專利名稱：環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及皂苷類化合物及其制備，具體涉及環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
環(huán)阿爾廷類(9，19-cycloartane)化合物為羊毛甾烷型四環(huán)三萜類化合物。近幾十年來，發(fā)現(xiàn)了大量的環(huán)阿爾廷苷類。已分離得到的環(huán)阿爾廷類化合物主要來自植物界，如豆科的紫云英屬(Astragalus)、毛莨科的升麻屬(Cimicifugeae)和唐松草屬(Thalictrum)等。
環(huán)阿爾廷類化合物是中藥升麻和黃芪的主要成分。近年來的研究表明其有多方面的藥理活性。文獻(xiàn)報(bào)道紫云英屬植物Astragalus oleifolius具有止汗、利尿的作用，并對腎炎、糖尿病、白血病、子宮癌有療效，其主要成分中包括環(huán)阿爾廷三萜；紫云英屬植物Astragalus spinous在埃及的民間用來治療高血壓、白血病和子宮癌，Astragalus verrucosus的醇提取物分別具有免疫增強(qiáng)作用和免疫調(diào)節(jié)作用，其主要成分中均包括環(huán)阿爾廷三萜?？傊瑢Ω缓h(huán)阿爾廷三萜的植物總提取物活性研究較多，而對單體化合物的研究較少，限制了這類成分在新藥研發(fā)中的應(yīng)用。
為了能更充分的研究這類天然產(chǎn)物的藥理活性，我們總結(jié)發(fā)現(xiàn)了一種快速、大量從植物界分離制備環(huán)阿爾廷三萜皂苷類化合物并檢測其抗腫瘤活性的方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物、制備方法及其應(yīng)用。
本發(fā)明提供了環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物，該皂苷具有如下結(jié)構(gòu)通式
式中R1為H或者OH；R2為CH3或者CH2OH；R為糖基；糖基的數(shù)目為1-5個(gè)；糖的種類有葡萄糖，鼠李糖，木糖，阿拉伯糖；糖之間的連接方式有1-2位連接，1-4位連接，1-3位連接和1-6位連接。
本發(fā)明提供的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，可以通過以下兩種方法中任意一種制備環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物， 方法一 (1)粉碎選定的中藥，然后利用閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50％-100％的乙醇或甲醇提取，減壓回收提取液至醇濃度低于5％，離心后取上清液； (2)上清液經(jīng)非極性大孔樹脂柱(非極性大孔吸附樹脂，如D101，HPD100，HPD400，AB-8等型號)色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，各洗脫部位利用LC-MS技術(shù)篩選富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，得到30％-100％醇洗脫下來的流分為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，即粗總皂苷； (3)粗總皂苷經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一些有機(jī)溶劑或混合溶劑(兩種混合，比例10∶1～1∶10)梯度洗脫，各洗脫流分利用LC-MS技術(shù)篩選富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分 (4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS柱色譜柱進(jìn)一步分離純化，以甲醇/水或乙醇/水梯度洗脫，減壓回收溶劑，所得流分經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈/水或甲醇/乙腈/水為流動相洗脫，得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物； 方法二 (1)粉碎選定的中藥，然后利用閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50％-100％的乙醇或甲醇提取，減壓回收提取液至醇濃度低于5％，提取液分別用氯仿或二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取2到5次，萃取溶劑與提取液體積比1∶3～3∶1，回收溶劑，收集得到氯仿或二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。
(2)正丁醇萃取物經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，各洗脫部位利用LC-MS技術(shù)篩選富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，得到30％-100％醇洗脫下來的流分為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，即粗總皂苷； (3)乙酸乙酯萃取物和步驟(2)中所得粗總皂苷分別經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，各洗脫流分利用LC-MS技術(shù)篩選富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分； (4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS柱色譜柱進(jìn)一步分離純化，以甲醇/水或乙醇/水梯度洗脫，減壓回收溶劑，所得流分經(jīng)制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈/水或甲醇/乙腈/水為流動相洗脫，得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物。
本發(fā)明中所選的中藥為豆科、鐵角蕨科和毛莨科的常見中草藥。
本發(fā)明提供的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，所述方法一和方法二中的步驟(2)的醇優(yōu)選為乙醇，其梯度洗脫濃度為10％-100％。
本發(fā)明提供的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，所述方法一中的步驟(3)進(jìn)一步優(yōu)選為粗總皂苷經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，洗脫溶劑為10∶1～1∶10的氯仿或二氯甲烷/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙酸乙酯一些常規(guī)有機(jī)溶劑，混合比例5∶1～1∶2的流分為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分。
本發(fā)明提供的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，所述方法二中的步驟(3)進(jìn)一步優(yōu)選為乙酸乙酯萃取物和步驟(2)中所得粗總皂苷分別經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，洗脫溶劑為不同比例的氯仿或二氯甲烷/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙酸乙酯一些常規(guī)有機(jī)溶劑，混合比例5∶1～1∶2的流分為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分。
本發(fā)明提供的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，所述方法一中的步驟(4)進(jìn)一步優(yōu)選為步驟(3)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS色譜柱分離純化，洗脫劑為甲醇/水或乙醇/水，混合溶劑比例1∶5～5∶1下來的流分進(jìn)一步經(jīng)高效液相色譜分離，流動相為甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/水，從甲醇/水混合溶劑比例為1∶5～5∶1、乙腈/水混合溶劑比例為1∶10～5∶1、甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1∶1∶10～5∶5∶2的流分中得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類單體化合物。
本發(fā)明提供的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，所述方法二中的步驟(4)進(jìn)一步優(yōu)選為步驟(3)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS色譜柱分離純化，洗脫劑為甲醇/水或乙醇/水，混合溶劑比例為1∶5～5∶1下來的流分進(jìn)一步經(jīng)高效液相色譜分離，流動相為甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/水，從甲醇/水混合溶劑比例為1∶5～5∶1、乙腈/水混合溶劑比例為1∶10～5∶1、甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1∶1∶10～5∶5∶2的流分中得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類單體化合物。
本發(fā)明提供的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法簡單可靠，制備的化合物純度度，且具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

具體實(shí)施例方式 下面的實(shí)施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
實(shí)施例1從過山蕨中制備環(huán)阿爾廷型三萜類化合物 (1)通過LC-MS技術(shù)選定鐵角蕨科過山蕨屬植物過山蕨為植物原料； (2)植物原料粉碎后利用溶劑提取法，采用70％的乙醇回流提取三次，減壓回收提取液至醇濃度低于2％，提取液分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶解收集得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物； (3)正丁醇萃取物經(jīng)非極性大孔樹脂(HPD-100)柱色譜處理，依次用水和30％，60％，90％乙醇梯度洗脫，各洗脫部位利用LC-MS技術(shù)篩選確定60％乙醇梯度洗脫部位富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，得粗總皂苷； (4)乙酸乙酯萃取物和操作(3)中所得粗總皂苷分別經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，依次用氯仿∶甲醇10∶1，8∶1，6∶1，4∶1，2∶1梯度洗脫，各洗脫流分利用LC-MS技術(shù)篩選確定乙酸乙酯萃取物6∶1部位和粗總皂苷4∶1，2∶1洗脫部位為富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分； (5)操作(4)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS柱色譜柱進(jìn)一步分離純化，所得流分經(jīng)制備型HPLC色譜分離得到如圖下所示的10個(gè)環(huán)阿爾廷皂苷單體化合物。


Glc β-D-glucopyranoside Xyl β-D-xylopyranoside Ara α-L-arabinopyranoside 實(shí)施例2從苦馬豆中制備環(huán)阿爾廷型三萜類化合物 (1)通過LC-MS技術(shù)選定豆科苦馬豆屬植物苦馬豆為植物原料； (2)植物原料粉碎后利用溶劑提取法，采用90％的乙醇回流提取二次，減壓回收提取液至醇濃度低于5％，離心后靜置24小時(shí)，取上清液； (3)上清液經(jīng)非極性大孔樹脂(D101)柱色譜處理，依次用水和40％，70％，90％乙醇梯度洗脫，各洗脫部位利用LC-MS技術(shù)篩選確定70％乙醇梯度洗脫部位富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，得粗總皂苷； (4)操作(3)中所得粗總皂苷分別經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，依次用氯仿∶甲醇9∶1，7∶1，5∶1，3∶1，1∶1梯度洗脫，各洗脫流分利用LC-MS技術(shù)篩選確定5∶1和3∶1洗脫部位為富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分； (5)操作(4)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS柱色譜柱進(jìn)一步分離純化，所得流分經(jīng)制備型HPLC色譜分離，以乙腈/水為流動相洗脫得到如下所示的6個(gè)環(huán)阿爾廷皂苷單體化合物。

實(shí)施例3環(huán)阿爾廷型三萜類化合物的體外抗腫瘤活性的測定 采用MTT法，在體外通過高通量篩選，測定了所分離得到的部分環(huán)阿爾廷型三萜類化合物(1-10)的體外抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1中所示。
實(shí)驗(yàn)方法 1.細(xì)胞的培養(yǎng) HL-60細(xì)胞株，Du145細(xì)胞株，Colon205細(xì)胞株的培養(yǎng)條件均為RMPI 1640培養(yǎng)液，10％胎牛血清，MCF-7細(xì)胞株的培養(yǎng)條件為低糖DMEM培養(yǎng)液10％胎牛血清，HepG2細(xì)胞株的培養(yǎng)條件為高糖DMEM培養(yǎng)液10％胎牛血清，A549細(xì)胞株的培養(yǎng)條件為RMPI 1640培養(yǎng)液，10％小牛血清。以上細(xì)胞株均培養(yǎng)于5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱中。
2.藥物的配制 將所測定的環(huán)阿爾廷型三萜類化合物(1-10)配成濃度為50mmol/L的母液，儲存于-20℃。
細(xì)胞株使用無血清的RMPI 1640培養(yǎng)液將藥物的母液稀釋成1000umol/L，500umol/L，100umol/L，10umol/L，每孔加入10uL，使得藥物的終濃度為100umol/L，50umol/L，10umol/L，1umol/L。
3.MTT實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞密度至1.0～1.5×105/ml，加入96孔培養(yǎng)板中每孔100ul，培養(yǎng)24h后加入上述各濃度藥物，每孔10ul。每濃度為6個(gè)復(fù)孔。孵育72h后，每孔加入10uLMTT，在培養(yǎng)箱中孵育4h后，進(jìn)行檢測。將上清液吸出，加入100ulDMSO，振蕩均勻后，于酶標(biāo)儀上492nm處測得OD值。
細(xì)胞成活率％＝給藥組OD值的平均值/空白乳組OD值的平均值×100％ 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS(13.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果用

表示。
5.每種藥物針對三種細(xì)胞的篩選要重復(fù)三次。
表1部分環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果



權(quán)利要求
1.環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物，其特征在于，該皂苷具有如下結(jié)構(gòu)通式
式中R1為H或者OH；R2為CH3或者CH2OH；R為糖基；糖基的數(shù)目為1-5個(gè)；糖的種類有葡萄糖，鼠李糖，木糖，阿拉伯糖；糖之間的連接方式有1-2位連接，1-4位連接，1-3位連接和1-6位連接。
2.一種如權(quán)利要求1所述的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征在于
(1)粉碎選定的中藥或植物原材料，然后利用閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50％-100％的乙醇或甲醇提取，減壓回收提取液至醇濃度低于5％，離心后取上清液；
(2)上清液經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，各洗脫部位利用LC-MS技術(shù)篩選富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，得到30％-100％醇洗脫下來的流分為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，即粗總皂苷；
(3)粗總皂苷經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一些有機(jī)溶劑或混合溶劑梯度洗脫，各洗脫流分利用LC-MS技術(shù)篩選富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分；
(4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS柱色譜柱進(jìn)一步分離純化，以甲醇/水或乙醇/水梯度洗脫，減壓回收溶劑，所得流分經(jīng)半制備或制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈/水或甲醇/乙腈/水為流動相洗脫，得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物。
3.一種如權(quán)利要求1所述的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征在于
(1)粉碎選定的中藥，然后利用閃式提取技術(shù)或溶劑提取法，采用50％-100％的乙醇或甲醇提取，減壓回收提取液至醇濃度低于5％，提取液分別用氯仿或二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，收集得到氯仿或二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；
(2)正丁醇萃取物經(jīng)非極性大孔樹脂柱色譜處理，依次用水和醇梯度洗脫，各洗脫部位利用LC-MS技術(shù)篩選富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，得到30％-100％醇洗脫下來的流分為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的有效部位，即粗總皂苷；
(3)乙酸乙酯萃取物和步驟(2)中所得粗總皂苷分別經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，各洗脫流分利用LC-MS技術(shù)篩選富集環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分；
(4)上述步驟(3)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS柱色譜柱進(jìn)一步分離純化，以甲醇/水或乙醇/水梯度洗脫，減壓回收溶劑，所得流分經(jīng)制備型HPLC色譜分離，以甲醇/水，乙腈/水或甲醇/乙腈/水為流動相洗脫，得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物。
4.按照權(quán)利要求1或2所述環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征在于步驟(2)的醇為乙醇，其梯度洗脫濃度為10％-100％。
5.按照權(quán)利要求1所述環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)為粗總皂苷經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，洗脫溶劑為不同比例(10∶1～1∶10)的氯仿或二氯甲烷/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙酸乙酯一些常規(guī)有機(jī)溶劑，混合比例5∶1～1∶2的流分為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分。
6.按照權(quán)利要求2所述環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征在于所述步驟(3)為乙酸乙酯萃取物和步驟(2)中所得粗總皂苷分別經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，洗脫溶劑為不同比例(10∶1～1∶10同上)的氯仿或二氯甲烷/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙酸乙酯一些常規(guī)有機(jī)溶劑，混合比例5∶1～1∶2的流分為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分的流分。
7.按照權(quán)利要求1所述環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征在于所述步驟(4)為步驟(3)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS色譜柱分離純化，洗脫劑為甲醇/水或乙醇/水，混合溶劑比例1∶5～5∶1下來的流分進(jìn)一步經(jīng)高效液相色譜分離，流動相為甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/水，從甲醇/水混合溶劑比例為1∶5～5∶1、乙腈/水混合溶劑比例為1∶10～5∶1、甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1∶1∶10～5∶5∶2的流分中得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類單體化合物。
8.按照權(quán)利要求2所述環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征在于所述步驟(4)為步驟(3)中所得流分經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS色譜柱分離純化，洗脫劑為甲醇/水或乙醇/水，混合溶劑比例為1∶5～5∶1下來的流分進(jìn)一步經(jīng)高效液相色譜分離，流動相為甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/水，從甲醇/水混合溶劑比例為1∶5～5∶1、乙腈/水混合溶劑比例為1∶10～5∶1、甲醇/乙腈/水混合溶劑比例為1∶1∶10～5∶5∶2的流分中得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類單體化合物。
9.權(quán)利要求1所述的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供了環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物、制備方法及其應(yīng)用，所述的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物通過利用閃式提取技術(shù)或溶劑提取法得提取液或萃取液、提取物或萃取液上非極性樹脂柱得粗總皂苷，粗總皂苷經(jīng)硅膠閃爍柱色譜法快速處理，溶劑梯度洗脫，再經(jīng)中低壓柱色譜或開口ODS柱色譜和HPLC技術(shù)進(jìn)一步分離純化，得到環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物，制備過程中利用LC-MS技術(shù)檢測環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類成分。所制備的環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物具有較好的抗腫瘤活性。
文檔編號C07J63/00GK101824068SQ20101016404
公開日2010年9月8日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者李寧, 李銑, 孟大利, 肖皖 申請人:沈陽藥科大學(xué)