專利名稱：一種對蝦msap技術(shù)分析體系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子標記的建立方法，具體地說，涉及到中國對蝦基因組DNA甲基化分析方法，一種對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，是基因組DNA在轉(zhuǎn)錄水平上進行調(diào)控的一種修飾方式，它參與了基因表達、生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答等過程，在基因表達的調(diào)控中具有重要作用。對基因組甲基化進行研究最常用的技術(shù)是甲基敏感擴增多態(tài)性技術(shù)(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP),該方法是利用識別5 ‘-CCGG序列的同裂酶取a II和I對基因組DNA甲基化敏感性不同，相同序列可以擴增出不同的譜帶，來檢測甲基化水平以及有效區(qū)分出基因組DNA的甲基化狀態(tài)。中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)是我國海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè),但自1993年對蝦病毒性疾病暴發(fā)以來，對蝦的病害問題直接影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，其中主要原因之一是養(yǎng)殖環(huán)境的惡化降低了中國對蝦的適應(yīng)性，養(yǎng)殖產(chǎn)量下降。近年來對中國對蝦分子生物學方面的研究大多集中在群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及免疫相關(guān)功能基因的克隆等方面，與其適應(yīng)性密切相關(guān)的DNA甲基化表觀遺傳變異尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對相關(guān)技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種適用于中國對蝦基因組DNA甲基化分析的MSAP技術(shù)體系，為研究中國對蝦基因組DNA甲基化表觀遺傳適應(yīng)機制提供依據(jù)，以解決無法通過DNA甲基化來研究中國對蝦的適應(yīng)性的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，包括如下步驟(I)首先提取對蝦基因組DNA，并稀釋備用；(2)建立雙酶切反應(yīng)體系和連接反應(yīng)體系；(3)建立預(yù)擴增反應(yīng)體系和預(yù)擴反應(yīng)程序；(4)建立選擴反應(yīng)體系和反應(yīng)程序；(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染。其中，步驟(I)中提取的是中國對蝦基因組DNA，稀釋成200ng/^L，并在_20°C保存待用。其中，步驟(2)中，雙酶切反應(yīng)體系的總體積為20μ ，包括DNA模板200ng，Hpa IIiMsp I 7. 5U, EcoR I 7. 5 U, IOXbuffer 2μ ，加 ddH20 至 20μ ，37°C 8h ;連接反應(yīng)體系為25 PL，包括酶切產(chǎn)物5 PL，50pmol的HM接頭和5pmol EcoR I接頭，2. 5U T4 DNA連接酶，16。。12h。其中，所述步驟(3)中，預(yù)擴反應(yīng)體系為20μ ，包括預(yù)擴引物各20pmol，Taq DNA酶IU，dNTPs 4 pmol, IOX Taq buffer (含 Mg2+33pmol) 2. 2 μ ，稀釋 10 倍的連接產(chǎn)物 Iμ ,加 ddH20 至 20μ ;預(yù)擴反應(yīng)程序94°C 30s,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min，10 個循環(huán)，60°C 30mim，4°C保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?，所述步驟(4)中，選擴反應(yīng)體系為20 μ ，包括選擴引物各30pmol，Taq DNA酶 1U，dNTPs 4 pmol, IOX Taq buffer (含 Mg2+30pmol) 2. OML，稀釋 10 倍的預(yù)擴產(chǎn)物5 ML，加ddH20至20ML ;選擴反應(yīng)程序為94°C 30s，94°C 30s，65°C (每循環(huán)降低0. 7°C )30s, 72°C 102min, 10 個循環(huán)，72°C 10min,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min,60°C 30min,
20個循環(huán)，4°C保存待用。其中，所述步驟(5)中，選擴產(chǎn)物與甲酰胺變性上樣液以2:1的比例混合，94°C變性5min，冰浴lOmin，采用65W恒功率進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳2h，銀染。甲酰胺變性液的配方在《分子克隆試驗指南》中有其詳細配置方法。其中銀染的方法(1)固定2L 1%的冰醋酸Ih ; (2)漂洗1. 5L ddH20漂洗兩次，每次2min;(3)染色I. 5L銀染液，0. 5_lh，銀染液組成I. 5gAgN03+2. 25L37 %甲醒 +315mL10mg/mLNa2S2O3 +1. 5LddH20 ； (4)顯影1. 5L 顯影液，3_5min,顯影液組成7. 5gNa0H+2. 25L 37% 甲醛 +1. 5L ddH20 ；(5)固定1L ddH20 5min。
本發(fā)明的MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，首先提取中國對蝦基因組DNA，并稀釋備用；然后對酶量、酶切時間、預(yù)擴增模板濃度、選擇性擴增模板濃度進行優(yōu)化篩選，確定預(yù)擴和選擴的反應(yīng)體系進行PCR擴增；擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染獲得所需條帶。本發(fā)明以中國對蝦為材料，通過對酶切時間、預(yù)擴和選擴的稀釋倍數(shù)等參數(shù)的優(yōu)化，建立并優(yōu)化MSAP分析體系，為研究中國對蝦基因組DNA甲基化表觀遺傳適應(yīng)機制提供依據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是
I、MSAP技術(shù)具有多態(tài)性高、引物設(shè)計簡單、成本低廉、甲基化位點明確、無需預(yù)先知道所分析DNA序列的優(yōu)點，即可對全基因組范圍內(nèi)的甲基化程度進行解析。2、本發(fā)明主要用于中國對蝦種質(zhì)資源鑒定、基因表達調(diào)控以及遺傳標記。


圖I是對蝦MSAP技術(shù)擴增結(jié)果；
其中H1-H3是采用功雙酶切的結(jié)果，M1-M3是采用#sp 1/EcoR I雙酶切的結(jié)果；A、B為不同的甲基化位點。
具體實施例方式下面通過實施例詳細敘述本發(fā)明的技術(shù)方法首先提取中國對蝦基因組DNA，并稀釋備用；然后對酶量、酶切時間、預(yù)擴增模板濃度、選擇性擴增模板濃度進行優(yōu)化篩選，確定預(yù)擴和選擴的反應(yīng)體系進行PCR擴增；擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染獲得所需的條帶。(I)中國對蝦基因組DNA的提取。肌肉DNA的提取采用傳統(tǒng)的飽和酚氯仿法，選擇純度0D260/0D280在I. 8 I. 9之間的DNA樣品定量，并稀釋成濃度為200ng/ML，_20°C保存待用。(2)基因組DNA酶切。為確定最佳的雙酶切量和酶切時間，功Il/EcoRl和1/EcoR I的雙酶切量分別設(shè)定為5、7. 5和10 U，雙酶切時間分別設(shè)定為6、8和10h。最后確定酶切反應(yīng)體系為 20μ ，功II 或#577 I HEcoR I 7. 5 U, IOXbuffer 2μ ，加 ddH20至20μ ，37°C 8h ;連接反應(yīng)體系為25 μ ,包括酶切產(chǎn)物5 μ , 50pmol的HM接頭和5pmolEcoR I 接頭，2. 5U T4 DNA 酶，16°C連接 12h。(3)預(yù)擴反應(yīng)體系和程序。將連接產(chǎn)物分別稀釋10、20和30倍各取WL，緩沖Buffer分別設(shè)定為I. 6、I. 8、2. 0,2. 2和2. 4 μ 進行反應(yīng)體系的優(yōu)化，最后確定預(yù)擴反應(yīng)體系為 20μ ，包括預(yù)擴引物各 20pmol，Taq DNA 酶 IU，dNTPs 4 pmol, IOX Taq buffer(含Mg2+33pmol) 2.2 μ ，稀釋10倍的連接產(chǎn)物I μ ，加ddH20至20μ ;預(yù)擴反應(yīng)程序940C 30s,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min，10 個循環(huán)，6(TC 30mim。(4)選擴反應(yīng)體系和程序。將預(yù)擴產(chǎn)物分別稀釋10、20和30倍取5μ ，反應(yīng)程序循環(huán)數(shù)設(shè)定在10，20到14，24之間進行優(yōu)化。確定選擴反應(yīng)體系為20 μ ，包括選擴引物各30pmol, Taq DNA 酶 IU，dNTPs 4 pmol, IOX Taq buffer (含 Mg2+30pmol) 2. 0M-L,稀釋10倍的預(yù)擴產(chǎn)物5 μ ，加ddH20至20μ ;選擴反應(yīng)程序為94°C 30s，94°C 30s, 65°C (每循環(huán)降低 0.7°C) 30s, 72°C 102min, 10 個循環(huán)，72°C 10min，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C2min，60°C 30min，20 個循環(huán)。(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染。選擴反應(yīng)結(jié)束后將在6%聚丙烯酰胺凝膠中電泳2h，功率為65W。將膠板進行銀染:(I)固定2L 1%的冰醋酸Ih ; (2)漂洗1. 5L ddH20漂洗兩次，每次 2min ；(3)染色1. 5L 銀染液(I. 5gAgN03+2. 25L37% 甲醛+315mL10mg/mLNa2S203+1. 5LddH20) O. 5-lh ; (4)顯影1. 5L 顯影液(7. 5gNa0H+2. 25L 37% 甲醛+1.5L ddH20)3_5min ; (5)固定IL ddH20 5 min。通過附圖I中的對蝦MSAP技術(shù)擴增結(jié)果，可以看出利用本發(fā)明進行中國對蝦DNA甲基化分析可以獲得的擴增條帶數(shù)多、多態(tài)性豐富，染色結(jié)果清晰、分辨率高、可重復(fù)性強，在不需要預(yù)知被測DNA序列信息的情況下，便可在全基因組范圍檢測DNA甲基化情況，在中 國對蝦遺傳育種和基因組研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，其特征在于包括如下步驟(1)首先提取對蝦基因組DNA，并稀釋備用；(2)建立雙酶切反應(yīng)體系和連接反應(yīng)體系；(3)建立預(yù)擴增反應(yīng)體系和預(yù)擴反應(yīng)程序；(4)建立選擴反應(yīng)體系和反應(yīng)程序；(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后獲得所需條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，其特征在于所述步驟(1)中提取的是中國對蝦基因組DNA，稀釋成200ng/ML，并在_20°C保存待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，其特征在于所述步驟(2)中，雙酶切反應(yīng)體系的總體積為20ML，包括DNA模板200ng，取all或#印17. 5U，EcoRl7.5 U, IOXbuffer 2ML，加ddH20至20ML，37°C 8h ;連接反應(yīng)體系為25 ML，包括酶切產(chǎn)物5ML，50pmol 的 HM 接頭和 5pmol EcoRl 接頭，2. 5U T4 DNA 連接酶，16°C，12h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，其特征在于所述步驟(3)中，預(yù)擴增反應(yīng)體系為20ML，包括預(yù)擴引物各20pmol，TaqDNA酶1U，dNTPs 4 pmol，IOX Taq buffer 2. 2 ML，稀釋10倍的連接產(chǎn)物1ML，加ddH20至20ML ;預(yù)擴反應(yīng)程序為940C 30s,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min，10 個循環(huán)，6(TC 30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，其特征在于所述步驟(4)中，選擴反應(yīng)體系為20ML，包括選擴引物各30pmol，Taq DNA酶1U，dNTPs 4 pmol,IOX Taq buffer (含 Mg2+30pmol) 2. 0ML，稀釋 10 倍的預(yù)擴產(chǎn)物 5 ML，加 ddH20 至 20ML ；選擴反應(yīng)程序為94°C 30s，94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 102min, 10 個循環(huán)，72°C IOmin,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min,60°C 30min，20 個循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，其特征在于所述步驟(5)中，選擴產(chǎn)物與甲酰胺變性上樣液以2:1的比例混合，94°C5min，冰浴lOmin，采用65W恒功率進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳2h，銀染。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，其特征在于所述銀染的方法(I)固定2L 1%的冰醋酸Ih ; (2)漂洗1. 5L ddH20漂洗兩次，每次2min ；(3)染色1. 5L 銀染液，0. 5-lh，銀染液組成1. 5gAgN03+2. 25L37% 甲醛 +315mLIOmgAiLNa2S2O3+1. 5LddH20 ;⑷顯影1. 5L 顯影液，3-5min，顯影液組成:7. 5gNa0H+2. 25L 37% 甲醛+1. 5LddH20 ； (5)固定1L ddH20 5min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對蝦MSAP技術(shù)分析體系的建立方法，(1)首先提取對蝦基因組DNA，并稀釋備用；(2)建立雙酶切反應(yīng)體系和連接反應(yīng)體系；(3)建立預(yù)擴增反應(yīng)體系和預(yù)擴反應(yīng)程序；(4)建立選擴反應(yīng)體系和反應(yīng)程序；(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后獲得所需條帶，上述方法為研究中國對蝦基因組DNA甲基化表觀遺傳適應(yīng)機制提供依據(jù)，可以解決無法通過DNA甲基化來研究中國對蝦的適應(yīng)性的問題。本發(fā)明適用于中國對蝦種質(zhì)資源鑒定、基因表達調(diào)控及遺傳標記，具有多態(tài)性高、成本低廉、甲基化位點明確的優(yōu)點，在無需預(yù)先知道DNA序列條件下，便可對全基因組范圍內(nèi)的甲基化程度進行解析。
文檔編號C12Q1/68GK102747160SQ20121024894
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者何玉英, 李健, 杜盈, 王清印 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所