專利名稱：一種適于規(guī)?；a(chǎn)的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種從眼鏡蛇蛇毒中提取神經(jīng)生 長因子(Nerve Growth Factor, NGF)的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor，NGF)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一不僅對中樞及 外周神經(jīng)的正常神經(jīng)細胞有營養(yǎng)因子作用，而且具有調(diào)節(jié)損傷神經(jīng)修復機能的生物活性分 子。神經(jīng)生長因子在臨床上有重大的應用價值，目前的適應癥主要包括各種外周神經(jīng)病、視 神經(jīng)損傷、脊椎損傷、顱腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧和缺血造成的損傷及早老性癡呆等。NGF 可以從蛇毒、人胎兒腦髓、人胎盤及雄性小鼠的頌下腺中提取，也可以通過基因工程的方法 制備。其中，基因工程表達是制備NGF的趨勢，但由于神經(jīng)生長因子須在CHO細胞等真核細 胞表達系統(tǒng)中才有較好的生物活性，技術(shù)難度大，形成工業(yè)化生產(chǎn)尚有相當長的時間。而人 胎兒腦髓、人胎盤等組織來源困難、成本高；雄性小鼠頌下腺原料成本高并且有動物組織污 染的風險。通過人工養(yǎng)殖毒蛇，蛇毒原料來源穩(wěn)定，成本低。同種毒蛇所產(chǎn)蛇毒性質(zhì)均一，原 料的穩(wěn)定性高。并且避免了破碎生物組織產(chǎn)生污染源的可能。原有的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子的制備方法，是將眼鏡蛇蛇毒原料溶于50mM Tris-HCL, pH 7. 0加有蛋白酶活性抑制劑的溶液中，離心后上清液上樣到用溶解原料的溶 液平衡好的Sephadex G-100的分子篩層析柱，收集活性部分，透析交換緩沖液到NaAC，pH 5. 0的緩沖液，將交換完緩沖液的樣品上樣到透析緩沖液平衡好的CM-52柱，NaCL溶液梯度 洗脫，收集活性部分，將活性部分上樣到含NaCL溶液，pH5. 0，50mmol/L的NaAC溶液平衡好 的Sephadex G-100層析柱，收集活性部分，即為眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子。此制備過程采用的是羧甲基纖維素陽離子層析介質(zhì)(CM-52)，此介質(zhì)在使用過程 中由于流速太慢，柱床高度會隨緩沖液濃度及PH改變，而且不能承受0. IM以上的NaOH在 位清洗，重生效果差，若用于規(guī)模化生產(chǎn)，則會影響效率。S^hadex G-100層析介質(zhì)的剛性 差流速慢，承受壓力后容易變形使流速更慢并且影響分離效果。交換緩沖液使用透析技術(shù)， 速度慢、透析過程終點不容易掌握，溶液用量大，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進已有技術(shù)的不足而提供一種生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率高、采 用超濾替代透析以及使用高流速、高載量的離子交換凝膠CM Sepharose FF和高分辨率的 分子篩凝膠Superdex 75prepgrade來制備眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子適于規(guī)?；a(chǎn)的方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，一種適于規(guī)?；a(chǎn)的眼鏡蛇蛇毒的神經(jīng)生長因子 的純化方法，其特點在于
1)將凍干的眼鏡蛇蛇毒干粉溶于水后加入硫酸銨，使其成為50 60%的硫酸銨 溶液，待其充分混勻后，靜置30min，IOOOOrpm離心30min，收集上清液，2)選用截留分子量為3k 5k的超濾膜包將上清液超濾交換緩沖液為pH 5. 0的 50mMNaAc 溶液；3)將完成緩沖液交換的上清液過0. 22 μ m濾膜，除去雜質(zhì)顆粒和細菌；4)將過膜后的上清液上樣于pH 5. 0濃度為50mM的NaAc緩沖溶液平衡好的CM Sepharose FF層析柱，流速5ml/min，上樣完畢，在8倍柱體積內(nèi)將緩沖液中的NaCL濃度從 0升至0. 5M，直線梯度；5)收集上步驟中的具有NGF活性的蛋白，用3K超濾膜膜包將蛋白溶液濃縮；6)濃縮后的目的蛋白上樣于含0. 15mol/L NaCL溶液，pH7. 520mmol/L的Tirs溶 液平衡好的Superdex 75prep grade柱，流速8ml/min，收集目的蛋白，即為眼鏡蛇蛇毒神 經(jīng)生長因子原液。本發(fā)明方法與原有方法相比大大縮短了生產(chǎn)周期，提高了處理量和得率，適用于 規(guī)?；a(chǎn)。用硫酸銨溶液處理蛇毒，沉淀了原料中的大量雜蛋白，為后續(xù)的離子交換步驟減 輕壓力，提高了處理量，采用此法的優(yōu)點是1、周期短，整個沉淀過程只要一小時，大大低于采用層析法所需要的時間。2、要求低，整個過程中只需要硫酸銨一種輔料，且不需特殊設(shè)備。3、效果好，能在短時間內(nèi)去除多達約50%的雜蛋白。使用超濾膜膜包，其中的超濾膜是以高分子材料采用特殊工藝制成的半透膜，在 壓力的作用下小于膜孔徑的分子透過膜成為超濾液，其它的高分子物質(zhì)，膠體，超微粒子， 細菌等則被膜阻擋成為濃縮液，從而達到物質(zhì)的分離，濃縮提純之目的。超濾分離對于極稀 溶液中分離溶質(zhì)具有廣泛的適應性，與其它分離過程相比，有如下特點1、超濾過程在常溫下進行，能耗低，不需加熱，無熱效應及相態(tài)變化，不需加入其 它物質(zhì)即可達到分離、濃縮、純化即分級等目的，故特別適用于1)熱敏性物質(zhì)(生物制品、 菌體、蛋白質(zhì))的濃縮分離。2)極稀溶液的濃縮回收。3)恒體積恒濃度下的脫鹽純化。2、超濾膜耐化學侵蝕，PH適應范圍廣。3、處理量大，速度快，適合于工業(yè)化生產(chǎn)和放大。采用瓊脂糖凝膠介質(zhì)，有以下特點1、介質(zhì)載體為剛性材料，粒度90μπι，流速快，結(jié)合量大，線速度可達到 300-500cm/h,對粗提液處理速度快。2、該介質(zhì)再生效果好。活性部分洗脫后，可用.0.5M NaOH溶液進行在位清洗，洗 脫雜質(zhì)效果好。同時避免了拆柱和再次裝柱，節(jié)省時間。3、該介質(zhì)裝填不需要特殊設(shè)備，效果重現(xiàn)性好，可以按比例放大適合工業(yè)化生產(chǎn)。采用超濾膜濃縮樣品，提高樣品的濃度可以收取更多的最終產(chǎn)品，提高了得率，減 小體積后用更少的層析介質(zhì)即可完成分離，節(jié)約了成本。本發(fā)明通過 使用硫酸銨沉淀雜蛋白，超濾替代透析以及使用流速更快、分辨率更 高的層析介質(zhì)達到了節(jié)約生產(chǎn)時間、生產(chǎn)成本，提高了原料處理量，獲得高品質(zhì)、高得率產(chǎn) 品的目的。適用于規(guī)?；a(chǎn)。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。圖 ICM Sepharose FF 層析圖 圖 2Superdex 75pr印 grade 層析圖
具體實施例方式實施例，一種適于規(guī)?；a(chǎn)的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子的純化方法，是包括以 下步驟(1)硫酸銨沉淀原料將合格的凍干眼鏡蛇蛇毒干粉IOg溶于200ml水，可適當攪拌，但要避免產(chǎn)生過多 的泡沫，待蛇毒完全溶解后，以IOOOOrpm離心lOmin，取上清液過0. 45μπι的濾膜，去除不溶 性雜質(zhì)，加入硫酸銨110g，適當攪拌，同樣要避免產(chǎn)生過多的泡沫，形成55%濃度的硫酸銨 溶液后，靜置30min待溶液中的膠體完全聚合，析出沉淀，而后IOOOOrpm離心使沉淀和上清 分離，小心倒出上清液120ml，備用；(2)超濾交換緩沖液將上步驟所得上清液120ml倒入3KDa分子量超濾系統(tǒng)，調(diào)整壓力和流速，經(jīng)10倍 體積緩沖液循環(huán)后上清液的緩沖液換成PH 5. 0濃度為50mM的NaAc溶液，將上清液倒出再 過0. 22 μ m濾膜以便除去細菌和雜質(zhì)顆粒；(3)CM S印harose FF 層析過膜后的上清液溶液上樣到pH 5.0濃度為50mM的NaAc溶液平衡好的CM Sepharose FF層析柱(5. 0 X 30cm)，流速5ml/min，待流穿峰洗脫完畢后，換洗脫緩沖液，洗 脫緩沖液是在平衡緩沖液中加NaCl，使NaCl濃度在8倍柱體積內(nèi)以直線梯度均勻地從0升 至0. 5M，收集活性部分，見圖1 ；(4)超濾濃縮蛋白溶液收集的活性部分倒入超濾系統(tǒng)，調(diào)整壓力和流速，待儲存杯中的溶液60ml時倒 出，留待下步驟使用；(5) Superdex 75prep grade 層析將濃縮好的蛋白溶液上樣于含0. 15mol/L NaCl，pH7. 5，20mmol/L的Tirs溶液平 衡好的Superdex 75 prep grade層析柱(5. 0 X80cm)，流速8ml/min，收集目的蛋白，即為 眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子原液，見圖2 ；(6)除鹽、冷凍真空干燥將步驟(5)得到的神經(jīng)生長因子產(chǎn)品峰用3KDa分子量超濾膜超濾除鹽，過 0. 22 μ m濾膜，無菌分裝，冷凍干燥后既得神經(jīng)生長因子62mg。
權(quán)利要求
一種適于規(guī)?；a(chǎn)的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子的純化方法，其特征在于1)將凍干的眼鏡蛇蛇毒干粉溶于水后加入硫酸銨，使其成為50～60％的硫酸銨溶液，待其充分混勻后，靜置30min，10000rpm離心30min，收集上清液，2)選用截留分子量為3k～5k的超濾膜包將上清液超濾交換緩沖液為pH 5.0的50mM NaAc溶液；3)將完成緩沖液交換的上清液過0.22μm濾膜，除去雜質(zhì)顆粒和細菌；4)將過膜后的上清液上樣于pH 5.0濃度為50mM的NaAc緩沖溶液平衡好的CM Sepharose FF層析柱，流速5ml/min，上樣完畢，在8倍柱體積內(nèi)將緩沖液中的NaCL濃度從0升至0.5M，直線梯度洗脫；5)收集上步驟中的具有NGF活性的蛋白，用3K超濾膜膜包將蛋白溶液濃縮；6)濃縮后的目的蛋白上樣于含0.15mol/L NaCL溶液，pH7.520mmol/L的Tirs溶液平衡好的Superdex 75 prep grade層析柱，流速8ml/min，收集目的蛋白，即為眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子原液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適于規(guī)模化生產(chǎn)的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子的純化方法，是將凍干的眼鏡蛇蛇毒溶解后用硫酸銨溶液進行沉淀，然后離心取上清液，采用截留分子量為3K的超濾膜膜包超濾，交換緩沖液至pH 5.0濃度為50mM的NaAc緩沖溶液，交換完緩沖液的樣品上樣于CM Sepharose FF柱層析，收集目的蛋白，上樣于Superdex 75柱，收集目的蛋白，得到眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子原液，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)方法相比提高了處理量和得率，適用于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C07K14/48GK101845093SQ20101001146
公開日2010年9月29日 申請日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者劉志強, 呂憲峰, 張坤, 曹恒, 林峰, 王東 申請人:中鑫東泰(萊陽)納米基因生物技術(shù)有限公司