專利名稱：一種雙氨基peg-抗菌肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，特別涉及一種雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法，具體是提供了一種經(jīng)過了雙氨基PEG枝接處理的 組合物，本發(fā)明提高了抗菌肽對胃液的穩(wěn)定性，對其推廣使用帶來了極大的便利。
背景技術(shù)：
抗菌妝(antibactericalpeptides),又稱抗微生物妝(antimicrobialpeptides)或肽類抗生素(peptide antibiotics),是指存在于生物體內(nèi)具有抵抗外源微生物侵害、消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類具有生物活性的小分子多肽，是生物體先天免疫的重要組成部分，廣泛分布于細(xì)菌、病毒等微生物和各種動(dòng)植物體內(nèi)?？咕淖鳛榉烙饨缥⑸锏牡谝坏婪谰€，具有抗菌效率高、抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性高、作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)。更為重要的是，抗菌肽對真核細(xì)胞幾乎沒有作用，一般只作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞，并且不會像傳統(tǒng)抗生素那樣使致病菌產(chǎn)生耐藥性?！盁o毒、無殘留、無耐藥性”是新一代抗菌制劑的發(fā)展趨勢和要求，因此，抗菌肽受到了人們的廣泛關(guān)注，國內(nèi)外學(xué)者在研究其一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)大批量表達(dá)抗菌肽，已經(jīng)成為臨床新一代抗菌藥的來源。蛋白質(zhì)或多肽的穩(wěn)定化處理方法主要有生物法(基因工程法)、化學(xué)法(側(cè)鏈修飾法和骨架改造)、物理法(緩釋法)等。不同的方法適應(yīng)范圍不同，效果不同，給藥方法不同，安全性也不同。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾即 PEG 化(pegylation),是將活化的PEG通過化學(xué)方法以共價(jià)鍵偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或多肽分子上，活化的PEG與PEG有顯著的不同，很多直接用PEG枝接并不能得到理想的結(jié)果，因此選擇合適的活化PEG在蛋白修飾中很關(guān)鍵?；罨疨EG修飾具有半衰期延長、免疫原性降低或消失、毒副作用減少以及物理、化學(xué)和生物穩(wěn)定性增強(qiáng)等。由于多肽通過口服使用容易在消化道中受到蛋白酶的降解而失去活性，抗菌肽的注射效果遠(yuǎn)高于口服效果，在畜禽動(dòng)物疾病防控方面，注射劑使用非常不方便，為了開發(fā)口服抗菌肽，發(fā)明人經(jīng)過了長期有效的研究，獲得了耐酸和蛋白酶、口服穩(wěn)定性大大提升的雙氨基PEG修飾抗菌肽制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法。其中抗菌肽經(jīng)過了雙氨基PEG穩(wěn)定化處理。經(jīng)過雙氨基PEG處理后的抗菌肽具有如下結(jié)構(gòu)特征
PEG-0-C-NH-CH2-C-NH- antibacterial peptides 0其中抗菌肽(antibacterial peptides, ABP)可以是基因工程方法獲得的，也可以天然提取的。
其中雙氨基聚乙二醇的分子量在1000-20000之間。雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法，包括以下關(guān)鍵步驟第一步，將抗菌肽用pH6. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液溶解，配制成濃度為l-10mg/ml的溶液；第二步，按抗菌肽雙氨基PEG為I : 0.5-10的重量比例，在第一步的溶液中加入雙氨基PEG ；第三步，把上述混合液在15_75°C條件下反應(yīng)0. 5-4小時(shí)；第四步，在上述溶液中加入IM甘氨酸溶液終止反應(yīng)；第五步，采用色譜柱法分離產(chǎn)物。所述雙氨基PEG-抗菌肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢本發(fā)明提供的雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法，很好的解決了抗菌肽給藥后的胃液對其快速降解的問題，口服制劑性質(zhì)穩(wěn)定、容易到達(dá)機(jī)體腸道，發(fā)揮抗菌活性，有望提升抗菌肽在臨床使用的效果和范圍。
具體實(shí)施例方式結(jié)合以下實(shí)施例可以觀察到本發(fā)明的有益性質(zhì)，這些實(shí)施例是說明性的，不會對本發(fā)明構(gòu)成限制。實(shí)施例I酵母細(xì)胞表達(dá)的抗菌肽LL37凍干粉雙氨基PGE4000，pH6. 0的磷酸鹽緩沖液參藥典方法進(jìn)行配制。配制操作規(guī)程、環(huán)境和器材要求均要完全符合獸藥GMP生產(chǎn)要求。組合物的配制方法是第一步，將抗菌肽用pH6. 5的磷酸鹽緩沖液溶解，配制成濃度為5mg/ml的溶液；第二步，按抗菌肽雙氨基PEG為I : 2的重量比例，在第一步的溶液中加入雙氨基 PEG ；第三步，把上述混合液在室溫條件下反應(yīng)4小時(shí)；第四步，在上述溶液中加入IM甘氨酸溶液終止反應(yīng)；第五步，以葡聚糖G-25為填充材料的分子排阻色譜對雙氨基PEG-抗菌肽進(jìn)行一步純化，洗脫液為PH6. 5磷酸鹽緩沖液，用280nm波長進(jìn)行紫外光吸收檢測，分別收集含雙氨基PEG-抗菌肽的洗脫液和未修飾的抗菌肽部分。實(shí)施例2酵母細(xì)胞表達(dá)的抗菌肽Fowlicidin-3凍干粉雙氨基PGE10000pH7. 0的磷酸鹽緩沖液參藥典方法進(jìn)行配制。配制操作規(guī)程、環(huán)境和器材要求均要完全符合獸藥GMP生產(chǎn)要求。組合物的配制方法是
第一步先將抗菌肽用pH7. 0的磷酸鹽緩沖液溶解，配制成濃度為lmg/ml的溶液；第二步按抗菌肽雙氨基PEG為I : 5的物質(zhì)的量的比例，在第一步的溶液中加入雙氣基PEG ；第三步把上述混合液在室溫條件下反應(yīng)2小時(shí)后，第四步，在上述溶液中加入IM甘氨酸溶液終止反應(yīng)；第五步，反應(yīng)中止后，以葡聚糖G-25為填充材料的分子排阻色譜對雙氨基PEG-抗菌肽進(jìn)行一步純化，洗脫液為PH7. 0磷酸鹽緩沖液，用280nm波長進(jìn)行紫外光吸收檢測，分別收集含雙氨基PEG-抗菌肽的洗脫液和未修飾的抗菌肽部分，即得目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例3雙氨基PEG-抗菌肽制劑耐酸和蛋白酶的穩(wěn)定性考察評價(jià)方法、考察結(jié)果除非有另外說明，否則都采用以下的步驟進(jìn)行耐胃液破壞性評價(jià)。3. I 原理根據(jù)豬胃消化液的主要成分及消化環(huán)境，在體外建立模擬胃消化體系，將抗菌肽、雙氨基PEG-抗菌肽在該體系中進(jìn)行消化，對60min消化樣品進(jìn)行蛋白含量測定，確定該蛋白在模擬胃液中被消化的穩(wěn)定性。3. 2試劑和材料3. 2. I測試蛋白抗菌肽為市場購買的酵母菌發(fā)酵的LL37蛋白，雙氨基PEG-抗菌肽為實(shí)施例I、實(shí)施例2產(chǎn)品，分別稱取50mg樣品蛋白，定容于ImL重蒸懼水中，混勻。3. 2. 2不穩(wěn)定對照蛋白溶液模擬胃液消化不穩(wěn)定對照蛋白溶液選用酪蛋白(a -casein)作為模擬胃液消化不穩(wěn)定對照，配制方法為稱取50mg樣品蛋白，定容于ImL重蒸懼水中，混勻。模擬胃液消化穩(wěn)定對照蛋白溶液選用大豆胰蛋白酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor, STI)作為模擬胃液消化穩(wěn)定對照,稱取50mg樣品蛋白，定容于ImL重蒸餾水中，混勻。。3. 2. 3模擬胃消化液(SGF):本測定中采用的胃蛋白酶(p印sin)活力為2100U/
mg o稱取0. 2g氯化鈉(NaCl)和150mg胃蛋白酶，加入70mL重蒸餾水，加入730 y L鹽酸，再用鹽酸調(diào)pH至I. 2，加水定容至100mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。3. 2. 30. 2mol/L氫氧化鈉溶液稱取0. 8g氫氧化鈉(NaOH)，溶于重蒸餾水中，定容至 IOOmL。3. 3模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)試驗(yàn)方法消化反應(yīng)時(shí)間為2min、60min的模擬胃液消化試驗(yàn)。3. 3. I在7mL離心管中加入I. 9mL模擬胃消化液(SGF)，37°C恒溫水浴5min。力口A 100 u L樣品蛋白溶液或?qū)φ盏鞍兹芤?50mg/mL)，迅速漩渦振蕩并快速置于37°C水浴，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后迅速加入I. OmL lmol/L碳酸氫鈉溶液，冰浴，備用。3. 3. 2胃蛋白酶對照
在I. 5mL離心管中加入190 y L模擬胃消化液(SGF)，再加入IOOy LI. 0mol/L碳酸氣納溶液，游潤振湯后，備用。3. 3. 3試樣蛋白對照
在1.5mL離心管中加入190 ii L不含胃蛋白酶的模擬胃緩沖液，再加入100111對照蛋白(50mg/mL),同時(shí)加入IOOiiL I. Omol/L碳酸氫鈉溶液,鏇潤振蕩后備用。3. 3. 4各樣品蛋白含量測定采用福林酚測定法測定各反應(yīng)結(jié)束后樣品中的蛋白質(zhì)含量，記錄并比較。 3. 4結(jié)果分析與表述3. 4. I對照樣品結(jié)果分析在模擬胃消化試驗(yàn)中，不穩(wěn)定對照蛋白可以2min內(nèi)被完全消化,而穩(wěn)定對照蛋白 在60min內(nèi)不能被消化，表明模擬胃/腸消化試驗(yàn)體系工作正常；否則需要查找原因重新進(jìn)行試驗(yàn)。3. 4. 2試樣蛋白結(jié)果分析與表述在試驗(yàn)體系工作正常的情況下，根據(jù)試樣蛋白含量來判斷蛋白的可消化性。表I消化不同時(shí)間后，測定樣品的蛋白質(zhì)濃度

權(quán)利要求
1.一種雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述抗菌肽經(jīng)過了雙氨基PEG穩(wěn)定化處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法，其特征在干，抗菌肽(antibacterial peptides, ABP)選自基因工程方法獲得、天然提取中的ー種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法，其特征在于，雙氨基PEG的分子量為1000-20000。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法，其特征在于制備包括以下關(guān)鍵步驟 第一歩，將抗菌肽用PH6. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液溶解，配制成濃度為l-10mg/ml的溶液； 第二步，按抗菌肽雙氨基PEG為I : 0.5-10的重量比例，在第一歩的溶液中加入雙氨基 PEG ； 第三步，上述混合液在15-75°C條件下反應(yīng)0. 5-4小時(shí)； 第四步，在上述溶液中加入IM甘氨酸溶液終止反應(yīng)； 第五步，采用色譜柱法分離產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的ー種雙氨基PEG-抗菌肽，其特征在干，所述的雙氨基PEG-抗菌肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙氨基PEG-抗菌肽的制備方法，經(jīng)過雙氨基PEG枝接穩(wěn)定化處理后，抗菌肽對胃液的耐受性得到了大幅度提升。
文檔編號C07K1/113GK102649809SQ20111004459
公開日2012年8月29日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者劉桂蘭, 王偉穎, 閆亮亮 申請人:瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司