。如果需要，共刺激分子或佐劑也能在組合物之前、之后或一起提供。
通過傳遞本發(fā)明組合物產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答包括激活HCV-特異性T細(xì)胞，可通過改變劑量、施用途徑或強(qiáng)化方案來增強(qiáng)。本發(fā)明的組合物可以單劑量方案給予，或優(yōu)選以多劑量方案，其中疫苗接種的主要過程包括1-10個(gè)單獨(dú)劑量，接著以維持和/或加強(qiáng)免疫應(yīng)答所需的后續(xù)時(shí)間間隔給予其它劑量，例如第2種劑量用1-4個(gè)月，如果需要，幾個(gè)月后用一種或幾種后續(xù)劑量。
III.實(shí)驗(yàn)下面是完成本發(fā)明的特定實(shí)施方案例子。提供例子僅用于闡明目的，而不想以任何方式限制本發(fā)明范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員易理解本發(fā)明可以本說明書教授的多種方法實(shí)踐。
努力確保所用數(shù)字的精確性(例如量、溫度等)，但當(dāng)然應(yīng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。
實(shí)施例1NS3*NS4NS5a核心多核苷酸的生成下列例子中的NS3*代表修飾的NS3分子。編碼NS3NS4NS5a的多核苷酸(約氨基酸1027到2399，編號(hào)是相對(duì)于HCV-1)(本文也定義為“NS345a”)分離自HCV。突變分子的NS3部分是通過突變?cè)诘鞍酌富钚晕稽c(diǎn)上發(fā)現(xiàn)的His、Asp和Ser殘基的編碼序列，從而使所得分子在這些位置編碼除His、Asp和Ser以外的氨基酸且缺乏NS3蛋白酶活性。此構(gòu)建物融合編碼核心多肽的多核苷酸，它包括全長多蛋白的氨基酸1-122。編碼核心的多核苷酸序列從下游融合編碼NS5a的構(gòu)建部分，因而所得融合蛋白在其C-末端包括核心多肽。構(gòu)建物被克隆到質(zhì)粒、牛痘病毒和腺病毒中。另外，構(gòu)建物被插入重組表達(dá)載體并被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以生成NS3*NS4NS5a核心融合蛋白。
蛋白酶活性如下確定。將NS4A肽(KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK)(SEQ IDNO8)和融合蛋白稀釋于90μl反應(yīng)緩沖液(25mM Tris，pH7.5、0.15M NaCl、0.5mMEDTA、10％甘油、0.05 n-十二烷基B-D-麥芽糖苷、5mM DTT)，并在室溫下混合30分鐘。將90μl混合物加到微量滴定板(Costar，Inc.，Corning，NY)，并加入10μl HCV底物(AnaSpec，Inc，San Jose CA)?；旌掀桨宀⒃贔luostar平板讀數(shù)器上讀數(shù)。結(jié)果表示為每分鐘的相對(duì)熒光單位(RFU)。
實(shí)施例2在免疫動(dòng)物中致敏HCV-特異性CTL如上所述生成的HCV融合蛋白NS3*NS4NS5a核心用于如下產(chǎn)生HCV融合-ISCOM。制備融合-ISCOM制劑，這是通過混合融合蛋白和作用ISCOMATRIX(空ISCOMs)，利用離子相互作用以最大化抗原與佐劑間的聯(lián)合。制備ISCOMATRIX基本如Coulter等(1998)Vaccine161243所述。
恒河猴在麻醉情況下免疫。動(dòng)物分成2組。第1組在第0個(gè)月用2×108噬斑形成單位(pfu)(皮下為1×108且劃痕為1×108)的rVVC/E1感染。此組用作CTL致敏的正對(duì)照。來自第2組的動(dòng)物用25-100μg上述HCV融合多肽免疫，融合多肽吸收于ISCOM，在第0、1、2和6個(gè)月肌肉內(nèi)(IM)注射左四頭肌。細(xì)胞毒活性在標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放測定中分析，測定描述于例如Paliard等(2000)AIDSRes.Hum.Retroviruses16273。
實(shí)施例3用NS3*NS4NS5a核心多核苷酸免疫在一個(gè)免疫操作中，動(dòng)物用50-250μg編碼NS3*NS4NS5a核心融合蛋白的質(zhì)粒DNA免疫，通過肌肉內(nèi)注射到前脛。6周后強(qiáng)化注射107pfu疫苗病毒(VV)-NS5a(腹膜內(nèi))或50-250μg質(zhì)粒對(duì)照(肌肉內(nèi))。
在另一個(gè)免疫操作中，肌肉內(nèi)注射動(dòng)物前脛，用1010編碼NS3*NS4NS5a核心融合蛋白的腺病毒粒子。6周后腹膜內(nèi)強(qiáng)化注射107pfu的VV-NS5a或肌肉內(nèi)強(qiáng)化注射1010腺病毒粒子。
實(shí)施例4激活HCV-特異性CD8+T細(xì)胞51Cr釋放測定。51Cr釋放測定用于測量HCV-特異性T細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的能力，靶細(xì)胞展示NS5a抗原表位。脾細(xì)胞收集自免疫動(dòng)物。IL-2存在時(shí)，這些細(xì)胞用來自HCV-NS5a的CTL抗原表位肽p214K9(2152-HEYPVGSQL-2160；SEQ ID NO1)體外再刺激6天。隨后在標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放測定中分析脾細(xì)胞抗肽敏化靶細(xì)胞(L929)的細(xì)胞毒活性，靶細(xì)胞表達(dá)MHC I型分子而不是II型，描述于Weiss(1980)J.Biol.Chem.2559912-9917。所測效應(yīng)(T細(xì)胞)與靶(B細(xì)胞)的比例為60∶1、20∶1和7∶1。計(jì)算各效應(yīng)與靶比例的百分比特異裂解。
實(shí)施例5激活表達(dá)IFN-γ的HCV-特異性CD8+T細(xì)胞干擾素-γ的胞內(nèi)染色(IFN-γ)。干擾素-γ的胞內(nèi)染色用于在NS5a抗原表位p214K9體外刺激后鑒定分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞。IL-2和莫能菌素存在時(shí)，單獨(dú)免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞用p214K9或非特異肽再刺激6-12個(gè)小時(shí)。然后染色細(xì)胞的表面CD8和胞內(nèi)IFN-γ，流式細(xì)胞儀分析。隨后計(jì)算也對(duì)IFN-γ陽性的CD8+T細(xì)胞百分比。
實(shí)施例6HCV-特異性CD4+T細(xì)胞的增殖淋巴增生測定。收集自免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞用磁珠去除CD8+T細(xì)胞，三倍培養(yǎng)，用來自HCV-NS5a的NS5a-抗原表位肽p222D(2224-AELIEANLLWRQEMG-2238；SEQ ID NO2)培養(yǎng)，或單獨(dú)在培養(yǎng)基中。72小時(shí)后，細(xì)胞用1μCi每孔的3H-胸苷脈沖，6-8小時(shí)后收集。收集后測量結(jié)合的放射活性。計(jì)算平均cpm。
實(shí)施例7NS3*45a核心-編碼DNA疫苗制劑致敏CTL的能力動(dòng)物用10-250μg編碼NS3*45a核心融合蛋白的質(zhì)粒DNA免疫，如實(shí)施例3所述，用PLG連接的NS3*45a核心編碼DNA(見下)或編碼NS3*45a核心的DNA，經(jīng)電穿孔傳遞(對(duì)于此傳遞技術(shù)，參見例如國際公開號(hào)WO/0045823)。免疫后6周用編碼NS3*45a核心的質(zhì)粒DNA強(qiáng)化注射。
PLG-傳遞的DNA。聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)聚合物來自BoehringerIngelheim，U.S.A.。PLG聚合物是RG505，其共聚物比例為50/50且分子量為65kDa(廠商數(shù)據(jù))。制備有吸收DNA的陽離子微粒，使用改進(jìn)的溶劑蒸發(fā)方法，方法基本如Singh Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97811-816所述。簡要地，制備微粒是通過高速乳化10ml 5％w/v聚合物溶液于甲叉二氯中，甲叉二氯有1ml PBS，使用IKA均化器。初級(jí)乳劑隨后加入50ml含鯨蠟三甲基溴化銨(CTAB)的蒸餾水(0.5％w/v)。這形成w/o/w乳劑，乳劑以6000rpm室溫?cái)嚢?2小時(shí)，使甲叉二氯能蒸發(fā)。所得微粒在蒸餾水中洗2遍，10,000g離心并冷凍干燥。制備后，洗滌和收集，DNA吸收于微粒上，這是通過在1mg/ml DNA溶液中4C孵育100mg陽離子微粒6小時(shí)。隨后離心分離微粒，沉淀用TE緩沖液洗，冷凍干燥微粒。
CTL活性和IFN-γ表達(dá)通過51Cr釋放測定或胞內(nèi)染色測量，如上面例子所述。
實(shí)施例8免疫途徑和編碼NS3*45a核心的復(fù)制粒子SINCR(DC+)制備α病毒復(fù)制粒子例如SINCR(DC+)如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)964598-4603所述。動(dòng)物肌肉內(nèi)(IM)注射5×106IU編碼NS3*45a核心的SINCR(DC+)復(fù)制粒子，如實(shí)施例3所述，或者在尾底部(BoT)和爪墊(FP)皮下注射(S/C)，或經(jīng)IM施用傳遞2/3 DNA結(jié)合經(jīng)BoT途徑施用1/3 DNA。免疫后強(qiáng)化注射編碼NS5a的牛痘病毒，如實(shí)施例3所述。IFN-γ表達(dá)通過胞內(nèi)染色測量，如實(shí)施例5所述。
實(shí)施例9α病毒復(fù)制子致敏，接著用不同強(qiáng)化方案制備α病毒復(fù)制粒子例如SINCR(DC+)如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)964598-4603所述。動(dòng)物用1.5×106IU編碼NS345a的復(fù)制粒子SINCR(DC+)致敏，通過肌肉內(nèi)注射到前脛，接著在第6周強(qiáng)化注射10-100μg編碼NS5a的質(zhì)粒DNA、1010編碼NS3*45a核心的腺病毒粒子、1.5×106IU編碼NS3*45a核心的SINCR(DC+)復(fù)制粒子或107pfu編碼NS5a的牛痘病毒。IFN-γ表達(dá)通過胞內(nèi)染色測量，如實(shí)施例5所述。
實(shí)施例10表達(dá)NS3*45a核心的α病毒制備α病毒復(fù)制粒子例如SINCR(DC+)和SINCR(LP)如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)964598-4603所述。動(dòng)物用1×102到1×106IU編碼NS3*45a核心的SINCR(DC+)復(fù)制粒子免疫，通過傳遞途徑組合(2/3IM和1/3 S/C)以及單獨(dú)S/C，或用1×102到1×106IU編碼NS3*45a核心的SINCR(LP)復(fù)制粒子，通過傳遞途徑組合(2/3IM和1/3 S/C)以及單獨(dú)S/C。免疫后在第6周強(qiáng)化注射107pfu編碼NS5a的牛痘病毒。IFN-γ表達(dá)通過胞內(nèi)染色測量，如實(shí)施例5所述。
至此已經(jīng)描述了刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的HCV融合多肽。盡管已經(jīng)在一定程度上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)該理解的是，在不背離這里所定義的本發(fā)明精神和范圍的前提下可作出明顯的改變。
序列表<110>希龍公司(Chiron Corporation)<120>具有修飾的NS3結(jié)構(gòu)域的HCV融合蛋白<130>PP19545.004(2300-19545.40)<150>60/394,510<151>2002-07-08<150>60/393,694<151>2002-07-02<150>09/721,479<151>2000-11-22<150>60/167,502<151>1999-11-24<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>被T細(xì)胞受體識(shí)別的表位<400>1His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu1 5<210>2<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>被T細(xì)胞受體識(shí)別的表位<400>2Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly1 5 10 15<210>3<211>546<212>DNA<213>人工的<220>
<223>代表性的天然、未修飾的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的DNA序列<400>3atg gcg ccc atc acg gcg tac gcc cag cag aca agg ggc ctc cta ggg 48Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1 5 10 15tgc ata atc acc agc cta act ggc cgg gac aaa aac caa gtg gag ggt 96Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly20 25 30gag gtc cag att gtg tca act gct gcc caa acc ttc ctg gca acg tgc 144Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys35 40 45atc aat ggg gtg tgc tgg act gtc tac cac ggg gcc gga acg agg acc 192Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr50 55 60atc gcg tca ccc aag ggt cct gtc atc cag atg tat acc aat gta gac 240Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Ash Val Asp65 70 75 80caa gac ctt gtg ggc tgg ccc gct ccg caa ggt agc cga tca ttg aca 288Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr85 90 95ccc tgc act tgc ggc tcc tcg gac ctt tac ctg gtc acg agg cac gcc 336Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
100 105 110gat gtc att ccc gtg cgc cgg cgg ggt gat agc agg ggc agc ctg ctg 384Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu115 120 125tcg ccc cgg ccc att tcc tac ttg aaa ggc tcc tcg ggg ggt ccg ctg 432Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu130 135 140ttg tgc ccc gcg ggg cac gcc gtg ggc ata ttt agg gcc gcg gtg tgc 480Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145 150 155 160acc cgt gga gtg gct aag gcg gtg gac ttt atc cct gtg gag aac cta 528Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ash Leu165 170 175gag aca acc atg agg tcc 546Glu Thr Thr Met Arg Ser180<210>4<211>182<212>PRT<213>人工的<220>
<223>代表性的天然、未修飾的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列<400>4Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1 5 10 15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly20 25 30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys35 40 45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50 55 60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65 70 75 80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr85 90 95Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala100 105 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu115 120 125Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu130 135 140Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145 150 155 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu165 170 175Glu Thr Thr Met Arg Ser180<210>5<211>5676<212>DNA<213>人工的<220>
<223>代表性的修飾的融合蛋白的DNA序列，其NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域被從N-末端刪除，且在C-末端含有核心多肽的氨基酸1-121<400>5atg gct gca tat gca gct cag ggc tat aag gtg cta gta ctc aac ccc 48Met Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Ash Pro1 5 10 15tct gtt gct gca aca ctg ggc ttt ggt gct tac atg tcc aag gct cat 96Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His
20 25 30ggg atc gat cct aac atc agg acc ggg gtg aga aca att acc act ggc144Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly35 40 45agc ccc atc acg tac tcc acc tac ggc aag ttc ctt gcc gac ggc ggg192Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly50 55 60tgc tcg ggg ggc gct tat gac ata ata att tgt gac gag tgc cac tcc240Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser65 70 75 80acg gat gcc aca tcc atc ttg ggc att ggc act gtc ctt gac caa gca288Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala85 90 95gag act gcg ggg gcg aga ctg gtt gtg ctc gcc acc gcc acc cct ccg336Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro100 105 110ggc tcc gtc act gtg ccc cat ccc aac atc gag gag gtt gct ctg tcc384Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser115 120 125acc acc gga gag atc cct ttt tac ggc aag gct atc ccc ctc gaa gta432Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val130 135 140atc aag ggg ggg aga cat ctc atc ttc tgt cat tca aag aag aag tgc480Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys145 150 155 160gac gaa ctc gcc gca aag ctg gtc gca ttg ggc atc aat gcc gtg gcc528Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala165 170 175tac tac cgc ggt ctt gac gtg tcc gtc atc ccg acc agc ggc gat gtt576Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val180 185 190gtc gtc gtg gca acc gat gcc ctc atg acc ggc tat acc ggc gac ttc624Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe
195 200 205gac tcg gtg ata gac tgc aat acg tgt gtc acc cag aca gtc gat ttc672Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe210 215 220agc ctt gac cct acc ttc acc att gag aca atc acg ctc ccc caa gat720Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp225 230 235 240gct gtc tcc cgc act caa cgt cgg ggc agg act ggc agg ggg aag cca768Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro245 250 255ggc atc tac aga ttt gtg gca ccg ggg gag cgc ccc tcc ggc atg ttc816Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe260 265 270gac tcg tcc gtc ctc tgt gag tgc tat gac gca ggc tgt gct tgg tat864Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr275 280 285gag ctc acg ccc gcc gag act aca gtt agg cta cga gcg tac atg aac912Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn290 295 300acc ccg ggg ctt ccc gtg tgc cag gac cat ctt gaa ttt tgg gag ggc960Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly305 310 315 320gtc ttt aca ggc ctc act cat ata gat gcc cac ttt cta tcc cag aca1008Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr325 330 335aag cag agt ggg gag aac ctt cct tac ctg gta gcg tac caa gcc acc1056Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr340 345 350gtg tgc gct agg gct caa gcc cct ccc cca tcg tgg gac cag atg tgg1104Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp355 360 365aag tgt ttg att cgc ctc aag ccc acc ctc cat ggg cca aca ccc ctg1152Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu
370 375 380cta tac aga ctg ggc gct gtt cag aat gaa atc acc ctg acg cac cca1200Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Ile Thr Leu Thr His Pro385 390 395 400gtc acc aaa tac atc atg aca tgc atg tcg gcc gac ctg gag gtc gtc1248Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val405 410 415acg agc acc tgg gtg ctc gtt ggc ggc gtc ctg gct gct ttg gcc gcg1296Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala420 425 430tat tgc ctg tca aca ggc tgc gtg gtc ata gtg ggc agg gtc gtc ttg1344Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val Ile Val Gly Arg Val Val Leu435 440 445tcc ggg aag ccg gca atc ata cct gac agg gaa gtc ctc tac cga gag1392Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu450 455 460ttc gat gag atg gaa gag tgc tct cag cac tta ccg tac atc gag caa1440Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln465 470 475 480ggg atg atg ctc gcc gag cag ttc aag cag aag gcc ctc ggc ctc ctg1488Gly Met Met Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu485 490 495cag acc gcg tcc cgt cag gca gag gtt atc gcc cct gct gtc cag acc1536Gln Thr Ala Ser Arg Gln Ala Glu Val Ile Ala Pro Ala Val Gln Thr500 505 510aac tgg caa aaa ctc gag acc ttc tgg gcg aag cat atg tgg aac ttc1584Asn Trp Gln Lys Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe515 520 525atc agt ggg ata caa tac ttg gcg ggc ttg tca acg ctg cct ggt aac1632Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn530 535 540ccc gcc att gct tca ttg atg gct ttt aca gct gct gtc acc agc cca1680Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro
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725 730 735cta agg gac atc tgg gac tgg ata tgc gag gtg ttg agc gac ttt aag2256Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys740 745 750acc tgg cta aaa gct aag ctc atg cca cag ctg cct ggg atc ccc ttt2304Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe755 760 765gtg tcc tgc cag cgc ggg tat aag ggg gtc tgg cga ggg gac ggc atc2352Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile770 775 780atg cac act cgc tgc cac tgt gga gct gag atc act gga cat gtc aaa2400Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His Val Lys785 790 795 800aac ggg acg atg agg atc gtc ggt cct agg acc tgc agg aac atg tgg2448Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn Met Trp805 810 815agt ggg acc ttc ccc att aat gcc tac acc acg ggc ccc tgt acc ccc2496Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro820 825 830ctt cct gcg ccg aac tac acg ttc gcg cta tgg agg gtg tct gca gag2544Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Thr Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu835 840 845gaa tac gtg gag ata agg cag gtg ggg gac ttc cac tac gtg acg ggt2592Glu Tyr Val Glu Ile Arg Gln Val Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly850 855 860atg act act gac aat ctt aaa tgc ccg tgc cag gtc cca tcg ccc gaa2640Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Val Pro Ser Pro Glu865 870 875 880ttt ttc aca gaa ttg gac ggg gtg cgc cta cat agg ttt gcg ccc ccc2688Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala Pro Pro885 890 895tgc aag ccc ttg ctg cgg gag gag gta tca ttc aga gta gga ctc cac2736Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly Leu His
900 905 910gaa tac ccg gta ggg tcg caa tta cct tgc gag ccc gaa ccg gac gtg2784Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val915 920 925gcc gtg ttg acg tcc atg ctc act gat ccc tcc cat ata aca gca gag2832Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu930 935 940gcg gcc ggg cga agg ttg gcg agg gga tca ccc ccc tct gtg gcc agc2880Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Val Ala Ser945 950 955 960tcc tcg gct agc cag cta tcc gct cca tct ctc aag gca act tgc acc2928Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr965 970 975gct aac cat gac tcc cct gat gct gag ctc ata gag gcc aac ctc cta2976Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu980 985 990tgg agg cag gag atg ggc ggc aac atc acc agg gtt gag tca gaa aac3024Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn995 10001005aaa gtg gtg att ctg gac tcc ttc gat ccg ctt gtg gcg gag gag gac3072Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu Glu Asp101010151020gag cgg gag atc tcc gta ccc gca gaa atc ctg cgg aag tct cgg aga3120Glu Arg Glu Ile Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Arg Arg1025 103010351040ttc gcc cag gcc ctg ccc gtt tgg gcg cgg ccg gac tat aac ccc ccg3168Phe Ala Gln Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro104510501055cta gtg gag acg tgg aaa aag ccc gac tac gaa cca cct gtg gtc cat3216Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His106010651070ggc tgc ccg ctt cca cct cca aag tcc cct cct gtg cct ccg cct cgg3264Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Lys Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg
107510801085aag aag cgg acg gtg gtc ctc act gaa tca acc cta tct act gcc ttg3312Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr Ala Leu109010951100gcc gag ctc gcc acc aga agc ttt ggc agc tcc tca act tcc ggc att3360Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ile1105 111011151120acg ggc gac aat acg aca aca tcc tct gag ccc gcc cct tct ggc tgc3408Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser Gly Cys112511301135ccc ccc gac tcc gac gct gag tcc tat tcc tcc atg ccc ccc ctg gag3456Pro Pro Asp Ser Asp Ala Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu114011451150ggg gag cct ggg gat ccg gat ctt agc gac ggg tca tgg tca acg gtc3504Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val115511601165agt agt gag gcc aac gcg gag gat gtc gtg tgc tgc tca atg tct tac3552Ser Ser Glu Ala Asn Ala Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr117011751180tct tgg aca ggc gca ctc gtc acc ccg tgc gcc gcg gaa gaa cag aaa3600Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Gln Lys1185 119011951200ctg ccc atc aat gca cta agc aac tcg ttg cta cgt cac cac aat ttg3648Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Leu120512101215gtg tat tcc acc acc tca cgc agt gct tgc caa agg cag aag aaa gtc3696Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser Ala Cys Gln Arg Gln Lys Lys Val122012251230aca ttt gac aga ctg caa gtt ctg gac agc cat tac cag gac gta ctc3744Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Ser His Tyr Gln Asp Val Leu123512401245aag gag gtt aaa gca gcg gcg tca aaa gtg aag gct aac ttg cta tcc3792Lys Glu Val Lys Ala Ala Ala Ser Lys Val Lys Ala Asn Leu Leu Ser
125012551260gta gag gaa gct tgc agc ctg acg ccc cca cac tca gcc aaa tcc aag3840Val Glu Glu Ala Cys Ser Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys1265 127012751280ttt ggt tat ggg gca aaa gac gtc cgt tgc cat gcc aga aag gcc gta3888Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Cys His Ala Arg Lys Ala Val128512901295acc cac atc aac tcc gtg tgg aaa gac ctt ctg gaa gac aat gta aca3936Thr His Ile Asn Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp Asn Val Thr130013051310cca ata gac act acc atc atg gct aag aac gag gtt ttc tgc gtt cag3984Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln131513201325cct gag aag ggg ggt cgt aag cca gct cgt ctc atc gtg ttc ccc gat4032Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp133013351340ctg ggc gtg cgc gtg tgc gaa aag atg gct ttg tac gac gtg gtt aca4080Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Thr1345 135013551360aag ctc ccc ttg gcc gtg atg gga agc tcc tac gga ttc caa tac tca4128Lys Leu Pro Leu Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser136513701375cca gga cag cgg gtt gaa ttc ctc gtg caa gcg tgg aag tcc aag aaa4176Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Gln Ala Trp Lys Ser Lys Lys138013851390acc cca atg ggg ttc tcg tat gat acc cgc tgc ttt gac tcc aca gtc4224Thr Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val139514001405act gag agc gac atc cgt acg gag gag gca atc tac caa tgt tgt gac4272Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ala Ile Tyr Gln Cys Cys Asp141014151420ctc gac ccc caa gcc cgc gtg gcc atc aag tcc ctc acc gag agg ctt4320Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala Ile Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu
1425 143014351440tat gtt ggg ggc cct ctt acc aat tca agg ggg gag aac tgc ggc tat4368Tyr Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Arg Gly Glu Asn Cys Gly Tyr144514501455cgc agg tgc cgc gcg agc ggc gta ctg aca act agc tgt ggt aac acc4416Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr146014651470ctc act tgc tac atc aag gcc cgg gca gcc tgt cga gcc gca ggg ctc4464Leu Thr Cys Tyr Ile Lys Ala Arg Ala Ala Cys Arg Ala Ala Gly Leu147514801485cag gac tgc acc atg ctc gtg tgt ggc gac gac tta gtc gtt atc tgt4512Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys149014951500gaa agc gcg ggg gtc cag gag gac gcg gcg agc ctg aga gcc ttc acg4560Glu Ser Ala Gly Val Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Ala Phe Thr1505 151015151520gag gct atg acc agg tac tcc gcc ccc cct ggg gac ccc cca caa cca4608Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gln Pro152515301535gaa tac gac ttg gag ctc ata aca tca tgc tcc tcc aac gtg tca gtc4656Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val154015451550gcc cac gac ggc gct gga aag agg gtc tac tac ctc acc cgt gac cct4704Ala His Asp Gly Ala Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro155515601565aca acc ccc ctc gcg aga gct gcg tgg gag aca gca aga cac act cca4752Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala Arg His Thr Pro157015751580gtc aat tcc tgg cta ggc aac ata atc atg ttt gcc ccc aca ctg tgg4800Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Phe Ala Pro Thr Leu Trp1585 159015951600gcg agg atg ata ctg atg acc cat ttc ttt agc gtc ctt ata gcc agg4848Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Val Leu Ile Ala Arg
160516101615gac cag ctt gaa cag gcc ctc gat tgc gag atc tac ggg gcc tgc tac4896Asp Gln Leu Glu Gln Ala Leu Asp Cys Glu Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr162016251630tcc ata gaa cca ctg gat cta cct cca atc att caa aga ctc cat ggc4944Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Pro Ile Ile Gln Arg Leu His Gly163516401645ctc agc gca ttt tca ctc cac agt tac tct cca ggt gaa atc aat agg4992Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly Glu Ile Asn Arg165016551660gtg gcc gca tgc ctc aga aaa ctt ggg gta ccg ccc ttg cga gct tgg5040Val Ala Ala Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Ala Trp1665 167016751680aga cac cgg gcc cgg agc gtc cgc gct agg ctt ctg gcc aga gga ggc5088Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Arg Leu Leu Ala Arg Gly Gly168516901695agg gct gcc ata tgt ggc aag tac ctc ttc aac tgg gca gta aga aca5136Arg Ala Ala Ile Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Arg Thr170017051710aag ctc aaa ctc act cca ata gcg gcc gct ggc cag ctg gac ttg tcc5184Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Ala Ala Ala Gly Gln Leu Asp Leu Ser171517201725ggc tgg ttc acg gct ggc tac agc ggg gga gac att tat cac agc gtg5232Gly Trp Phe Thr Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Val173017351740tct cat gcc cgg ccc cgc tgg atc tgg ttt tgc cta ctc ctg ctt gct5280Ser His Ala Arg Pro Arg Trp Ile Trp Phe Cys Leu Leu Leu Leu Ala1745 175017551760gca ggg gta ggc atc tac ctc ctc ccc aac cga atg agc acg aat cct5328Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg Met Ser Thr Asn Pro176517701775aaa cct caa aga aag acc aaa cgt aac acc aac cgg cgg ccg cag gac5376Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp
178017851790gtc aag ttc ccg ggt ggc ggt cag atc gtt ggt gga gtt tac ttg ttg 5424Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu179518001805ccg cgc agg ggc cct aga ttg ggt gtg cgc gcg acg aga aag act tcc 5472Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser181018151820gag cgg tcg caa cct cga ggt aga cgt cag cct atc ccc aag gct cgt 5520Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg1825 183018351840cgg ccc gag ggc agg acc tgg gct cag ccc ggg tac cct tgg ccc ctc 5568Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu184518501855tat ggc aat gag ggc tgc ggg tgg gcg gga tgg ctc ctg tct ccc cgt 5616Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg186018651870ggc tct cgg cct agc tgg ggc ccc aca gac ccc cgg cgt agg tcg cgc 5664Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg187518801885aat ttg ggt aag 5676Ash Leu Gly Lys1890<210>6<211>1892<212>PRT<213>人工的<220>
<223>代表性的修飾的融合蛋白的氨基酸序列，其NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域被從N-末端刪除，且在C-末端含有核心多肽的氨基酸1-121<400>6Met Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro1 5 10 15
Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His20 25 30Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly35 40 45Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly50 55 60Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser65 70 75 80Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala85 90 95Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro100 105 110Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser115 120 125Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val130 135 140Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys145 150 155 160Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala165 170 175Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val180 185 190Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe195 200 205Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe210 215 220Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp225 230 235 240Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro
245 250 255Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe260 265 270Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr275 280 285Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn290 295 300Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly305 310 315 320Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr325 330 335Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr340 345 350Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp355 360 365Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu370 375 380Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Ile Thr Leu Thr His Pro385 390 395 400Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val405 410 415Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala420 425 430Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val Ile Val Gly Arg Val Val Leu435 440 445Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu450 455 460Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln465 470 475 480
Gly Met Met Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu485 490 495Gln Thr Ala Ser Arg Gln Ala Glu Val Ile Ala Pro Ala Val Gln Thr500 505 510Asn Trp Gln Lys Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe515 520 525Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn530 535 540Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro545 550 555 560Leu Thr Thr Ser Gln Thr Leu Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val565 570 575Ala Ala Gln Leu Ala Ala Pro Gly Ala Ala Thr Ala Phe Val Gly Ala580 585 590Gly Leu Ala Gly Ala Ala Ile Gly Ser Val Gly Leu Gly Lys Val Leu595 600 605Ile Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val610 615 620Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val625 630 635 640Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val645 650 655Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala660 665 670Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His675 680 685Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val690 695 700Thr Ala Ile Leu Ser Ser Leu Thr Val Thr Gln Leu Leu Arg Arg Leu705 710 715 720
His Gln Trp Ile Ser Ser Glu Cys Thr Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp725 730 735Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys740 745 750Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe755 760 765Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile770 775 780Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His Val Lys785 790 795 800Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn Met Trp805 810 815Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro820 825 830Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Thr Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu835 840 845Glu Tyr Val Glu Ile Arg Gln Val Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly850 855 860Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Val Pro Ser Pro Glu865 870 875 880Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala Pro Pro885 890 895Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly Leu His900 905 910Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val915 920 925Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu930 935 940Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Val Ala Ser
945 950 955 960Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr965 970 975Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu980 985 990Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn99510001005Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu Glu Asp101010151020Glu Arg Glu Ile Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Arg Arg1025 103010351040Phe Ala Gln Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro104510501055Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His106010651070Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Lys Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg107510801085Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr Ala Leu109010951100Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ile1105 111011151120Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser Gly Cys112511301135Pro Pro Asp Ser Asp Ala Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu114011451150Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val115511601165Ser Ser Glu Ala Asn Ala Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr117011751180
Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Gln Lys1185 119011951200Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Leu120512101215Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser Ala Cys Gln Arg Gln Lys Lys Val122012251230Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Ser His Tyr Gln Asp Val Leu123512401245Lys Glu Val Lys Ala Ala Ala Ser Lys Val Lys Ala Asn Leu Leu Ser125012551260Val Glu Glu Ala Cys Ser Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys1265 127012751280Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Cys His Ala Arg Lys Ala Val128512901295Thr His Ile Asn Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp Asn Val Thr130013051310Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln131513201325Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp133013351340Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Thr1345 135013551360Lys Leu Pro Leu Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser136513701375Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Gln Ala Trp Lys Ser Lys Lys138013851390Thr Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val139514001405Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ala Ile Tyr Gln Cys Cys Asp141014151420
Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala Ile Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu1425 143014351440Tyr Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Arg Gly Glu Asn Cys Gly Tyr144514501455Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr146014651470Leu Thr Cys Tyr Ile Lys Ala Arg Ala Ala Cys Arg Ala Ala Gly Leu147514801485Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys149014951500Glu Ser Ala Gly Val Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Ala Phe Thr1505 151015151520Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gln Pro152515301535Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val154015451550Ala His Asp Gly Ala Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro155515601565Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala Arg His Thr Pro157015751580Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Phe Ala Pro Thr Leu Trp1585 159015951600Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Val Leu Ile Ala Arg160516101615Asp Gln Leu Glu Gln Ala Leu Asp Cys Glu Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr162016251630Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Pro Ile Ile Gln Arg Leu His Gly163516401645Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly Glu Ile Asn Arg
165016551660Val Ala Ala Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Ala Trp1665 167016751680Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Arg Leu Leu Ala Arg Gly Gly168516901695Arg Ala Ala Ile Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Arg Thr170017051710Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Ala Ala Ala Gly Gln Leu Asp Leu Ser171517201725Gly Trp Phe Thr Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Val173017351740Ser His Ala Arg Pro Arg Trp Ile Trp Phe Cys Leu Leu Leu Leu Ala1745 175017551760Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg Met Ser Thr Asn Pro176517701775Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp178017851790Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu179518001805Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser181018151820Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg1825 183018351840Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu184518501855Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg186018651870Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg187518801885
Asn Leu Gly Lys1890<210>7<211>21<212>PRT<213>人工的<220>
<223>E2表位共有序列<400>7Gly Ser Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gly Phe Val Ser Leu Phe Ala Pro1 5 10 15Gly Ala Lys Gln Asn20<210>8<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>NS4A肽<400>8Lys Lys Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys1 5 10 15Pro Ala Ile Ile Pro Lys Lys20
權(quán)利要求
1.一種免疫原性融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括(a)修飾的NS3多肽，它含有至少1個(gè)對(duì)HCV NS3區(qū)的氨基酸取代，從而抑制蛋白酶活性，和(b)至少一種多肽，該多肽來自除了NS3區(qū)的HCV多蛋白區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述修飾包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白。
3.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白包括修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和任選的核心多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白進(jìn)一步包括NS5b多肽和任選的核心多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白進(jìn)一步包括E2多肽、p7多肽、NS2多肽和任選的核心多肽。
6.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白進(jìn)一步包括E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽和任選的核心多肽。
7.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白進(jìn)一步包括E2多肽和任選的核心多肽。
8.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白進(jìn)一步包括E1多肽、E2多肽和任選的核心多肽。
9.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白包括E2多肽、修飾的NS3多肽和任選的核心多肽。
10.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白包括E1多肽、E2多肽、修飾的NS3多肽和任選的核心多肽。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，(a)和(b)的多肽來自相同HCV分離物。
12.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，至少一種融合中存在的多肽來自與修飾的NS3多肽不同的分離物。
13.一種免疫原性融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的組成從氨基末端到羧基末端方向主要是(a)修飾的NS3多肽、NS4多肽和NS5a多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(b)修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和NS5b多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(c)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽和NS5a多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(d)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽和NS5a多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(e)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和NS5b多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(f)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和NS5b多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(g)E2多肽和修飾的NS3多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(h)E1多肽、E2多肽和修飾的NS3多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(i)E2多肽、p7多肽、NS2多肽和修飾的NS3多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(j)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽和修飾的NS3多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性。
14.一種免疫原性融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的組成從氨基末端到羧基末端方向主要是(a)修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(b)修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽、NS5b多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(c)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(d)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(e)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽、NS5b多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(f)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽、NS4多肽、NS5a多肽、NS5b多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(g)E2多肽、修飾的NS3多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(h)E1多肽、E2多肽、修飾的NS3多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(i)E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性；(j)E1多肽、E2多肽、p7多肽、NS2多肽、修飾的NS3多肽和核心多肽，NS3多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，從而抑制蛋白酶活性。
15.一種修飾的NS3多肽，其特征在于，所述多肽包括對(duì)應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號(hào)是相對(duì)于全長HCV-1多蛋白，因而當(dāng)修飾的NS3多肽存在于HCV融合蛋白中時(shí)，蛋白酶活性被抑制。
16.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的免疫原性融合蛋白或權(quán)利要求15所述的修飾的NS3多肽，與藥學(xué)上可接受的賦形劑聯(lián)合。
17.一種在脊椎動(dòng)物受試者中刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，所述方法包括施用治療有效量的權(quán)利要求16所述的組合物。
18.如權(quán)利要求15所述的組合物在用于在脊椎動(dòng)物受試者中刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法中的應(yīng)用。
19.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的融合蛋白或權(quán)利要求15所述的修飾的NS3多肽在制造用于在脊椎動(dòng)物受試者中刺激的細(xì)胞免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
20.一種生產(chǎn)組合物的方法，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的免疫原性融合蛋白或權(quán)利要求15所述的修飾的NS3多肽與藥學(xué)上可接受的賦形劑聯(lián)合。
21.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括編碼權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的融合蛋白或權(quán)利要求15所述的修飾的NS3多肽的編碼序列。
22.一種重組載體，其特征在于，所述載體包括(a)權(quán)利要求21所述的多核苷酸；和(b)至少1個(gè)操作性連接于所述多核苷酸的控制元件，其中所述編碼序列能在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。
23.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包括權(quán)利要求22所述的重組載體。
24.一種生成免疫原性融合蛋白或修飾的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括在生成所述蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞群。
全文摘要
本發(fā)明提供了HCV融合蛋白，它包含突變的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域，與至少一種來自HCV多蛋白另一區(qū)域的HCV抗原表位融合。融合能用于刺激對(duì)HCV的細(xì)胞免疫應(yīng)答方法，如激活丙肝病毒(HCV)－特異性T細(xì)胞，包括CD4+和CD8+T細(xì)胞。此方法可用于模擬系統(tǒng)以發(fā)展HCV－特異性免疫原性組合物，以及免疫哺乳動(dòng)物抗HCV。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1678630SQ03820719
公開日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月2日
發(fā)明者M·霍格頓 申請(qǐng)人:希龍公司