專利名稱：甲基化分析的通用方法
甲基化分析的通用方法在整個本申請中，各種參考的出版物都用括號注明資料來源。對于這些參考文獻 的完整出處可在說明書的最后，權(quán)利要求書之前找到。這些出版物的完整披露在此被作為 參考并于本申請，以便更加完整地描述與本發(fā)明有關(guān)的目前技術(shù)發(fā)展水平。
背景技術(shù)：
哺乳動物的基因組大約含有2千8百萬個CpG位點，其中的60%左右在胞嘧啶的 5-位上是甲基化的(Rollins et al.，2006)。CpG較多的啟動子的甲基化產(chǎn)生非常強烈的 轉(zhuǎn)錄阻遏(Stein et al.，1982，Lorincz et al.，2002)；啟動子甲基化基本上被限制在印 記基因，轉(zhuǎn)座子啟動子，和失活的X染色體上的CpG島(CpG islands)。許多實驗已經(jīng)證實 了在體細胞的許多細胞分裂(Wigler et al. ,1981 ；Lorincz et al. ,2002)以及許多植物 的有性繁殖(它們含有與脊椎動物類似的DNA甲基化系統(tǒng)，由Goll & Bestor在2005年綜 述)有自始自終可靠的甲基化模式的遺傳。這種遺傳性表明基因組的甲基化模式可能具有 許多生物的功能，已經(jīng)提出了許多這樣的功能。這些功能中最熟悉的有在發(fā)育過程中的基 因調(diào)控(Holliday & Pugh，1975 ；Rigga, 1975)。其他提出過的功能包括基因組穩(wěn)定性(Chen et al.，1998)，學(xué)習(xí)和記憶(Miller & Sweatt，2007 ；該宣稱引起了很大的爭論)，防御轉(zhuǎn)座 子(Yoder et al.，1997 ；Bestor，2003)，以及 X 染色體失活(Panning & Jaenisch, 1996) 盡管留有很多爭論，但是啟動子甲基化使轉(zhuǎn)錄沉默的能力以及基因組甲基化模式的遺傳性 還是得到大量的使人非相信不可的證據(jù)的支持。在三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferases)中任意一個的無效突變是隱性 的致死因子，DNMT3L的缺失造成男性不育和女性的母性效應(yīng)致死率(maternal effect lethality infemales)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中的基因DMNT3B的突變造成ICF綜合癥，它的特 征是聯(lián)合免疫缺陷，往往在童年期是致命的，染色體1，9，和16的著絲粒非常不穩(wěn)定，輕微 但典型的臉部異常(Xu et al.，1999)。突變型鼠的部分脫甲基化或過度甲基化導(dǎo)致印記基 因的不正常表達伴隨早期致死率(Biniszkiewicz 2002 ；Yamade et al.，2005)。盡管哺乳 動物基因組的正常功能明顯依賴于基因組的甲基化模式，但是，由于缺少整個基因組甲基 化分析(methylation profiling)的方法，在人類疾病中發(fā)現(xiàn)的基因組甲基化模式的異常 已經(jīng)難以辨別。發(fā)明綜述提供了一種化合物，它具有這樣的結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1. 一種化合物，它具有這樣的結(jié)構(gòu) ,
2.如權(quán)利要求第1項所述的化合物，其特征在于該式中的R為
3. 一種組合物，它包含具有這樣結(jié)構(gòu)的化合物
4 其特征在于式中的R為
5.如權(quán)利要求第3或第4項所述的組合物，其特征在于該CpG甲基轉(zhuǎn)移酶為Sssl甲基 轉(zhuǎn)移酶。
6.一種制備雙鏈DNA衍生物的方法，它包含使該雙鏈DNA與CpG甲基轉(zhuǎn)移酶和具有這 樣結(jié)構(gòu)的S-腺苷甲硫氨酸類似物接觸
7.如權(quán)利要求第6項所述的方法，其特征在于該化學(xué)基團具有結(jié)構(gòu)
8.如權(quán)利要求第6或第7項所述的方法，其特征在于該化學(xué)基團具有結(jié)構(gòu)
9.如權(quán)利要求第6，7或第8項所述的方法，其特征在于該CpG甲基轉(zhuǎn)移酶為Sssl甲基 轉(zhuǎn)移酶。
10.如權(quán)利要求第6，7，8或第9項任意一項所述的方法，其特征在于當(dāng)該能被該CpG甲 基轉(zhuǎn)移酶從S-腺苷甲硫氨酸類似物上轉(zhuǎn)移到該雙鏈DNA的未甲基化的胞嘧啶的5-碳原子 上的化學(xué)基團共價地結(jié)合在該雙鏈DNA的未甲基化的胞嘧啶的5-碳原子上時，允許該未甲 基化的胞嘧啶的4-位上發(fā)生氧化脫氨基反應(yīng)。
11.如權(quán)利要求第6，7，8或第9項任意一項所述的方法，其特征在于該未甲基化的胞嘧 啶按序直接與該雙鏈DNA的單鏈中的鳥嘌呤鄰接。
12.一種測定存在于一雙鏈DNA已知序列中的胞嘧啶是否是未甲基化的方法，它包括 a)通過使該雙鏈DNA與CpG甲基轉(zhuǎn)移酶和具有這樣結(jié)構(gòu)的s_腺苷甲硫氨酸類似物接觸來制備該雙鏈DNA衍生物
13.如權(quán)利要求第12項所述的方法，其特征在于該化學(xué)基團具有結(jié)構(gòu)
14.如權(quán)利要求第12或第13項所述的方法，其特征在于該化學(xué)基團具有結(jié)構(gòu)
15.如權(quán)利要求第12，13或第14項所述的方法，其特征在于該CpG甲基轉(zhuǎn)移酶為Sssl 甲基轉(zhuǎn)移酶。
16.如權(quán)利要求第12，13，14或第15項任意一項所述的方法，其特征在于該未甲基化的 胞嘧啶按序直接與該雙鏈DNA的單鏈中的鳥嘌呤鄰接。
17.如權(quán)利要求第12，13，14，15或第16項任意一項所述的方法，其特征在于當(dāng)該能被 該CpG甲基轉(zhuǎn)移酶從S-腺苷甲硫氨酸類似物上轉(zhuǎn)移到該雙鏈DNA的未甲基化的胞嘧啶的 5-碳原子上的化學(xué)基團共價地結(jié)合在該雙鏈DNA的未甲基化的胞嘧啶的5-碳原子上時，允 許該未甲基化的胞嘧啶的4-位上發(fā)生氧化脫氨基反應(yīng)。
18.如權(quán)利要求第12，13，14，15，16或第17項任意一項所述的方法，其特征在于，在該 步驟c)中的測序是通過合成來測序。
19.如權(quán)利要求第18項所述的方法，其特征在于，通過合成測序包括使衍生的單鏈與 DNA聚合酶，引物寡核苷酸，dATP，dCTP，dTTP，以及與結(jié)合有可探測標記的三磷酸雙脫氧核 苷酸接觸。
20.如權(quán)利要求第19項所述的方法，其特征在于該可探測標記是有放射性的或者有熒 光的。
21.如權(quán)利要求第19項所述的方法，其特征在于該可探測標記是一種mass標記物。
22.如權(quán)利要求第12-21項的任意一項所述的方法，該方法還包括將該單鏈在進行步 驟c)之前與固體載體相結(jié)合。
23.一種衍生的DNA分子，其特征在于，該衍生的DNA分子與DNA的區(qū)別在于它包含一 種核苷酸殘基，該核苷酸殘基包含具有如下結(jié)構(gòu)的堿基
24. 一種衍生的DNA分子，其特征在于，該衍生的DNA分子與DNA的區(qū)別在于它包含-種核苷酸殘基，該核苷酸殘基包含具有如下結(jié)構(gòu)的堿基
25. 一種化合物，它具有這樣的結(jié)構(gòu)
26.如權(quán)利要求第25項所述的化合物，其特征在于該式中的R為
27. 一種制備雙鏈DNA衍生物的方法，它包含使該雙鏈DNA與CpG甲基轉(zhuǎn)移酶和具有這 樣結(jié)構(gòu)的S-腺苷甲硫氨酸類似物接觸
28.如權(quán)利要求第27項所述的方法，其特征在于該化學(xué)基團具有的結(jié)構(gòu)為
29.如權(quán)利要求第28項所述的方法，其特征在于該CpG甲基轉(zhuǎn)移酶為Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶。
30.一種測定存在于已知序列的雙鏈DNA序列中的胞嘧啶是否是未甲基化的方法，它 包括a)通過使該雙鏈DNA與CpG甲基轉(zhuǎn)移酶和具有這樣結(jié)構(gòu)的s_腺苷甲硫氨酸類似物接 觸來制備該雙鏈DNA衍生物
31.如權(quán)利要求第30項所述的方法，其特征在于該化學(xué)基團具有的結(jié)構(gòu)為
32.如權(quán)利要求第30或第31項所述的方法，其特征在于該CpG甲基轉(zhuǎn)移酶為Sssl甲 基轉(zhuǎn)移酶。
33.如權(quán)利要求第30，31，或第32項所述的方法，其特征在于，在其步驟c)中的測序是 通過合成來測序。
34.如權(quán)利要求第33項所述的方法，其特征在于，通過合成的測序包括使衍生的單鏈 與DNA聚合酶，引物寡核苷酸，dATP，dCTP，dTTP，新堿基y或新堿基Y’以及結(jié)合有可探測標記的三磷酸雙脫氧核苷酸接觸。
35.如權(quán)利要求第34項所述的方法，其特征在于該可探測標記是有放射性的或者有熒 光的。
36.如權(quán)利要求第34項所述的方法，其特征在于該可探測標記是一種mass標記物。
37.如權(quán)利要求第30-36項的任意一項所述的方法，該方法還包括將該單鏈在進行步 驟c)之前與固體載體相結(jié)合。
38.一種使雙鏈DNA分子衍生的試劑盒，它包括 a) 一種化合物，它具有這樣的結(jié)構(gòu)
39.如權(quán)利要求第38項所述的試劑盒，其特征在于該CpG甲基轉(zhuǎn)移酶為Sssl甲基轉(zhuǎn)移
40.一種包含用于Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶的輔助因子的試劑盒，它包含 a) 一種化合物，它具有這樣的結(jié)構(gòu)
41. 一種化合物，具有這樣的結(jié)構(gòu)
全文摘要
本發(fā)明提供了衍生雙鏈DNA的方法，包括使雙鏈DNA與CpG甲基轉(zhuǎn)移酶和S-腺苷甲硫氨酸類似物接觸。本發(fā)明也提供了對DNA測序來確定甲基化模式的方法。本發(fā)明還提供了新堿基以及利用新堿基對甲基化模式進行測序的方法。
文檔編號C07H19/16GK102105483SQ200980129203
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日
發(fā)明者曉旭·李, 約翰·R·愛德華茲, 蒂莫西·H·貝斯托, 靜月·居 申請人:紐約哥倫比亞大學(xué)理事會