專利名稱：一種酶解和膜分離制備免疫活性大豆肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用蛋白酶酶解和膜分離制備大豆蛋白免疫活性肽的方法，屬于 大豆蛋白深加工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
健康人體的免疫系統(tǒng)需要維持一個(gè)合理的平衡。若免疫力弱，人容易感染、引發(fā)腫 瘤等疾病。隨著在細(xì)胞和分子水平機(jī)理研究的深入，以及對(duì)免疫體系內(nèi)部錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò) 結(jié)構(gòu)的了解，人們逐漸認(rèn)識(shí)到免疫調(diào)節(jié)在維持健康方面的作用比以前要大得多。近年來(lái)人 們發(fā)現(xiàn)了很多能夠?qū)μ烊幻庖唔憫?yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的小肽，被稱為免疫活性肽，它們可能作為抗 原性物質(zhì)或免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的化學(xué)遞質(zhì)而發(fā)揮作用。免疫活性肽對(duì)于增強(qiáng)防病能力、延緩 衰老等具有深遠(yuǎn)的意義，它們可以通過(guò)飲食來(lái)增強(qiáng)人體的免疫力、提高機(jī)體抵御外界病原 體感染能力，因此研究不同食物蛋白中潛在的免疫活性肽是一項(xiàng)對(duì)于維持人體健康、增強(qiáng) 人體免疫力很有意義的研究工作。2009年我國(guó)大豆產(chǎn)量約1450萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)量的7%，居第四位。隨著國(guó)內(nèi)對(duì)大 豆功能性成分越來(lái)越深入的研究，大豆肽作為一種新型的大豆深加工產(chǎn)品，必將得到進(jìn)一 步的開(kāi)發(fā)利用，并蘊(yùn)含著巨大的市場(chǎng)潛力。研究報(bào)道的免疫活性肽中主要是合成肽，而其中一小部分的食物源免疫活性肽的 研究也主要集中在乳蛋白來(lái)源，關(guān)于大豆蛋白來(lái)源的免疫活性肽的研究較少。Yoshikawa 和Takahashi應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)從大豆蛋白的胰蛋白酶酶解物中得到一個(gè)肽鏈順序 為His-CyS-Gln-Arg-Pro-Arg的六肽，這種肽能刺激巨噬細(xì)胞和多核白細(xì)胞的吞噬作用， 具有免疫調(diào)節(jié)功能。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室的楊小軍等人研究 發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白用胃蛋白酶水解得到的溶液能顯著促進(jìn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、刺激 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、提高腸腔SlgA水平，而且大豆蛋白酶解物的作用優(yōu)于面筋蛋白酶解 物。大豆肽是指大豆蛋白經(jīng)酶解或微生物技術(shù)處理得到的水解產(chǎn)物，它是由大豆蛋白 水解后的多種肽分子混合組成，其中包括少量游離氨基酸、大豆低聚糖、無(wú)機(jī)鹽等成分。目 前市場(chǎng)上的大豆肽產(chǎn)品存在純度和活性都不高等問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)酶解制備大豆肽，進(jìn)一 步采用膜分離技術(shù)富集純化大豆肽，最終獲得高肽含量、高免疫活性的大豆肽產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種通過(guò)酶水解和膜分離制備免疫活性大豆肽的方法，獲得的 肽含量高，免疫活性高，提高了大豆蛋白的綜合價(jià)值。本發(fā)明的技術(shù)方案一種酶解和膜分離制備免疫活性大豆肽的方法，所述方法步 驟為
(1)對(duì)脫脂大豆蛋白粉進(jìn)行酸洗得到酸洗大豆蛋白以脫脂大豆蛋白粉為原料，按 g/mL為l:l(Tl:20 (w/v)加酸洗液，酸洗液采用質(zhì)量濃度2g/L的Na2SO3水溶液，調(diào)節(jié)ρΗ4. (Γ5. 0，溫度5(T60°C，洗滌時(shí)間l(T20min，酸洗2、次，酸洗后離心除去上清液，得到酸
洗大豆蛋白；
(2)使用Alcalase蛋白酶在一定條件下進(jìn)行酶水解得到粗大豆肽液將步驟(1)所得 的酸洗大豆蛋白，按g/mL為l:l(Tl:20 (w/v)加水，調(diào)節(jié)ρΗ至8.0，調(diào)至ρΗ8.0過(guò)程中，蛋 白粘度逐漸增大，要攪勻，調(diào)節(jié)溫度為55飛5°C，添加Alcalase蛋白酶，E/S=l. 09Γ3. 0%，反 應(yīng)過(guò)程中保持PH值恒定，當(dāng)水解度DH=20%時(shí)，調(diào)節(jié)pH至4. 0滅酶，3000r/min離心15min， 所得上清液即為粗大豆肽液；
(3)采用微濾、超濾和納濾對(duì)所制備得到的粗大豆肽液進(jìn)行澄清、富集、脫鹽處理； 采用微濾對(duì)所制備得到的粗大豆肽液進(jìn)行澄清除雜處理在室溫下對(duì)大豆肽液進(jìn)行
全回流微濾操作，采用的微濾膜為孔徑0. 1(Γ0. 45 μ m的聚砜膜；在處理過(guò)程中，微濾以 ISOmin為一個(gè)運(yùn)行周期，收集得到澄清透明的粗大豆肽液；運(yùn)行周期結(jié)束后停機(jī)進(jìn)行膜組 件的清洗和再生；
采用超濾對(duì)微濾后的粗大豆肽液進(jìn)行富集處理在室溫下對(duì)微濾后的粗大豆肽液進(jìn)行 全回流超濾操作，采用的超濾膜的截留分子量(MWCO)為5000、000，料液的大豆肽初始濃 度為6. 09Γ8. 0%，ρΗ為4. 0，壓力在0. 35 0. 8MPa之間，收集濾出液，實(shí)現(xiàn)對(duì)活性大豆肽液 的富集；
采用納濾對(duì)超濾后的粗大豆肽液進(jìn)行脫鹽處理在室溫下對(duì)超濾后的粗大豆肽液進(jìn)行 全回流納濾操作，采用的納濾膜的截留分子量(MWCO)為15(Γ300，操作pH為4.0，壓力在 0. 4 0. 7MPa之間，收集濾出液；
(4)對(duì)納濾后收集的濾出液通過(guò)噴霧干燥得到粉狀的免疫活性大豆肽；
(5)采用吞噬中性紅試驗(yàn)或淋巴細(xì)胞增殖法(MTT)測(cè)定大豆肽活性，表明制備所得的大 豆肽具有良好的免疫活性。采用下面兩種方法對(duì)大豆肽的免疫活性進(jìn)行測(cè)定 1.淋巴細(xì)胞增殖法(MTT法)
MTT法是依據(jù)活細(xì)胞線粒體中富含琥珀酸脫氫酶，此酶可使MTT分解產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀 甲肷，并沉積于細(xì)胞內(nèi)活細(xì)胞周圍，形成甲肷量與細(xì)胞增值程度呈正相關(guān)。溶解甲肷之后用 酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，就可以得到細(xì)胞的增殖情況。這種方法相對(duì)來(lái)說(shuō)簡(jiǎn)單易行，現(xiàn)在被廣泛 應(yīng)用于評(píng)價(jià)外源物對(duì)淋巴細(xì)胞或機(jī)體免疫功能的作用。具體方法如下小鼠斷頸處死后無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌PBS液的小平皿中， 用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，用PBS液洗3次，每次離心 轉(zhuǎn)速1500 r/min，時(shí)間8min。然后將細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞的密度為4X IO9 個(gè)/L。將細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5 mL，再按下列設(shè)置分別加入完全培養(yǎng)液或 400mg/L的肽液，使每孔總體積達(dá)到1 mL，每樣品設(shè)8個(gè)復(fù)孔，其中4孔加入ConA溶液，使之 終濃度為7 mg/L，另外4孔不加ConA溶液，置37°C、50 mL/L CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng) 結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液，加入0. 7 mL不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時(shí)加 入MTT (5 g/L) 50 μ L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打 混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板中，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，于波長(zhǎng)570nm 測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)中以培養(yǎng)液組作為空白對(duì)照。大豆肽的免疫調(diào)節(jié)活性用刺激指數(shù)(Si) 表示，SI值越大，說(shuō)明酶解產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性越強(qiáng)，計(jì)算公式為SI=陽(yáng)性O(shè)D值/陰性O(shè)D
4值。2.中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)
巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種重要的免疫細(xì)胞，具有吞噬和殺傷多種病原微生物、 處理和呈遞抗原、分泌細(xì)胞因子(IL21、IL26、IL28、IL212、TNF2a)等作用，在炎癥、感染 和腫瘤等許多疾病治療過(guò)程中均發(fā)揮了重要作用，有活性的巨噬細(xì)胞可吞噬中性紅染色， OD值大小反映細(xì)胞吞噬能力的大小。具體方法如下取健康小鼠，剪開(kāi)腹壁皮膚，腹腔注射5mL PBS輕柔5min，慢慢抽 吸細(xì)胞懸液，加入離心管中，離心洗滌2次，用1640完全培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)至1.8 X IO6/ mL，于96孔平底板各孔加IOOyL細(xì)胞懸液及不同濃度的藥物，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱，培 養(yǎng)22 h后取出培養(yǎng)板，棄上清，于每孔各加入0.073 %的中性紅50uL繼續(xù)培養(yǎng)30min，棄 去中性紅，用預(yù)溫的PBS洗2次，再加細(xì)胞裂解劑(醋酸無(wú)水乙醇=1:1) 100yL，2h后 用酶標(biāo)儀在540nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果以吞噬指數(shù)(phagocytic index, PI)表示PI=實(shí) 驗(yàn)孔OD54tl值/對(duì)照孔OD54tl均值。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用酶解和膜分離技術(shù)，在水解得到大豆肽的基礎(chǔ)上 達(dá)到澄清、富集免疫活性大豆肽及除鹽等目的，大大提高了大豆肽產(chǎn)品的免疫活性質(zhì)量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述。實(shí)施例1
低溫脫脂豆粉酸洗4次。酸洗時(shí)添加質(zhì)量濃度2g/LNa2S03溶液，調(diào)節(jié)pH4. 5，按1 10 (w/V)加酸洗液，溫度55°C，洗滌時(shí)間lOmin，酸洗后離心除去上清液，得到酸沉蛋白。經(jīng)過(guò) 酸洗的大豆蛋白，按1:10 (w/v)加水，調(diào)節(jié)pH至8.0 (調(diào)至pH8.0過(guò)程中，蛋白粘度逐漸 增大，要攪勻)，調(diào)節(jié)溫度55°C，添加Alcalase蛋白酶(E/S=l. 0%)，反應(yīng)過(guò)程中保持pH值恒 定。當(dāng)水解度DH=20%時(shí)，調(diào)pH至4.0滅酶，3000r/min下離心15min，所得上清液即為粗 大豆肽液。采用微濾技術(shù)對(duì)粗肽液進(jìn)行澄清除雜，采用孔徑為0. 45 μ m的微濾膜(聚砜膜)。 在處理過(guò)程中，微濾膜以ISOmin為一個(gè)運(yùn)行周期，停機(jī)進(jìn)行膜組件的清洗和再生。收集得 到的澄清透明肽液。在室溫下對(duì)微濾后的大豆肽液進(jìn)行全回流超濾操作，采用截留分子量 (MWCO)為8000的復(fù)合膜(醋酸纖維+聚砜)作為超濾膜。料液初始濃度為8. 0%，操作壓力 0. 55MPa、料液溫度40°C、料液pH值4. 0、操作時(shí)間周期180min。收集濾出液，從而實(shí)現(xiàn)對(duì) 活性大豆肽液的富集。然后在室溫下對(duì)超濾后的大豆肽液進(jìn)行納濾處理，使用截留分子量 (MWCO)為300的復(fù)合膜作為納濾膜。操作pH為4.0，壓力0.4MPa，收集濾出液。最后通過(guò) 噴霧干燥得到粉狀的免疫活性大豆肽。實(shí)施例2
低溫脫脂豆粉酸洗2次。酸洗時(shí)添加質(zhì)量濃度2g/LNa2S03溶液，調(diào)節(jié)pH4. 0，按1 20 (w/V)加酸洗液，溫度50°C，洗滌時(shí)間15min，酸洗后離心除去上清液，得到酸沉蛋白。經(jīng)過(guò) 酸洗的大豆蛋白，按1:15 (w/v)加水，調(diào)節(jié)pH至8.0 (調(diào)至pH8.0過(guò)程中，蛋白粘度逐漸 增大，要攪勻)，調(diào)節(jié)溫度60°C，添加Alcalase蛋白酶(E/S=3. 0%)，反應(yīng)過(guò)程中保持pH值恒 定。當(dāng)水解度DH=20%時(shí)，調(diào)節(jié)pH至4. 0滅酶，3000r/min下離心15min，所得上清液即為粗 大豆肽液。采用微濾技術(shù)對(duì)粗肽液進(jìn)行澄清除雜。采用0. 10 μ m的微濾膜(聚砜)。在處理
5過(guò)程中，微濾膜以ISOmin為一個(gè)運(yùn)行周期，停機(jī)進(jìn)行膜組件的清洗和再生。最后收集得到 的澄清透明肽液。在室溫下對(duì)大豆肽溶液進(jìn)行全回流超濾操作。采用的超濾膜截留分子量 (MWCO)為5000 PES膜(聚醚砜)。料液初始濃度為7. 0%，操作壓力0. 55MPa、料液溫度40°C、 料液PH值4. 0、操作時(shí)間周期180min，收集濾出液，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活性大豆肽液的富集。然后 在室溫下對(duì)大豆肽溶液進(jìn)行納濾處理。采用的納濾膜截留分子量(MWCO)為150復(fù)合膜。操 作pH為4. 0，壓力0. 6MPa,收集濾出液。最后通過(guò)噴霧干燥得到粉狀的免疫活性大豆肽。實(shí)施例3
低溫脫脂豆粉酸洗3次。酸洗時(shí)添加質(zhì)量濃度2g/LNa2S03溶液，調(diào)節(jié)pH5. 0，按1 20 (w/V)加酸洗液，溫度60°C，洗滌時(shí)間15min，酸洗后離心除去上清液，得到酸沉蛋白。經(jīng)過(guò) 酸洗的大豆蛋白，按1:20 ( 八)加水，調(diào)節(jié)？!1至8.0 (調(diào)至pH8. O過(guò)程中，蛋白粘度逐漸增 大，要攪勻)，添加Alcalase蛋白酶(E/S=2. 0%)，調(diào)節(jié)溫度60°C，反應(yīng)過(guò)程中保持pH值恒定。 當(dāng)水解度DH=20%時(shí)，調(diào)pH至4. O滅酶，3000r/min下離心15min，所得上清液即為粗大豆肽 液。采用微濾技術(shù)對(duì)粗肽液進(jìn)行澄清除雜。采用的微濾膜膜孔徑為0.45μπι(聚砜)。在處 理過(guò)程中，微濾膜以ISOmin為一個(gè)運(yùn)行周期，停機(jī)進(jìn)行膜組件的清洗和再生。最后收集得 到的澄清透明肽液。在室溫下對(duì)大豆肽溶液進(jìn)行全回流超濾操作。采用截留分子量(MWCO) 為5000的復(fù)合膜(聚醚砜)作為超濾膜。料液初始濃度為6. 0%，pH為4. 0，壓力0. 8MPa,料 液溫度40°C，操作時(shí)間180min。收集濾出液，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活性大豆肽液的富集。然后在室 溫下對(duì)大豆肽溶液進(jìn)行納濾處理。采用的納濾膜截留分子量(MWCO)為150復(fù)合膜。操作 PH為4.0，壓力0.5 MPa，收集濾出液。最后通過(guò)噴霧干燥得到粉狀的免疫活性大豆肽。表1實(shí)施例中得到的免疫活性大豆肽產(chǎn)品的肽含量及免疫活性
肱含量(以 干基計(jì))％SIPI不力口 ConA加 ConA對(duì)照組-1.04±0.031.08±0.061.00±0.02實(shí)施例191.82%1.24 士 0.02*1.48±0.04木1,40±0.04*實(shí)施例293.2.7%1.—33±0.05*1.51±0.05 木1.39±0.01*實(shí)施例392.66%1.20±0.03*1.46 土 0.03$1.47 士 0.06 木
*表示樣品與對(duì)照組有顯著差異。
權(quán)利要求
一種酶解和膜分離制備免疫活性大豆肽的方法，其特征在于所述方法步驟為(1)對(duì)脫脂大豆蛋白粉進(jìn)行酸洗得到酸洗大豆蛋白以脫脂大豆蛋白粉為原料，按g/mL 為1:10~1:20加酸洗液，酸洗液采用質(zhì)量濃度2g/L 的Na2SO3水溶液，調(diào)節(jié)pH4.0~5.0，溫度50~60℃，洗滌時(shí)間10~20min，酸洗2~4次，酸洗后離心除去上清液，得到酸洗大豆蛋白；(2)使用Alcalase蛋白酶在一定條件下進(jìn)行酶水解得到粗大豆肽液將步驟(1)所得的酸洗大豆蛋白，按g/mL 為1:10~1:20加水，調(diào)節(jié)pH至8.0，調(diào)至pH8.0過(guò)程中，蛋白粘度逐漸增大，要攪勻，調(diào)節(jié)溫度為55~65℃，添加Alcalase蛋白酶，E/S=1.0%~3.0%，反應(yīng)過(guò)程中保持pH值恒定，當(dāng)水解度DH=20%時(shí)，調(diào)節(jié)pH至4.0滅酶，3000r/min離心15min，所得上清液即為粗大豆肽液；(3)采用微濾、超濾和納濾對(duì)所制備得到的粗大豆肽液進(jìn)行澄清、富集、脫鹽處理；采用微濾對(duì)所制備得到的粗大豆肽液進(jìn)行澄清除雜處理在室溫下對(duì)大豆肽液進(jìn)行全回流微濾操作，采用的微濾膜為孔徑0.10~0.45μm的聚砜膜；在處理過(guò)程中，微濾以180min為一個(gè)運(yùn)行周期，收集得到澄清透明的粗大豆肽液；運(yùn)行周期結(jié)束后停機(jī)進(jìn)行膜組件的清洗和再生；采用超濾對(duì)微濾后的粗大豆肽液進(jìn)行富集處理在室溫下對(duì)微濾后的粗大豆肽液進(jìn)行全回流超濾操作，采用的超濾膜的截留分子量MWCO為5000~8000，料液的大豆肽初始濃度為6.0%~8.0%，pH為4.0，壓力在0.35～0.8MPa之間，收集濾出液，實(shí)現(xiàn)對(duì)活性大豆肽液的富集；采用納濾對(duì)超濾后的粗大豆肽液進(jìn)行脫鹽處理在室溫下對(duì)超濾后的粗大豆肽液進(jìn)行全回流納濾操作，采用的納濾膜的截留分子量MWCO為150~300，操作pH為4.0，壓力在0.4~0.7MPa之間，收集濾出液；(4)對(duì)納濾后收集的濾出液通過(guò)噴霧干燥得到粉狀的免疫活性大豆肽；(5)采用吞噬中性紅試驗(yàn)或淋巴細(xì)胞增殖法測(cè)定大豆肽活性，表明制備所得的大豆肽具有良好的免疫活性。
全文摘要
一種酶解和膜分離制備免疫活性大豆肽的方法，屬于大豆蛋白深加工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以脫脂大豆蛋白粉為原料，首先對(duì)其進(jìn)行酸洗得到酸洗大豆蛋白，然后使用Alcalase蛋白酶在一定條件下進(jìn)行酶水解得到粗大豆肽液；再采用微濾對(duì)所制備得到的粗大豆肽液進(jìn)行澄清處理；然后采用超濾和納濾進(jìn)行富集和脫鹽處理；最后通過(guò)干燥得到粉狀的免疫活性大豆肽。采用中性紅吞噬試驗(yàn)和淋巴細(xì)胞增殖法測(cè)定大豆肽活性表明，制備所得的大豆肽具有良好的免疫活性。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101974589SQ20101052374
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者華欲飛, 孔祥珍, 張彩猛, 董蝶, 黃文凱 申請(qǐng)人:江南大學(xué)