專(zhuān)利名稱(chēng)：：多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新多肽以及它們?cè)谥委熍c補(bǔ)體Cfe受體和/或甲?；氖荏w的活化相關(guān)的癥狀與疾病中的用途。本發(fā)明特別提供金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(ChemotaxisInhibitoryProteinofStaphylococcusaureus)(‘CHIPS，)的變體形式以及它們?cè)谥委熂毙院吐匝仔圆“Y中的用途。
背景技術(shù)：
：金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus)是導(dǎo)致多種疾病的常見(jiàn)人類(lèi)病原體。金黃色葡萄球菌導(dǎo)致疾病的機(jī)理是多因素的。除了由特殊毒素(例如引起中毒性休克綜合征的中毒性休克綜合征毒素(TSST-I)或腸毒素)引起的一些葡萄球菌病之外，金黃色葡萄球菌感染的致病性是不依賴(lài)于單一因素的。金黃色葡萄球菌擁有大量不同的“工具”來(lái)引發(fā)疾病。這些不同因素整體組合的共同作用促進(jìn)其在宿主內(nèi)的定殖(colonization)、生長(zhǎng)和擴(kuò)散。吞噬細(xì)胞對(duì)于葡萄球菌的吞噬和殺傷是最重要的宿主防御機(jī)制。吞噬細(xì)胞通過(guò)入侵者(例如甲?；?所釋放的細(xì)胞因子和趨化因子并且在炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)(inflammatorycascades)如補(bǔ)體系統(tǒng)活化時(shí)被吸引至感染部位。釋放這些化學(xué)引誘物所產(chǎn)生的梯度，將吞噬細(xì)胞吸引至炎癥部位。Veldkamp等研究了生長(zhǎng)中的金黃色葡萄球菌上清液與吞噬細(xì)胞的相互作用。他們發(fā)現(xiàn)，盡管葡萄球菌上清液能夠刺激吞噬細(xì)胞，但如通過(guò)單克隆抗體檢測(cè)，還存在一種能夠特異性下調(diào)補(bǔ)體Cfe受體(CfeR)和甲?；氖荏w(FPR)表達(dá)的因子(見(jiàn)Veldkamp等，2000,InfectImmun68(10):5908-13;Veldkamp等，1997，Inflammation21(5):541-51)。他們從金黃色葡萄球菌的上清液中分離出了導(dǎo)致該作用的14.IkDa的蛋白；該蛋白被命名為CHIPS，即金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白。CHIPS能夠抑制由Cfe和fMLP引起的嗜中性粒細(xì)胞的趨化性以及活化。此外，還發(fā)現(xiàn)CHIPS非常具有選擇性，因?yàn)樗挥绊憦V泛選擇的其他受體(abroadselectionofotherrec印tors)，包括存在于嗜中性粒細(xì)胞上的其他化學(xué)引誘物受體，例如FPR-樣1、C3aR、IL-8RA和IL-8RB、LTB4受體和PAF受體。這表明CHIPS特異性地抑制G-蛋白偶聯(lián)受體家族中的兩個(gè)成員，C5aR和FPR。CHIPS對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，并且還抑制其他細(xì)胞例如單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的C5aR。Postma等顯示，CHIPS以不依賴(lài)于能量的方式直接同C5aR和FPR結(jié)合。此外，CHIPS在同其受體結(jié)合時(shí)不發(fā)生內(nèi)化。CHIPS分別以1.1和35.4nM的表觀Kd值同C5aR和FPR兩個(gè)受體結(jié)合(見(jiàn)Postma等，2004，JImmunol172(11):6994-7001)。這些Kd值的范圍與對(duì)它們的天然配體所記錄的范圍相同(見(jiàn)VanEpps等，1993，JImmunol150(1):246-252；Falk等，1982，InfectImmun36(2):450-454;Huey&Hugli，1985，Immunol.135(3):2063-8;Pike等，1980，JExpMed152(1):31-40)。CHIPS中用于結(jié)合甲?；氖荏w和Cfe受體的活性部位位于CHIPS分子的不同區(qū)域。N-末端和C-末端并且特別是第一個(gè)和第三個(gè)氨基酸參與了CHIPS對(duì)甲?；氖荏w的活性(見(jiàn)Haas等，2004，JImmunol173(9):5704-11)。至少前30個(gè)N-末端氨基酸不參與CHIPS同C5aR的結(jié)合和對(duì)C5aR的阻斷。因此，不含前30個(gè)氨基酸的CHIPS蛋白，CHIPhw21，顯示出對(duì)C5aR阻斷活性的完整保留，但完全失去了對(duì)FI3R的活性(見(jiàn)Haas等，2005，JMolBiol353(4):859-872)。近年來(lái)人們已經(jīng)清楚，僅次于宿主防御，趨化因子受體，例如FI3R和CfeR，也參與了多種其他炎性過(guò)程。近來(lái)鑒定的多種新型和源于宿主的FI^R激動(dòng)劑，擴(kuò)展了FI^R在疾病過(guò)程中的功能意義(見(jiàn)Le等，2002，TrendsImmunol23(11):541-8)。對(duì)C5aR在多種不同疾病過(guò)程中的顯著作用，人們開(kāi)展了許多研究，所述疾病過(guò)程包括膿毒癥、缺血-再灌注損傷、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘和免疫復(fù)合物疾病。多種使用動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究證明了在這些疾病過(guò)程中將C5aR作為目標(biāo)帶來(lái)的有益效果(見(jiàn)Guo等，2004，Shock21(1)1-7；Huber-Lang等，2001，JImmunol166(2):1193-1199;Heller等，1999，JImmunol163(2)985-94)。CHIPS特異性抑制FI3R和C5aR的獨(dú)特性質(zhì)，使該蛋白成為了一些疾病的抗炎藥物中的有力候選者(promisingcandidate)，在所述疾病中FPR或C5aR的激活起重要作用。使用分離的人類(lèi)和小鼠嗜中性粒細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，CHIPS對(duì)于小鼠C5aR的活性不到其對(duì)于人類(lèi)受體的活性的30分之一。這種在與小鼠細(xì)胞比較時(shí)針對(duì)人細(xì)胞的活性方面存在的30倍差距表明了CHIPS的人特異性，其阻礙了CHIPS在小鼠感染模型或其他動(dòng)物模型中的測(cè)試。金黃色葡萄球菌是人類(lèi)皮膚的正常共生物，由金黃色葡萄球菌引起的輕微皮膚或傷口感染一般而言是自我限制性(self-limiting)的。金黃色葡萄球能夠潛在地感染身體的任何組織，并偶爾由最初(primary)感染部位擴(kuò)散而導(dǎo)致威脅生病的疾病，例如骨髓炎、心內(nèi)膜炎、肺炎和敗血癥。CHIPS基因存在于大部分的臨床金黃色葡萄球菌的菌株和來(lái)自健康攜帶者的菌株中，體內(nèi)CHIPS的生成如由Haas等利用小鼠感染模型所描述(見(jiàn)Haas等，2004，JExpMed199(5):687-%)。由于金黃色葡萄球菌是非常常見(jiàn)的細(xì)菌，大多數(shù)個(gè)體很有可能在生命的早期接觸金黃色葡萄球菌和CHIPS蛋白，并導(dǎo)致了抗CHIPS抗體的產(chǎn)生。野生型CHIPS蛋白的氨基酸序列如下所示(其中氨基酸數(shù)31至113標(biāo)以下劃線)FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKESFKNSGLPTTLGKLDERLRNYLKKGTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYLNTPLAEDRKNVELLGKMYKTYFFKKGESKSSYVINGPGKTNEYAYSEQIDNO1野生型CHIPS蛋白的氨基酸序列還以數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)AAQ14339、CAG41022和YP_041409進(jìn)行了公開(kāi)。野生型CHIPS蛋白的多種片段、變體和衍生物及其用途公開(kāi)于EP1095059A、EP1244790A,PCT/EP2005/004156和PCT/EP2007/001443，其公開(kāi)通過(guò)提述并入本文。本發(fā)明探索的是提供基于野生型CHIPS蛋白的新突變型式的治療劑，其顯示出有利的性質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了具有金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(‘CHIPS’)生物活性的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有CHIPS生物活性的片段或變體，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有CHIPS生物活性的片段或變體組成，其中所述片段或變體相對(duì)于SEQIDNO1的野生型CHIPS蛋白質(zhì)保留氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、NlllK禾口/或G112A。NSGLPTTLGELVERLRNYLKKGTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYLJJTPLAEDRKNVELLGKMYKTYFFRKGESRSSYVIKAPSEQIDNO2應(yīng)理解的是SEQIDNO2對(duì)應(yīng)于具有下述氨基酸取代的SEQIDNO=I的氨基酸31-113:K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和G112A(參見(jiàn)SEQIDNO2中粗體下劃線的氨基酸)。應(yīng)進(jìn)一步理解的是，SEQIDNO2的多肽可含或不含N端甲硫氨酸(未示于SEQIDNO2)而表達(dá)。本文中所有對(duì)SEQIDNO:2多肽的提及均應(yīng)視為如此。為了避免疑問(wèn)，除非另行指明，在本說(shuō)明書(shū)中，所有氨基酸相對(duì)于CHIPS蛋白片段、變體或衍生物等的編號(hào)為相對(duì)于野生型CHIPS蛋白(即SEQIDNO:1)。舉例而言，相對(duì)于SEQIDNO1的取代K40E對(duì)應(yīng)于在SEQIDNO2中第十個(gè)氨基酸用谷氨酸取代賴(lài)氨酸(因?yàn)镾EQIDNO2并不包含SEQIDNO1的前30個(gè)氨基酸)。本發(fā)明的第一個(gè)方面涵蓋了SEQIDNO2具有CHIPS生物活性的片段和變體，其中所述變體保留相對(duì)于SEQIDNO:1的野生型CHIPS蛋白的氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、m1IK和/或Gl12A。在此上下文中，“保留”意指當(dāng)所述變體包含對(duì)應(yīng)于SEQID而1的40、42、77、100、105、111和/或112位的氨基酸時(shí)，則該氨基酸分別為谷氨酸、纈氨酸、組氨酸、精氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸和/或丙氨酸。舉例而言，當(dāng)所述多肽是SEQIDNO2的52個(gè)C端氨基酸的變體時(shí)，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO=I的77位的氨基酸處包含組氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1的100位的氨基酸處包含精氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1的105位的氨基酸處包含精氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的111位的氨基酸處包含賴(lài)氨酸，并在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的77位的氨基酸處包含丙氨酸。然而，由于該示例性變體缺乏SEQIDNO:2的氨基酸1至51，其并不包含對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1的40或42位的氨基酸。由SEQIDNO2限定的多肽包含83個(gè)氨基酸。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是本發(fā)明多肽可為更長(zhǎng)或更短的長(zhǎng)度。舉例而言，所述多肽可包含多于或少于83個(gè)氨基酸，或可由多于或少于83個(gè)氨基酸組成，或可包含恰好83個(gè)氨基酸，或恰好由83個(gè)氨基酸組成。優(yōu)選地，所述多肽長(zhǎng)度上少于500個(gè)氨基酸，例如長(zhǎng)度上少于400、300、200、150、140、130、125、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、95、90、85、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、65、60、55、50、40、30個(gè)或更少的氨基酸。舉例而言，所述多肽的長(zhǎng)度可為70至110個(gè)氨基酸，例如長(zhǎng)度上為75至90個(gè)氨基酸，例如75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽的長(zhǎng)度為83個(gè)氨基酸。因此，在本發(fā)明的第一個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQIDN0:2的氨基酸序列的片段、或其變體，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列的片段、或其變體組成。關(guān)于“片段”，我們包括了SEQIDNO:2氨基酸序列的至少10、20、30、40、50、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81或82個(gè)連續(xù)氨基酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多肽包含在N和/或C端或內(nèi)部插入了一個(gè)或多個(gè)附加的氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸序列，或由在N和/或C端或內(nèi)部插入了一個(gè)或多個(gè)附加的氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。舉例而言，所述多肽可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)附加的氨基酸，或由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)附加的氨基酸組成。有利地，附加的氨基酸位于SEQIDNO:2氨基酸序列的C端。在本發(fā)明第一個(gè)方面的更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的變體、或其片段，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列的變體、或其片段組成?！白凅w”意指所述多肽并不與SEQIDNO:2享有100%氨基酸序列同一性，S卩SEQIDNO2的一個(gè)或多個(gè)氨基酸必須經(jīng)修飾。舉例而言，所述多肽可包含與SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少60%同一性，更優(yōu)選與所述序列具有至少70%或80%或85%或90%同一性，且最優(yōu)選與所述氨基酸序列具有至少95^^96^^97^^98%或99%同一性的氨基酸序列，或由與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少60%同一性，更優(yōu)選與所述序列具有至少70%或80%或85%或90%同一性，且最優(yōu)選與所述氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列組成。同一性百分比能夠通過(guò)本領(lǐng)域已知方法確定，例如使用在Expasy工具網(wǎng)站(http//www,ch.embnet.org/software/LALIGNform,html)上的LALIGN程序(Huang禾口Miller,Adv.App1.Math.(1991)12:337-357)，利用全局比對(duì)選項(xiàng)、評(píng)分矩陣BL0SUM62、開(kāi)啟^口罰分(openinggappenalty)—14、延串@□罰分(extendinggappenalty)-4{^參數(shù)。或者，兩個(gè)多肽之間的序列同一性百分比可以利用適當(dāng)?shù)碾娔X程序測(cè)定，例如威斯康辛大學(xué)遺傳計(jì)算組(UniversityofWisconsinGeneticComputingGroup)的GAP程序，并且應(yīng)理解(itwillbeappreciatedthat)同一性百分比的計(jì)算是相對(duì)于其序列已進(jìn)行了最優(yōu)比對(duì)排列的多肽而進(jìn)行的?！靶揎棥币庵冈谔囟ㄎ恢玫陌被崤cSEQIDNO:2的多肽中的該氨基酸相比發(fā)生改變。舉例而言，在特定位置的氨基酸可為非天然的，缺失的或取代的，或可為一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入/添加位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是所述取代可為保守的或非保守的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生保守取代的片段，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生保守取代的片段組成?！氨Ｊ厝〈币庵敢粋€(gè)氨基酸由另一個(gè)具有類(lèi)似性質(zhì)(大小，疏水性等)取代，從而使得所述多肽的功能并不受顯著改變。因此“保守取代”旨在指如Gly、Ala；Val>lie、Leu；Asp、Glu；AsruGln；Ser、Thr；Lys、Arg；禾口Phe、Tyr的組合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述變體包含在暴露于多肽表面的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處的修飾。暴露于表面的氨基酸可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)測(cè)定(見(jiàn)實(shí)施例B)。然而，應(yīng)理解的是，對(duì)非暴露的氨基酸的修飾也可以造成在變體多肽表面的結(jié)構(gòu)變化(相對(duì)于野生型CHIPS蛋白或SEQIDNO2的多肽而言)。技術(shù)人員應(yīng)理解的是，氨基酸分子還可以以其他方式進(jìn)行修飾，例如通過(guò)化學(xué)修飾。因此，本發(fā)明的多肽可以由通過(guò)肽鍵或經(jīng)過(guò)修飾的肽鍵而彼此相連的氨基酸組成，例如肽酯，并包含除基因編碼的20個(gè)氨基酸之外的氨基酸。例如，所述多肽可以包含L-氨基酸和/或D-氨基酸，以及經(jīng)修飾的氨基酸比如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、0-磷酸絲氨酸和0-磷酸酪氨酸。所述多肽可以通過(guò)自然方法來(lái)修飾，例如翻譯后修飾，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)來(lái)修飾。修飾能夠在所述變體CHIPS多肽氨基酸序列內(nèi)的任何位置，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基端或羧基端進(jìn)行。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含天然L-氨基酸或由天然L-氨基酸組成。已知多肽的修飾型(modifiedform)或變體型能夠使用本領(lǐng)域已知技術(shù)生成(見(jiàn)Sambrook&Russell,2000,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarbor,NewYork,(分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第三版，冷泉港，紐約)其以引用的方式并入本文中)。例如，點(diǎn)突變可以通過(guò)定點(diǎn)誘變而引入到特定的氨基酸殘基處(見(jiàn)Sambrook&Russell,同上，第13章)。生成親本多核苷酸的變體的其他方法描述如下。關(guān)于CHIPS的“生物活性”用于本文表示野生型CHIPS蛋白對(duì)于活體、組織或細(xì)胞的作用。這些作用在此處包含但不限于與其一個(gè)或多個(gè)天然配體的結(jié)合，以及由此產(chǎn)生的下游事件，引起對(duì)活體的直接或間接作用。因此，CHIPS蛋白的“生物活性”包括對(duì)由補(bǔ)體成分Cfe和/或N-甲酰肽fMLP誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞的趨化性和/或活化的抑制。例如，保持的活性可以包含對(duì)Cfe受體(CfeR)的拮抗和/或?qū)柞；氖荏w(FPR)的拮抗。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體CHIPS多肽缺乏FI3R結(jié)合位點(diǎn)(例如，所述多肽缺乏SEQIDNO1的氨基酸1至30)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽顯示出CHIPS蛋白在體內(nèi)的一種或多種生物活性。測(cè)定野生型CHIPS蛋白及其變體的生物活性和結(jié)合特性的測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的(見(jiàn)實(shí)施例)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明第一方面的多肽相對(duì)于野生型CHIPS蛋白顯示出的水平可以顯示出更低、相等或更高水平的生物活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽顯示出野生型CHIPS蛋白顯示出的水平的至少10%水平的生物活性，例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽與野生型CHIPS蛋白顯示出的生物活性相比顯示出相等水平或更高的生物活性。最優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽顯示出相對(duì)于野生型CHIPS蛋白更高水平的生物活性(即更有活性)。例如，本發(fā)明的多肽可以顯示出野生型CHIPS蛋白顯示出的水平的至少110%水平的生物活性，例如至少120%,130%,140%,150%,160%,170%,180%、190%,200%、250%、300%、500%或更尚。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽對(duì)于C5aR和/或FRP具有特異結(jié)合活性，該活性等于或大于野生型CHIPS蛋白顯示的相應(yīng)活性。因此，本發(fā)明的多肽僅顯示出CHIPS蛋白的生物活性，即該多肽的活性具有選擇性。例如，本發(fā)明的多肽可以選擇性地抑制由補(bǔ)體成分Cfe和/或由N-甲酰肽fMLP誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞的趨化性和/或活化?！斑x擇性”表示與對(duì)細(xì)胞中其他蛋白活性的調(diào)控相比，該多肽在更大程度上抑制了所述生物活性。因此，該多肽優(yōu)選地僅抑制野生型CHIPS蛋白的生物活性，然而應(yīng)該了解，細(xì)胞中其他蛋白的表達(dá)和活性可以作為所述選擇性抑制的下游后果而發(fā)生改變。因此，我們排除了對(duì)細(xì)胞過(guò)程具有非特異性作用的作用物(agents)。在本發(fā)明第一個(gè)方面的更進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述多肽是SEQIDNO2的多肽的變體，其中一個(gè)或多個(gè)表面表位經(jīng)修飾。此類(lèi)修飾可為直接的(即表位自身內(nèi)氨基酸的修9飾)或間接的(即修飾的氨基酸不在表位中，但是當(dāng)其被修飾時(shí)，導(dǎo)致表位內(nèi)氨基酸或該表位結(jié)構(gòu)的修飾)。“表面表位”意指野生型CHIPS蛋白表面暴露的氨基酸殘基的構(gòu)象，所述構(gòu)象由響應(yīng)于CHIPS抗原攻擊(challenge)而產(chǎn)生的抗CHIPS抗體和/或響應(yīng)于金黃色葡萄球菌攻擊而產(chǎn)生的抗體所識(shí)別。在本發(fā)明第一個(gè)方面的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述多肽在人體中相對(duì)于SEQIDNO1的多肽具有更低的免疫原性。“免疫原性”意指多肽在宿主生物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即產(chǎn)生抗多肽的抗體)的能力。優(yōu)選地，該多肽在人體內(nèi)相對(duì)于SEQIDNO:1的多肽具有更低的免疫原性。免疫原性可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法確定。例如，家兔或其他動(dòng)物物種(例如小鼠、大鼠、豚鼠、狗等)可用本發(fā)明的多肽進(jìn)行免疫，并確定免疫復(fù)合物的形成。理想情況下，在幾種不同物種中研究免疫應(yīng)答，以排除物種特異性的影響。一種合適的評(píng)估人體內(nèi)可能存在的免疫原性的方法包括純化人抗CHIPSIgG并確定變體多肽對(duì)此類(lèi)抗體的親和力，例如使用ELISA(見(jiàn)以下實(shí)施例)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽能夠抑制嗜中性粒細(xì)胞的Cfe誘導(dǎo)的活化。該抑制可以為部分的或完全的。因此，與缺乏該多肽時(shí)的活化相比，響應(yīng)于本發(fā)明的多肽可將嗜中性粒細(xì)胞的Cfe誘導(dǎo)的活化抑制至少10%，例如至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%且優(yōu)選100%。在本發(fā)明第一個(gè)方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽呈現(xiàn)一種或多種(例如，全部)下述性質(zhì)(a)抑制嗜中性粒細(xì)胞遷移(趨化性)的IC5tl小于InM，優(yōu)選0.5nM或更小(參見(jiàn)實(shí)施例)；和/或(b)血清IgG效價(jià)為野生型CHIPS的2%或更少(參見(jiàn)實(shí)施例)；和/或(c)阻斷CfeR的IC5tl小于野生型CHIPS的四倍(lessthanfourtimesthatofwildtypCHIPS)(參見(jiàn)實(shí)施例)；和/或(d)解鏈溫度Tm高于50°C，優(yōu)選高于60°C(參見(jiàn)實(shí)施例)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列。舉例而言，所述多肽可由SEQIDNO:2的氨基酸序列與附加的N端甲硫氨酸組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列組成。本發(fā)明的多肽可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備(例如，見(jiàn)Sambrook&Russell,2000,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarbor,NewYork，其以引用的方式并入本文中)。簡(jiǎn)言之，構(gòu)建的表達(dá)載體可以包含核酸分子，所述核酸分子能夠在合適的宿主中表達(dá)由該核酸分子編碼的多肽。已經(jīng)發(fā)展出了許多將核酸分子特別是DNA可操作地連接到載體上的方法，例如通過(guò)互補(bǔ)粘性末端。例如，互補(bǔ)均聚物束(complementaryhomopolymertracts)可以加至將要插入載體DNA中的DNA區(qū)段。然后將該載體和DNA區(qū)段通過(guò)互補(bǔ)均聚物尾部(complementaryhomopolymertails)之間的氫鍵鍵合而結(jié)合形成重組DNA分子。具有一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了另一種將DNA區(qū)段與載體連接的方法。將DNA區(qū)段，例如由內(nèi)切核酸酶的限制性消化而產(chǎn)生的DNA區(qū)段，用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I處理，所述酶通過(guò)其3’-5’外切核酸酶活性除去了突出的、3’-單鏈末端，并以其聚合活性填充凹陷的3’-末端。因此，這些活性結(jié)合起來(lái)產(chǎn)生了平末端的DNA區(qū)段。然后將該平末端區(qū)段與較大量摩爾過(guò)量(alargermolarexcess)的接頭分子在酶的存在下溫育，所述酶能夠催化平末端DNA分子的連接，例如噬菌體T4DNA連接酶。因此，反應(yīng)的產(chǎn)物為末端具有聚合接頭序列的DNA區(qū)段。然后將這些DNA區(qū)段用合適的限制性酶切割，并連接到表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體已經(jīng)經(jīng)過(guò)酶切產(chǎn)生了能與上述DNA區(qū)段相容(compatiblewith)的末端。含有各種限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的合成接頭可從多種來(lái)源以商業(yè)方法得到，包括從InternationalBiotechnologiesInc.,NewHaven,CN,USA。對(duì)編碼本發(fā)明多肽的DNA的理想修飾方法是利用PCR。該方法可以用于將DNA引入合適的載體，例如通過(guò)工程構(gòu)建到合適的限制性位點(diǎn)中，或可以以本領(lǐng)域已知的其它有效方式修飾DNA。在本方法中，將要進(jìn)行酶擴(kuò)增的DNA兩側(cè)是兩個(gè)特異性引物，該引物本身將被納入擴(kuò)增出的DNA中。所述特異性引物可以包含限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)能夠使用本領(lǐng)域已知方法用于向表達(dá)載體中的克隆。然后，將該DNA(或者在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下為RNA)在合適的宿主中表達(dá)，生成包含本發(fā)明化合物的多肽。因此，可以根據(jù)已知技術(shù)，再按照包含于本文的教導(dǎo)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎梺?lái)使用編碼所述多肽的DNA，以構(gòu)建表達(dá)載體，然后將該表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞以表達(dá)和生成本發(fā)明的化合物。此類(lèi)技術(shù)包括在以下文件中公開(kāi)的那些1984年4月3日頒發(fā)給Rutter等人的美國(guó)專(zhuān)利第4440859號(hào)，1985年7月23日頒發(fā)給狗化細(xì)肌的美國(guó)專(zhuān)利第4530901號(hào)，1986年4月15日頒發(fā)給Crowl的美國(guó)專(zhuān)利第45擬800號(hào)，1987年6月30日頒發(fā)給Mark等人的美國(guó)專(zhuān)利第4677063號(hào)，1987年7月7日頒發(fā)給Goeddel的美國(guó)專(zhuān)利第4678751號(hào)，1987年11月3日頒發(fā)給Itakura等人的美國(guó)專(zhuān)利第4704362號(hào)，1987年12月1日頒發(fā)給Murray的美國(guó)專(zhuān)利第4710463號(hào)，1988年7月12日頒發(fā)給Toole，Jr.等人的美國(guó)專(zhuān)利第4757006號(hào)，1988年8月23日頒發(fā)給Goeddel等人的美國(guó)專(zhuān)利第4766075號(hào)，和1989年3月7日頒發(fā)給Stalker的美國(guó)專(zhuān)利第4810648號(hào)(將它們以引用的方式并入本文中)。編碼組成本發(fā)明化合物的多肽的DNA(或者在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下為RNA)可以與多種其他DNA序列結(jié)合以引入合適的宿主。該伴隨DNA(companionDNA)將依賴(lài)于宿主的性質(zhì)、將DNA引入宿主的方式以及是否希望保留或整合附加體。通常來(lái)講，DNA以正確的方向和正確的閱讀框插入至表達(dá)載體中例如質(zhì)粒中以作表達(dá)。如必要的話，DNA可以連接于由預(yù)期的宿主識(shí)別的適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)性控制核苷酸序列，雖然這樣的控制通常在表達(dá)載體中也可以實(shí)現(xiàn)。然后將該載體通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入宿主。通常來(lái)講，不是所有的宿主都會(huì)受到所述載體的轉(zhuǎn)化。因此，有必要選擇轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞。一種選擇技術(shù)包括將一個(gè)DNA序列連同任何必需的控制元件引入該表達(dá)載體，所述DNA序列編碼在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中可選擇的性狀(trait)，例如抗生素抗性。或者，這種可選擇的性狀的基因可以在另一個(gè)用于共轉(zhuǎn)化預(yù)期的宿主細(xì)胞的載體上。然后將用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的合適的條件11下參考包含于本文的教導(dǎo)培養(yǎng)足夠時(shí)間，以使該多肽表達(dá)，其后可以回收所述多肽。許多表達(dá)系統(tǒng)為已知的，包括細(xì)菌(例如，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))、酵母(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、絲狀真菌(例如曲霉屬(Aspergillus))、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞。載體通常包括原核復(fù)制子，例如ColElori,以用于在原核細(xì)胞中的增殖，即使該載體是用于其他非原核生物細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)。載體還可以包含合適的啟動(dòng)子，例如原核生物啟動(dòng)子，其能夠指導(dǎo)基因在受其轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)。啟動(dòng)子是一種表達(dá)控制元件，由DNA序列組成，其使RNA聚合酶能夠結(jié)合并使轉(zhuǎn)錄發(fā)生。與示范性細(xì)菌宿主兼容的啟動(dòng)子序列通常由質(zhì)粒載體提供，所述載體包含方便的限制性位點(diǎn)以插入本發(fā)明的DNA區(qū)段。典型的原核載體質(zhì)粒為可從BioradLaboratories(Richmond,CA,USA)獲得的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329,以及可從Pharmacia,Piscataway，NJ,USA獲得的pTrc99A和pKK223-3。特別優(yōu)選的原核載體質(zhì)粒包括pET系統(tǒng)(Novagene)，pRSET和pHIP(Invitrogen,California,USA)。典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體質(zhì)粒是可從Wiarmacia，Piscataway,NJ,USA獲得的pSVL。該載體利用SV40晚期啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)克隆基因的表達(dá)，其中最高水平的表達(dá)發(fā)現(xiàn)于T抗原生成細(xì)胞，例如C0S-1細(xì)胞。可誘導(dǎo)性哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的例子是pMSG，同樣可從Wmrmacia獲得。該載體利用源于小鼠乳瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以驅(qū)動(dòng)克隆基因的表達(dá)。可利用的酵母質(zhì)粒載體為pRS403-406和pRS413_416，其通常可從MratageneCloningSystems,LaJolla，CA92037，USA獲得。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406為酵母整合型質(zhì)粒(YeastIntegratingplasmidJIps)，并合并了酵母選擇標(biāo)記HIS3、TRP1、LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS413_416為酵母著絲粒質(zhì)粒(Ycps)。其他載體和表達(dá)系統(tǒng)均為本領(lǐng)域已知的，并用于多種宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以為原核或真核的。細(xì)菌細(xì)胞為優(yōu)選的原核宿主細(xì)胞，并通常是大腸桿菌的菌株，比方說(shuō)，例如可從BethesdaResearchLaboratoriesInc.，Bethesda，MD，USA獲得的大腸桿菌菌株DH5和可從Rockvi1Ie，MD,USA的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC))獲得的RRl(編號(hào)ATCC31343)。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選脊椎動(dòng)物細(xì)胞，比如來(lái)自小鼠、大鼠、猴或人類(lèi)成纖維細(xì)胞系和腎細(xì)胞系的那些。酵母宿主細(xì)胞包括YPH499、YPH500和YPH501，其通?？蓮腟tratageneCloningSystems,LaJolla，CA92037，USA獲得。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括可從ATCC作為CRL1658獲得的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、293細(xì)胞即人胚腎細(xì)胞和NSO細(xì)胞。優(yōu)選的昆蟲(chóng)細(xì)胞為可用桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞。以本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞宿主，是通過(guò)已知方法完成的，并通常依賴(lài)于所用載體的類(lèi)型。關(guān)于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，參見(jiàn)例如Cohen等(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA69，2110禾口Sambrook等(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化描述于Sherman等(1986)MethodsInYeastGenetics,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor，NY。Beggs(1978)Nature275，104-109中描述的方法也可適用。關(guān)于脊椎動(dòng)物細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞的試劑例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖或脂質(zhì)體制劑，可由MratageneCloningSystems或LifeTechnologiesInc.,Gaithersburg,MD20877,USA提供。電穿孔法也可以用于轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并已知在本領(lǐng)域中能夠用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和脊椎動(dòng)物細(xì)胞。例如，許多細(xì)菌種類(lèi)可以通過(guò)Luchansky等(1988)Mol.Microbiol.2，637-646中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其以引用的方式并入本文中。最大數(shù)量的轉(zhuǎn)化體在以25μFD使用6250V每em對(duì)懸浮于2.5PEB中的DNA-細(xì)胞混合物進(jìn)行電穿孔之后持續(xù)(consistently)回收。以電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法公開(kāi)于Becker&Guarente(1990)MethodsEnzymo1.194，182中。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，可通過(guò)已知技術(shù)鑒定。例如，可以培養(yǎng)在引入本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體后產(chǎn)生的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽?？梢允斋@并裂解細(xì)胞，并可以使用由Southern(1975)J.Mol.Biol.98，503或Berent等(1985)Biotech.3，208描述的方法檢驗(yàn)它們的DNA內(nèi)容物中所述DNA的存在?；蛘?，上清液中所述蛋白的存在可以通過(guò)下面描述的抗體來(lái)檢測(cè)。除了直接檢測(cè)存在的重組DNA之外，當(dāng)重組DNA能夠指導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)，成功的轉(zhuǎn)化還能夠通過(guò)已知的免疫學(xué)方法而確認(rèn)。例如，表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生成展現(xiàn)適當(dāng)抗原性的蛋白。收獲疑似得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞樣品，并利用合適的抗體檢測(cè)所述蛋白。宿主細(xì)胞可以是非人動(dòng)物體內(nèi)的宿主細(xì)胞。因此，依靠轉(zhuǎn)基因的存在而表達(dá)本發(fā)明第一方面的化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物也包含于此。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物例如小鼠。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以使用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生。培養(yǎng)宿主細(xì)胞和分離重組蛋白的方法為本領(lǐng)域熟知的。應(yīng)理解，依賴(lài)于宿主細(xì)胞，生成的本發(fā)明化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))可以是不同的。例如，特定的宿主細(xì)胞，例如酵母或細(xì)菌細(xì)胞，可以不含，也可以包含不同的翻譯后修飾系統(tǒng)，所述系統(tǒng)可以產(chǎn)生可能以不同方式進(jìn)行翻譯后修飾的多種形式的本發(fā)明化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))。優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))在真核系統(tǒng)中產(chǎn)生，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)次優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))可利用商業(yè)上可以獲得的體外翻譯系統(tǒng)而在體外生成，例如家兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液或麥胚裂解液(可從!Iomega獲得)。優(yōu)選地，該翻譯系統(tǒng)為兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液。方便地，該翻譯系統(tǒng)可以耦合至轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，例如TNT轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)(Promega)。此系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)，即在與翻譯相同的反應(yīng)中從編碼DNA多核苷酸產(chǎn)生合適的mRNA轉(zhuǎn)錄物。因此，本發(fā)明的第二方面提供編碼本發(fā)明第一方面的多肽的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸分子為DNA分子。有利的是，該核酸分子進(jìn)一步包含宿主細(xì)胞可識(shí)別的信號(hào)肽，所述宿主細(xì)胞即為在其中表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞。本發(fā)明的第三方面提供包含本發(fā)明第二方面的核酸分子的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體為表達(dá)載體(例如來(lái)自pET系統(tǒng)、pRSET或pHIP的任何載體)。本發(fā)明的第四方面提供包含本發(fā)明第二方面的核酸分子或本發(fā)明第三方面的載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。本發(fā)明的第五方面提供生成本發(fā)明第一方面多肽的方法，其包括在表達(dá)該多肽的條件下，培養(yǎng)含有本發(fā)明第二方面的核酸分子或本發(fā)明第三方面的載體的宿主細(xì)胞群體，并從中分離所述多肽。表達(dá)多肽的“分離”包括從培養(yǎng)基中去除一部分或全部的雜質(zhì)，例如細(xì)胞碎片。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是基本上(substantially)純的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽優(yōu)選地以藥物組合物的形式提供，該藥物組合物包含所述化合物和藥學(xué)上可接受的載體。因此，本發(fā)明的第六方面提供包含本發(fā)明第一方面的多肽的藥理組合物。“藥學(xué)上可接受的”包括無(wú)菌且不含熱原(pyrogenfree)的制劑。合適的藥物載體為制藥領(lǐng)域熟知的。載體必須為“可接受的(acc印table)”，即在某種意義上與本發(fā)明的化合物相兼容，且對(duì)其受體無(wú)害。通常，載體會(huì)是無(wú)菌且不含熱原的水或鹽水；然而，也可以利用其他可接受的載體。因此，“藥學(xué)上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括用于形成該制劑一部分的任何化合物，其旨在僅產(chǎn)生載體的作用，即本身不具有生物活性。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑通常為安全的、無(wú)毒的，且不會(huì)在生物學(xué)或其他方面產(chǎn)生不良影口向(neitherbiologicallynorotherwiseundersirable)。用于本文的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑同時(shí)包括一種和多于一種的此類(lèi)載體或賦形劑的情況。本發(fā)明的多肽可以制成不同濃度，其依賴(lài)于所用化合物的效力/毒性。優(yōu)選地，該制劑包含濃度為0.ΙμΜ至ImM的本發(fā)明的作用物，更優(yōu)選ΙμΜ至100μΜ，5μΜ至50μΜ，10μM至50μΜ，20μM至40μM且最優(yōu)選約30μΜ。對(duì)于體外應(yīng)用，該制劑可以包含更低濃度的本發(fā)明化合物，例如0.0025μM至1μΜ。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述藥物和作用物(即多肽)通常將與根據(jù)計(jì)劃的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐而選擇的合適的藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合施用(例如，見(jiàn)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995,Ed.AlfonsoGennaro,MackPublishingCompany，Permsylvginiii，USA，gM3|M白勺入*^；巾)。例如，所述藥物和作用物可以以片劑、膠囊、胚珠制劑(ovule)、酏劑、溶液或懸浮液的形式進(jìn)行口服、口腔或舌下施用，其可以包含調(diào)味劑或著色劑，用于立即釋放的、延遲釋放的或控制釋放的應(yīng)用。該藥物和作用物還可以通過(guò)海綿體內(nèi)注射(intracavernosalinjection)的方式施用。此類(lèi)片劑可以包含以微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣(dibasiccalciumphosphate)和甘氨酸為例的賦形劑，以淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯(tapioca)淀粉)、乙醇酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和特定的復(fù)合硅酸鹽為例的崩解劑，以及以聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠為例的造粒粘合劑(granulationbinder)。此外，以硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石為例的潤(rùn)滑劑也可以包含在內(nèi)。相似類(lèi)型的固體組合物也可以用作明膠膠囊的填充劑。就這點(diǎn)而言優(yōu)選的賦形劑包括乳糖(lactose)、淀粉、纖維素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。對(duì)于水性懸浮液和/或酏劑，本發(fā)明的化合物可以與以下物質(zhì)組合各種甜味劑或調(diào)味劑，色素(colouringmatter)或染料，乳化劑和/或懸浮劑，以水、乙醇、丙二醇和甘油為例的稀釋劑，以及它們的組合。本發(fā)明的藥物和作用物還可以以胃腸外施用，例如靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)或皮下施用，或者可以通過(guò)灌注技術(shù)施用。它們的最佳應(yīng)用形式是無(wú)菌水溶液，其可以包含其他物質(zhì)，例如足夠的鹽或葡萄糖以使該溶液與血液等滲。如必要的話，水溶液應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)?shù)鼐彌_(優(yōu)選緩沖至PH3-9)。無(wú)菌條件下合適的胃腸外制劑的制備，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)藥物技術(shù)容易地完成。適合胃腸外施用的制劑包括水性和非水性的無(wú)菌注射溶液，其可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與目標(biāo)受體血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無(wú)菌懸浮液，其可以包含懸浮劑和增稠劑。該制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封安瓿和小瓶，并可以在冷凍干燥(凍干)的條件下貯存，其只需要在使用前即刻加入無(wú)菌液體載體，例如注射用水。臨時(shí)調(diào)配的(extemporaneous)注射溶液和懸浮液可以用上文描述的類(lèi)型的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備。對(duì)于向人類(lèi)患者的口服和胃腸外施用，所述藥物和作用物的每日劑量水平通常會(huì)介于每位成人1至IOOOmg(即大約0.015至15mg/kg)之間，以單獨(dú)或分開(kāi)的劑量施用。所述藥物和作用物還可以通過(guò)鼻內(nèi)或通過(guò)吸入施用，并方便地以干粉吸入劑或氣溶膠噴霧劑的形式遞送，所述干粉吸入劑或氣溶膠噴霧劑由加壓容器、泵、噴霧器或霧化器呈遞，其中利用合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、以1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134A3)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EA3)為例的氫氟烷烴、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，其劑量單位可以通過(guò)提供定量遞送的閥門(mén)而確定。該加壓容器、泵、噴霧器或霧化器可以包含活性化合物的溶液或懸浮液，例如利用乙醇和推進(jìn)劑的混合物作為溶劑，其可以額外地包含潤(rùn)滑劑，例如三油酸山梨坦。用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒(例如以明膠制成)可以配制成包含本發(fā)明化合物和合適的粉末基底例如乳糖或淀粉的粉末混合。優(yōu)選安排氣溶膠或干粉制劑，從而使每計(jì)量藥劑或“噴氣”包含至少I(mǎi)mg的本發(fā)明化合物以供遞送給患者。應(yīng)理解，氣溶膠的每日總劑量因患者而異，且可以以單劑量施用，或者更通常在一天中以分開(kāi)的多個(gè)劑量施用?；蛘撸鏊幬锖妥饔梦锟梢砸运▌┗蜿幍浪ǖ男问绞┯?，或者它們可以以洗劑(lotion)、溶液、乳霜(cream)、藥膏或撒粉(dustingpowder)的形式施用。本發(fā)明的化合物還可經(jīng)皮施用，例如，通過(guò)利用皮膚貼片(skinpatch)0它們還可以通過(guò)眼部途徑施用。對(duì)于向皮膚的局部用藥，所述藥物和作用物可以制成包含活性化合物的合適的藥膏，所述活性化合物懸浮或溶解于例如一種或多種以下物質(zhì)的混合物中礦物油、液體石蠟、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物(polyoxyethylenepolyoxypropylenecompound)、乳化蠟和水?；蛘?，它們可以制成合適的洗劑或乳霜，其懸浮或溶解于例如一種或多種以下物質(zhì)的混合物中礦物油、單硬脂山梨坦、聚乙二醇、液體石蠟、聚山梨酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇(cetearylalcohol)、2_辛基十二醇、苯甲醇和水。適合在口中的局部施用的制劑包括錠劑(lozenges)，其包含的活性成分存在于加香基料(flavouredbasis)中，所述基料通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍芪膠(tragacanth)；錠片(pastilles)，其包含的活性成分存在于惰性基料中，例如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠；以及漱口劑，其包含的活性成分存在于合適的液體載體中。當(dāng)藥物或作用物為多肽時(shí)，可優(yōu)選利用緩釋(sustained-release)藥物遞送系統(tǒng)，例如微球。它們是為了減少注射的頻率而特別設(shè)計(jì)的。該系統(tǒng)的一個(gè)例子是NutropinD印ot(重組生長(zhǎng)激素緩釋劑)，其將重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)包裹于可生物降解的微球中，一旦注射，其將在一段持續(xù)的時(shí)間內(nèi)緩慢釋放rhGH。緩釋免疫球蛋白組合物還包括脂質(zhì)體包裹的免疫球蛋白。含有免疫球蛋白的脂質(zhì)體由本身已知的方法制備。參見(jiàn)，例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-92(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030-4(1980)；美國(guó)專(zhuān)利第4485045,4544545,6139869和6027726號(hào)。普通情況下，脂質(zhì)體為小型(約200至約800埃)、單層型的，其中脂質(zhì)含量大于約30摩爾百分?jǐn)?shù)(mol.膽固醇；選擇的比例是為了最佳的免疫球蛋白治療而調(diào)整的?；蛘撸嚯乃幬锖妥饔梦锟梢酝ㄟ^(guò)外科手術(shù)植入的設(shè)備來(lái)施用，其將藥物直接釋放于所需部位。電穿孔治療(EPT)系統(tǒng)也可以用于該蛋白和多肽的施用。對(duì)細(xì)胞遞送脈沖電場(chǎng)的設(shè)備增加細(xì)胞膜對(duì)藥物的通透性，致使細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的顯著增強(qiáng)。蛋白和多肽還可以通過(guò)電摻入(electroincorporation；EI)遞送。當(dāng)皮膚表面上直徑高達(dá)30微米的小顆粒經(jīng)受與電穿孔中所用相同或類(lèi)似的電脈沖時(shí)，EI就會(huì)發(fā)生。在EI中，這些顆粒受到驅(qū)動(dòng)而穿透角質(zhì)層并進(jìn)入皮膚的更深層。該顆粒可以用藥物或基因加載或包裹，或可以簡(jiǎn)單地像“子彈”一樣在皮膚上產(chǎn)生小孔，藥物能夠通過(guò)這種小孔進(jìn)入。另外一種遞送蛋白和多肽的方法是熱敏感ReGel注射劑(thermo-sensitiveReGelinjectable)0低于體溫時(shí)，ReGel為可注射的液體，而它在體溫時(shí)會(huì)迅速形成凝膠狀貯存器，其緩慢消蝕并溶解成已知的、安全的、可生物降解的聚合物?；钚运幬锝?jīng)過(guò)一段時(shí)間隨著該生物聚合物的溶解而進(jìn)行遞送。蛋白和多肽藥物還可以口服遞送。一種這樣的系統(tǒng)利用了口服攝入維生素B12至體內(nèi)的天然過(guò)程來(lái)共同遞送蛋白和多肽。通過(guò)搭載于該維生素B12的攝入系統(tǒng)，該蛋白或多肽能夠移動(dòng)穿透腸壁。維生素B12的類(lèi)似物和藥物形成復(fù)合物，所述復(fù)合物同時(shí)保留該復(fù)合物的維生素B12部分對(duì)于內(nèi)因子(IF)的高親和力以及該復(fù)合物的藥物部分的高生物活性。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供本發(fā)明第一方面的多肽以用于醫(yī)藥用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的多肽用于抑制補(bǔ)體如(C5a)和/或N-甲酰肽fMLP的生物活性。本發(fā)明一個(gè)相關(guān)的方面提供本發(fā)明第一方面的多肽在制備藥物中的用途，所述藥物用以抑制補(bǔ)體和/或N-甲酰肽fMLP的生物活性。過(guò)敏毒素Cfe介導(dǎo)多種炎性反應(yīng)。通過(guò)作用于C5aR，其在活化和募集吞噬細(xì)胞中起重要作用，并對(duì)入侵微生物的有效清除是至關(guān)重要的。近年來(lái)，已經(jīng)明了的是，Cfe還在破壞性炎性過(guò)程例如組織損傷和導(dǎo)致器官衰竭的嚴(yán)重炎性癥狀中起重要作用。此外，Cfe還與其他幾種生物過(guò)程相關(guān)，所述過(guò)程影響正常的器官發(fā)育、多種細(xì)胞譜系的早期分化以及保護(hù)細(xì)胞免受程序性死亡(見(jiàn)表1)。表1C5a_相關(guān)的生物過(guò)程MAPK的活化內(nèi)皮細(xì)胞活化單核細(xì)胞活化血管生成嗜伊紅粒細(xì)胞趨化髓鞘化細(xì)胞凋亡胞吐作用嗜中性粒細(xì)胞活化花生四烯酸代謝受精作用嗜中性粒細(xì)胞趨化星形股質(zhì)細(xì)胞活化纖維蛋白溶解磷脂酶C活化嗜堿性粒細(xì)胞活化葡萄糖代謝磷脂代謝凝血糖酵解血小板活化骨重建己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激酶C活化骨吸收高度磷酸化肌動(dòng)蛋白聚合的調(diào)控兒荼酸胺生物合成脂代謝呼吸爆發(fā)細(xì)胞黏附酯加氧酶途徑平滑肌收縮細(xì)胞周期淋巴細(xì)胞活化精子發(fā)生細(xì)胞分化淋巴細(xì)胞趨化超氧化物釋放細(xì)月包生長(zhǎng)淋巴細(xì)胞增殖T細(xì)胞增殖細(xì)胞入侵巨噬細(xì)胞活化血管收縮細(xì)胞遷移巨噬細(xì)胞趨化血管舒張環(huán)氧合酶途徑巨噬細(xì)胞分化病毒進(jìn)入類(lèi)花生酸生物合成肥大細(xì)胞活化傷口愈合胞吞作用微管聚合人甲酰肽受體(FPI)及其變體FPRL-I(FPR-樣1)和FPRL-2(FPR-樣幻屬于七跨膜域的Gi-蛋白偶聯(lián)受體。兩種受體均以高水平存在于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中。FI^R定義為高親和力甲酰肽受體，而FPRL-I基于其僅由高濃度f(wàn)MLP活化而定義為低親和力受體。由于自然中甲酰肽的唯一來(lái)源是細(xì)菌和線粒體蛋白合成，人們認(rèn)為這些受體的功能是作為介導(dǎo)者(mediator)將吞噬細(xì)胞募集至細(xì)菌入侵或組織損傷部位。該觀點(diǎn)由以下觀察結(jié)果所支持，即FPR敲除小鼠更容易受到單核細(xì)胞增生利斯特桿菌(Listeriamonocytogenes)的感染。同樣，功能失常的FI^R等位基因與局限型青少年牙周炎有關(guān)。在過(guò)去的幾年中，鑒定了這些受體的大量非甲?；呐潴w(見(jiàn)表幻。這些配體起源于不同來(lái)源，包括隨機(jī)肽文庫(kù)、內(nèi)生性來(lái)源(endogenoussource)和病原體。它們中的一些與包括阿爾茨海默病、淀粉樣變性和朊病毒病在內(nèi)的人類(lèi)疾病相關(guān)。因此，將甲酰肽受體在不同炎性過(guò)程的治療中作為目標(biāo)。表2FPR和FPRL-I激動(dòng)劑和拮抗劑細(xì)菌肽QvlLF和類(lèi)似物Hp(2-20)HIV-I包膜肽T20(DP178)T21N36F肽V3肽W-肽(WKYMVm)MMK-IWKYMVM表2-續(xù)來(lái)源受體ECsoJjC^o細(xì)菌和FPR0.1-1nM線粒體FPRL-I1μΜmFPRl1μΜmFPR210μΜ幽門(mén)螺桿菌FPRLl0.3μΜ{Helicobacterpylori)FPRL-210μΜHIV-lLAvgp41FPR0.5μΜ(aa643-678)mFPRl1μΜmFPR-20.5μΜHIV-lLAvgp41FPR0.1μΜ(aa558-595)FPRL-I50ηΜHIV-lLAvgp41FPRL-I12.5μΜ(aa546-581)HIV-lBragpl20FPRLl10μΜ(aa414-434)HIV-lMNgpl20FPRL-I2μΜ(V3環(huán))隨機(jī)肽文庫(kù)FPR1ηΜF(xiàn)PRL-I1ρΜF(xiàn)PRL-25ηΜmFPR-150ηΜmFPR-21ηΜ隨機(jī)肽文庫(kù)FPRL-I0.5ηΜmFPR20.5ηΜ隨機(jī)肽FPRL-I2ηΜF(xiàn)PRL-280ηΜ18MHC結(jié)合肽NADH脫氫酶亞基IFPRL-I0.5nMLL-37hCAP18i_37FPRL-I1.0μΜAc1-26膜聯(lián)蛋白(aal-26)FPR5μΜAc9-25膜聯(lián)蛋白(aa9-25)FPR10nMD2D388-274uPAR(aa88-274)FRPLl5ρΜLXA4脂質(zhì)代謝產(chǎn)物FPRLlΙ.ΟηΜSAA急性期FPRL-I0.1μΜ蛋白mFPR-21μΜΑβ242APP(aal-42)FPRL-I1μΜmFPR-22μΜPrPl06-1262朊病毒(aal06-126)FPRL-I25μΜ拮抗劑Boc-FLFLF合成的FPR2μΜ環(huán)孢菌素H真菌FPR0.5μΜDCA膽汁酸FPR100μΜCDCA膽汁酸FPR175μΜF(xiàn)PRL-I300μΜSpinorphin腦脊液FPR50μΜ因此，將該多肽用作C5aR的拮抗劑。方便地，該多肽能夠與該受體直接結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽用于抑制Cfe受體的整體或部分功能。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，Cfe受體位于嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞上。因此，該多肽可以用于抑制由補(bǔ)體誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞的活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽用于治療炎癥，例如急性或慢性炎性反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“治療”以及類(lèi)似用語(yǔ)，用于本文通常表示取得希望的藥理學(xué)和生理學(xué)效果。此外，它表示任何過(guò)程、作用、應(yīng)用、治療或者諸如此類(lèi)的意思，其中哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)，出于改善該哺乳動(dòng)物狀況的目的而受到直接或非直接地醫(yī)治(medicalaid)。因此，治療包括治療性和預(yù)防性兩種用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽用于治療選自下組的疾病或癥狀的用途急性反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、急性移植排斥、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、酒精性肝炎、同種異體移植、阿爾茨海默病、動(dòng)脈硬化、阿爾圖斯反應(yīng)、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、特應(yīng)性皮炎、細(xì)菌性腦膜炎、支氣管癌(bronchogeniccarcinoma)、大皰性類(lèi)天皰疫(bullouspemphigoid)、燒傷(burn)、心肺分流術(shù)(cardiopulmonarybypass)、心血管疾病、慢性支氣管炎、慢性淋巴白血病、慢性阻塞性肺病0DPD)、接觸性皮炎、克羅恩病(Crohn’sdisease)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、囊性纖維化、皮膚病(dermatoses)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)、實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)、實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性神經(jīng)炎(ΕΑΝ)、凍傷、胃癌、腸胃病、泌尿生殖疾病、痛風(fēng)、幽門(mén)螺桿菌胃炎(Helicobacterpylorigastritis)、血液透析、遺傳性血管性水腫、超敏性肺炎、特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis)、免疫復(fù)合物(IC)誘發(fā)性血管炎、缺血性休克、缺血再灌注發(fā)作、缺血再灌注損傷、關(guān)節(jié)疾病、(大)血管外科手術(shù)((large)vesselsurgery)、金屬煙熱(metalfumefever)、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)器官衰竭、重癥肌無(wú)力、心肌梗死、胰腺炎、腹膜炎、胸膜氣腫(pleuralemphesema)、心肺分流術(shù)后(CPB)炎癥、銀屑病(psoriasis)、重復(fù)性勞損(r印etitivestraininjury)(RSI)、呼吸系統(tǒng)疾病(respiratorydisease)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒癥(s印sis)、敗血性休克、鼻竇炎、皮膚病(skindisease)、中風(fēng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、移植、(創(chuàng)傷性)腦損傷((traumatic)braininjury)、潰瘍性結(jié)腸炎、尿路感染、血管滲漏綜合征、血管炎和異種移植。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽用于治療再灌注損傷的用途。例如，再灌注損傷可以與急性心肌梗死(AMI)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)、中風(fēng)和/或器官移植相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽用于治療急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的用途。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供治療受試者的方法，該受試者需要使用補(bǔ)體和/或N-甲酰肽fMLP的生物活性抑制劑的治療，該方法包括向受試者施用本發(fā)明第一方面的多肽或本發(fā)明第六方面的藥物組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述受試者為人。將本發(fā)明的多肽或藥物組合物以有效量對(duì)患者施用?！爸委熡行Я俊被颉坝行Я俊被颉爸委熡行У摹保糜诒疚谋硎緦?duì)補(bǔ)體和/或N-甲酰肽fMLP的生物活性產(chǎn)生抑制的量。這是經(jīng)計(jì)算能產(chǎn)生預(yù)期治療效果的活性物質(zhì)的預(yù)定量。此外，還旨在表示該量足夠減少且最優(yōu)選防止宿主的活性、功能和反應(yīng)上的臨床顯著性缺陷?；蛘?，治療有效量是足夠?qū)λ拗鞯呐R床顯著癥狀產(chǎn)生改善作用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，化合物的量可以根據(jù)其比活性而改變。聯(lián)系到所需的稀釋劑，合適的劑量可以包含經(jīng)計(jì)算能產(chǎn)生預(yù)期治療效果的預(yù)定量的活性組合物。在制備本發(fā)明組合物的方法和用途中，提供活性成分的治療有效量。治療有效量可以由醫(yī)藥或獸醫(yī)領(lǐng)域的普通工作人員運(yùn)用此領(lǐng)域的已知方法根據(jù)患者的特性，例如年齡、重量、性別、癥狀、并發(fā)癥、其他疾病等確定。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)個(gè)體施用足以發(fā)揮C5aR和/或FTO拮抗劑作用的量的所述化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述有效量的化合物或其制劑可以以單一大丸劑(singlebolusdose)遞送(即急性施用)，或者，更優(yōu)選地，在一段時(shí)間內(nèi)以多劑量遞送(即慢性施用)。本發(fā)明的變體CHIPS蛋白可以通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)制備，例如由AlligatorBioscienceAB開(kāi)發(fā)的Fragment—InducedNucleotideDiversity(‘FIND，)(片段引發(fā)的核苷酸多樣性)方法。該FIND方法在W098/58080，W002/48351和W003/97834中有詳細(xì)描述。因此，本發(fā)明的另一方面提供用于生成本發(fā)明第一方面的多肽的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一種或多種編碼SEQIDNO2的多肽或其變體的親本多核苷酸分子；(b)以核酸酶(例如外切核酸酶)消化所述一種或多種親本多核苷酸分子以產(chǎn)生多核苷酸片段；(c)將步驟(b)產(chǎn)生的所述多核苷酸片段彼此接觸；和(d)擴(kuò)增彼此退火的片段以產(chǎn)生至少一種編碼變體CHIPS多肽的多核苷酸序列，所述變體CHIPS多肽與所述一種或多種親本多核苷酸分子編碼的那些多肽相比具有改變的氨基酸序列。技術(shù)人員應(yīng)理解，步驟(a)提供的親本多核苷酸可以為雙鏈或單鏈的。然而步驟(a)中的親本多核苷酸分子優(yōu)選為單鏈的。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(d)包括添加具有預(yù)定變異性的寡核苷酸，以控制引入親本多核苷酸確定區(qū)域的變異性程度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法另外包括步驟(e)，即表達(dá)步驟(d)中產(chǎn)生的至少一種多核苷酸序列并在所得多肽中篩選野生型CHIPS蛋白的生物活性，例如能夠抑制嗜中性粒細(xì)胞的Cfe誘導(dǎo)的活化和/或嗜中性粒細(xì)胞的fMLP誘導(dǎo)的活化。步驟(e)還可以包括檢測(cè)產(chǎn)生的多肽同C5aR和/或FPR結(jié)合的能力。該結(jié)合特性可以使用本領(lǐng)域的已知技術(shù)評(píng)估，例如親和層析和噬菌體展示。更優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步包括步驟(f)，即在所得多肽中篩選相對(duì)于SEQIDNO2的多肽降低的免疫原性。例如，步驟(e)可以包含以下篩選過(guò)程中的一種或多種⑴測(cè)定變體CHIPS多肽結(jié)合C5aR的能力。例如，噬菌體選擇可以用于篩選變體多肽與對(duì)應(yīng)于C5aR的N-末端部分的肽的結(jié)合。第一輪陽(yáng)性篩選之后，可以將洗脫的噬菌體擴(kuò)增，并進(jìn)行下一輪陽(yáng)性篩選。在第二輪陽(yáng)性篩選中，可以加入人抗CHIPS抗體，以吸附多余的CHIPS分子，所述多余CHIPS分子保留有對(duì)抗CHIPS抗體的結(jié)合；該方法能夠增加鑒定具有較低免疫原性的克隆的可能性。第二輪陽(yáng)性篩選之后，立即將洗脫的噬菌體與包裹于磁珠的人抗CHIPS抗體進(jìn)行溫育。然后收集洗脫液的匯集物(pool)，如下(1)不結(jié)合抗體的噬菌體，(2)清洗步驟后洗脫的噬菌體，(3)以低濃度CHIPS洗脫的噬菌體或以高濃度CHIPS洗脫的噬菌體?？梢赃x擇來(lái)自匯集物(1)和O)的克隆優(yōu)先用于進(jìn)一步篩選。來(lái)自所選突變體匯集物的基因可以克隆至pRSET載體，且蛋白以HT形式生成。(ii)通過(guò)表達(dá)ELISA測(cè)定每種變體CHIPS多肽的濃度。(iii)測(cè)定變體CHIPS多肽與抗CHIPS抗體的結(jié)合活性，例如通過(guò)抑制性ELISA(inhibitionELISA)和/或人抗CHIPS抗體ELISA。(iv)選擇的變體CHIPS多肽還可以重新表達(dá)，并以表達(dá)ELISA和肽ELISA進(jìn)行分析。示范性篩選過(guò)程的進(jìn)一步細(xì)節(jié)在實(shí)施例中提供(見(jiàn)下文)。應(yīng)理解，能夠高通量操作的篩選測(cè)定法是特別優(yōu)選的。實(shí)例可以包括基于細(xì)胞的測(cè)定法和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定法?？梢赃\(yùn)用基于SPA(閃爍親近測(cè)定法；AmershamInternational)的胃·。其他檢測(cè)多肽/多肽相互作用的方法包括超濾與離子噴射質(zhì)譜/HPLC方法或者其他物理方法和分析方法。例如，可以運(yùn)用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceEnergyResonanceTransfer)(FRET)方法,其中兩個(gè)熒光標(biāo)記實(shí)體的結(jié)合可以通過(guò)測(cè)量熒光標(biāo)記彼此靠近時(shí)的相互作用而測(cè)量。檢測(cè)多肽與大分子例如DNA、RNA、蛋白和磷脂的結(jié)合的其他方法，包括表面等離振子共振測(cè)定法(surfaceρlasmonresonanceassay),例如由Plant等(1995)AnalytBiochem226(，342-348描述的(其以引用的方式并入本文中)。這些方法可以利用經(jīng)過(guò)21標(biāo)記的多肽，例如用放射性或熒光標(biāo)記標(biāo)記的多肽。能夠結(jié)合目標(biāo)大分子(例如C5aR或FPR)的多肽的其它鑒定方法為這樣一種方法，其中當(dāng)目標(biāo)大分子暴露于多肽時(shí)，多肽與所述大分子的任何結(jié)合都會(huì)被檢測(cè)和/或測(cè)量。多肽與大分子結(jié)合的結(jié)合常數(shù)可以確定。多肽和大分子結(jié)合的合適的檢測(cè)和/或測(cè)量(量化)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，且可以利用例如能夠進(jìn)行高通量操作的方法進(jìn)行，例如基于芯片的方法。名為VLSIPS的新技術(shù)，能夠產(chǎn)生包含數(shù)以十萬(wàn)計(jì)或更多的不同分子探針的極小型芯片。這些生物芯片或陣列具有成列的探針；每個(gè)探針都分配有特定的位點(diǎn)。產(chǎn)生的生物芯片其每個(gè)位點(diǎn)均有例如10微米的尺寸。所述芯片可以用于確定目標(biāo)分子是否與芯片上的任何探針有相互作用。在選定的測(cè)試條件下，將陣列暴露于目標(biāo)分子后，掃描設(shè)備可以檢測(cè)陣列的每個(gè)位點(diǎn)并確定目標(biāo)分子是否與該位點(diǎn)的探針相互作用。生物芯片或陣列能夠應(yīng)用在多種篩選技術(shù)中以獲得有關(guān)探針或目標(biāo)分子的信息。例如，可以利用肽文庫(kù)作為探針以篩選藥物。所述肽可以暴露于受體，并且結(jié)合于受體的探針可以得到鑒定。參見(jiàn)1999年2月23號(hào)頒發(fā)給Rava等人的美國(guó)專(zhuān)利第5874219號(hào)。應(yīng)理解，鑒定可在體內(nèi)阻斷C5aR和/或FPR的多肽將是理想的。因此，應(yīng)理解，可以選擇所述方法中應(yīng)用的試劑和條件從而使所述多肽和與其相互作用的多肽間的相互作用，與體內(nèi)天然存在的所述多肽和天然存在的與其相互作用的多肽間的相互作用基本相同。本發(fā)明的示范性實(shí)施方案由以下非限制性實(shí)施例所描述，并涉及以下圖示圖1-健康人類(lèi)供體(n=168)中IgG抗CHIPS效價(jià)的頻率分布。效價(jià)定義為減去背景值后吸光值為0.300的稀釋度的對(duì)數(shù)。平均效價(jià)為3.62，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.72。插入值表示研究開(kāi)始前的6個(gè)受試者的抗CHIPS效價(jià)(每次ELISA中以匯集(pooled)人血清為參照進(jìn)行了校正的3個(gè)值的平均值(meanof3valuescorrectedforhumanpooledserumasreferenceineveryELISA))。圖2-志愿者血清中檢測(cè)出的CHIPS的藥效學(xué)。CHIPS是通過(guò)靜脈內(nèi)注射(ivinjection)CHIPS后在不同時(shí)間點(diǎn)以特異性捕獲ELISA而測(cè)定的?？招牡臉?biāo)志代表安慰劑，而實(shí)心標(biāo)志代表CHIPS接受者(receiver)。圖3-人抗CHIPSIgG抑制了通過(guò)捕獲ELISA完成的CHIPS的檢測(cè)。將回收的2.5ng·mL^CHIPS摻入(spikeinto)不同濃度的匯集的人血清中并由捕獲ELISA進(jìn)行測(cè)量(a)。經(jīng)過(guò)蛋白-G-S印harose(瓊脂糖凝膠)消耗人血清中的IgG，消除對(duì)CHIPS捕獲ELISA的抑制作用(b)。將不同濃度的CHIPS與緩沖液(·)、1%人血清(來(lái)自單一供體，▲)、或經(jīng)過(guò)蛋白-G-S印harose后的的血清(▼)溫育。數(shù)據(jù)顯示的是一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。圖4-CHIPS于外周血嗜中性粒細(xì)胞的表面回收。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時(shí)間點(diǎn)，結(jié)合于嗜中性粒細(xì)胞表面的CHIPS的存在性用兔抗CHIPS抗體檢測(cè)。顯示各個(gè)受試者；白色柱代表安慰劑，而黑色柱代表CHIPS接受者。數(shù)值表示在不同時(shí)間點(diǎn)(T=0、15、60,240分鐘和M小時(shí)之后)EDTA全血樣品中門(mén)控的嗜中性粒細(xì)胞(gatedneutrophils)的平均熒光(MFL)。次級(jí)FITC標(biāo)記的結(jié)合物(secondaryFITClabelledconjugate)的背景MFL值為6。圖5-人外周血嗜中性粒細(xì)胞上FPR(a)和C5aR(b)的表達(dá)。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時(shí)間點(diǎn)，嗜中性粒細(xì)胞表面上存在的FPR通過(guò)FITC標(biāo)記的fMLP來(lái)檢測(cè)，而存在的C5aR通過(guò)FITC標(biāo)記的抗OT88mAb(單克隆抗體)來(lái)檢測(cè)。白色柱代表安慰劑，而黑色柱代表CHIPS接受者。數(shù)值表示門(mén)控的嗜中性粒細(xì)胞的平均熒光(MFL)。圖6-離體(exvivo)全血fMLP刺激后外周血嗜中性粒細(xì)胞的抑制指數(shù)。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時(shí)間點(diǎn)，將EDTA抗凝血與緩沖液和fMLP于37°C溫育30分鐘，并分析⑶lib和⑶62L二者的表達(dá)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將⑶lib和⑶62L的表達(dá)相對(duì)于經(jīng)緩沖液處理的對(duì)照樣品表示(⑶lib相對(duì)增高而⑶62L表達(dá)相對(duì)降低)。這些數(shù)值用于計(jì)算在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)受試者的活化指數(shù)(CD62L的相對(duì)值/CDllb的相對(duì)值)。數(shù)值以平均值士SD(標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示了安慰劑(〇)、血清和嗜中性粒細(xì)胞CHIPS陰性(-)受試者(·)和CHIPS陽(yáng)性⑴受試者(■)。圖7-循環(huán)外周血白細(xì)胞(a)和血清炎癥標(biāo)記物CRP(b)的水平。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行WBC的計(jì)數(shù)和CRP的測(cè)量。(1.1和1.6分別表示1天零1個(gè)小時(shí)或一天零6個(gè)小時(shí))。將WBC的數(shù)據(jù)相對(duì)于T=0時(shí)的數(shù)值表示，并以mg·Γ1表示CRP的數(shù)據(jù)。數(shù)值為安慰劑(·)和CHIPS接受者(▲)的平均值士SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。圖8-以循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC；(a))和肥大細(xì)胞標(biāo)志類(lèi)胰蛋白酶(b)的水平量度的CHIPS的不良反應(yīng)。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)兩種標(biāo)記物進(jìn)行了特異性檢測(cè)。將數(shù)據(jù)相對(duì)于T=0時(shí)的數(shù)值表示，并顯示為安慰劑(·)和CHIPS接受者(▲)的平均值士SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。圖9-靜脈內(nèi)注射CHIPS后不同時(shí)間點(diǎn)的循環(huán)外周血嗜中性粒細(xì)胞上⑶lib和⑶62L的表達(dá)指數(shù)。對(duì)于每個(gè)受試者，將在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上⑶lib和⑶62L的表達(dá)都相對(duì)于T=0時(shí)的起始表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這些數(shù)值用于計(jì)算每個(gè)受試者在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活化指數(shù)(⑶lib的相對(duì)值/⑶62L的相對(duì)值)。圖10-健康人受試者中CHIPS的免疫原性。在試驗(yàn)開(kāi)始前和試驗(yàn)結(jié)束后7天和42天時(shí)在全部受試者中測(cè)定針對(duì)CHIPS的特異性IgG效價(jià)。數(shù)值為安慰劑(·)和CHIPS接受者(■)的平均值士SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。圖11-體外CHIPS-IgG復(fù)合物誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞上⑶lib的相對(duì)表達(dá)。從健康志愿者中分離的嗜中性粒細(xì)胞以濃度漸增的CHIPS連同(■)或不連同(·)20μg.mr1親和純化的人抗CHIPSIgG進(jìn)行攻擊(challenge)。為了確定FcγR的功能，將細(xì)胞用封閉mAb抗FcRlUlV-3)和F(ab，)2抗FcRIII(3G8)預(yù)處理，清洗并用于用緩沖液中的CHIPS(□)刺激或用抗CHIPSIgG(O)刺激。攻擊之后，將細(xì)胞與熒光標(biāo)記的抗⑶libmAb進(jìn)行冰浴，以測(cè)定細(xì)胞活化的水平。將數(shù)據(jù)相對(duì)于單獨(dú)的緩沖液中(不含CHIPS也不含IgG)細(xì)胞的⑶lib表達(dá)來(lái)表示，并顯示為平均值士SEM(η彡3)。圖12-離體CHIPS和丙氨酸取代突變體誘導(dǎo)的全血嗜中性粒細(xì)胞上⑶lib的相對(duì)表達(dá)。以濃度漸增的野生型CHIPS(CHIPSwt)、取代了46位精氨酸的丙氨酸取代突變體(CHIPSe46a)和取代了69位賴(lài)氨酸的丙氨酸取代突變體(CHIP^59a)對(duì)來(lái)自健康志愿者中的EDTA血進(jìn)行攻擊。⑶lib的表達(dá)通過(guò)特異性mAb于冰上確定，并將數(shù)據(jù)相對(duì)于單獨(dú)緩沖液中的細(xì)胞表示，表示為平均值士SEM(η彡3)。圖13-特異性抗CHIPSIgG效價(jià)和離體(exvivo)全血嗜中性粒細(xì)胞的最大刺激所需的CHIPS之間的關(guān)系。用濃度漸增的CHIPS攻擊來(lái)自健康志愿者的EDTA血液，并將⑶lib表達(dá)作為細(xì)胞活化的指標(biāo)測(cè)量。IgG抗CHIPS效價(jià)是通過(guò)ELISA確定的，并定義為給出0.300吸光度的對(duì)數(shù)血清稀釋。使用下式進(jìn)行回歸分析y=截距+斜率χln(x)0圖14-減少CHIPS與人抗CHIPSIgG的相互作用，但仍保留C5aR阻斷活性的實(shí)驗(yàn)策略。在起始輪次的隨機(jī)誘變和噬菌體選擇/ELISA篩選之后進(jìn)行三輪的FIND.并對(duì)減少的IgG結(jié)合和保留的C5aR肽結(jié)合進(jìn)行噬菌體選擇/ELISA篩選。然后分析改善的克隆中突變的結(jié)構(gòu)分布，并通過(guò)理性設(shè)計(jì)導(dǎo)入新的突變。對(duì)減少的IgG相互作用和保留的C5aR結(jié)合和抑制對(duì)這些克隆進(jìn)行進(jìn)一步分析。圖15-將來(lái)自輪次1(n=360)、輪次3(η=320)和輪次4(η=96)的克?、旌妥罴芽寺?B)的平均值與wtCHIPSh21進(jìn)行比較，將所述平均值測(cè)量為對(duì)人抗CHIPS31_113IgG的％結(jié)合。來(lái)自輪次4的96個(gè)克隆的分布示于C。圖16-在對(duì)減少的抗CHIP^H13IgG結(jié)合和保留的C5aR結(jié)合進(jìn)行篩選的過(guò)程中第四個(gè)多樣化輪次之后鑒定的42個(gè)最佳克隆的圖。選擇對(duì)人C5aR顯示出最高結(jié)合的10個(gè)克隆(圓圈內(nèi))用于進(jìn)一步的計(jì)算/理性設(shè)計(jì)。圖17-在隨機(jī)誘變、FIND:和理性設(shè)計(jì)之后最佳的七個(gè)克隆的序列比對(duì)。在幾乎所有克隆中位置K40、D42、N77、mil和G112發(fā)生突變并與位置K50、K69、K92、K100和Κ105處的突變進(jìn)行不同組合。突變的位置位于α-螺旋、β工和β2折疊之間的環(huán)、β2和β3折疊之間的環(huán)、β折疊3、^33和β4折疊之間的環(huán)和β折疊4。圖18-ADC-1004突變的結(jié)構(gòu)分布。ADC-1004突變的表面呈遞。將CHIPS31_121(PDB編號(hào)1XEE)的已知NMR結(jié)構(gòu)用于顯示ADC-1004氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、milK和G112A的結(jié)構(gòu)分布。該圖是由PyMol分子作圖程序(DeLano，2002.ThePyMolMolecularGraphicsSystem.DelanoScientific,SanCarlos)生成的。圖19-ADC-1004顯示與人血清中的抗體具有非常低的相互作用。將ADC-1004在人血清中的IgG結(jié)合與CHIPSmpCHIPStm、鏈激酶和阿那白滯素(Anakinra)的結(jié)合通過(guò)ELISA相比較。將人血清的系列稀釋添加至包被CHIPS變體或PBS的板。人血清匯集物的IgG效價(jià)示于(A)，而觀個(gè)不同個(gè)體的人血清的效價(jià)示于(B)。直線代表中位值。圖20-ADC-1004是補(bǔ)體活化的低水平誘導(dǎo)劑。通過(guò)ELISA來(lái)研究由來(lái)自人血清的抗CHIPS抗體和CHIPS變體之間相互作用介導(dǎo)的補(bǔ)體片段C3c沉積。將ADC-1004介導(dǎo)的C3c沉積與CHIPSh21或CHIPhwi3的C3c沉積相比較。將人血清的系列稀釋添加至包被CHIPS變體或PBS的板。量化補(bǔ)體片段C3c的沉積并將其針對(duì)血清濃度作圖。使用人血清匯集物的C3c沉積示于(A)，而使用觀個(gè)不同個(gè)體的人血清在10%血清的沉積示于(B)。直線代表中位值。圖21-ADC-1004抑制Cfe誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞活化和遷移。(A)-將Fluo_3標(biāo)記的嗜中性粒細(xì)胞用濃度漸增的CHIPS變體(CHIPSmpCHIPStm或ADC-1004)預(yù)溫育，并用恒定濃度的C5a(3nM)刺激。結(jié)果表示為經(jīng)緩沖液處理的細(xì)胞的百分比抑制，并來(lái)自代表性實(shí)驗(yàn)。(B)-將鈣黃綠素標(biāo)記的嗜中性粒細(xì)胞和一定效價(jià)的CHIPS變體(CHIPSH2PCHIPS3H13或ADC-1004)添加至1TransweIl系統(tǒng)的上室，而將InMCfe添加至下室。在平板讀數(shù)器中測(cè)量標(biāo)記的嗜中性粒細(xì)胞的遷移。結(jié)果表示為與未添加CHIPS的細(xì)胞相比的趨化性的百分比抑制。圖22-根據(jù)MR/SPECT測(cè)量ADC-1004顯著減少了相對(duì)于缺血區(qū)域(風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域)的梗死大小(P<0.007，Mann-WhitneyU檢驗(yàn))。24圖23-ADC-1004減少微血管梗阻。圖24-來(lái)自經(jīng)安慰劑(A)和ADC-1004(B)處理的動(dòng)物的來(lái)自梗死區(qū)域的心肌組織針對(duì)⑶18表達(dá)進(jìn)行染色。切片的圖像分析顯示ADC-1004處理的動(dòng)物中的較低染色，表明炎性細(xì)胞活化的減少。圖25-主動(dòng)脈血液中的I^02/Fi02基線處(移植之前)，移植兩個(gè)經(jīng)安慰劑處理的動(dòng)物(對(duì)照1和2)和兩個(gè)經(jīng)ADC-1004處理的受試者(ADC-10041和2)之后1、3和6小時(shí)處。實(shí)施例A-體內(nèi)CHIPS活性材料和方法動(dòng)物樽型中CHIPS毒件的臨床前評(píng)價(jià)進(jìn)行了不同的臨床前毒理學(xué)研究以研究CHIPS的安全性。其包括(i)在一組由3只組成的麻醉小獵犬(beagledog)中CHIPS對(duì)于不同心血管和呼吸參數(shù)的作用。對(duì)這些狗以大約30分鐘的間隔通過(guò)歷時(shí)1分鐘的靜脈內(nèi)灌注施用0.2,2.0、20mg·kg—1的遞增劑量的CHIPS。(ii)小鼠的行為(“Irwin”(歐文行為計(jì)分法))測(cè)試將CHIPS以7.5、25和75mg·kg"1的劑量作為單次靜脈內(nèi)注射施用給雄性ICROT-I小鼠(每組3只)，以評(píng)估其對(duì)一般行為的影響。另一附加組接受了同樣體積(IOmL·kg—1)的運(yùn)載體(vehicle)(0.9%w/v無(wú)菌鹽水)。(iii)大鼠中的急性靜脈內(nèi)毒性研究將96.Img·kg^CHIPS作為((themaximumpracticallyachievableduetovolumeconsiderations))對(duì)5只雄性和5只雌性大鼠靜脈內(nèi)施用。(iv)小鼠中的急性靜脈內(nèi)毒性將96.Img·Icg-1CHIPS作為單劑量對(duì)5只雄性和5只雌性小鼠靜脈內(nèi)施用。(ν)大鼠中7天靜脈內(nèi)推注的初步(preliminary)毒性研究04只雄性和M只雌性，最大劑量IOmg·kg"1)。(vi)大鼠中7天靜脈內(nèi)推注的毒性研究(76只雄性和76只雌性，最大劑量IOmg·kg—1)。(vii)狗中7天靜脈內(nèi)推注的劑量范圍的探測(cè)研究O只雄性和2只雌性，最大劑量20mg·kg"1)。(viii)狗中7天靜脈內(nèi)推注的毒性研究(12只雄性和12只雌性，最大劑量20mg·kg-1)。包括人類(lèi)志愿者健康志愿者的納入標(biāo)準(zhǔn)如下(i)受試者應(yīng)為男性。(ii)受試者應(yīng)滿足以下體重指數(shù)(BMI)范圍18-30(kg*m2)和年齡范圍18-50周歲，包括兩個(gè)端值(bothinclusive)。(iii)醫(yī)學(xué)篩選分為兩部分。受試者以抗CHIPS抗體水平進(jìn)行預(yù)篩選。只有具有低效價(jià)的受試者能在用藥之前的3周內(nèi)進(jìn)行第二部分篩選，其包括病史，體檢，血壓、心率、呼吸和體溫的檢測(cè)，呼氣酒精測(cè)試(alcoholbreathtest)，血液尿液檢查，心電圖(ECG)和藥物篩選。入院禾口隨訪(admissionandfollow-up)將選擇的6位受試者G位接受CHIPS，2位為對(duì)照)在用藥的前一天收至ClinicalPharmacologyUnit()(Kendle,Utrecht,TheNetherlands)。ii行了基線測(cè)定，包括為保證安全性的血樣(bloodsamplesforsafety)、尿液分析、暫時(shí)性病史(interimmedicalhistory)、體檢、生命體征和ECG(心電圖)。給藥當(dāng)日，將野生型CHIPS(0.Img·kg"1作為單劑量的無(wú)菌冷凍等滲鹽水溶液施用，所述溶液含有濃度為5mg·mL—1的CHIPS)或安慰劑(0.9%NaCl)通過(guò)歷時(shí)5分鐘的靜脈輸注施用。將受試者與遙測(cè)系統(tǒng)相連，從給藥前30分鐘開(kāi)始進(jìn)行心臟監(jiān)測(cè)，并持續(xù)至給藥開(kāi)始后4小時(shí)。用Finapres連續(xù)測(cè)量受試者的血壓，從給藥前5分鐘直至給藥后30分鐘。進(jìn)行生命體征的測(cè)量，并在入院期間特定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行ECG。為安全起見(jiàn)，對(duì)所有受試者進(jìn)行臨床狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)(血液學(xué)、生物化學(xué)、凝血和尿液分析)的監(jiān)控。對(duì)不良事件，根據(jù)其嚴(yán)重程度及與CHIPS或安慰劑的關(guān)系而進(jìn)行記錄和表征。受試者在給藥后M小時(shí)出院。給藥兩周后，受試者重返該單位進(jìn)行評(píng)估生命體征、ECG、血和尿以及抗CHIPS抗體水平的訪問(wèn)。隨訪安排在給藥6周后。CHIPS的克降和表汰CHIPS的克隆和表達(dá)如Haas等(2004)J.Immunol.173:5704-11所述。簡(jiǎn)言之，將不含信號(hào)序列的基因通過(guò)重疊延伸PCR克隆至pRSET載體，其直接位于腸激酶切割位點(diǎn)的下游(directlydownstreamoftheenterokinasecleavagesite)及EcoRI限制位點(diǎn)之Itr。MCelLyticBBacterialCelllysis/ExtractionReagent(CelLyticBMWMMM解/提取試劑)(Sigma)和溶菌酶按廠商說(shuō)明對(duì)細(xì)菌進(jìn)行裂解。組氨酸標(biāo)記的蛋白以鎳柱(HiTrapChelatingHP,5mL,AmershamBiosciences)根據(jù)廠商說(shuō)明進(jìn)行純化，其后以腸激酶(Invitrogen)進(jìn)行切割。以15%SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳，MiniProtean3系統(tǒng)，Bio-Rad)和考馬斯亮藍(lán)(CoomassieBrilliantBlue)(Merck)檢測(cè)樣品的純度和蛋白的存在。用于靜脈內(nèi)使用的CHIPS的純化在8L發(fā)酵培養(yǎng)基中在由大豆蛋白胨和酵母提取物組成生長(zhǎng)培養(yǎng)基中使全長(zhǎng)CHIPS在含有CHIPS編碼序列的大腸桿菌菌株中表達(dá)，所述CHIPS編碼序列直接位于PelB編碼序列的下游。通過(guò)兩階段陽(yáng)離子交換純化過(guò)程繼以脫鹽步驟從生長(zhǎng)培養(yǎng)基和細(xì)胞二者中分離CHIPS。將細(xì)菌細(xì)胞團(tuán)(cellpellet)重懸于包含NaCl(IOmM)和DTT(IOmM)的磷酸鹽緩沖液(30mM;pH7.0)并冷凍。其后于37°C解凍，冰浴并進(jìn)行超聲處理。于15，OOOrpm離心后，回收了琥珀色的“細(xì)胞”上清液。將該上清液以30mM磷酸鹽緩沖液稀釋4倍，并過(guò)SourceS-30柱。以磷酸鹽緩沖液鹽梯度洗脫材料，并將包含CHIPS的級(jí)分合并，并進(jìn)一步利用具有小落差鹽梯度(shallowsaltgradient)的精制柱(polishingcolumn)進(jìn)行純化。將包含CHIPS且純度高于97%(由HPLC測(cè)定)的級(jí)分合并，并過(guò)kphadexG25脫鹽柱以除去磷酸鹽和過(guò)量的氯化鈉。通過(guò)在Affimix樹(shù)脂(Biorad)上輕輕地?fù)u動(dòng)除去內(nèi)毒素，并通過(guò)超濾對(duì)制備物進(jìn)行滅菌。通過(guò)HPLC-MS在MicrobondapacCN-RP柱上檢查純度，該柱具有由水-TFA至甲醇-TFA組成的梯度流動(dòng)相。CHIPS—般于大約13分鐘時(shí)洗脫。該產(chǎn)物以無(wú)菌鹽水稀釋至所需濃度，并貯存于-20°C?？笴HIPS抗體利用弗氏完全佐劑(Freund，sCompleteAdjuvants)以重組CHIPS免疫兔子，并以弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫(boost)。用ELISA按前述方法(見(jiàn)Haas等，2004，JImmunol173(9):5704-11)檢查出血對(duì)于CHIPS的反應(yīng)性。從最后的出血(finalbleeding)中以標(biāo)準(zhǔn)ftOtein-G(Pharmacia)親和層析法按照廠商說(shuō)明純化IgG。對(duì)于CHIPS的特異性小鼠單克隆(抗體)(monoclonal)按所述方法生成，以ftOtein-Gkpharose(瓊脂糖凝膠)柱純化IgG(見(jiàn)Haas等，2004，JImmunol173(9):5704-11)。親和純化的人抗CHIPSI甙的分離利用CNBR-活化的S^harose4B(Pharmacia,GE)按照廠商的通用說(shuō)明將CHIPS'偶聯(lián)于(coupleto)固體基質(zhì)上。將大約8mg的純化CHIPS偶聯(lián)于1克kpharose(瓊脂糖凝膠)上。用該材料裝填一個(gè)小型柱(士ImL)，以PBS平衡并緩慢灌入稀釋于PBS的靜脈用人IgG(IgG-IV；Sanquin,Amsterdam,TheNetherlands)。以PBS充分洗滌該柱，并隨后以PH3的0.IMGlycineHCl(鹽酸甘氨酸)緩沖液洗脫。將0.5mL的級(jí)分收集至含有50yLIMTris/HClpH8的試管，用于中和。匯集具有最高OD28tl值的級(jí)分，并相對(duì)于PBS透析。以ELISA分析最終制備物的IgG含量。因此用PBS中2μg-πιΓ1的綿羊抗人IgG(ICN)包被平板，以5%BSA封閉，并同標(biāo)準(zhǔn)IgG制備物(參考血清；Boehringer)和未知樣品的連續(xù)稀釋一起進(jìn)行溫育。捕獲的IgG以過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG(S0Uthern)檢測(cè)，并以TMB作為底物。IgG的濃度由參考曲線計(jì)算而得。抗CHIPSELISA微量滴定板(Greiner)以每孔50μL包含1μg·mL^CHIPS的PBS包被，并于4°C過(guò)夜。所有清洗步驟均以PBS-0.05%Tween-20進(jìn)行3次，隨后于37°C溫育1小時(shí)。平板以PBS-0.05%Tween-204%BSA封閉，清洗并與稀釋于PBS-0.05%Tween-201%BSA的血清或抗體一起溫育。結(jié)合的抗體以結(jié)合了過(guò)氧化物酶的物種特異性山羊抗IgG(全部來(lái)自Southern,Birmingham,USA)檢測(cè)，并以TMB作為底物。以H2SO4終止反應(yīng)，并在BioRadELISA-分析儀(ELISA-reader)中測(cè)量450nm的吸光度。捕獲ELISA(CaptureELISA)微量滴定板以50μL的包含3μg·ml/1抗CHIPSmAb2G8的PBS包被，并于4°C過(guò)夜。將板以包含4%BSA和0.05%Tween-20的PBS封閉，清洗，并與在含1%BSA的PBS/Tween中稀釋的樣品及作為標(biāo)準(zhǔn)品的2倍稀釋范圍的CHIPS—起進(jìn)行溫育。隨后，將板與0.33μg·ml/1兔抗CHIPSIgG和15000稀釋的結(jié)合有過(guò)氧化物酶的山羊抗兔IgG(Southem)一起溫育。結(jié)合的抗體以TMB作為底物進(jìn)行定量，以INH2SO4終止反應(yīng)，并在BioRadELISA-分析儀上在450nm測(cè)量。人PMN的分離將獲得自健康志愿者的血液收集至含有肝素鈉(GreinerBio-One)作為抗凝血?jiǎng)┑脑嚬苤?。以PBS按1/1(ν/ν)稀釋肝素化血，并以IOmLFicoll(聚蔗糖)(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)禾口12mLHistopaque(密度1.119g·mL_1；Sigma-Aldrich,St.Louis,M0)^J^&M&^M(layerontoagradientofIOmLFicolland12mLHistopaque)。離心(320Xg20分鐘，于22°C)后，從Histopaque相收集嗜中性粒細(xì)胞，并以含有25mMHEPES緩沖液、L-谷氨酰胺GnvitrogenLifeTechnologies)和0.05%HSA(Sanguin)的冷RPMI1640培養(yǎng)液清洗。剩余的紅細(xì)胞以冰冷的水(ice-coldwater)裂解30秒，之后加入濃縮PBS(10XPBQ以恢復(fù)等滲。清洗后，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并按照每毫升107個(gè)嗜中性粒細(xì)胞重懸于RPMI-1640/0.05%HSA。嗜中性粒細(xì)胞抗原表達(dá)將全血收集至K3-EDTA試管并置于冰上。將熒光標(biāo)記的mAb的最優(yōu)稀釋等量分裝至i^ilcon試管，并與50μL血液在溫和攪拌下于冰上混合30分鐘。以FACS-Lysingsolution(FACS-裂解溶液)(BD)裂解紅細(xì)胞，隨后以緩沖液清洗并將細(xì)胞團(tuán)重懸于含0.5%多聚甲醛(paraformaldehyde)和0.疊氮化物的PBS。以基于正向和橫向散射作為門(mén)控(basedonforwardandsidewardscattersforgating)的FACsCalibur分析嗜中性粒細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。用校準(zhǔn)珠(Calibrationbeads)(Calibrite；BD)和同型匹配對(duì)照(isotypematchedcontrols)設(shè)置合適的背景值及電子補(bǔ)償。應(yīng)用以下mAb和探針=APC標(biāo)記的抗CDllb(CR3)(克隆44；BD)；PE標(biāo)記的抗CD62L(L_選擇素)(克隆Dreg56BD)；FITC標(biāo)記的抗CD88(C5aR)(克隆W17/1；Serotec)；熒光素標(biāo)記的甲?；?Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys("FITC-fMLP";MolecularProbes)；兔抗CHIPSIgG(EffI)和FITC標(biāo)記的F(ab)，2羊抗兔IgG(Sigma)。全血離體刺激將部分K3-EDTA血保存于室溫下，并用于離體嗜中性粒細(xì)胞的刺激。因此，將血液與10倍濃縮的刺激物(緩沖液對(duì)照，1XIO-8MfMLP)混合，并于37°C伴有溫和振蕩溫育30分鐘。將試管置于冰上以終止反應(yīng)，并與抗⑶lib和抗⑶62LmAb混合。于冰上30分鐘后，按上述方法處理樣品。CHIPS/IrG刺激的嗜中件粒細(xì)胞上的⑶lib表汰將不同濃度的CHIPS(最終濃度0-9μg·mL—1)與親和純化的人抗CHIPSIgG(0-40μg.mL—1)于37°C溫育30分鐘。之后，將50μL分離的人嗜中性粒細(xì)胞(IOW1)加入至CHIPS/抗CHIPS混合物并于37°C伴有溫和振蕩溫育30分鐘。將細(xì)胞在冰上放置10分鐘，之后加入3.5μL熒光小鼠抗人CDllb(BDbiosciences,SanDiego,CA)并冰浴30分鐘。以RPMI1640/0.05%HSA清洗細(xì)胞，并以200μL0.5%多聚甲醛進(jìn)行固定。全血中細(xì)胞上的CDllb表達(dá)利用從人類(lèi)志愿者中收集的血液進(jìn)行，選擇不同的抗CHIPS效價(jià)。由于IgG已經(jīng)存在于全血中，于是僅將樣品(50μL)與CHIPS(0_9μgΓ1)于37°C溫育30分鐘。將樣品在冰上放置10分鐘，之后加入3.5μL熒光標(biāo)記的小鼠抗人⑶1Ib并冰浴30分鐘。裂解紅細(xì)胞并加入ImLFACS裂解溶液(110稀釋于水)固定4分鐘。將細(xì)胞于1200rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘，并以冰冷的RPMI1640/0.05%HSA清洗細(xì)胞團(tuán)。最后，將細(xì)胞重懸于175μLRPMI1640/0.05%HSA。以FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BDBiosciences)測(cè)量代表細(xì)胞活化的受體表達(dá)。循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)以來(lái)自Quidel(SanDiego,CA)的兩種不同ELISA測(cè)定CIC=CIC-Clq酶免疫測(cè)定法是基于補(bǔ)體結(jié)合性IC會(huì)與固定的人Clq純化蛋白結(jié)合的原理；CIC-Raji細(xì)胞取代酶免疫測(cè)定法通過(guò)利用mAb測(cè)量含有IC的C3活化片斷，所述mAb特異性結(jié)合C3的iC!3b、C3dg和C3d活化片斷，其方式類(lèi)似于典型的Raji細(xì)胞CR2結(jié)合反應(yīng)。合并兩種測(cè)定法的數(shù)據(jù)，并將結(jié)果相對(duì)于時(shí)間為0時(shí)的數(shù)值表示。血清類(lèi)胰蛋白酶的濃度^lJffijfegPharmaciaDiagnostics(ffoerden,TheNetherlands)白勺ImmunoCAPTM技術(shù)在UniCAPR-100上測(cè)量源于血清的類(lèi)胰蛋白酶(α和β兩種形式)。健康對(duì)照的正常幾何平均值(normalgeometricmean)為5·6μg·Γ1(Pharmacia)。結(jié)果相對(duì)于時(shí)間為0時(shí)的數(shù)值表示。研究方案及其任何修正均通過(guò)了獨(dú)立的倫理委員會(huì)(incbpendentethicscommittee)的批準(zhǔn)。本研究依照歐共體(EuropeanCommunity；EC)的良好藥品臨床試驗(yàn)管理規(guī)范(GoodClinicalPractice)(GCP)和“赫爾辛基宣言”(‘DeclarationofHelsinki，)(2000)的規(guī)則施行。結(jié)果CHIPS在臨床前毒理學(xué)研究中未顯示出明顯的毒件CHIPS的施用在所有的毒理學(xué)動(dòng)物研究中，在以下方面均未引起與CHIPS相關(guān)的毒理學(xué)顯著變化臨床觀察、體重、攝食(foodconsumption)、血液學(xué)、凝血、血液化學(xué)參數(shù)、檢眼鏡檢查、心電圖、宏觀或顯微病理或行為。在麻醉的小獵犬中檢查了CHIPS對(duì)于各種心血管和呼吸參數(shù)的影響。在接受低劑量CHIPS(0.02和Zmg^kg-1)的犬中，與輸注運(yùn)載體(等滲鹽水)相比時(shí)沒(méi)有對(duì)心血管和呼吸有影響的證據(jù)。以20mg-kg^CHIPS靜脈內(nèi)施用后，在開(kāi)始施用后大約1分鐘時(shí)記錄到了平均動(dòng)脈血壓的短暫降低(40%)。開(kāi)始給藥后大約5分鐘內(nèi)，平均動(dòng)脈血壓恢復(fù)至給藥前水平。對(duì)血壓的影響與心率短暫的、不一致的(inconsistent)變化相符。在CHIPS首次施用之后的大約30分鐘，對(duì)一只犬施用重復(fù)靜脈內(nèi)的CHIPS劑量(20mg·kg—1)。記錄到的類(lèi)似于第一劑后的對(duì)心肺參數(shù)的短暫影響在該CHIPS重復(fù)施用后不顯著。然而，二次施用產(chǎn)生了延長(zhǎng)的平均動(dòng)脈血壓降低，其在二次施用后約30分鐘達(dá)到了最大18%的降低。僅在這只動(dòng)物中，CHIPS重復(fù)施用后的12分鐘，出現(xiàn)了與某些形式的輕微過(guò)敏反應(yīng)一致的全身t生皮月夫反應(yīng)(generalizedskinreaction)0該研究結(jié)果表明在人類(lèi)受試者中，在所用劑量范圍下(0.Img^g"1)不太可能觀察到對(duì)心肺的影響。此外，可能發(fā)生的任何影響都預(yù)計(jì)為短暫和可逆的?？笴HIPS抗體效價(jià)的分布由于金黃色葡萄球菌是一種常見(jiàn)細(xì)菌且CHIPS基因存在于大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌株中，因此我們假定所有個(gè)體均具有循環(huán)抗CHIPS抗體。因此，我們檢測(cè)了健康志愿者血清中的抗CHIPSIgG的量。圖1表示了一組168名健康人類(lèi)志愿者中抗CHIPSIgG效價(jià)的分布。在測(cè)量的這組樣品中，沒(méi)有效價(jià)低于所用ELISA的檢測(cè)限。認(rèn)為研究的群體代表一般群體。從該數(shù)據(jù)得出的結(jié)論是，一般群體中超過(guò)99%的人具有可檢測(cè)出的抗CHIPSIgG血清水平。圖1還顯示了試驗(yàn)中包括的受試者的效價(jià)。靜脈內(nèi)施用的CHIPS的藥物代謝動(dòng)力學(xué)在CHIPS施用后的四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，以ELISA測(cè)定了CHIPS血清效價(jià)(圖2)。僅在具有低效價(jià)抗CHIPS抗體的接受CHIPS的個(gè)體中(受試者104和105)觀察到了CHIPS效價(jià)的增加。我們確定了人血清對(duì)CHIPSELISA的影響。將CHIPS摻入不同濃度的匯集的人血清，并由捕獲ELISA進(jìn)行檢測(cè)。圖3a顯示，血清抑制了捕獲ELISA。利用蛋白G-瓊脂糖凝膠(proteinG-sepharose)柱消耗IgG消除了抑制作用(圖北)。CHIPS體內(nèi)結(jié)合FPR和C5aRCHIPS以高親和力結(jié)合嗜中性粒細(xì)胞上的FI3R和C5aR，且可以由抗CHIPS抗體按照前文對(duì)小鼠mAb的描述檢測(cè)。CHIPS施用后的不同時(shí)間點(diǎn)，存在于嗜中性粒細(xì)胞表面的CHIPS的量使用兔抗CHIPS抗體測(cè)定，如圖4中所示。只有在具有低抗CHIPS抗體效價(jià)的受試者中(受試者#104和#105)檢測(cè)到了嗜中性細(xì)胞表面的CHIPS。此外，在這兩個(gè)受試者中，對(duì)CHIPS的檢測(cè)與抗CHIPS抗體效價(jià)呈負(fù)相關(guān)。由于存在于血清中的抗CHIPS抗體干擾了(interferewith)CHIPS的直接檢測(cè)，因此，該直接檢測(cè)的陰性結(jié)果并不能排除CHIPS結(jié)合了受體。然而，結(jié)合于FPR和C5aR的CHIPS干擾了通過(guò)抗FPR和抗C5aR抗體對(duì)這些受體的檢測(cè)，如前文所述(見(jiàn)Veldkamp等，2000JnfectImmun68(10):5908-13)。圖5顯示通過(guò)FITC-fMLP和抗C5aR抗體結(jié)合而測(cè)定的FPR和Cfe受體的表達(dá)。具有低抗CHIPS抗體效價(jià)的受試者顯示FI5R和C5aR表達(dá)的降低，表明CHIPS已經(jīng)占據(jù)了所述受體。在具有高抗CHIPS抗體效價(jià)的受試者中(103和106)，F(xiàn)PR和C5aR的表達(dá)沒(méi)有變化，表明抗CHIPS抗體干擾了CHIPS結(jié)合受體。依賴(lài)干杭CHIPS杭體效價(jià)的CHIPS對(duì)干fMLPi秀導(dǎo)的嗜中件粒細(xì)朐活化的離體抑M細(xì)胞活化時(shí)，出現(xiàn)了⑶62L表達(dá)的降低和⑶lib表達(dá)的增高。為了檢測(cè)靜脈內(nèi)CHIPS對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞抑制的影響，我們離體測(cè)量了fMLP誘導(dǎo)的⑶62L和⑶lib的表達(dá)。在全血測(cè)定中，將嗜中性粒細(xì)胞用fMLP離體活化。如圖6所示，靜脈內(nèi)施用的CHIPS能夠離體抑制fMLP誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞活化。這種抑制僅在具有可檢測(cè)的CHIPS血清濃度的受試者中(受試者104和10觀察到。CHIPS引發(fā)的不良反應(yīng)在CHIPS施用后直接觀察到了嚴(yán)重的副作用。大部分不良事件于受試者106中觀察到，其包括肌肉疼痛、呼吸困難、腹痛、嘔吐、肌肉痙攣、寒戰(zhàn)、出汗、眼眶水腫(edemaorbita)和眩暈。這些癥狀的最終診斷為類(lèi)過(guò)敏性反應(yīng)。對(duì)該受試者以氯馬斯汀(clemastine)、IV液(IVfluids)、曲馬多(tramadol)和潑尼松龍(prednisolone)治療。報(bào)道的其他不良事件包括心悸、發(fā)熱(feelingwarm)、胸痛、面紅(flushing)、發(fā)寒、腿部疲勞、體位性頭暈(posturaldizziness)、發(fā)燒、頭痛、惡心、視力模糊。除了受試者106的嚴(yán)重背痛之外，受試者103與105報(bào)道有輕微背痛。受試者104報(bào)道有肌肉痙攣。受試者104和105在用藥后大約4小時(shí)開(kāi)始觀察到高達(dá)38.6°C的發(fā)燒，并在第一天晚間消退。血壓沒(méi)有變化，且ECG未見(jiàn)異常。除了受試者106(89%氧飽和)在上述不良事件期間的間歇性低讀數(shù)，未觀察到氧飽和的異常。接受安慰劑的受試者未報(bào)道有不良反應(yīng)。靜脈內(nèi)CHIPS引發(fā)了白細(xì)胞減少和CRP水平升高如圖7所示，我們測(cè)量了給藥前和給藥后的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)和C反應(yīng)性蛋白濃度(CRP)。在接受CHIPS的受試者中，CHIPS引發(fā)了短暫的白細(xì)胞減少，其在2天內(nèi)消退。此外，用藥后的第一天開(kāi)始產(chǎn)生CRP濃度的升高，其在第15天隨訪過(guò)程中對(duì)受試者進(jìn)行篩選時(shí)恢復(fù)到了正常水平(圖7b)。循環(huán)免疫g合4勿禾Π升高的血清表日月類(lèi)過(guò)敏+牛反應(yīng)我們測(cè)量了循環(huán)免疫復(fù)合物的量和血清類(lèi)胰蛋白酶濃度。靜脈內(nèi)施用CHIPS誘導(dǎo)了接受CHIPS的受試者體內(nèi)免疫復(fù)合物的形成(圖8a)。我們還觀察到了類(lèi)胰蛋白酶血清濃度的升高，其于給藥后大約10分鐘時(shí)達(dá)到最高(圖8b)。CHIPS誘導(dǎo)了體內(nèi)細(xì)胞活化為了研究CHIPS對(duì)于細(xì)胞活化的直接作用，我們測(cè)定了嗜中性粒細(xì)胞上CD62L和CDllb受體的表達(dá)。受體表達(dá)的測(cè)量于收集血樣后立刻進(jìn)行，而無(wú)需任何進(jìn)一步的細(xì)胞刺激。受試者104、105和106顯示了嗜中性粒細(xì)胞上⑶62L表達(dá)的減低和⑶lib表達(dá)的升高，代表了體內(nèi)細(xì)胞活化(圖9)。CHIPS施用后抗CHIPS抗體效價(jià)的升高蛋白的免疫原性的特點(diǎn)是引發(fā)抗體的能力。我們測(cè)定了健康人類(lèi)受試者中CHIPS的免疫原性。接受靜脈內(nèi)CHIPS的受試者表現(xiàn)出了抗CHIPSIgG的增加(圖10)。體外CHIPS對(duì)于嗜中件粒細(xì)胞的活化依賴(lài)于抗體濃度我們研究了體外CHIPS-IgG復(fù)合物對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞的活化。將不同濃度的CHIPS與20μg·πιΓ1人親和純化的抗CHIPSIgG一起預(yù)溫育，并用于刺激分離的嗜中性粒細(xì)胞，如圖11所示。親和純化的抗CHIPSIgG在缺乏CHIPS的情況下不能活化嗜中性粒細(xì)胞(未顯示數(shù)據(jù))。CHIPS-IgG復(fù)合物能夠以依賴(lài)劑量的方式刺激嗜中性粒細(xì)胞。圖11還顯示，存在細(xì)胞最大活化所需要的最優(yōu)CHIPS濃度。CHIPS-IgG誘導(dǎo)的細(xì)胞活化由FcR封閉抗體完全抑制。因此，結(jié)論是，這種測(cè)定法中CHIPS-IgG誘導(dǎo)的細(xì)胞活化是由Fc受體介導(dǎo)的。CHIPSe46a(第46位精氨酸用丙氨酸取代)和CHIPSk69a(第96位賴(lài)氨酸用丙氨酸取代)為兩種具有單氨基酸取代的CHIPS突變體，如先前所述(見(jiàn)Haas等，2005，JMolBiol353(4):859-872)。如通過(guò)ELISA測(cè)量，這些CHIPS突變體顯示出了對(duì)純化的抗CHIPSIgG降低的親和力(未顯示數(shù)據(jù))。當(dāng)用于全血細(xì)胞活化測(cè)定法時(shí)，這些突變體與野生型CHIPS相比具有較低的細(xì)胞活化潛能(圖12)。對(duì)于CHIPSk46a和CHIP^59a，與野生型CHIPS相比，需要高10倍的濃度才能達(dá)到相同的細(xì)胞活化。這表明，僅次于抗體效價(jià)，與抗原的反應(yīng)性水平?jīng)Q定了細(xì)胞活化的程度(amount)。chips對(duì)于嗜中件粒細(xì)胞的離體活化也依賴(lài)于抗chipsirg濃度我們?cè)谌x體測(cè)定法中測(cè)量了CHIPS對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞活化的作用。由于抗CHIPS抗體已經(jīng)存在于全血中，因此并未將CHIPS與親和純化的抗CHIPSIgG一起預(yù)溫育。將不同濃度的CHIPS加入來(lái)自人類(lèi)志愿者的血液中，并測(cè)量代表細(xì)胞活化的CDllb表達(dá)。圖13表明了通過(guò)在來(lái)自8名具有不同抗CHIPSIgG效價(jià)的健康志愿者的全血中的⑶lib表達(dá)，測(cè)得了嗜中性粒細(xì)胞最大刺激所需的CHIPS濃度。如體外實(shí)驗(yàn)所示，嗜中性粒細(xì)胞的最大刺激依賴(lài)于CHIPS/抗CHIPS的比率。這也在離體測(cè)定法中觀察到。當(dāng)存在更高的抗CHIPS濃度時(shí)，嗜中性粒細(xì)胞的最大刺激需要更高的CHIPS濃度。討論金黃色葡萄球菌的趨化抑制蛋白是人Cfe受體和甲酰肽受體非常有力的抑制劑。兩種受體，尤其是C5aR，均在多種不同炎性疾病的治療中被描述為重要靶物。CHIPS有效抑制C5aR和FI3R的能力，使該蛋白成為這些疾病治療中的候選治療劑。此外，針對(duì)C5aR和FPR的活性位于CHIPS分子不同區(qū)域的事實(shí)，使得靶向特定受體成為可能(見(jiàn)Haas等，2004，JImmunol173(9):5704-11)。CHIPS蛋白的人類(lèi)特異性，如從對(duì)人類(lèi)細(xì)胞的活性與對(duì)小鼠細(xì)胞活性的30倍差異中所顯而易見(jiàn)的，阻礙了在動(dòng)物模型中對(duì)CHIPS活性的體內(nèi)評(píng)估(見(jiàn)deHaas等，2004，JExpMed199(5):687-95)。我們研究了一組6位健康人類(lèi)受試者中金黃色葡萄球菌的趨化抑制蛋白的活性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)和毒性。在不同動(dòng)物模型中施用高濃度CHIPS(小鼠中高至96.Img·kg—1的單次靜脈內(nèi)劑量)的臨床前毒理學(xué)研究未顯示顯著的毒性跡象。因此，以0.Img-kg"1的起始劑量靜脈內(nèi)施用5分鐘被認(rèn)為是安全的。由于金黃色葡萄球菌是一種常見(jiàn)細(xì)菌且CHIPS蛋白在大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌株中均有表達(dá)，因此我們假定所有個(gè)體均具有抗CHIPS抗體。通過(guò)在對(duì)168份從人類(lèi)志愿者隨機(jī)采集的血清的匯集物中篩選抗CHIPSIgG效價(jià)證實(shí)了這點(diǎn)。使用小鼠單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)表明，這些單克隆抗體可以在體外干擾CHIPS的活性(見(jiàn)Haas等，2004，JImmunol173(9):5704-11).因此，有理由猜測(cè)，接受CHIPS蛋白的健康受試者中存在的抗CHIPS抗體同樣干擾活性。對(duì)人受試者施用CHIPS是研究體內(nèi)活性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)的獨(dú)特機(jī)會(huì)。靜脈內(nèi)施用0.Img·Icg-1CHIPS后，我們測(cè)量了CHIPS血清濃度。圖2表示了給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的CHIPS血清濃度。在接受了CHIPS蛋白的四名受試者中，僅有兩名測(cè)量到了增加的CHIPS血清濃度(受試者104和10。有趣的觀察現(xiàn)象是，這兩個(gè)個(gè)體同時(shí)顯示最低的抗CHIPSIgG效價(jià)。這表明，抗CHIPS抗體干擾了對(duì)CHIPS的檢測(cè)。因此，由于這種干擾的存在，在受試者104和105中測(cè)量的CHIPS血清濃度是被低估的?；谶@些數(shù)據(jù)，我們計(jì)算出CHIPS在體內(nèi)的預(yù)測(cè)半衰期至少為1.5小時(shí)。當(dāng)檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞膜表面存在的CHIPS量時(shí)，我們觀察到與抗CHIPSIgG效價(jià)之間的相同關(guān)系。僅在來(lái)自受試者104和105的嗜中性粒細(xì)胞表面能夠檢測(cè)到CHIPS。此外，還顯示這些CHIPS分子占據(jù)FPR和C5aR，其原因是在這些個(gè)體中通過(guò)抗FPR和抗C5aR抗體對(duì)兩種受體的檢測(cè)中存在下調(diào)。同樣，以fMLP刺激時(shí)，只有來(lái)自受試者104和105的嗜中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出降低的活化。不幸的是，用Cfe刺激的實(shí)驗(yàn)因技術(shù)原因失敗。然而，這些實(shí)驗(yàn)清晰地表明，靜脈內(nèi)施用的CHIPS對(duì)于離體嗜中性粒細(xì)胞活化具有抑制作用，且該作用由抗CHIPS抗體所抑制。在臨床前動(dòng)物毒性研究中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的不良反應(yīng)。在人類(lèi)受試者中施用的0.Img·kg^CHIPS為2名受試者(受試者103和104)所耐受，在受試者105中中度耐受，而受試者106在CHIPS輸注后直接產(chǎn)生了嚴(yán)重的癥狀，其診斷為類(lèi)過(guò)敏性反應(yīng)。我們測(cè)量了所有受試者中的嗜中性粒細(xì)胞CDllb表面表達(dá)以研究CHIPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活化。對(duì)受試者104、105和106觀察到了細(xì)胞的活化。在接受CHIPS的一組受試者中，在給藥后第2天時(shí)C反應(yīng)性蛋白相對(duì)于對(duì)照有所增加。肥大細(xì)胞，其為存在于外周組織的白細(xì)胞，在炎癥和速發(fā)型變應(yīng)反應(yīng)中具有核心作用。從分泌性顆粒釋放的類(lèi)胰蛋白酶是肥大細(xì)胞脫粒的代表性特征。血清肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶濃度在過(guò)敏性反應(yīng)和其他變應(yīng)性癥狀中增加(見(jiàn)I^ayne&KamdOiM，Anaesthesia59(7):695-703)0CHIPS施用后觀察到的類(lèi)過(guò)敏性反應(yīng)，通過(guò)代表肥大細(xì)胞活化的類(lèi)胰蛋白酶水平的增加所確認(rèn)。在類(lèi)胰蛋白酶水平的升高之前是循環(huán)免疫復(fù)合物的增加。免疫復(fù)合物能夠通過(guò)FcγR交聯(lián)和通過(guò)補(bǔ)體活化以及C5a的生成而活化肥大細(xì)胞(見(jiàn)Jancar&Crespo，2005，TrendsImmunol26(1):48-55)。體外實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了在抗CHIPS抗體存在下CHIPS的細(xì)胞活化特性。CHIPS誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞活化，通過(guò)阻斷FcγRII和FcγRIII封閉抗體而受到抑制。這表明，CHIPS誘導(dǎo)的這些細(xì)胞的活化，最有可能是由CHIPS/抗CHIPS免疫復(fù)合物引起的。當(dāng)我們?cè)跈z驗(yàn)的受試者中尋找循環(huán)免疫復(fù)合物時(shí)，在接受靜脈內(nèi)CHIPS的受試者中還發(fā)現(xiàn)了免疫復(fù)合物的增加?？笴HIPS抗體效價(jià)和CHIPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活化間的關(guān)系在體外和離體實(shí)驗(yàn)中均很清晰。這與受試者103中觀察到的形成對(duì)比，所述受試者103具有最高的抗CHIPS抗體效價(jià)，但卻只報(bào)告了輕微的不良反應(yīng)。當(dāng)然，研究的群體僅限于4個(gè)受試者，且有大量不同的因素影響個(gè)體內(nèi)不良反應(yīng)的發(fā)生和感知(perception)。此外，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了存在誘導(dǎo)細(xì)胞活化的最優(yōu)抗體濃度。非常高的抗CHIPS抗體效價(jià)有可能減少了類(lèi)過(guò)敏性反應(yīng)的發(fā)生。早期研究表明，CHIPS不結(jié)合除表達(dá)C5aR和FPR的細(xì)胞外的其他細(xì)胞，且沒(méi)有證據(jù)顯示CHIPS直接活化細(xì)胞。雖然抗體在細(xì)胞活化中明顯發(fā)揮了作用，但少數(shù)觀察結(jié)果和體內(nèi)的復(fù)雜性均阻礙了對(duì)這些數(shù)據(jù)的解釋。我們證實(shí)了對(duì)于抗CHIPSIgG具有降低的親和性的兩個(gè)CHIPS突變體(CHIPSk46a和CHIP^59a)在體外顯示出了降低的細(xì)胞活化潛能。盡管抗CHIPS抗體具有中和作用，我們依然能夠檢測(cè)出CHIPS蛋白顯著的血清濃度。此外，在循環(huán)嗜中性粒細(xì)胞上檢測(cè)出了靜脈內(nèi)施用的CHIPS，其結(jié)合于FI3R和CfeR，并能夠在離體用fMLP刺激時(shí)抑制嗜中性粒細(xì)胞響應(yīng)。這表明，CHIPS蛋白能夠在體內(nèi)找到它的目標(biāo)，即FPR^PC5aR。我們發(fā)現(xiàn)，CHIPS蛋白在血清中的半衰期約為1.5小時(shí)。此外，還觀察到在細(xì)胞表面結(jié)合于其受體的CHIPS具有相同的半衰期，表明其具有相同數(shù)量級(jí)的功能半衰期。這表明，CHIPS蛋白不是立即從血液中清除的。通過(guò)引入點(diǎn)突變有可能延長(zhǎng)CHIPS蛋白半衰期，例如已經(jīng)對(duì)鏈激酶所顯示的，其為一種在急性心肌梗死中用于溶栓的蛋白藥物(見(jiàn)mi等，1998，ApplEnvironMicrobiol64(3)=824-829)然而，1.5小時(shí)的半衰期意味著在停止給藥時(shí)任何(免疫抑制)效果都將迅速消失。這相對(duì)于以hfliximab為例的具有較長(zhǎng)半衰期的抗體藥物而言可以是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，所述具有較長(zhǎng)半衰期的抗體藥物與升高的感染發(fā)生率相關(guān)(見(jiàn)Listing等，2005，ArthritisRheum52(11):；3403_3412;Crum等，2005，Medicine(Baltimore)84(5):291-302)。實(shí)施例B-定向進(jìn)化CHIPS以生成具有降低的與人抗體的相互作用的功能性變體fiM金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(CHIPS)是結(jié)合并阻斷Cfe受體(CfeR)和甲酰化肽受體，從而抑制與炎癥相關(guān)的免疫細(xì)胞募集的蛋白質(zhì)。如果CHIPS與存在的人抗體具有較小的反應(yīng)性，則其應(yīng)可用作抗炎藥。因此，我們對(duì)CHIPS基因應(yīng)用了定向進(jìn)化和計(jì)算/理性設(shè)計(jì)，從而生成展示與人IgG較低相互作用但仍保留生物活性的新CHIPS變體。該優(yōu)化是以四個(gè)輪次進(jìn)行的一個(gè)輪次的隨機(jī)誘變以增加CHIPS基因的多樣性和三個(gè)輪次的通過(guò)FragmentINducedDiversity(FIND)的DNA重組。每個(gè)輪次通過(guò)噬菌體選擇和/或ELISA來(lái)篩選減少的與人IgG的相互作用和保留的C5aR結(jié)合。人抗CHIPSIgG的平均結(jié)合隨著每輪進(jìn)化而減少。對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化，通過(guò)理性設(shè)計(jì)，基于在定向進(jìn)化過(guò)程中鑒定的突變，導(dǎo)入新的氨基酸取代。最終，可鑒定出七個(gè)具有與人IgG較低相互作用并保留C5aR阻斷能力的CHIPS變體。背景介紹炎癥是組織對(duì)損傷或病原體感染的反應(yīng)。將免疫細(xì)胞和可溶性分子吸引至損害或感染位點(diǎn)起始愈合過(guò)程。盡管引起炎性應(yīng)答的能力對(duì)生存至關(guān)重要，但為了健康亦需要控制炎癥的能力?？寡姿幹荚谧钄嘌装Y中的關(guān)鍵事件以供治療具有過(guò)量或不受控的炎癥的疾病。此類(lèi)藥物的實(shí)例為批準(zhǔn)供治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的Remicade和Kineret。許多細(xì)菌發(fā)展出回避人免疫系統(tǒng)的策略，例如通過(guò)避免識(shí)別，或通過(guò)分泌中和免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗菌作用的蛋白質(zhì)。金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(CHIPS)是14.IkDa的蛋白質(zhì)，通過(guò)結(jié)合并阻斷Cfe受體(CfeR)和甲酰化肽受體，其為與炎癥相關(guān)的免疫細(xì)胞募集和活化的強(qiáng)力抑制劑(DeHaas等，2004；Postma等，2004)。如此，CHIPS是有望用于治療幾種炎性疾病例如膿毒癥(Rittirsch等，2008)或缺血-再灌注損傷和免疫復(fù)合物病(Heller等，1999)的抗炎蛋白。然而，多數(shù)個(gè)體具有一定效價(jià)的預(yù)先形成的對(duì)CHIPS具特異性的抗體(Wright等，2007)。這些抗體可中和CHIPS的功能或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，因此CHIPS分子可受益于進(jìn)行使其作為藥物在人循環(huán)中良好作用的優(yōu)化。定向進(jìn)化是已確立的供改進(jìn)蛋白質(zhì)的方法。其已用于改進(jìn)多種蛋白質(zhì)功能如穩(wěn)定性、活性或親和力(Johannes等，2006)。重要的是，對(duì)于蛋白質(zhì)療法的開(kāi)發(fā)，證明定向進(jìn)化對(duì)于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的治療潛力的蛋白質(zhì)變體是有用的工具auan等，200幻。所述定向進(jìn)化方法是特別有效的，因?yàn)槠洳⒉恍枰獙?duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的先驗(yàn)知識(shí)。替代使用效率低下并耗費(fèi)時(shí)間的基于定位誘變的方法，可進(jìn)行數(shù)輪基因重組和高通量篩選以鑒定改進(jìn)的變體。該過(guò)程可反復(fù)進(jìn)行，且有益的突變會(huì)累積，同時(shí)對(duì)所需性質(zhì)不需要的突變會(huì)被排除，如(Yuan等，2005)和(Zhao,2007)中所綜述。幾種用于定向進(jìn)化的不同方法已描述于文獻(xiàn)中；其中包括DNA改組(Stemmer，1994a；Stemmer,1994b)和StaggeredExtension過(guò)程(StEP)(Yuan等，2005；Zhao等，1998)。另一種稱(chēng)為FragmentINducedDiversity(FIND)的DNA重組技術(shù)之前已證明可用于優(yōu)化羧肽酶U的熱穩(wěn)定性(Knecht等，2006)和IL-I受體拮抗劑的活性(Dahlen等，2008)。盡管已成功地利用定向進(jìn)化鑒定新的和改善的蛋白質(zhì)變體，該類(lèi)型技術(shù)的限制是無(wú)法篩選蛋白質(zhì)的整個(gè)序列空間。然而，如果將定向進(jìn)化與計(jì)算工具和理性設(shè)計(jì)結(jié)合，可更有效地探索序列空間(Wong等，2007；Zhao,2007)。在本實(shí)施例中，將FIND.與CHIPS基因的理性/計(jì)算設(shè)計(jì)組合，旨在構(gòu)建與現(xiàn)存特異性人IgG具有較低相互作用的新的蛋白質(zhì)變體。改進(jìn)的CHIPS分子應(yīng)表征為與現(xiàn)存抗體的減少的反應(yīng)性，但仍保留對(duì)C5aR的活性。因此，與篩選減少的IgG相互作用的過(guò)程平行監(jiān)視受體結(jié)合。如此，我們能夠分離與人抗CHIPSIgG具有顯著減少的相互作用但仍保留C5aR阻斷活性的新CHIPS變體。材料和方法重組蛋白的克隆、表達(dá)和純化如前所述克隆、表達(dá)和純化了野生型(Wt)CHIPSw21(DeHaas等，2004)。具有截短C端的CHIPS(CHIPSΔC)長(zhǎng)為112個(gè)氨基酸，作為克隆的結(jié)果，具有兩個(gè)額外的無(wú)關(guān)氨基酸包含于表達(dá)蛋白的C末端(CHIPS'》。通過(guò)截短和定位誘變從編碼wt全長(zhǎng)CHIPSh21的基因構(gòu)建編碼CHIPS八(及其相應(yīng)單突變體1(6認(rèn)、1(694和1(10(^以及CHIPSΔΝ/C(CHIPS31_113)的基因。然后將這些CHIPS變體如上所述克隆和表達(dá)。將單突變體用于Haas等(Haas等，2005)的結(jié)構(gòu)分析，但還對(duì)抗CHIPSIgG結(jié)合進(jìn)行篩選，且突變體K61A、K69A和K100A顯示了減少的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。將選自該研究中的文庫(kù)的CHIPS變體以相同方式表達(dá)，但從包涵體純化(Gustafsson等，2009)或通過(guò)ExpresswayCell-FreeΕ.coliExpressionSystem(Invitrogen,Carlsbad,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行表達(dá)。文庫(kù)構(gòu)建隨機(jī)誘變?yōu)榱嗽谳喆?(參見(jiàn)圖14)中構(gòu)建CHIPS變體的不同文庫(kù)，使用兩種不同的隨機(jī)誘變方法以構(gòu)建總共四個(gè)文庫(kù)。如前所述進(jìn)行易錯(cuò)PCR(Leung等，1989)。構(gòu)建了一個(gè)具有高突變頻率的文庫(kù)(文庫(kù)1.1)和一個(gè)具有低突變頻率的文庫(kù)(文庫(kù)1.2)。使用引物(Fw:5’-TCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTTTACTTTTGAACCG-3，[SEQIDNO3]和Rev:5，_GCCTGCGGCCGCAGATCTACCATTAATTACATAAG-3，[SEQIDNO:4])在7.5mMMgCl2和0.64mMMnCl2存在下進(jìn)行了20個(gè)循環(huán)的PCR。添加2.5UAmpliTaqThermostableDNA聚合酶(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)，并使用如下程序進(jìn)行反應(yīng)94°C進(jìn)行5分鐘/(94°C進(jìn)行30秒/55°C進(jìn)行30秒/72°C進(jìn)行40秒)進(jìn)行20次并最終在72°C進(jìn)行10分鐘延伸。如生產(chǎn)商推薦使用GeneMorphII(Stratagene,LaJolla,CA)將IOpgDNA(CHIPSΔC和相應(yīng)的K61A、K69A和Κ100Α單突變體的混合物)用于設(shè)計(jì)低突變頻率文庫(kù)(文庫(kù)1.4)而將IngDNA用于更高突變頻率的文庫(kù)(文庫(kù)1.3)。PCR反應(yīng)包含如上所述的引物，而PCR程序?yàn)?5°C進(jìn)行2分鐘/(95°C進(jìn)行1分鐘/60°C進(jìn)行1分鐘和72°C進(jìn)行1分鐘)進(jìn)行40次并最終在72°C延伸10分鐘。為了增加Ing文庫(kù)中的突變頻率，對(duì)其進(jìn)行再一輪的GenemorphII誘變。此時(shí)，PCR反應(yīng)中DNA的量為10ng。在純化之后，將PCR產(chǎn)物根據(jù)生產(chǎn)商的推薦亞克隆入pGEM_T載體(!Iomega，Madison,WI)，并分析序列和評(píng)估堿基交換。FIND在輪次2至4進(jìn)行FIND重組以構(gòu)建重組克隆的不同文庫(kù)，如例如專(zhuān)利EP1341909和EP1504098中所述。簡(jiǎn)言之，通過(guò)使用一個(gè)生物素化的和一個(gè)常規(guī)的引物生成PCR產(chǎn)物來(lái)制備單鏈DNA。將所述PCR產(chǎn)物固定化于含有鏈霉抗生物素結(jié)合的磁性珠的柱上(MiltenyiBiotecGmbH,BergischGladbach,Germany)，并置于μMACS分離器的磁場(chǎng)中。將PCR產(chǎn)物用0.IMNaOH變性，并收集洗脫的非生物素化DNA鏈，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳使用Recochips(TakaraBioInc.，Shiga,Japan)依照生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行純化。FIND實(shí)驗(yàn)是通過(guò)分別對(duì)200ng有義和反義ssDNA在不同試管中在緩沖液中如生產(chǎn)商所推薦用外切核酸酶I(ExoI)(NewEnglandBiolabs,Ipswich,ΜΑ)(lOOU/μgDNA)片段化10分鐘，用外切核酸酶V(ExoV)(USB,Cleveland,OH)(25U/μgDNA)片段化45分鐘和用外切核酸酶VII(ExoVII)(USB)(10U/ygDNA)片段化30分鐘來(lái)起始。將從外切核酸酶消化所得的ssDNA片段在不添加引物的PCR樣反應(yīng)中重組，然后使用標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行擴(kuò)增。在純化之后，將PCR產(chǎn)物依照生產(chǎn)商的推薦亞克隆入pGEM-T載體(!Iomega)并分析序列。平板形式的蛋白質(zhì)表達(dá)將通過(guò)隨機(jī)誘變或FIND構(gòu)建的CHIPS文庫(kù)克隆入經(jīng)修飾的pRSETB載體(Invitrogen)的KdsI和BglII位點(diǎn)中以供在大腸桿菌中表達(dá)。將文庫(kù)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL2lstarDE3pLysS(Invitrogen)，鋪板于具有補(bǔ)充50μg/ml氨芐西林和34μg/ml氯霉素的LB瓊脂的20cmQtray板，并在37°C溫育過(guò)夜。翌日，使用菌落挑取機(jī)器人挑取大腸桿菌菌落并接種于含有150μ1補(bǔ)充有50μg/ml氨芐西林和34μg/ml氯霉素的LuriaBroth(LB)的96孔圓底板中。將培養(yǎng)物在37°C以78%濕度并在Multitron平板振蕩器(InforsHT,Bottmingen,Switzerland)中以700rpm振蕩溫育過(guò)夜。從過(guò)夜培養(yǎng)物通過(guò)1/100稀釋至具有50μg/ml氨芐西林的新鮮培養(yǎng)基來(lái)制備日間培養(yǎng)物(dayculture),并如上所述在37°C繼續(xù)溫育。為了誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，在三小時(shí)之后將0.5mMIPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)添加至培養(yǎng)物，然后再將培養(yǎng)物培養(yǎng)三小時(shí)。通過(guò)離心沉淀大腸桿菌培養(yǎng)物，并將沉淀在-20°C冷凍。通過(guò)在含完全不含EDTA的蛋白酶抑制劑(Roche，Basel,Switzerland)、25U/mlBenzonase(Sigma-Aldrich,StLouis,MO)禾口lKU/mlrLysozyme(EMDChemicals,Darmstadt,Germany)的PBS0.05%Tween20中凍融所述大腸桿菌沉淀來(lái)制備裂解液，并在室溫振蕩溫育10分鐘。定點(diǎn)誘變定點(diǎn)誘變是使用QuikChangeII誘變?cè)噭┖?Stratagene)依照生產(chǎn)商的推薦用攜帶特定突變的引物進(jìn)行的。驗(yàn)證新的CHIPS變體的序列，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL2IStar(DE3)pLysS(Invitrogen)以供蛋白質(zhì)表達(dá)。人抗CHIP31_113IgG的親和純化將純化的CHIPS3H13偶聯(lián)于經(jīng)CNBr活化的S印harose4B(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)，并依照生產(chǎn)商的指示裝填Tricon5/20柱(AmershamBiosciences)。親和純化是在AKTAPrime系統(tǒng)(AmershamBiosciences)上依照生產(chǎn)商的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行的。將總?cè)薎gG(Ig)(IV-IgG)(Sanquin,Amsterdam,TheNetherlands)在柱上運(yùn)行，然后用0.IM甘氨酸pH3.O洗脫結(jié)合的人IgG，并用IMTris,pH8.O中和pH。匯集含有蛋白質(zhì)的洗脫級(jí)分，并在PD-IO柱(AmershamBiosciences)上將緩沖液變?yōu)镻BS。噬菌體選擇將隨機(jī)誘變文庫(kù)和FIND文庫(kù)克隆入噬菌粒PFAB75(Johansen等，1995)的SfiI和NotI位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌T0P10F'(Invitrogen)以供在噬菌體顆粒上表達(dá)。依照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案使用VSCM13(Stratagene)作為輔助噬菌體(CicortasGunnarsson等，2004)制備噬菌體儲(chǔ)備。正選擇是對(duì)由氨基酸7-組成的具有硫酸化的酪氨酸的生物素化的C5aR肽(生物素_C5aR肽)(AnaSpec，SanJose,CA)在終濃度10_7M和鏈霉抗生物素包被的磁性Dynabeadanvitrogen)上進(jìn)行的。將所述混合物在室溫旋轉(zhuǎn)溫育1小時(shí)，然后在含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS0.05%Tween20(選擇緩沖液)中充分洗滌。肽結(jié)合劑的洗脫是用IM甘氨酸0.1%BSA，pH2.2進(jìn)行的，然后添加IMTrispH9.O以中和洗脫液。然后如上所述將該選擇方案重復(fù)一次。就在第二輪正選擇之后，對(duì)CHIPS噬菌體儲(chǔ)備進(jìn)行一輪對(duì)人抗CHIPSh113IgG結(jié)合的負(fù)選擇。將包被人抗CHIPSh113IgG的htapor0.83μm磁珠(Bangs-LaboratoriesInc.，F(xiàn)ishers，IN)在選擇緩沖液中洗滌三次，然后在選擇緩沖液中在室溫旋轉(zhuǎn)封閉1小時(shí)。將來(lái)自正選擇的洗脫液添加至珠，并將其在室溫溫育另外15分鐘。在磁體上分離之后，保存上清，并將其用于感染指數(shù)生長(zhǎng)中的大腸桿菌T0P10F'，并從該大腸桿菌純化噬菌粒。ELISA在整個(gè)研究中，將ELISA用于篩選并表征結(jié)合。將Maxisorb透明或白色96或384孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)在4°C用PBS中的特異性蛋白質(zhì)或抗體包被過(guò)夜。如果沒(méi)有不同的描述，溫育是以100或25μ1的體積在室溫進(jìn)行1小時(shí)，總是接著用PBS0.05%Tween20洗滌三次。使用SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate(Pierce,Rockford,IL)并測(cè)量發(fā)光。蛋白表達(dá)分析對(duì)于表達(dá)蛋白的量化，將板用3μg/ml識(shí)別CHIPS氨基酸的肽的單克隆抗CHIPS抗體2H7包被(Haas等，2004)。將板在含3%奶粉的PBS0.05%Tween20中封閉，洗滌，并用來(lái)自ACCHIPS變體的裂解液的稀釋來(lái)溫育。用3yg/ml多克隆兔抗CHIPSN-端IgG(通過(guò)用KLH偶聯(lián)的對(duì)應(yīng)于CHIPSN端氨基酸1_14的合成肽對(duì)兔免疫接種產(chǎn)生的IgG)和辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG(SouthernBiotech,Birmingham,AL)檢測(cè)結(jié)合?？笴HIPSIgG結(jié)合分析對(duì)于人抗CHIP^H13IgG對(duì)CHIPSΔC變體結(jié)合的檢測(cè)，將板用大腸桿菌裂解液如針對(duì)蛋白表達(dá)分析所述進(jìn)行包被、封閉和溫育。添加親和純化的人抗CHIPi^113IgG,并用山羊抗人IgGHRP(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)檢測(cè)結(jié)合。在最初篩選過(guò)程中，對(duì)CHIPS裂解液進(jìn)行單點(diǎn)測(cè)量，并將其與WtCHIPSh21的滴定曲線比較。將結(jié)果與來(lái)自表達(dá)ELISA的結(jié)果相關(guān)聯(lián)。在之后的篩選/表征中對(duì)有限數(shù)量的變體繪制完整的滴定曲線。肽結(jié)合分析為了測(cè)量CHIPS變體對(duì)C5aR肽的結(jié)合，包被了5μg/ml鏈霉抗生物素(Sigma-Aldrich)。此外，在洗滌并封閉板(PBS0.05%Tween20中的2%BSA)之后將生物素-C5aR肽(Anaspec)添加至0.3μg/ml的終濃度。然后用CHIPS裂解液溫育板，并用1μg/mlmAb2H7和HRP-結(jié)合的兔抗小鼠IgG(Dako，Glostrup,Denmark)進(jìn)行檢測(cè)。與CHIPSh21競(jìng)爭(zhēng)的抗CHIPSIgG結(jié)合分析將CHIPS變體的五倍稀釋系列在室溫在聚丙烯板(Nunc)中用60ng/ml親和純化的人抗CHIP&U多克隆IgG預(yù)溫育2小時(shí)。純化的wtCHIPSw21包被于ELISA板中。在用PBS-0.05%Tween-20中的4%BSA封閉之后，將IgG/CHPS變體混合物添加至板，并在室溫進(jìn)一步溫育2小時(shí)。用山羊抗人IgGHRP和鄰苯二胺二鹽酸鹽底物(OPD)進(jìn)行檢測(cè)。血清IgG結(jié)合分析在ELISA中對(duì)來(lái)自人匯集血清的IgG測(cè)試其與CHIPS變體的反應(yīng)性。將板用等摩爾量的蛋白質(zhì)或PBS包被。在含3%奶粉的PBS-0.05%Tween-20中封閉之后，添加系列稀釋的人血清。用兔抗人IgG-HRP(Dako)檢測(cè)結(jié)合于CHIPS變體的IgG。報(bào)道的IgG效價(jià)是通過(guò)將發(fā)光數(shù)據(jù)相對(duì)稀釋因子作圖接著在非線性曲線擬合模型中進(jìn)行分析來(lái)計(jì)算的。效價(jià)報(bào)道為達(dá)到截取值的血清稀釋因子。該截取值是通過(guò)包被野生型CHIPS1-121并分析IgG在不同稀釋度的匯集人血清中的結(jié)合來(lái)設(shè)定的。由稀釋1/40000的血清產(chǎn)生的信號(hào)設(shè)為截取值，這是因?yàn)樵谠撓♂尳Y(jié)合于CHIPS1-121的IgG顯示為位于結(jié)合曲線的動(dòng)態(tài)區(qū)間(dynamicinterval)0生物學(xué)測(cè)定對(duì)人C5aR的結(jié)合人嗜中性粒細(xì)胞是從獲得自LundUniversityHospital(Lund,Sweden)的血液棕黃層(buffycoat)制備的。將所述血液棕黃層用含2%新生小牛血清(NBQ(Lonza)的PBS進(jìn)行1/1(ν/ν)稀釋?zhuān)⑻砹谥罠icollPaqueplus(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)頂部。在以1000χg離心30分鐘之后將嗜中性粒細(xì)胞收集于PBS中。然后通過(guò)用冰冷H2O溫育30秒來(lái)裂解紅細(xì)胞，并添加4χPBS，并將懸液在4°C以600χg離心7分鐘。在含有2%NBS的PBS中收集嗜中性粒細(xì)胞，并將剩余的紅細(xì)胞通過(guò)用冰冷H2O溫育30秒來(lái)裂解，并添加4χPBS0嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)在4°C以1000χg離心5分鐘來(lái)收集。對(duì)人嗜中性粒細(xì)胞以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系U937/CfeR(來(lái)自E.Prossnitz博士(UniversityofNewMexico,Albuquerque,NM)慷慨的禮物)研究對(duì)人C5aR的結(jié)合。將細(xì)胞在75em2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中在5%CO2培養(yǎng)箱中在37°C培養(yǎng)，并維持于含L-谷氨酰胺(Lonza)和10%胎牛血清(FBS)(Lonza,Basel,Switzerland)的RPMI1640培養(yǎng)基中。對(duì)C5aR的結(jié)合以兩種方式通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)分析。在第一種方法中，將ACCHIPS變體(通過(guò)來(lái)自Invitrogen的ExpresswayCell-FreeΕ.coliExpressionSystem表達(dá))的稀釋系列與細(xì)胞一同溫育，并通過(guò)2H7單克隆抗CHIPS抗體繼以R-藻紅蛋白(RPE)標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako)來(lái)檢測(cè)CHIPS結(jié)合。在第二種方法中，將CHIPSAC變體與如上的細(xì)胞一同溫育，然后通過(guò)將單克隆抗C5aR抗體和RPE標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白添加至細(xì)胞來(lái)量化對(duì)結(jié)合的抑制程度。C5aR阻斷人嗜中性粒細(xì)胞中Cfe誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員是通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)研究的。將5X106/ml的嗜中性粒細(xì)胞用含有0.05%BSA的RPMI1640培養(yǎng)基中的2μMFluo-3AM(Sigma-Aldrich)在室溫(RT)溫育30分鐘，然后在含有0.05%BSA的RPMI1640中洗滌并重懸。然后將細(xì)胞用純化的CHIPS變體(重克隆為ΔΝ/C形式)的3倍稀釋系列在室溫預(yù)溫育30分鐘，并添加C5a(Sigma-Aldrich)(終濃度0.3nM)以誘導(dǎo)鈣釋放。這可通過(guò)在FACScalibur流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(BDBiosciences,SanJose,CA)上以熒光方式來(lái)測(cè)量。C5a誘導(dǎo)的人嗜中性粒細(xì)胞的遷移(趨化性)是在Transwe11系統(tǒng)(NeuroProbe,Gaithersburg,MD)中測(cè)量的。因此將5X106/ml人嗜中性粒細(xì)胞用4μMCalcein-AM(Sigma-Aldrich)標(biāo)記，在含1%人血清白蛋白(HSA)的Hank平衡鹽溶液(HBSS)中洗滌，并重懸于含HSA的HBSS中。將細(xì)胞進(jìn)一步在RT用一定效價(jià)的純化CHIPSΔΝ/C變體溫育15分鐘。將Cfe添加至孔的下室至終濃度為InM。將經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞添加至上室。將板在37°C，5%CO2溫育30分鐘。然后用PBS漂洗過(guò)濾器以去除未遷移的細(xì)胞，并以485nm的激發(fā)和530nm的發(fā)射在熒光平板讀數(shù)器中測(cè)量熒光。將數(shù)據(jù)用非線性回歸模型(S形劑量應(yīng)答曲線0-100，具有可變的斜率)擬合。通過(guò)圓二餼性(CD)光譜學(xué)下的熱變性在CHIPS變體的熱展開(kāi)過(guò)程中從4至85°C以1°C/分鐘的掃描率，16秒的應(yīng)答和Inm的帶寬監(jiān)視212nm處的CD信號(hào)。蛋白質(zhì)濃度為PBSpH7.2中的0.5mg/ml，并使用具有Imm光路長(zhǎng)度的石英小杯。為了調(diào)查可逆性，在向上掃描之后監(jiān)視從85至4°C的熱掃描。結(jié)構(gòu)變化是從每次熱掃描之前和之后在4或85°C的遠(yuǎn)UVCD光譜確定的。記錄250至190nm的光譜，掃描速率為20nm/分鐘，應(yīng)答為8秒而帶寬為lnm。所有的CD光譜學(xué)是在具有JASCOPTC-343Peltier型恒溫試池架(cellholder)的Jasco(JascoInc.,Easton,MD)J-720分光旋光計(jì)上進(jìn)行的。由于對(duì)于所有變體熱展開(kāi)是不可逆的，無(wú)法獲得熱力學(xué)穩(wěn)定性。然而，由于對(duì)于所有變體是以相同的速度監(jiān)視展開(kāi)，1提供了變體之間的比較性熱穩(wěn)定性。Tm是通過(guò)將方程1擬合至⑶數(shù)據(jù)獲得的。^Jk,,,T+bx^Ikl=jjπ,,,i^rJ(方程1)在方程1中，ε。bs是在212nm處觀察到的橢圓率，kN、bN、k和b分別限定天然和38展開(kāi)狀態(tài)的基線。A是擬合過(guò)程中的參數(shù)，但對(duì)于不可逆展開(kāi)無(wú)價(jià)值，T是以開(kāi)爾文計(jì)的溫度，而R為氣體常數(shù)。在該方程中，假定蛋白質(zhì)遵循兩個(gè)狀態(tài)的變性過(guò)程，并在該溫度區(qū)具有恒定的AC°P，從而使得變性遵循GilAs-Helmholtz方程。對(duì)于此種展開(kāi)，參數(shù)A為ΔΗ°.，而3000是AC°p的估計(jì)的量度，然而這些參數(shù)對(duì)于不可逆展開(kāi)不相關(guān)。分子津模建模是通過(guò)使用可獲得的CHIPS31_121匪R結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)1XEE)(Haas等，2005)和PyMol分子圖像程序(DeLano，2008)進(jìn)行的。結(jié)果用低IgG結(jié)合構(gòu)津CHIPS變體的策略對(duì)于抗CHIPSIgG相互作用減少但仍保留C5aR阻斷活性的進(jìn)化是在一輪隨機(jī)誘變和三輪FIND重組中，然后進(jìn)行計(jì)算分析和理性設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行的(圖14)。選擇之前顯示較不易結(jié)合人抗CHIPSIgG(數(shù)據(jù)未顯示)的在N端和C端均截短(CHIPSΔΝ/C)并包含單突變K61A、K69A和K100A的較短的CHIPS變體作為優(yōu)化過(guò)程的起始材料。維持CHIPS中的頭30個(gè)N端氨基酸作為識(shí)別序列(對(duì)其不進(jìn)行誘變或重組)以供在ELISA中捕獲抗體。然后將選定的克隆重新克隆入截短的(CHIPSΔΝ/C)形式，然后對(duì)生物活性進(jìn)行表征(C5aR抑制)。為了增加找到具有減少的IgG結(jié)合的新CHIPS變體的可能性，應(yīng)用幾種不同的ELISA以研究CHIPS和親和純化的抗CHIPS31_113IgG之間的相互作用。在ELISA中對(duì)于輪次1、3和4中的每個(gè)文庫(kù)進(jìn)行幾個(gè)篩選輪次。每輪的初始篩選是通過(guò)單點(diǎn)測(cè)量進(jìn)行的，而在后續(xù)輪次的篩選中進(jìn)行更加全面的測(cè)定，即對(duì)于每個(gè)選定的突變體繪制完整滴定曲線。此外，為了在選擇和篩選過(guò)程中保留新的CHIPS變體的生物功能性，持續(xù)監(jiān)視對(duì)具有硫酸化酪氨酸的C5aRN端氨基酸7-的肽的結(jié)合。C5aR的殘基10-18之前顯示為對(duì)CHIPS的結(jié)合域(Postma等，2005)。C5aR的酪氨酸11和14顯示為經(jīng)硫酸化，顯示其對(duì)于C5aR的Cfe依賴(lài)性活化至關(guān)重要(Farzan等，2001)。最近對(duì)于CHIPS結(jié)合于C5aRN端肽的研究著重于位置11和14的硫酸化酪氨酸對(duì)于CHIPS結(jié)合的作用，并顯示CHIPS以高親和力結(jié)合于C5aRN端的硫酸化肽(Ippel等，2009)。隨機(jī)誘變文庫(kù)和篩選通過(guò)隨機(jī)誘變將多樣性導(dǎo)入CHIPSAC序列。構(gòu)建了四個(gè)具有不同突變頻率的文庫(kù)(文庫(kù)的細(xì)節(jié)描述于表3)。對(duì)所有四個(gè)文庫(kù)進(jìn)行噬菌體選擇首先對(duì)于C5aR肽結(jié)合(正選擇)，然后對(duì)減少的抗CHIPSIgG結(jié)合進(jìn)行選擇(負(fù)選擇)。匯集來(lái)自負(fù)選擇的上清液，允許其感染大腸桿菌，并純化噬菌粒。將來(lái)自突變體匯集物的CHIPS編碼序列重新克隆入表達(dá)載體PRSETB,并隨后將360個(gè)CHIPS變體以板形式表達(dá)，并以ELISA篩選減少的抗-CHIPS31_113IgG結(jié)合(圖15A)?？寺★@示與wtCHIPS1^121相比平均70%的抗CHIPSh113IgG結(jié)合。最為改善的克隆顯示53%結(jié)合。對(duì)具有最低抗CHIP^h13IgG結(jié)合的64個(gè)克隆進(jìn)一步以ELISA分析其保留的C5aR肽結(jié)合。C5aR肽結(jié)合的平均值為相對(duì)于wtCHIPSw2180%的結(jié)合。選擇具有最高C5aR肽結(jié)合的30個(gè)克隆以供通過(guò)以ELISA繪制完整的滴定曲線來(lái)進(jìn)一步分析減少的抗CHIPS31_113IgG結(jié)合。最終，選擇具有顯著減少的抗CHIPS31_113IgG結(jié)合但仍保留C5aR肽結(jié)合的9個(gè)克隆用于通過(guò)Find的DNA重組。FIND文庫(kù)和篩詵FINDMKι兩個(gè)具有不同重組頻率(即不同交換數(shù))的文庫(kù)是從在隨機(jī)誘變步驟中選出的9個(gè)克隆(包含總共18個(gè)氨基酸取代)構(gòu)建的(表3)。文庫(kù)2.1通過(guò)FIND設(shè)計(jì)，其中將短的隨機(jī)化寡核苷酸添加至反應(yīng)。該寡核苷酸對(duì)應(yīng)于氨基酸100至112，且其添加是為了增加CHIPS的C末端的突變數(shù)。文庫(kù)2.2通過(guò)FIND在易錯(cuò)條件下設(shè)計(jì)以增加整個(gè)CHIPS序列中新突變數(shù)。對(duì)文庫(kù)進(jìn)行如上所述的噬菌體選擇，并匯集來(lái)自負(fù)選擇的上清液，并從大腸桿菌純化噬菌粒。使用DNA的這種匯集物作為第二輪FIND啲起始材料。FINDMK2在第二輪FIND中，構(gòu)建了一個(gè)文庫(kù)(文庫(kù)3.1)(參見(jiàn)表3)。將6.3XIO3個(gè)克隆以板形式表達(dá)，并以ELISA篩選與抗CHIPS31_113IgG和C5aR肽的兩種相互作用。對(duì)C5aR肽的平均結(jié)合是wtCHIPSh121結(jié)合的92%。選擇顯示對(duì)抗CHIPS31_113IgG的結(jié)合具有wtCHIPSw21最大70%和對(duì)C5aR肽的結(jié)合具有wtCHIPSw21至少80%的320個(gè)克隆以供第二輪對(duì)更低的抗CHIPS31_113IgG結(jié)合的ELISA篩選。通過(guò)一個(gè)單獨(dú)的ELISA中的分析來(lái)將應(yīng)答與表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)。改善最多的克隆顯示與wtCHIPSh21相比13%的抗CHIPSh113IgG結(jié)合，而這些克隆中的平均值為39%結(jié)合(圖15A)。其中，40個(gè)克隆與wtCHIPSh21相比顯示<40%的結(jié)合，然后對(duì)其進(jìn)一步以劑量依賴(lài)性設(shè)定以ELISA進(jìn)行分析。確定每個(gè)變體的EC5tl值(即介導(dǎo)最大結(jié)合一半的每個(gè)CHIPS變體的濃度)和平臺(tái)值，并將其與wtCHIPSh21W值比較。選擇相對(duì)于來(lái)自隨機(jī)誘變輪次的最佳克隆有所改善的12個(gè)克隆以供最后輪次的FIND重組。這些克隆在抗CHIPS31_113IgG結(jié)合中顯示高至至少2.4倍的EC5tl和wtCHIPSw21平臺(tái)值的最多。find輪次3在最終輪次的FIND’中構(gòu)建了兩個(gè)文庫(kù)。第一個(gè)文庫(kù)基于六個(gè)選定的呈現(xiàn)14個(gè)氨基酸改變的克隆(文庫(kù)4.1)，而第二個(gè)文庫(kù)是從在之前輪次的FIND中選擇的所有12個(gè)克隆(總計(jì)25個(gè)氨基酸改變)制備的(文庫(kù)4.2)。兩個(gè)文庫(kù)均是通過(guò)使用兩個(gè)重復(fù)輪次的FIND且其間并無(wú)任何選擇或篩選而設(shè)計(jì)的，與之前的文庫(kù)相比產(chǎn)生了更高頻率的重組克隆(92%)(表3)。將9.6XIO3個(gè)克隆以板形式表達(dá)，并以ELISA篩選減少的人抗CHIPh^13IgG結(jié)合。1000個(gè)克隆顯示W(wǎng)tCHIPSh121結(jié)合于抗CHIPSh113IgG的最大10%，并用ELISA進(jìn)一步分析C5aR肽結(jié)合。C5aR肽結(jié)合的平均值為wtCHIPS1^1結(jié)合的45%。選擇與wtCHIPS1^121相比顯示至少95%對(duì)C5aR肽的結(jié)合的96個(gè)克隆(圖15A)進(jìn)一步以ELISA分析減少的抗CHIPS31_113IgG結(jié)合和以流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析保留的C5aR結(jié)合。所述克隆與wtCHIPS1^121相比顯示平均7.的抗-CHIPSh113IgG結(jié)合。改善最多的克隆與wtCHIPSw2Jg比顯示2.5%的結(jié)合(圖15B)。該96個(gè)克隆的分布顯示于圖15C。在測(cè)序之后，鑒定了42個(gè)獨(dú)特的克隆。所有42個(gè)克隆在最后一輪篩選之后與wtCHIPSh21相比顯示<10%的對(duì)抗CHIPSh113IgG的結(jié)合。通過(guò)不含細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)這些克隆以改善蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，并通過(guò)ELISA和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)一步表征產(chǎn)物。在該徹底的表征過(guò)程中，少數(shù)克隆與在之前的篩選過(guò)程中所測(cè)量的相比顯示更高的針對(duì)抗CHIPS31^113IgG的結(jié)合，因此截取值設(shè)為13%而非之前的10。選擇對(duì)人C5aR顯示最高結(jié)合以及對(duì)抗CHIPS31_113IgG顯示低結(jié)合(<wtCHIPSh21的13%)的10個(gè)克隆以供進(jìn)一步誘變。這些克隆示于表5。分子津樽和理件設(shè)計(jì)為了更進(jìn)一步減少與抗CHIP^H13IgG的相互作用，通過(guò)定點(diǎn)誘變10個(gè)選定克隆中的四個(gè)，構(gòu)建了27個(gè)新的CHIPS變體(表5和表6)。通過(guò)將新突變導(dǎo)入這些特定克隆，呈現(xiàn)了所有在定向進(jìn)化中鑒定出的12個(gè)突變位置。該定點(diǎn)誘變是通過(guò)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的，其中特別著眼于在定向進(jìn)化過(guò)程中生成的突變氨基酸的結(jié)構(gòu)作用。對(duì)這些突變位置中的一些提出了新的取代，并將其加入相對(duì)于在定向進(jìn)化中生成的克隆的新組合中。CHIPS變體的表征首先通過(guò)ELISA分析突變體對(duì)C5aR肽的結(jié)合。選擇與所述肽顯示至少90%結(jié)合的克隆以供進(jìn)一步分析。在后續(xù)的用人嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在位置112為丙氨酸的克隆S3.09相對(duì)于在該位置為纈氨酸的相應(yīng)克隆(F3.08；wtCHIPSw21結(jié)合的84%)展示對(duì)C5aR的改善結(jié)合(wtCHIPS1^121結(jié)合的105)。就此原因，在多數(shù)選定的克隆中，在位置112將V112取代為丙氨酸。此外，將克隆重新克隆為ΔΝ/C形式，并隨后從包涵體如前所述(Gustafsson等，2009)通過(guò)大量洗滌包涵體、溶解、重新折疊(將蛋白質(zhì)溶液逐滴添加至PBS中)和凝膠過(guò)濾來(lái)加以純化。選擇在對(duì)U937/C5aR細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)驗(yàn)中顯示最高的C5aR阻斷活性(在Cfe刺激之后阻斷Ca2+釋放)的16個(gè)克隆以供進(jìn)一步表征。在對(duì)人嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)ELISA分析CHIPS對(duì)血清IgG的結(jié)合和通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析生物功能性(C5aR阻斷活性)之后，可最終選定7個(gè)克隆作為最有前途的候選(參見(jiàn)補(bǔ)充表III)。該選擇是基于下述標(biāo)準(zhǔn)血清IgG效價(jià)最高為2.3%，而C5aR阻斷活性(嗜中性粒細(xì)胞中)為對(duì)于wtCHIPSh21K觀察到的至少50%。將這些克隆通過(guò)研究對(duì)嗜中性粒細(xì)胞遷移(趨化性)的抑制和通過(guò)由CD光譜學(xué)確定Tm值來(lái)進(jìn)一步表征(表4)。溫度變性顯示所有克隆與CHIPSΔΝ/C相比具有高解鏈溫度。一些變體在低溫顯示小轉(zhuǎn)變而在高溫顯示大轉(zhuǎn)變，表明在低溫下的部分展開(kāi)。CHIPSΔN/C顯示可逆的展開(kāi)，而所有七個(gè)克隆顯示不可逆的熱展開(kāi)。這表明所述克隆在展開(kāi)狀態(tài)與wtCHIPSh21和CHIPSΔΝ/C相比具有更高的聚集傾向。所述七個(gè)克隆的理論P(yáng)l值在表6給出。這些值略高于wtCHIPSh21WPl(PI為9.36)，因此在低于9.36的pH，wtCHIPSw21和所述七個(gè)變體攜帶凈正電荷。圖17顯示了七個(gè)最佳克隆的序列比對(duì)。所述克隆包含每序列五至八個(gè)突變。三個(gè)突變位置位于α-螺旋，一個(gè)位于鏈和02鏈之間的環(huán)，兩個(gè)位于β2鏈和β3鏈之間的環(huán)，一個(gè)位于β鏈3，一個(gè)位于03和β4鏈之間的環(huán)，而兩個(gè)位于β鏈4。更具體而言，位置Κ40、D42、Ν77、Κ100、Nlll和G112在四個(gè)或更多克隆中與位置Κ50、Κ69、Κ92和Κ105的突變以不同方式組合突變。取代Ν77Υ、Ν111Κ和G112A在所述克隆中最常見(jiàn)，分別呈現(xiàn)于七個(gè)克隆中的六個(gè)。在所述七個(gè)克隆中，將一個(gè)變體(376)鑒定為最吸引人，并選為在后續(xù)研究中進(jìn)行進(jìn)一步表征。圖18顯示了克隆376表面圖，突變用綠色標(biāo)記。盡管該候選在所述七個(gè)最佳克隆中并不具有最低的IgG效價(jià)，但是其效價(jià)與wtCHIPSh2JH比降低了幾乎180倍。認(rèn)為該突變體高度保留阻斷C5aR信號(hào)傳導(dǎo)和抑制Cfe誘導(dǎo)的趨化性的能力更加重要。41討論盡管蛋白質(zhì)的某些特征可為藥物開(kāi)發(fā)所矚目，但是其他性質(zhì)可能需要改善以設(shè)計(jì)有前景的藥物候選。目前，有多種藥物(經(jīng)批準(zhǔn)或在臨床試驗(yàn)階段)通過(guò)使用蛋白質(zhì)工程改造而經(jīng)優(yōu)化。組織型纖溶酶原活化劑(t-PA)經(jīng)數(shù)次改進(jìn)以最終在血清中具有更長(zhǎng)半衰期以及對(duì)纖維蛋白的更高特異性(Keyt等，1994)。tPA的這種工程改造型式(TNKase)現(xiàn)已批準(zhǔn)用于治療急性心肌梗死。ANYARA是具有腫瘤特異性的超抗原偶聯(lián)抗體，目前處于臨床試驗(yàn)中。降低了超抗原葡萄球菌腸毒素A(SEA)的抗原性以使得ANYARA成為更具吸引力的抗腫瘤藥物候選(Erlandsson等，2003)。與設(shè)計(jì)完善的篩選方法組合，可利用定向進(jìn)化來(lái)改進(jìn)蛋白質(zhì)的幾乎所有特征，即改善的親和力，較高的效力或降低的免疫原性。然而，當(dāng)改善所需的特定性質(zhì)時(shí)，重要的是持續(xù)監(jiān)視該蛋白質(zhì)在所述特定性質(zhì)的優(yōu)化過(guò)程中亦可能改變的其他重要特征。在該研究中，我們得以將CHIPS變體和人IgG之間的相互作用減少至wtCHIPS1^121的僅0.5%，同時(shí)仍舊保持C5aR阻斷活性。這是通過(guò)在定向進(jìn)化和篩選的輪次中持續(xù)監(jiān)視C5aR結(jié)合從而確保該性質(zhì)在優(yōu)化過(guò)程中不致喪失而達(dá)成的。而且，為了增加找到具有減少的IgG結(jié)合的新CHIPS變體的可能性，在篩選輪次中應(yīng)用了幾種驗(yàn)證該性質(zhì)的方法。將定向進(jìn)化(隨機(jī)誘變和FIND:)與計(jì)算/理性設(shè)計(jì)組合使用以將CHIPS分子朝著與特定人IgG較低相互作用的方向改進(jìn)。首先通過(guò)隨機(jī)誘變將多樣性導(dǎo)入序列，然后順序進(jìn)行三輪FIND,每輪之后進(jìn)行選擇和/或篩選。無(wú)需對(duì)CHIPS中針對(duì)現(xiàn)存IgG的表位的先驗(yàn)知識(shí)，將在之前輪次中發(fā)現(xiàn)為有益的突變重組以形成新的CHIPS變體，并顯示IgG結(jié)合隨著每一輪次而減少。在最后一輪FIND之后，最佳的克隆展示對(duì)人抗CHIPS31_113IgG的結(jié)合減少至對(duì)wtCHIPSh21結(jié)合的僅2.5%。這是通過(guò)應(yīng)用定向進(jìn)化而取得的顯著的結(jié)合減少。然而，為了更進(jìn)一步減少結(jié)合，通過(guò)分子建模設(shè)計(jì)了定點(diǎn)誘變，并導(dǎo)入了其他突變。改善最多的最終克隆顯示了對(duì)于wtCHIPSh21觀察到的IgG結(jié)合的0.5%。這是通過(guò)分析在定向進(jìn)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其重要性的位置的結(jié)構(gòu)分布而達(dá)成的。在七個(gè)最佳克隆中突變的組合導(dǎo)致這些變體的獨(dú)特性質(zhì)。在調(diào)查不同突變殘基的貢獻(xiàn)的嘗試中，應(yīng)用了在最終七個(gè)克隆中最頻繁的突變位置D42、N77、mil和G112的結(jié)構(gòu)分析。D42是α-螺旋中的氨基酸，其表現(xiàn)對(duì)分子內(nèi)相互作用的重要性。取代為纈氨酸(V)潛在地破壞了D42和R46之間形成的H-H鍵。該變化可改變CHIPS分子的結(jié)構(gòu)，并還有可能改變IgG表位。在位置42導(dǎo)入疏水的纈氨酸表現(xiàn)為增加分子的穩(wěn)定性。更可能的是，該疏水性殘基良好地融入結(jié)構(gòu)內(nèi)部，并使疏水性核穩(wěn)定化，而這可能是為何其呈現(xiàn)于七個(gè)選定克隆的六個(gè)中的原因。然而，由于增加的疏水性，該突變可影響可逆性和展開(kāi)狀態(tài)中的聚集傾向。N77在所述克隆中的六個(gè)中突變?yōu)槔野彼?Y)，在一個(gè)克隆中突變?yōu)榻M氨酸(H)。其在β2-β3環(huán)中暴露，并可直接參與IgG結(jié)合。當(dāng)比較Ν77Υ和Ν77Η時(shí)，在該位置酪氨酸表現(xiàn)為與組氨酸相比增加穩(wěn)定性。另一方面，在該位置具有組氨酸的克隆376，與除了位置77為酪氨酸之外完全相同的克隆335相比，更好地保留了生物學(xué)功能(趨化性的抑制)。mil是β4中暴露的殘基。該位置當(dāng)取代為賴(lài)氨酸(K)時(shí)變得荷更多正電，這是顯著的表面變化，在所述七個(gè)克隆的六個(gè)中顯示為有益的。日4中的6112并不特別暴露。發(fā)現(xiàn)在該位置小氨基酸是有利的。如果大氨基酸如纈氨酸插入該位置，其可能與Μ93沖突(collide)，結(jié)果可能影響結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)將在定向進(jìn)化中選出的G112V突變改變?yōu)楸彼?A)在所有攜帶G112V突變的克隆中對(duì)于保留C5aR阻斷活性是有益的。有趣的是，七個(gè)最佳克隆中的三個(gè)(變體335、338和377)與定向進(jìn)化中發(fā)現(xiàn)的克隆是相同的，但在位置112用A取代了V。在七個(gè)最終克隆中，12個(gè)賴(lài)氨酸中的四個(gè)突變?yōu)榫彼?。在位?2和105精氨酸取代賴(lài)氨酸見(jiàn)于所述克隆中的三個(gè)，而在位置100的取代見(jiàn)于所述克隆中的四個(gè)。對(duì)于為何所述四個(gè)賴(lài)氨酸取代為精氨酸可有幾種解釋。從賴(lài)氨酸至精氨酸的取代可來(lái)自僅僅一個(gè)堿基變化，且精氨酸與賴(lài)氨酸具有多種類(lèi)似性質(zhì)，而數(shù)種其他可通過(guò)一個(gè)堿基變化而獲得的氨基酸與賴(lài)氨酸差異更大，因此更難融入所述蛋白質(zhì)的表面。精氨酸可穩(wěn)定該蛋白質(zhì)，并通常常見(jiàn)于結(jié)合表面。在所述CHIPS變體中，精氨酸可貢獻(xiàn)于保留C5aR結(jié)合。其他研究者已成功地應(yīng)用了將隨機(jī)誘變或定向進(jìn)化與計(jì)算/理性設(shè)計(jì)組合的方法(Buskirk等，2004)。舉例而言，可首先利用誘變以提供關(guān)于對(duì)于突變重要的殘基的信息。如此，可將誘變從隨機(jī)化的視角取而代之地導(dǎo)向基于理性的選擇(Lingen等，2002)。我們的結(jié)果闡明了通過(guò)使用定向進(jìn)化和計(jì)算/理性設(shè)計(jì)可有效地在細(xì)菌來(lái)源的蛋白質(zhì)中減少針對(duì)人IgG的表位?？贵w表位的去除在免疫學(xué)之內(nèi)的多個(gè)學(xué)科中具有相關(guān)性。在變態(tài)反應(yīng)研究中，去除IgE表位以構(gòu)建低變應(yīng)原性變應(yīng)原衍生物以用作候選疫苗(Linhart等，2008；Mothes-Luksch等，2008；Szalai等，2008；Vrtala等，2004)。該研究主要通過(guò)表位定位和后續(xù)的遺傳工程或通過(guò)設(shè)計(jì)嵌合蛋白或雜交分子進(jìn)行，但也有通過(guò)定向進(jìn)化構(gòu)建低變應(yīng)原的研究。在最近的研究(Gafvelin等，2007)中，通過(guò)對(duì)三個(gè)組2個(gè)螨變應(yīng)原基因進(jìn)行多基因重組的定向進(jìn)化生成了具有減少的IgE反應(yīng)性并保留T細(xì)胞反應(yīng)性的低變應(yīng)原候選。總而言之，通過(guò)使用定向進(jìn)化、計(jì)算分析和理性設(shè)計(jì)，我們更高程度地生成了與現(xiàn)存的特異性人IgG具有減少的相互作用而不影響CHIPS和C5aR之間相互作用的新CHIPS分子。該研究導(dǎo)致與wtCHIPSh21蛋白相比更適于治療用途的CHIPS變體，因其與現(xiàn)存人IgG形成復(fù)合物的傾向顯著降低，并由此更易耐受，并在功能上作為C5aR拮抗劑比wtCHIPSw21蛋白更為有效。在這些變體中，鑒定了一個(gè)具有令人意想不到的有利性質(zhì)的變體(376)。將該克隆命名為ADC-1004。參考文獻(xiàn)Buskirk,A.R.，Landrigan,A.和Liu,D.R.(2004)ChemBiol,11，1157-1163.CicortasGunnarsson,L.,NordbergKarIsson,Ε.,Albrekt,Α.S.,Andersson,Μ.,Hoist,0.andOhlin,Μ.(2004)ProteinEngDesSel，17，213-221.Dahlen，Ε.，等Q008)JImmunotoxicol，5，189-199.DeHaas,C.J.,Veldkamp,K.Ε.,Peschel,Α.,Weerkamp,F.,VanWamel,W.J.,Heezius,Ε.C.,Poppelier,Μ.J.,VanKessel,K.P.和VanStrijP,J.A.(2004)JExpMed,199,687-695.DeLano,W.L.(2008)ThePyMOLMolecularGraphicsSystem.DelanoScientificLLC,PaloAlto,CA.Erlandsson,E.，等(2003)JMolBiol，333，893-905.Farzan,Μ.,Schnitzler,C.Ε.,Vasilieva,N.,Leung,D.,Kuhn,J.,Gerard,C.,Gerard,N.P.和Choe，H.(2001)JExpMed，193，1059-1066.Gafvelin,G.,Parmley,S.,Neimert-Andersson,Τ.,Blank,U.,Eriksson,Τ.L.,vanHage,Μ.禾口Punnonen，J.(2007)JBiolChem，282，3778—3787.Gustafsson,Ε.,Forsberg,C.,Haraldsson,K.,Lindman,S.,Ljung,L.禾口Furebring,C.(2009)ProteinExprPurif63,95-101.Haas,P.J.,deHaas,C.J.,Kleibeuker,W.,Poppelier,M.J.,vanKessel,K.P.,Kruijtzer,J.A.,Liskamp,R.M.禾口vanStrijp,J.A.(2004)JImmunol，173，5704—5711.Haas,P.J.，等(2005)JMolBiol，353，859-872.Heller，T.，等(1999)JImmunol，163，985-994.Ippel,J.H.,deHaas,C.J.,Bunschoten,A.,vanStrijP,J.A.,Kruijtzer,J.A.,Liskamp，R.M.和Kemmink，J.(2009)JBiolChem.doi:10.1074/jbc.M808179200.Johannes,T.W.和Zhao，H.(2006)CurrOpinMicrobiol,9,261-267.Johansen,L.K.,Albrechtsen,B.,Andersen,H.W.禾口Engberg,J.(1995)ProteinEng，8，1063-1067.Keyt，B.A·，等(1994)ProcNatlAcadSciUSA，91，3670-3674.Knecht，W.，等(2006)FebsJ，273，778-792.Leung,D.W.,Chen,E.禾口Goeddel，D.V.(1989)Technique,11-15.Lingen,B.，Grotzinger,J.，Kolter,D.，Kula,Μ.R.禾口Pohl，Μ.(2002)ProteinEng,15,585-593.Linhart,B.,Mothes-Luksch,N.,Vrtala,S.,Kneidinger,Μ.,Valent,P.禾口Valenta,R.(2008)BiolChem,389，925-933.Mothes-Luksch，N.，等Q008)JImmunol，181，4864-4873.Postma,B.,Kleibeuker,W.,Poppelier,Μ.J.,Boonstra,Μ.,vanKessel,K.P.,vanStrijp,J.Α.和deHaas,C.J.(2005)JBiolChem.Postma,B.,Poppelier,M.J.,vanGalen,J.C.,Prossnitz,E.R.,vanStrijp,J.A.,deHaas,C.J.和vanKessel,K.P.(2004)JImmunol，172，6994—7001·Reetz,Μ.T.(2004)ProcNatlAcadSciUSA，101，5716-5722.Rittirsch,D.，等(2008)NatMed,14，551-557.Sneeden,J.禾口Loeb,L.(2003)Randomoligonucleotidemutagenesis.InArnold,F.andGeorgiou,G.(eds.),Directedevolutionlibrarycreation.Methodsandprotocols.HumanaPress,Totowa,NewJersey,Vol.231,pp.65-73.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1.權(quán)利要求38至40任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括在所得多肽中篩選相對(duì)于SEQIDNO1的多肽降低的免疫原性的步驟(f)。42.權(quán)利要求38至41任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)中所述的一種或多種親本多核苷酸分子為單鏈的。43.權(quán)利要求41至42任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)中所述的核酸酶為外切核酸酶。44.權(quán)利要求38至43任一項(xiàng)的方法，其中步驟(d)包括添加具有預(yù)定變異性的寡核苷酸。45.權(quán)利要求39至44任一項(xiàng)的方法，其中步驟(e)包括檢測(cè)所得多肽結(jié)合C5aR的能力。46.一種基本如本文說(shuō)明書(shū)所描述的多肽。47.一種基本如本文說(shuō)明書(shū)所描述的核酸分子。48.一種基本如本文說(shuō)明書(shū)所描述的載體。49.一種基本如本文說(shuō)明書(shū)所描述的宿主細(xì)胞。50.一種基本如本文說(shuō)明書(shū)所描述的產(chǎn)生多肽的方法。51.一種基本如本文說(shuō)明書(shū)所描述的藥理組合物。52.一種基本如本文說(shuō)明書(shū)所描述的多肽的用途。全文摘要本發(fā)明提供具有金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(‘CHIPS’)生物活性的多肽，該多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其具有CHIPS生物活性的片段或變體，或由SEQIDNO2的氨基酸序列或其具有CHIPS生物活性的片段或變體組成，其中所述片段或變體相對(duì)于SEQIDNO1的野生型CHIPS蛋白質(zhì)保留氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和/或G112A。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列組成。本發(fā)明的相關(guān)方面提供了包含本發(fā)明多肽的藥物組合物，及其制備和使用方法。文檔編號(hào)C07K14/31GK102348719SQ200980157916公開(kāi)日2012年2月8日申請(qǐng)日期2009年11月30日優(yōu)先權(quán)日2009年1月8日發(fā)明者克里斯蒂娜.富雷布林,卡林.哈拉爾德森,埃里卡.古斯塔夫森,安娜.羅森,比約恩.沃爾斯申請(qǐng)人:鱷魚(yú)生物科學(xué)公司