專利名稱：原細纖維結(jié)合抗體及其在帕金森氏癥、路易體癡呆和其他α-共核蛋白病的治療和診斷方 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有對人類a-突觸核蛋白(a -synuclein)原細纖維(protofibrils)高的親和カ和a -突觸核蛋白單體低的結(jié)合的抗體或其片段,其中抗體或片段具有特定的互補決定區(qū)(CDR)序列。本發(fā)明也涉及包含這樣的抗體或片段的組合物，并涉及利用這樣的抗體或片段檢測a-突觸核蛋白原細纖維的方法。在進ー步的實施例中，本發(fā)明涉及通過給予這樣的抗體或片段預(yù)防、推遲具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病(neurodegenerative disorder)的發(fā)作或治療所述疾病的方法,并涉及在制備治療具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的藥物組合物中應(yīng)用這樣的抗體或片段。本發(fā)明也涉及在診斷或監(jiān)測具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)展中應(yīng)用這樣的抗 體或片段，并涉及通過這樣的抗體或片段的給予減少或抑制a-突觸核蛋白聚集的方法。
背景技術(shù)：
帕金森氏癥(PD)和路易體癡呆(dementia with Lewy bodies)(DLB)是具有a -突觸核蛋白腦病理的神經(jīng)退化性疾病的兩個最普遍的實例。ro是最普遍的運動紊亂，且ro的特點是僵化、運動功能減退、顫動和姿勢不穩(wěn)定(postural instability)。認為大約四到六百萬的世界人ロ患H)。DLB代表所有癡呆的5-15%。除了健忘和經(jīng)常波動的其他瘋狂的癥狀之外，DLB病人一般遭受反復(fù)出現(xiàn)的跌傷和視幻覺。a -突觸核蛋白的神經(jīng)元內(nèi)(Intraneuronal)積聚導(dǎo)致路易體的形成，球形的嗜曙紅玻璃質(zhì)10-20 u m大的內(nèi)含物，或路易神經(jīng)突的形成，拉長的線狀的畸形的軸突和樹突。在F1D腦中，路易體和路易神經(jīng)突的沉積物通常限于連接紋狀體和黑質(zhì)(substantianigra)的神經(jīng)細胞。這些細胞對于運動和姿勢功能的完成、說明癥狀的本性來說是至關(guān)重要的。在DLB腦中，在中腦和皮質(zhì)區(qū)域中都發(fā)現(xiàn)路易體和路易神經(jīng)突的廣泛分布的沉積物。a -突觸核蛋白是主要地發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)內(nèi)的蛋白質(zhì)。在神經(jīng)細胞內(nèi)，a -突觸核蛋白主要地位于突觸前(presynaptically)，且因此推測它在突觸的活性的調(diào)節(jié)中扮演的作用。識別了 a-突觸核蛋白的三個主要的亞型，它的最長的和最普通的形式包含140個氨基酸。這種亞型已被應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的抗體的a -突觸核蛋白(a -突觸核蛋白)有關(guān)的特征涉及a-突觸核蛋白的這種亞型。除了 a-突觸核蛋白之外，路易體由多種分子組成，其中ー個分子是4-羥基-2_ 壬烯醒(4-hydroxy-2_nonenal)(HNE)、a，-不飽和的輕基烯經(jīng)(hydroxyalkenal)(Qin等人，2007)。在體外已經(jīng)顯示HNE能修飾a -突觸核蛋白，且因此促進a -突觸核蛋白的寡聚化(oligomerization)。特別地是，已經(jīng)顯示HNE增加和固定原細纖維的形成,例如，a-突觸核蛋白的可溶解的較大的寡聚形式(Qin等人，2007 ;W0 2009/133521，包括在此以供參考)。在許多由錯誤折疊的a -突觸核蛋白的病理的積聚表征的神經(jīng)退化性疾病中已經(jīng)暗示了氧化應(yīng)激(Oxidative stress).各種活性氧組分能誘導(dǎo)脂質(zhì)的過氧化，如細胞膜或脂蛋白，且也導(dǎo)致來自多不飽和脂肪酸的高度地活性醛的產(chǎn)生(yoritaka等人，1996)。在具有DLB大約50%病例中可看到阿爾茨海默氏病(AD)的腦病理指征，例如，淀粉樣斑塊(amyloid plaques)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles)。不清楚的是，平行的病理的存在是否暗示兩種不同的疾病或者僅僅代表每ー個各自紊亂的變體。有時將共病理的病例描述為具有AD的路易體變體(Hansen等人，1990)。近來的研究暗示了在AD和唐氏綜合征(Down’s syndrome)中a-突觸核蛋白的作用，如已經(jīng)證明了 a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)在這些紊亂中的邊緣區(qū)中的積聚(Crews等人，2009)。HNE對半光氨酸、組氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈起反應(yīng)并修飾所述側(cè)鏈，充分地改變這些側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)和物理性能。因此，HNE能與C-3碳或與醛基或其組合起 反應(yīng)。因此，HNE能作用于分子間地或作用于分子內(nèi)共價地修飾蛋白質(zhì)。帕金森氏癥和路易體癡呆的遺傳學(xué)能通過a-突觸核蛋白基因的點突變或重復(fù)形成ro和DLB的稀有的主要地遺傳的形式。已經(jīng)描述了引起家族ro的致病突變A30P和A53T (Kruger等人，1998)(polymeropoulos等人，1998)和基因的重復(fù)(chartier-Harlin等人，2004),然而已經(jīng)報道了引起I3D或DLB的一個其他的a-突觸核蛋白突變，E46K (Zarranz等人，2004)和a-突觸核蛋白基因的三倍體(triplication) (Singleton等人，2003)。僅部分地了解a-突觸核蛋白突變種的致病的結(jié)果。然而，體外數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示，A30P和A53T突變種增加聚集率(Conway等人，2000)。多種不同組成的a-突觸核蛋白種類(単體、ニ聚體、寡聚體，包括原細纖維)都涉及聚集過程，所有這些可具有不同的毒性。不清楚的是，哪ー個分子種類在腦中有毒性作用。然而，最近的研究表明，a-突觸核蛋白的寡聚的形式是顯著地神經(jīng)毒性的。通過引起遺傳的帕金森氏癥的某些a-突觸核蛋白突變種(A30P和A53T)，導(dǎo)致寡聚化増加率的觀察給出關(guān)于寡聚物的作用的另外的證據(jù)。還沒有完全地了解a-突觸核蛋白聚集級聯(lián)是如何開始的?？赡埽谶@些中間大小種類在路易體中作為不可溶解的原纖維沉積之前，單體的a-突觸核蛋白的改變的構(gòu)造開始ニ聚體和三聚體的形成，其繼續(xù)形成較大的可溶解的寡聚體，包括原細纖維。也應(yīng)該理解，a-突觸核蛋白寡聚體，一旦它們形成，則能結(jié)合新的單體和/或a-突觸核蛋白較小的多聚體，因此加速原纖維(fibrils)形成過程。這樣的播種(seeding)作用可能也能在細胞外空間中發(fā)生，如最近的證據(jù)表明a-突觸核蛋白病理可在患病的腦中從神經(jīng)細胞傳播到神經(jīng)細胞。除了在a -共核蛋白病(synucleinopathies)中的神經(jīng)病理的改變之外，a -突觸蛋白的水平通常在受侵襲的腦區(qū)域中增加(Klucken等人，2006)。a-共核蛋白病的主要的病理是細胞內(nèi)的，其引起免疫治療途徑的挑戰(zhàn)。然而，可能，活躍誘導(dǎo)的片段或被動給予的抗體也能在神經(jīng)元內(nèi)結(jié)合它們的靶抗原。此外，血漿和腦脊髓液兩者中的a -突觸核蛋白的識別(El-Agnaf等人，2006)說明，不僅僅在神經(jīng)細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)。減少的這樣的細胞外a-突觸核蛋白可改變細胞內(nèi)和細胞外蛋白質(zhì)集合之間的平衡，且也導(dǎo)致減少細胞內(nèi)的a-突觸核蛋白。證據(jù)表明，在溶液中的a-突觸核蛋白能滲透細胞膜中的脂質(zhì)雙分子層，并因此內(nèi)在化或輸出細胞。最近的發(fā)現(xiàn)證明，a-突觸核蛋白在細胞外的空間中有毒性作用，因此，提供關(guān)于a-突觸核蛋白病理如何作為疾病發(fā)展傳遍腦的似乎真實的解釋。研究顯示，在移植的ro病人中路易病理傳播給移植的神經(jīng)細胞(Li等人，2008)。此外,通過內(nèi)吞作用(endocytosis)將a -突觸核蛋白傳播給鄰近的神經(jīng)細胞，且a-突觸核蛋白聚集體的細胞到細胞的傳播已經(jīng)與I3D和其他a-共核蛋白病中的神經(jīng)細胞死亡和病態(tài)發(fā)展聯(lián)系(Desplats等人，2009)。PD和DLB的診斷需要改進的診斷工具和方法，從而識別具有a -突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的風(fēng)險?，F(xiàn)今，在對腦的真實的傷害已經(jīng)發(fā)生之前，沒有生物化學(xué)的方法能幫助臨床醫(yī)生診斷在疾病的早期階段中的病人的臨床癥狀。精確的診斷分析變得比新治療的可能性出現(xiàn)更加重要。截至今天，只有癥狀治療(通過取代腦中活性的多巴胺的損失)對ro病人可用。對于DLB，甚至 更少的治療選擇是可用的。然而，臨床醫(yī)生經(jīng)常地評價對于AD的標準治療對DLB病人的可能的有益的影響，例如，膽堿酯酶抑制劑。在任一方法中，對于a-共核蛋白病的現(xiàn)有的治療策略沒有一個可針對潛在的疾病過程。另外，也需要監(jiān)測疾病發(fā)展和治療效果。對于改變帕金森氏癥的發(fā)展的不同的方法的評價，參見George等人，2009?？紤]到上述提及的參與幾種神經(jīng)退化性疾病中的a-突觸核蛋白，需要能消除或減少有毒的a -突觸核蛋白種類的影響的新的治療，并需要好的生物標志物，以監(jiān)測新的干涉并提供好的預(yù)測特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及具有對人類a -突觸核蛋白原細纖維高的親和カ和a -突觸核蛋白單體的低的結(jié)合的改進的抗體和它的片段。本發(fā)明也涉及包含這樣的抗體或片段的組合物和涉及利用這樣的抗體或片段檢測a-突觸核蛋白原細纖維的方法。在進ー步地實施例中，本發(fā)明涉及通過給予這樣的抗體或片段預(yù)防、推遲具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作或治療所述疾病的方法，并涉及制備在具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的治療的藥物組合物中使用的這樣的抗體或片段。本發(fā)明也涉及在具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)展的診斷或監(jiān)測中這樣的抗體或片段的應(yīng)用，并涉及通過這樣的抗體或片段的給予減少或抑制a-突觸核蛋白聚集的方法。在一個實施例中，抗體或其片段具有對人類a-突觸核蛋白原細纖維高的親和力和a -突觸核蛋白単體的低的結(jié)合，和具有三個可變的重鏈(VH)⑶R序列(VH-⑶R-1、VH-CDR-2、和 VH-CDR-3 和三個可變的輕鏈(VL) CDR 系列(VL-CDR-l、VL-CDR-2、和VL-⑶R-3)，其中抗體或其片段的六個⑶R序列選自下列各組VH-CDR-1 SEQ ID N0S: 22，23，24，25，26 或者 27VH-CDR-2 SEQ ID N0S: 28，29，30，31，32，33 或者 34VH-CDR-3 SEQ ID N0S: 35，36，37，38，39 或者 40VL-CDR-l SEQ ID N0S: 41，42，43，44，45 或者 46VL-CDR-2 SEQ ID N0S: 47，48 或者 49VL-CDR-3 SEQ ID N0S: 50，51，52，53，54 或者 55在另ー個實施例中，抗體或其片段具有對人類a-突觸核蛋白原細纖維高的親和力和a -突觸核蛋白単體的低的結(jié)合，和具有三個可變的重鏈(VH)⑶R序列(VH-⑶R-1、VH-CDR-2、和 VH-CDR-3 和三個可變的輕鏈(VL) CDR 系列(VL-CDR-l、VL-CDR-2、和VL-⑶R-3)，其中抗體或其片段的六個⑶R序列選自下列各組，和與任何ー個各自組的所述序列具有大于70、80、90、95或98%的相似性的序列VH-CDR-1 SEQ ID N0S: 22，23，24，25，26 或者 27VH-CDR-2 SEQ ID N0S: 28，29，30，31，32，33 或者 34VH-CDR-3 SEQ ID N0S:35，36，37，38，39 或者 40VL-CDR-l SEQ ID N0S: 41，42，43，44，45 或者 46VL-CDR-2 SEQ ID N0S: 47，48 或者 49
VL-CDR-3 SEQ ID N0S: 50，51，52，53，54 或者 55其中抗體或其片段結(jié)合到模型系統(tǒng)中的固定的線性a-突觸核蛋白的氨基酸區(qū)域 113-140 內(nèi)的表位上，例如，113-131，具體地，表位 125-131、121-124、121-127、121-131、113-123或136-140上，其中所述模型系統(tǒng)中的固定的線性a -突觸核蛋白包含具有11個氨基酸重疊的15-mer a -突觸核蛋白肽。根據(jù)本發(fā)明的抗體、片段、組合物和方法在具有和/或在發(fā)展這樣的疾病的風(fēng)險上的個體中，在診斷、監(jiān)測、預(yù)防、推遲具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作和/或治療中提供改進。通過具體的說明，本發(fā)明的各種實施方式的另外的方面、實施例和優(yōu)勢將更加明顯。


通過附圖，將更加充分地理解具體實施方式
，其中圖I顯示如通過競爭性ELISA測定的原細纖維特異性單克隆抗體的性能。如實例4中描述的利用HNE-固定(stabilized)的a -突觸核蛋白原細纖維進行試驗。圖2A和2B顯示通過如實例4中描述的競爭性ELISA分析原細纖維特異性抗體mAb49/G的性能。圖2A顯示原細纖維特異性單克隆抗體mAb49/G以高親和カ結(jié)合到通過HNE或ONE固定的人類a-突觸核蛋白原細纖維上。圖2B顯示單克隆抗體也以高親和カ結(jié)合到a -突觸核蛋白的人類突變的形式的HNE-固定的原細纖維上，A30P和A53T。圖3A-3C顯示通過如實例4中描述的競爭性ELISA分析的原細纖維特異性抗體的性能。原細纖維特異性單克隆抗體以高親和カ結(jié)合到通過HNE(PF-HNE)或ONE(PF-ONE)固定的野生型人類a-突觸核蛋白原細纖維上。單克隆抗體也以高親和力結(jié)合到a-突觸核蛋白的人類突變的形式的HNE-固定的原細纖維上，A30P (A30P-HNE)和A53T (A30P-HNE)。圖4A和4B涉及通過如實例5中描述的三明治式ELISA (夾心ELISA，sandwichELISA), a -突觸核蛋白原細纖維的量化。圖4A顯示用作捕獲抗體和檢測抗體兩種作用的原細纖維特異性抗體mAb49/G的示意圖。圖4B顯示利用HNE-固定的a -突觸核蛋白原細纖維產(chǎn)生的標準的曲線。試驗性能達到LOQ = 9pM的量化的限制。圖5A和5B顯示利用如實例6中描述的a -突觸核蛋白原細纖維特異性三明治式ELISA，患病的(DLB)和対照的人類腦提取物的分析的結(jié)果。圖6顯示如實例7中描述的對照組小鼠(ntg,非轉(zhuǎn)基因的)和來自Khale轉(zhuǎn)基因的(tg)小鼠H)模型的5月大的小鼠的腦提取物的分析。利用tris緩沖鹽(TBS)和含有Triton的TBS提取腦組織。利用如實例5中描述的a -突觸核蛋白原細纖維三明治式ELISA進行分析。原細纖維特異性抗體mAb49/G用作捕獲抗體和檢測抗體。在圖表中，y軸代表在0D450上的吸光率。 圖7A-7F顯示如實例8中描述的組織的免疫組織化學(xué)(IHC)分析。圖7A顯示路易體的38E2/7結(jié)合，且黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陽性a - a -突觸核蛋白對照。圖7B顯示路易體的38E2/7結(jié)合和在DLB皮質(zhì)和黑質(zhì)中的神經(jīng)突以及陽性a-a-突觸核蛋白對照。圖7C顯示多種抗體結(jié)合路易體和在DLB皮質(zhì)和黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陰性對照。圖7D顯示多種抗體結(jié)合路易體和在ro黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陰性對照。圖7E顯示在非疾病相關(guān)的黑質(zhì)中38E2/7沒有結(jié)合且陽性a - a -突觸核蛋白対照。圖7F顯示38E2/7結(jié)合和在阿爾茨海默氏癥病人的皮質(zhì)中的陽性a-AP対照的比較。圖8A和8B顯示利用如實例9中描述的腦提取方案，提取的具有原細纖維選擇性的單克隆抗體38E2/7的人類腦提取物的免疫沉淀反應(yīng)。圖9A和9B顯示利用如實例10中描述的裝備FITC落射熒光(印ifluorescence)濾光器的Axiovert 200顯微鏡測量的熒光數(shù)據(jù)。圖9A顯示處理過的細胞，而圖9B顯示與抗體未處理的a -突觸核蛋白過表達的細胞相比較，將其設(shè)定為100%，以在熒光強度中相對％減少計算的數(shù)據(jù)。考慮到下面列出的實施例，將更充分地理解各個圖。
具體實施例方式在第一個實施例中，本發(fā)明涉及具有對人類a -突觸核蛋白原細纖維高親和カ和a-突觸核蛋白単體的低的結(jié)合的改進的抗體和它的片段。在具體的實施例中，抗體是ー類IgG抗體或它的變體。在本公開內(nèi)，對人類a-突觸核蛋白原細纖維的高的親和カ意味著，抗體或片段對人類a-突觸核蛋白原細纖維表現(xiàn)小于10_7M的分離常數(shù)Kd。如本領(lǐng)域已知的，原細纖維是a-突觸核蛋白的可溶解的寡聚物。典型的原細纖維具有的分子量范圍從大約1000到大約5000kDa，以球狀蛋白為參考，利用尺寸排阻色譜適當(dāng)?shù)販y量，但是本發(fā)明不限于這樣的典型的原細纖維。另外，在本公開內(nèi)，a-突觸核蛋白単體的低的結(jié)合意味著，根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段對a-突觸核蛋白単體的結(jié)合至少小于對a-突觸核蛋白原細纖維的結(jié)合的100倍。在具體的實施例中，根據(jù)競爭性ELISA，例如，如實例4中描述的，測量這些結(jié)合親和力。本發(fā)明進ー步涉及在預(yù)防、推遲具有a -突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作、所述疾病的治療、監(jiān)測和/或診斷中用于改進的這樣的抗體和片段的方法和應(yīng)用，所述疾病包括，但不限于，帕金森氏疾病(PD)、路易體癡呆(DLB)、阿爾茨海默氏癥的路易體變體(the Lewy body variant of Alzheimer’s disease)、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神病、精神分裂癥和克雅ニ氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)。在a -共核蛋白病中，作為路易體和路易神經(jīng)突的聚集的a-突觸核蛋白在腦中，在某些指征中，也在其他器官中積聚。已經(jīng)通過經(jīng)典的雜交瘤細胞技術(shù)揭露了根據(jù)本發(fā)明的抗體的實例?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體。在具體的實施例中，抗體是單克隆抗體。在很多場合中本公開涉及抗體和它的片段時，為了方便的目的，在本公開中的術(shù)語“抗體”包括它的片段，意味著它的活性片段，例如，片段具有根據(jù)本發(fā)明的抗體定義的相同的特征，即對a-突觸核蛋白寡聚體/原細纖維具有高親和カ和a-突觸核蛋白単體低的結(jié)合。在病理形式的a-突觸核蛋白的清除中，抗體和它的片段表現(xiàn)出高效率。發(fā)明的抗體結(jié)合聚集的形式，具體地是原細纖維，包括未修飾的或結(jié)合的a-突觸核蛋白，例如，結(jié)合到4-輕基-2-壬烯醒(HNE)或4-氧-壬烯醒(4-oxo-2-nonenal)(ONE)、或其他a，￠-不飽和的羥基烯烴、或多-不飽和脂肪酸，這種結(jié)合固定致病的原細纖維/寡聚a-突觸核蛋白表位。所述表位在構(gòu)象改變的或修飾的a-突觸核蛋白上出現(xiàn)，例如，在患有a -共核蛋白病的病人的腦中出現(xiàn)的a-突觸核蛋白原細纖維和寡聚體，如，但不限于，帕金森氏癥、DLB，等等。發(fā)明的抗體也結(jié)合到通過a-突觸核蛋白突變種形成的致病的原細纖維/寡聚結(jié)構(gòu)上，例如，已經(jīng)描述了引起家族I3D的A30P和A53T (Kruger等人，1998)(Polymeropoulos等人，1997)。本發(fā)明的抗體的這種祀目標的另一個實例是通過 引起或DLB的突變種a -突觸核蛋白E46K形成的原細纖維。在本發(fā)明的ー個具體的實施例中，提供用于區(qū)分、診斷、識別與a-突觸核蛋白病理有關(guān)的疾病的發(fā)展的風(fēng)險、和/或治療所述疾病的單克隆抗體，包括，但不限于，例如，帕金森氏癥、路易體癡呆、阿爾茨海默氏病的路易體變體、阿爾茨海默氏病、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神錯亂、精神分裂癥、克雅ニ氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)和其他神經(jīng)退化性疾病。本發(fā)明的抗體或片段包括在抗體的可變的輕鏈(VL)和可變的重鏈(VH)鏈上的CDR1-3區(qū)域限定的氨基酸序列，其中所述抗體對含有“H)和/或DLB疾病的表位”的可溶解的a-突觸核蛋白原細纖維具有高的親和力。在具體的實施例中，CDR區(qū)域與Fe區(qū)域的變型結(jié)合，以便調(diào)節(jié)效應(yīng)器功能，如，但不限于，F(xiàn)e受體結(jié)合(Fe receptor binding)、補體因子Clq結(jié)合(complement factor Clq binding)、有效的半衰期(effecting half-life)、補體的激活(complement activation)和炎癥過程?？贵w的恒定區(qū)具有許多重要的功能，顯著地結(jié)合Fe-受體和補體因子Clq。能阻止后面的功能激活，以便避免炎癥反應(yīng)。如與其他已知的免疫治療的治療藥比較，具有對a-突觸核蛋白原細纖維高的親和カ和對a-突觸核蛋白単體低的結(jié)合的本發(fā)明的抗體和片段具有下列獨特的優(yōu)勢I)本發(fā)明的抗體和片段例如，通過抑制寡聚化(參見實例10)或通過其他機制，靶向和滅活或至少減少疾病引起的a-突觸核蛋白原細纖維。2)通過本發(fā)明的抗體和片段表現(xiàn)的對a-突觸核蛋白原細纖維的高的親和カ減少治療需要的有效的臨床劑量。3)與活性的免疫方法例如疫苗比較，本發(fā)明的抗體和片段提供在老年病人中精確劑量的模式。4)在邊緣區(qū)/全身中對a-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合，因此允許更多的抗體/片段可用于腦中a-突觸核蛋白寡聚形式的結(jié)合和清除。5)抗體和片段通過對補體因子Clq低的或沒有的結(jié)合減少炎癥副作用的風(fēng)險，例如，月兇膜腦炎(meningioencephalitis)。本發(fā)明的ー個方面是CDR區(qū)域的抗體氨基酸序列的發(fā)現(xiàn)，其中所述CDR區(qū)域?qū)τ谌祟愐吧秃屯蛔凅wa-突觸核蛋白原細纖維的結(jié)合扮演重要的作用。通過對野生型人類a -突觸核蛋白寡聚體/原細纖維的高的親和カ表征具有根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合位點(CDR區(qū)域)的抗體，以便用作治療或診斷。免疫球蛋白(IgG)分子的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)包括通過ニ硫橋連接在一起的兩個同樣的輕鏈和兩個同樣的重鏈。輕鏈，其是、或K，具有每ー個大約110個氨基酸殘基的可變區(qū)域(VL)和恒定區(qū)域(CL)。重鏈具有大約110個氨基酸殘基的可變區(qū)域(VH)，但是具有300-400個氨基酸殘基的更大的恒定區(qū)域(CH)，包括CH Y I、CH Y 2和CH Y 3區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。恒定區(qū)(Fe)激活補體系統(tǒng)并結(jié)合到巨噬細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和嗜中性細胞上的Fe受體上，其吸收和破壞感染的微生物或外源的/非自身的抗原。這種功能是重要的，因為它是抗體的治療原則的部分，例如，F(xiàn)e受體介導(dǎo)小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的吞噬作用和a-突觸核蛋白原細纖維的清除。已經(jīng)證明了通過溶酶體降解途徑調(diào)節(jié)的a-突觸核蛋白寡聚體的清除(Lee等人，2004)。這個過程涉及，在其中降解a -突觸核蛋白原細纖維的溶酶體的 融合之后，受體依賴的或非受體依賴的抗體/原細纖維復(fù)合物的內(nèi)吞作用(Masliah等人，2005)。已經(jīng)表明了控制這個過程的受體包括Thyl. I受體和與脂蛋白受體有關(guān)的蛋白質(zhì)(LPR)。也可能操作其他的抗a -突觸核蛋白的清除機制?？扇芙獾腶-突觸核蛋白原細纖維的清除是根據(jù)本發(fā)明的治療的重要的機制，認為a-突觸核蛋白原細纖維是高度地毒害神經(jīng)的，啟動和加快了疾病過程。腦中a-突觸核蛋白原細纖維的清除是重要的臨床評價的機制。除了 a-突觸核蛋白原細纖維的清除之外，將通過a-突觸核蛋白原細纖維如，a -突觸核蛋白原細纖維、ニ聚體、三聚體、四聚體和更高的寡聚形式的前體形式的清除間接地簡化包括a-突觸核蛋白原纖維的其他a-突觸核蛋白聚集的形式。包括原細纖維和原纖維的不同的a-突觸核蛋白形式保持平衡狀態(tài)。利用高的親和カ的原細纖維結(jié)合抗體的治療并通過所述抗體對a-突觸核蛋白原細纖維的清除也具有間接地簡化其他a-突觸核蛋白聚集的或寡聚的形式的優(yōu)勢。還有另ー個抗體的作用機制是通過結(jié)合到毒性的a-突觸核蛋白種類和阻止它們的與神經(jīng)細胞的相互作用阻斷或抑制a-突觸核蛋白的毒性。重鏈和輕鏈的各自的可變區(qū)含有稱作互補決定區(qū)或⑶R的三個高變區(qū)(hypervariable regions)。Q)R區(qū)域是位于VL和VH區(qū)域中的，大約7-23個,例如，13-23個氨基酸的短的延伸?？贵w的ー個“臂”上的六個CDR區(qū)域形成結(jié)合抗原的“ ロ袋”。在文獻中使用⑶R-序列的幾個定義。SEQ IDN0S: 1-21利用第一識別系統(tǒng)定義發(fā)明的⑶R-序列，因而在表格I中(參見實例2)通過下劃線區(qū)域在人類野生型和突變體a -突觸核蛋白原細纖維特異性單克隆抗體中的VL和VH中顯示識別的CDR序列。SEQ ID N0S: 22-55利用已知的Kabat系統(tǒng)識別發(fā)明的CDR-序列，因而在表格2中(參見實例2)通過下劃線區(qū)域在人類野生型和突變種a -突觸核蛋白原細纖維特異性單克隆抗體中的VL和VH中顯示識別的Kabat CDR序列。在本公開中使用根據(jù)Kabat (SEQ ID N0S:22_55)發(fā)明的CDR-序列的識別。因而，一個實施例中，通過具有六個⑶R序列(VH-⑶R-1、VH-⑶R-2、VH-⑶R-3、VL-⑶R-l、VL-⑶R-2、和VL-⑶R-3)表征根據(jù)本發(fā)明的抗體，其中所述⑶R序列選自以任意組合的方式的CDR序列的每個下列各自組。VH CDR-IGFTFNTYAM SEQ ID NO:I GFTFNTYAMN SEQ ID NO:22GFTFSNYAM SEQ ID NO:2 GFTFSNYAMS SEQ ID NO:23
GFTFSSYAM SEQ ID NO:3 GFTFSSYAMS SEQ ID NO:24⑶SFTSGYWSEQ ID NO:4 ⑶SFTSGYWN SEQ ID NO:25GFSLTSYGVH SEQ ID NO :26GFTFTDYYMS SEQ ID NO :27VH CDR-2RIRTKSNDYATYYADSVKG SEQ ID NO:5RIRTKSNDYATYYADSV SEQ ID NO :28TVTSGGSYTYYPDSVRGSEQ ID NO:6 TVTSGGSYTYYPDSVSEQ ID NO :29TISNGGS YT YYPD S VKG SEQ ID NO:7TISNGGS YT YYPD S V SEQ ID NO:30YIRYSGNTYYNPSLKSSEQ ID NO:8YIRYSGNTYYNPSLSEQ ID NO:31VIffRGGSTDYSAAFSEQ ID NO :32TISTGGSYTYYPDSVSEQ ID NO:33FIRNKANGYTTEYSASVSEQ ID NO:34VH CDR-3VGYRPYAMDYSEQ ID NO:9 (SEQ ID NO:35)QNFGSRGffYFDV SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:36)HSDYSGAffFAY SEQ ID NO:11 (SEQ ID NO:37)SYYDYDRAffFAY SEQ ID NO:12 (SEQ ID NO:38)LLRSVGGFADSEQ ID NO :39DYGNYAMDYSEQ ID NO :40VL CDR-IRSSQNIVHSNGNTYLE SEQ ID NO:13 (SEQ ID N0:41)RSSQSIVNSNGNTYLE SEQ ID NO:14 (SEQ ID NO:42)SASSSVSYMYSEQ ID NO:15 (SEQ ID N0:43)RSSQSLVHSNGNTYLH SEQ ID NO:16 (SEQ ID N0:44)RSSQTIVHNNGNTYLE SEQ ID NO:45KSSQSLLYSSNQKNYLA SEQ ID NO :46VL CDR-2KVSNRFS SEQ ID NO:17 (SEQ ID NO:47)RTSNLAS SEQ ID NO:18 (SEQ ID NO:48)WASTRES SEQ ID NO :49VL CDR-3FQGSHVPLT SEQ ID NO:19 (SEQ ID NO:50)QQYHSYPYT SEQ ID NO:20 (SEQ ID NO:51)SQSTHVPffT SEQ ID NO:21 (SEQ ID NO:52)FQGSHVPFT SEQ ID NO :53
QQFHSYPYT SEQ ID NO :54QQYYSYPYT SEQ ID NO :55排除了為了某些感興趣的特征最初選擇的ー個抗體，因為它不能滿足根據(jù)本發(fā)明的標準的定義的抗體。這種排除的重要的參數(shù)是具有由這種抗體暴露的五個氨基酸的相當(dāng)短的VH⑶R-3序列。因此，推斷，VH⑶R-3序列需要超過5個氨基酸。在具體的實施例中，VH CDR-3序列是9、10、11或12個氨基酸。在具體的實施例中，根據(jù)本發(fā)明的抗體和片段具有選自下列組合的六個CDR序列SEQ ID N0S:22，28，35，41，47 和 50，SEQ ID N0S:23，29，36，42，47 和 50，
SEQ ID N0S:24，30，37，43，48 和 51，SEQ ID N0S:25，31，38，44，47 和 52，SEQ ID N0S:26，32，39，45，47 和 53，SEQ ID N0S: 23，33，37，43，48 和 54，和SEQ ID N0S:27，34，40，46，49 和 55。在另外的具體的實施例中，在滿足此處定義的其他重要的特征時，提供關(guān)于a-突觸核蛋白原細纖維的期望的特異性的抗體具有選自下列下列各組的抗體或片段的六個⑶R序列VHCDR-I SEQ ID N0S: 23，24，25 或者 26VH CDR-2 SEQ ID N0S: 29，30，31 或者 32VH CDR-3 SEQ ID NO:36VL CDR-I SEQ ID N0S: 42，43，44 或者 45VL CDR-2 SEQ ID N0S: 47 或者 48VL CDR-3 SEQ ID N0S: 50，51，52 或者 53或選自下列各組VH CDR-I SEQ ID NOS: 23，24，25 或者 26VH CDR-2 SEQ ID N0S: 29，30，31 或者 32VH CDR-3 SEQ ID NO:37VL CDR-I SEQ ID N0S:42，43，44 或者 45VL CDR-2 SEQ ID N0S: 47 或者 48VL CDR-3 SEQ ID N0S: 50，51，52 或者 53或選自下列各組VHCDR-I SEQ ID NOS: 23，24，25 或者 26VH CDR-2 SEQ ID N0S: 29，30，31 或者 32VH CDR-3 SEQ ID NO:38VL CDR-I SEQ ID N0S: 42，43，44 或者 45VL CDR-2 SEQ ID N0S: 47 或者 48VL CDR-3 SEQ ID N0S: 50，51，52 或者 53或選自下列各組
VHCDR-I SEQ ID NOS: 23，24，25 或者 26VH CDR-2 SEQ ID NOS: 29，30，31 或者 32VH CDR-3 SEQ ID NO :39VL CDR-I SEQ ID NOS:42，43，44 或者 45VL C·DR-2 SEQ ID NOS :47 或者 48VL CDR-3 SEQ ID NOS: 50，51，52 或者 53。如先前提到的，通過對靶目標的高的親和力表征α-突觸核蛋白原細纖維結(jié)合的根據(jù)本發(fā)明的抗體和片段。高親和力，以分離常數(shù)Kd表示，小于1(ΤΜ。在另外的實施例中，對于人類α -突觸核蛋白原細纖維的分離常數(shù)Kd小于10_8Μ、小于10_9Μ、小于ΙΟ,Μ、或甚至小于10_ηΜ。與具有10_6Μ周圍或更高的親和力的抗體比較，這些抗體和片段具有它們能夠以較低的劑量給予的優(yōu)勢。如這些能通過注射給予的高親和力抗體，能皮下給予，因為為了達到功效只需要低量的抗體，這具有重要的臨床優(yōu)勢。給予方式不限于皮下的或靜脈注射。此外，功效需要較低的劑量將減少用于抗體生產(chǎn)的物質(zhì)的成本。除了抗體對α-突觸核蛋白原細纖維的高的親和力之外，抗體和片段對α-突觸核蛋白單體表現(xiàn)低的結(jié)合，和可選地對α-突觸核蛋白原纖維表現(xiàn)低的結(jié)合。如上述提到的，對α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合意味著，根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段對α-突觸核蛋白單體的結(jié)合小于對α-突觸核蛋白原細纖維的結(jié)合的至少100倍。在更具體的實施例中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段對α-突觸核蛋白原細纖維的結(jié)合超過對α-突觸核蛋白單體的結(jié)合的500倍或甚至超過1000倍。在另一個實施例中，抗體和片段對α-突觸核蛋白原纖維表現(xiàn)低的結(jié)合。在更具體的實施例中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段對α-突觸核蛋白原細纖維的結(jié)合超過對α-突觸核蛋白原纖維的結(jié)合的100倍、500倍、或甚至超過1000倍。在本發(fā)明的還有的另一個實施例中，抗體和片段對β淀粉樣(Αβ )原細纖維表現(xiàn)低的結(jié)合(例如，Kd>10_5M)且對β淀粉體單體表現(xiàn)低的結(jié)合(例如，Kd>10_5M)。在本發(fā)明的還有的另一個實施例中，抗體和片段對突觸核蛋白單體、Y-突觸核蛋白單體、IAPP (胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide))、和/或Medin多肽表現(xiàn)低的結(jié)合，例如，抗體和片段對一個或更多這些肽/蛋白質(zhì)的結(jié)合至少小于對人類α-突觸核蛋白原細纖維的結(jié)合的100倍。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，能通過在模型系統(tǒng)中對氨基酸(aa)區(qū)域113-140內(nèi)的α-突觸核蛋白中的線性表位的結(jié)合限定為根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段，例如，aa區(qū)域113-131，具有 aa 125—131、121—124、121—127、121—131、113—123 和 136-140 作為特定的表位的實例。在這種模型系統(tǒng)中，使用具有11個氨基酸序列重疊的15-mer α -突觸核蛋白肽(參見下列實例3)。根據(jù)本發(fā)明的另外的實施例，提供抗體或片段，所述抗體或片段具有對人類α-突觸核蛋白原細纖維高的親和力和α-突觸核蛋白單體低的結(jié)合，且包含選自SEQ IDNO: 22-27,28-34,35-40,41-46,47-49 和 50-52 的每一個六個 CDR 序列組的一個 CDR-序列的組合，且序列與每一個各自組中的所述序列的任何一個具有大于70、80、90、95或98%的相似性。抗體或片段結(jié)合到氨基酸(aa)區(qū)域113-140內(nèi)的表位上，例如，aa區(qū)域113-131，和具體地模型系統(tǒng)中的固定的線性α-突觸核蛋白的表位aa125-131、121-124、121-127、121-131、113-123或136-140，其中所述系統(tǒng)包含具有11個氨基酸重疊的15_mer α -突觸核蛋白。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體的實施例，高親和力α-突觸核蛋白原細纖維結(jié)合的抗體能減少或抑制α-突觸核蛋白聚集，因此減少腦中可溶解的寡聚α-突觸核蛋白形式的水平。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體的實施例，高親和力α-突觸核蛋白原細纖維結(jié)合的抗體也能結(jié)合CNS外面的α -突觸核蛋白寡聚體/原細纖維，因此以這樣的方式改變血腦屏障上的所述α-突觸核蛋白形式的平衡，以便降低所述α-突觸核蛋白形式的CNS水平(排除)。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體的實施例，抗體是IgG類型的抗體，適于能經(jīng)過血腦屏障的治療應(yīng)用?？稍O(shè)計高親和力α-突觸核蛋白原細纖維結(jié)合的IgG抗體，以便減少結(jié)合至IJ IgGl的CH2結(jié)構(gòu)域上的補體因子Clq，并減少補體激活和炎癥的風(fēng)險。能以幾種不同的方式完成這種修飾。一種方式是制造嵌合抗體，其中刪除了 IgGl恒定區(qū)的CH Y 2結(jié)構(gòu)域并換成IgG4的相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域或賦予Clq結(jié)合的部分結(jié)構(gòu)域。很確定，IgG4不結(jié)合Clq，因此不激活補體級聯(lián)反應(yīng)。為了完成這個，以這樣的方式設(shè)計重鏈(CH)的恒定區(qū)，以使IgGl上的高親和力Fe-受體結(jié)構(gòu)域(CH Y 3)與IgG4對補體因子Clq不具有結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(CH Y 2)結(jié)合。含有嵌合的恒定的重鏈(IgGl CHy UCH Y 2 IgG4,CH Y 3 =IgGl)的這種新的抗體具有通過Fe-受體介導(dǎo)的吞噬作用使α -突觸核蛋白原細纖維有效的清除的重要的性能并減少副作用的風(fēng)險，例如炎癥如腦膜腦炎的副作用的風(fēng)險。減少炎癥的風(fēng)險的還有的另一個方式是改變抗體的寡聚糖結(jié)構(gòu)，其將減少補體因子Clq結(jié)合和補體激活作用。已經(jīng)描述了人類IgGl中Asn-297上的合成的雜合的寡聚糖的三十個不同的結(jié)構(gòu)。認為CH2關(guān)聯(lián)的糖類的缺失引起抗體的“鉸鏈”區(qū)中的構(gòu)象的改變，減少與效應(yīng)器分子的相互作用的功效和補體激活功能和Clq結(jié)合的損失。高親和力人類α -突觸核蛋白原細纖維結(jié)合抗體通過Asn-297的位置定點突變成任意其他的氨基酸的修飾將產(chǎn)生具有較少的Clq結(jié)合的保留Fe-受體結(jié)合的抗體，因此減少炎癥的風(fēng)險，具體地是在血腦屏障上的炎癥的風(fēng)險?？贵w上可替換地修飾糖基化是在其中已經(jīng)抑制了 N-乙酰葡糖胺(acteylglucosaminyl)轉(zhuǎn)移酶的細胞類型中表達抗體。這將產(chǎn)生在Asn-297上具有改變的碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體。形成Man5GlcNAc2的結(jié)構(gòu)，但不限于這個結(jié)構(gòu)。這種碳水化合物修飾將減少補體因子Clq結(jié)合和抑制炎癥(Wright等人，1998)。可替換地，能通過在含有衣霉素的情況下培養(yǎng)表達抗體的細胞獲得無糖基化的(aglycosylated)原細纖維結(jié)合抗體,其中所述衣霉素抑制糖基化。這些抗體已經(jīng)改變了補體激活活性和改變Fe-受體功能(Leatherbarrow等人,1985)。具有低的補體激活和高的Fe-受體結(jié)合的表達抗體的克隆表達的篩選將產(chǎn)生原細纖維結(jié)合抗體，其表現(xiàn)α -突觸核蛋白原細纖維的高的Fe-介導(dǎo)的清除和低的Clq結(jié)合。 在另一個實施例中，高親和力人類α-突觸核蛋白原細纖維結(jié)合抗體是IgG亞型，例如，IgGl或IgG4，其中以這樣的方式已經(jīng)修飾了補體因子Clq結(jié)合位點，例如，Pro331>Ser331(Xu等人，1994)，以便減少或抑制補體因子Clq的結(jié)合。這樣的抗體特別地適合于，例如，用于治療、預(yù)防或推遲具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作，對患有這樣的疾病或在發(fā)展這樣的疾病的風(fēng)險上的個體給予這樣的抗體，例如，但不限于，患有或具有發(fā)展成ro的風(fēng)險的個體。也能將人類IgGl中的位置331上的脯氨酸殘基改變成蘇氨酸或甘氨酸或任何其他極性氨基酸。能通過標準的分子生物學(xué)技術(shù)如定點突變或DNA缺失完成這種修飾。本發(fā)明的還有的另一個方面是關(guān)于具體地測定人類或動物組織中的原細纖維水平的高親和力人類α-突觸核蛋白原細纖維結(jié)合抗體的應(yīng)用，例如，腦脊髓液(CSF)、血、尿、唾液、腦組織中，作為診斷工具或生物標志用于，或用于監(jiān)測，患有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病。帕金森氏癥(PD)、路易體癡呆(DLBO、阿爾茨海默氏病的路易體變體、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神錯亂、精神分裂癥、和克雅二氏癥僅僅是患有α -突觸核蛋白病理的這樣的神經(jīng)退化性疾病的例證。例如，如與不具有帕金森氏癥或任何其他α-共核蛋白病的匹配的老年的對照組相比,H)病人的CSF或血中的人類α -突觸核蛋白原細纖維的水平可能是不同的。與對照的受試者相比，發(fā)展帕金森氏癥或任何其他α-共核蛋白病的人可能改變了 CSF或血液中的α-突觸核蛋白原細纖維的水平。因此，CSF或血液中α-突觸核蛋白原細纖維水平的測定能提供所述疾病的早期診斷。對于以根據(jù)本發(fā)明的新的高親 和力的α-突觸核蛋白原細纖維結(jié)合抗體完成所述測定是可能的，且，在具體的實施例中，可結(jié)合三明治氏ELISA方法完成所述測定(參見實例5)，其中已經(jīng)測定了降至9ρΜ水平的α-突觸核蛋白原細纖維?？梢院雎云渌?突觸核蛋白形式的干擾，具體地α-突觸核蛋白單體，和可選地α-突觸核蛋白原纖維和試驗中的α-突觸核蛋白片段的干擾。利用抗-α -突觸核蛋白原細纖維抗體分析這些組織和細胞培養(yǎng)基中的α _突觸核蛋白原細纖維的適當(dāng)?shù)姆椒ǖ膶嵗庖叻治鋈鏓LSA、RIA、蛋白質(zhì)印跡或斑點印跡(dot blotting)。這些方法適合于如通過臨床試驗中原細纖維減少測量和/或如診斷檢驗的下列治療功效。因為CSF和血中的α-突觸核蛋白原細纖維水平是非常低的，本發(fā)明的高親和力α -突觸核蛋白原細纖維結(jié)合抗體用于診斷檢驗是有利的，例如，基于ELISA方法的診斷檢驗，以允許低水平的α -突觸核蛋白原細纖維的測量。根據(jù)這樣的方法，將根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段加入到包含或懷疑包含α -突觸核蛋白原細纖維的生物樣品上，且檢測在α-突觸核蛋白原細纖維和抗體或片段之間形成的復(fù)合物(comp I ex)的存在?？啥ㄐ缘貦z測復(fù)合物，例如，檢測復(fù)合物的存在，或定性地，例如，如期望的，可檢測復(fù)合物的濃度或復(fù)合物的閾值濃度。在另外的實施例中，本發(fā)明包括在用于人類和動物組織中的α-突觸核蛋白原細纖維的檢測、定位和定量的成像中高親和力原細纖維特異性抗體和片段的應(yīng)用。可利用可檢測的標簽標記抗體或片段，例如，放射性的配體如Im、C14、H3或鎵68，但不限于這些放射性同位元素，且與樣品接觸或為了檢測目的給予。這樣的方法適于用作具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的診斷工具，所述疾病包括，但不限于，帕金森氏癥、路易體癡呆和其他α-突觸核蛋白有關(guān)的神經(jīng)退化性疾病。在具體的實施例中，這樣的方法可指導(dǎo)監(jiān)測沒有或在藥物治療或其他可能的治療下的受試者中的α-突觸核蛋白有關(guān)的疾病的發(fā)展。因此，在本發(fā)明的一個方面中，將抗體加入到包含或懷疑包含α-突觸核蛋白原細纖維的生物樣品中，測量所述原細纖維和所述抗體之間形成的復(fù)合物的濃度，用于樣品中原細纖維的檢測和/或定量化。在具體的實施例中，檢測方法包含免疫分析和鄰位連接技術(shù)(proximity ligation assay)。生物樣品可以是從受試者獲得的體外樣品和體內(nèi)液體。
本發(fā)明的還有的另一個方面是制造在獸醫(yī)中應(yīng)用的特定的抗體種類。列出的診斷方法也適合于獸醫(yī)應(yīng)用。本發(fā)明的另一個方面是所述抗體的人源化，以便避免副作用，例如，以避免當(dāng)用作治療或診斷試劑時對抗人類中的抗體的免疫響應(yīng)。這樣的人源化技術(shù)在本領(lǐng)域的一個普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含此處描述的抗體或片段，和藥物學(xué)上可接受的載體。在治療應(yīng)用的具體的實施例中，組合物是生理學(xué)上可接受的配制劑，其包含在適于人類和/或動物給予的生理學(xué)上的緩沖液中根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段的治療上的活性量，所述緩沖液例如，但不限于，PBS。為了更好的固定性，能凍干抗體或片段。凍干的配制劑可含有任何適當(dāng)?shù)膫鹘y(tǒng)的賦形劑，包括固定劑、凍干支持劑(lyoprotectants)、緩沖液等等,如,但 不限于，甘露醇，用于在凍干和/或后來的存儲期間和/或之后，保護和/或固定產(chǎn)品?？蛇x擇地，抗體配制劑可含有抗菌試劑或其他防腐劑或不干擾原細纖維結(jié)合抗體或片段的功能或功效的添加劑。實施例下列實施例用于說明，并不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的這些具體的實施例。實施例Iα -突觸核蛋白原細纖維抗體免疫/多克隆抗體在免疫方案中，利用Balb/C小鼠。如抗原，使用HNE固定的α -突觸核蛋白原細纖維。如上面描述的生產(chǎn)這些，除了使用HNE和α-突觸核蛋白之間60:1的比率(TO2009/133521，包括在此以供參考)。對于免疫，用HNE固定的α-突觸核蛋白原細纖維和佐劑(例如，3-6倍)注射小鼠。在處死小鼠之前，進行含有HNE-修飾的α-突觸核蛋白原細纖維的一個加強注射(booster injection)。分析對α-突觸核蛋白原細纖維和α -突觸核蛋白單體反應(yīng)性的免疫的小鼠的血液。通過直接的ELISA分析多克隆抗體響應(yīng)的特異性。在典型的實驗中，利用單體的α-突觸核蛋白(未修飾的或利用HNE或其他醛修飾的)、原細纖維/寡聚α -突觸核蛋白(未修飾的或利用HNE或其他醛修飾的)或纖維狀的α -突觸核蛋白，以400ng/孔的最終濃度包被在平底高度結(jié)合的96-孔聚苯乙烯微滴定板上。利用2%BSA封閉所述板，利用0. 05%Tween-20/PBS洗滌板，并將來自研究的多克隆抗體的細胞培養(yǎng)基上清液(未稀釋的或利用磷酸鹽緩沖的鹽1:1稀釋的)作為初級抗體加入到孔中。將1/1000的稀釋的堿性的磷酸酶-結(jié)合的山羊-抗鼠鼠IgG/IgM抗體(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)用作第二抗體。利用p-硝基苯磷酸鹽(p-nitrophenyl-phosphate) (Sigma-Aldrich, MO, USA)可視化顯不免疫反應(yīng)性。在血清中，檢測特異性地識別α-突觸核蛋白原細纖維/寡聚體的抗體。另外，能發(fā)現(xiàn)識別α-突觸核蛋白單體的抗體。陰性對照代表未免疫的小鼠。雜交瘤細胞/單克隆抗體鼠B-細胞雜交瘤細胞用于生產(chǎn)單克隆α-突觸核蛋白原細纖維結(jié)合抗體。分離脾細胞且將其放置在消過毒的磷酸鹽-緩沖的鹽(PBS)中，以及在1200Xg上離心lOmin，以便收集細胞富集的顆粒狀物。進一步利用PBS洗滌細胞，且在1200 Xg上離心lOmin。在以1%抗生素補充的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，Invitrogen, La Jolla1CA, USA)中重懸細胞顆粒狀物。在DMEM中將脾細胞與Sp2/0細胞(鼠骨髓瘤細胞系)以I: I比率混合。為了促進細胞融合，將Iml聚乙二醇(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)加入到細胞混合物中，且添加DMEM終止反應(yīng)。收集細胞，且在以10% (v/v)胎牛血清(Cambrex，CharlesCity, IA, USA)補充的和也含有 1% (v/v)丙酮酸鈉(Cambrex, Charles City, IA, USA)、1%(ν/ν)抗生素(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和 1% (v/v)L-谷氨酸(Cambrex, CharlesCity, IA, USA)>5% (v/v) BM 條件介質(zhì)(BM condition media) (Roche DiagnosticsScandinavia, Bromma, Sweden)和 2% (v/v) HAT 介質(zhì)補充物(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)的DMEM中重懸顆粒狀物。將細胞平鋪在96孔細胞培養(yǎng)板上，且允許保留并生長2周。在直接的ELISA中分析雜交瘤細胞細胞上清液。在典型的實驗中，利用單體的α -突觸核蛋白(未修飾的或利用HNE或其他醛修飾的)、寡聚/原細纖維α _突觸核蛋白(未修飾的或利用HNE或其他醛修飾的)或纖維狀的α -突觸核蛋白包被在平底高度結(jié)合96-孔聚苯乙烯微滴定板上。利用1%BSA封閉所述板，利用PBS-Tween 20 (O. 05%)洗滌板，并將來自研究的雜交瘤細胞的細胞培養(yǎng)基上清液(未稀釋的或利用PBS-Tween 20 (0. 05%)1:2或1:5稀釋的)作為初級抗體加入到孔中。將1/5000稀釋的辣根過氧化物酶-結(jié)合的 HRP-連接結(jié)合的山羊抗鼠 Ig (Southern Biotechnology, prod. No. 1010-05)用作第二抗體。利用 K-藍色水性 TMB 基底液(K-Blue Aqueous TMB substrate) (Neogen Corp. prod.No. 331177)可視化顯示免疫反應(yīng)性。實施例2α -突觸核蛋白原細纖維特異性單克隆抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL/Vkappa)的可變區(qū)的氨基酸序列通過mRNA模板的RT PCR,隨后通過DNA測序測定抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)的氨基酸序列，包括抗體的CDR區(qū)域的氨基酸序列。在表格I中顯示選擇性的抗體的可變重鏈區(qū)域(VH)和可變輕鏈區(qū)域(VL)的氨基酸序列。在⑶R區(qū)域1-3的位置下劃線并顯示。CDR區(qū)域的氨基酸序列形成結(jié)合人類野生型和組成α-突觸核蛋白的“致病的表位”的突變的α-突觸核蛋白原細纖維的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在表格I中顯示根據(jù)本發(fā)明的原細纖維特異性抗體的各自的VL和VH鏈的CDR區(qū)域1-3的氨基酸序列。在表格2中，包括根據(jù)本發(fā)明的一系列另外的抗體的CDR-序列。VH和VL鏈的CDR1-3區(qū)域的組合的氨基酸序列形成以高親和力和特異性結(jié)合人類α-突觸核蛋白野生型原細纖維的分子“口袋”。這種“口袋”形成“H)/DLB表位”的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在VH鏈和VL鏈兩種鏈中都觀察到CDR氨基酸序列長度中的變化，且所述變化與對人類α-突觸核蛋白原細纖維的結(jié)合一致。較短的CDR區(qū)域提供更加有限的三維結(jié)構(gòu)的抗體結(jié)合口袋，然而較長的CDR區(qū)域更靈活。如在表格I和2中示出的CDR序列是本發(fā)明的實施例，因為它們是VH和VL鏈的“鼠框架”區(qū)域中的氨基酸序列，例如，CDR區(qū)域外面的，和原細纖維特異性抗體的人類VL和VH框架區(qū)域，但不限于那些。與在表格I和2中示出的相比較，CDR區(qū)域中的其他氨基酸置換與高親和力和高特異性結(jié)合人類α-突觸核蛋白原細纖維相同。其中極性氨基酸在能通過一個極性氨基酸置換的具體的氨基酸的CDR區(qū)域中的具體的位置中出現(xiàn)，對α -突觸核蛋白原細纖維具有保留的或改進的高親和力和特異性結(jié)合。同樣地，如果非極性或負或正帶電荷的氨基酸在某些位置中出現(xiàn)，能通過來自相同的極性組的相似的氨基酸置換某些位置上的氨基酸。如通過功能等效物在CDR區(qū)域中的任何位置中交換具體的氨基酸，其中功能的等效物賦予關(guān)于α-突觸核蛋白原細纖維親和力的抗體充分地相同的功能和結(jié)構(gòu)，這樣的構(gòu)造當(dāng)然在本發(fā)明的范疇內(nèi)。在這點上，與一個先前指示的各自組的VH⑶R和VL⑶R序列具有大于70、80、90、95或98%的相似性的抗體和片段，具有在本文中描述的維持的表位結(jié)合，都在本發(fā)明的范疇內(nèi)。表格I.來自人類野生型和突變α-突觸核蛋白原細纖維特異性的四個不同單克隆抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL/V K )的可變區(qū)的氨基酸序列。在VL和VH中的各種CDR區(qū)域(1-3)的位置有下劃線。抗體ΒΑ1-ΒΑ4是根據(jù)本發(fā)明的高親和力原細纖維特異性抗體的實例。
權(quán)利要求
1.ー種具有對人類a-突觸核蛋白原細纖維的高親和カ和a-突觸核蛋白単體的低結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或片段具有三個可變的重鏈(VH) CDR序列(VH-CDR-1、VH-CDR-2、和 VH-CDR-3)和三個可變的輕鏈(VL) CDR 序列(VL-CDR-1、VL-CDR-2、和VL-⑶R-3)，并且其中所述抗體或其片段的六個⑶R序列選自下列各組VH-CDR-1 SEQ ID NO:22，23，24，25，26 或 27VH-CDR-2 SEQ ID NO:28，29，30，31，32，33 或 34VH-CDR-3 SEQ ID NO:35，36，37，38，39 或 40VL-CDR-I SEQ ID NO:41，42，43，44，45 或 46VL-CDR-2 SEQ ID NO:47，48 或 49VL-CDR-3 SEQ ID NO:50，51，52，53，54 或 55。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段的所述六個CDR序列選自下列各組VH CDR-I SEQ ID NO:23，24，25 或 26VH CDR-2 SEQ ID NO:29，30，31 或 32VH CDR-3 SEQ ID NO:36，37，38 或 39VL CDR-I SEQ ID NO:42，43，44 或 45VL CDR-2 SEQ ID NO:47 或 48VL CDR-3 SEQ ID NO:50，51，52 或 53。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體或片段，具有選自下列組合的⑶R序列組合SEQ ID NO:22，28，35，41，47 和 50，SEQ ID NO:23，29，36，42，47 和 50，SEQ ID NO:24，30，37，43，48 和 51，SEQ ID NO:25，31，38，44，47 和 52，SEQ ID NO:26，32，39，45，47 和 53， SEQ ID NO:23，33，37，43，48 和 54，以及 SEQ ID NO:27，34，40，46，49 和 55。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合到模型系統(tǒng)中的固定的線性a-突觸核蛋白的氨基酸區(qū)域113-140內(nèi)的表位上，例如，氨基酸區(qū)域 113-131，且特別地，表位氨基酸 125-131、121-124、121-127、121-131、113-123或136-140，所述模型系統(tǒng)中的固定的線性a-突觸核蛋白包含具有11個氨基酸重疊的15-mer a -突觸核蛋白肽。
5.ー種具有對人類a-突觸核蛋白原細纖維的高親和カ和a-突觸核蛋白単體的低結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或片段具有三個可變的重鏈(VH) CDR序列(VH-CDR-1、VH-CDR-2、和 VH-CDR-3)和三個可變的輕鏈(VL) CDR 序列(VL-CDR-1、VL-CDR-2、和VL-CDR-3)，并且其中所述抗體或其片段的六個CDR序列選自下列各組，并且序列與所述各組的任何所述序列具有大于70、80、90、95或98%的相似性VH-CDR-1 SEQ ID NO:22，23，24，25，26 或 27VH-CDR-2 SEQ ID NO:28，29，30，31，32，33 或 34VH-CDR-3 SEQ ID NO:35，36，37，38，39 或 40VL-CDR-I SEQ ID NO:41，42，43，44，45 或 46VL-CDR-2 SEQ ID NO :47, 48 或 49VL-CDR-3 SEQ ID NO :50, 51，52，53，54 或 55， 并且其中所述抗體或其片段結(jié)合到模型系統(tǒng)中的固定的線性a-突觸核蛋白的氨基酸區(qū)域113-140內(nèi)的表位上，例如，氨基酸區(qū)域113-131，且特別地，表位氨基酸125-131、121-124、121-127、121-131、113-123或136-140，所述模型系統(tǒng)中的固定的線性a -突觸核蛋白包含具有11個氨基酸重疊的15-mer a-突觸核蛋白肽。
6.ー種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體或片段，和藥物學(xué)上可接受的載體。
7.—種檢測a-突觸核蛋白原細纖維的方法，包括以下步驟 -將權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體或片段加入到包含或懷疑包含a -突觸核蛋白原細纖維的生物樣品中，以及 -檢測a-突觸核蛋白原細纖維和所述抗體或片段之間形成的復(fù)合物的存在。
8.一種在個體中預(yù)防、推遲具有a -突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作或治療所述神經(jīng)退化性疾病的方法，包含給予所述個體根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體或片段或根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述神經(jīng)退化性疾病是帕金森氏疾病(PD)、路易體癡呆(DLB)、阿爾茨海默氏癥的路易體變體、阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神病、精神分裂癥或克雅ニ氏病。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體或片段在制備用于治療具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中所述神經(jīng)退化性疾病是帕金森氏疾病(PD)、路易體癡呆(DLB )、阿爾茨海默氏癥的路易體變體、阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神病、精神分裂癥或克雅ニ氏病。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體或片段或根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物在診斷或監(jiān)測具有a-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的進展中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，診斷或監(jiān)測帕金森氏疾病(PD)、路易體癡呆(DLB)、阿爾茨海默氏癥的路易體變體、阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神病、精神分裂癥或克雅ニ氏病的進展。
14.一種減少或抑制a-突觸核蛋白聚集的方法，通過給予包含可溶解的a-突觸核蛋白種類的樣品根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體或片段或根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物。
全文摘要
抗體及其片段具有對人類α-突觸核蛋白原細纖維高的親和力和α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合，其中抗體或片段具有特定的互補決定區(qū)(CDR)序列。組合物包含這樣的抗體或片段和利用這樣的抗體或片段檢測α-突觸核蛋白原細纖維的方法。在進一步的實施例中，預(yù)防、推遲具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作或治療所述疾病的方法包括給予這樣的抗體或片段，且這樣的抗體或片段用于制備治療具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的藥物組合物。這樣的抗體或片段用于具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病進展的診斷或監(jiān)測，以及用于通過這樣的抗體或片段的給予減少或抑制α-突觸核蛋白聚集的方法中。
文檔編號C07K16/18GK102869680SQ201180011363
公開日2013年1月9日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者埃娃·努德斯特倫, 亞里克斯·卡斯拉亞恩, 莫妮卡·?？素惱? 瓦倫丁娜·斯克雷潘蒂松德奎斯特, 拉爾斯·蘭費爾特, 馬茨·霍姆奎斯特 申請人:生命北極神經(jīng)科學(xué)公司