專利名稱：分離無細(xì)胞凋亡或胎兒核酸的方法
分離無細(xì)胞凋亡或胎兒核酸的方法
背景技術(shù)：
在懷孕期間通常進(jìn)行產(chǎn)前檢查或篩查以確定胎兒的性別或檢測胎兒的遺傳病 和/或染色體異常。到現(xiàn)在為止，已經(jīng)認(rèn)識到了由一種或多種缺陷基因引起的超過4000 種遺傳病。一些例子包括囊性纖維化(Cystic Fibrosis)、亨廷頓病(Huntington，s Disease)、0地中海貧血(Beta Thalassaemia)、強直性肌營養(yǎng)不良(Myotonic Dystrophy)、鐮狀細(xì)胞貧血(Sickle Cell Anemia)、卟啉癥(Porphyria)和脆性X染色 體綜合征(Fragile-X-Syndrome)。染色體異常是由染色體數(shù)量的畸變、染色體材料的 復(fù)制或缺失，以及由染色體結(jié)構(gòu)的缺陷引起的。染色體異常的例子有三體性，例如16三 體性(trisomy 16)，妊娠前三個月引起流產(chǎn)的主要原因，21三體性(trisomy 21)(唐氏 綜合征(Down syndrome))、13 三體性(trisomy 13)(中白陶綜合征(Patau syndrome)) > 18三體性(trisomy 18)(愛德華茲綜合征(Edwards syndrome))；克萊恩費爾特綜合 征(Klinefelter，s syndrome) (47，XXY)、(47，XYY)和(47，XXX)；染色體的缺失(單體 性(monosomy))，例如特納綜合征(Turner syndrome) (45，X0)；染色體的異位、缺失和/ 或微缺失(microdeletion)，例如羅伯遜易位(Robertsonian translocation)、安格爾 曼綜合征(Angelman syndrome)、迪喬治綜合征(DiGeorge syndrome)禾口沃-希綜合征 (Wo1f-Hirschhorn Syndrome)。目前可用的產(chǎn)前遺傳檢查通常涉及侵入性操作。例如，對妊娠10-12周左右的孕 婦進(jìn)行的絨毛膜絨毛取樣(CVS)和在14-16周左右進(jìn)行的羊膜腔穿刺術(shù)都包括侵入性操作 以獲得樣品供檢查胎兒染色體異常用。通常使用細(xì)胞遺傳學(xué)或熒光原位雜交(FISH)分析 來檢查通過這些取樣操作獲得的胎兒細(xì)胞的染色體異常。盡管這些操作對于檢測染色體異?？赡苁怯杏玫模湟呀?jīng)顯示了與流產(chǎn)的風(fēng)險 有關(guān)。因此羊膜穿刺術(shù)或CVS僅提供給感覺存在增加的風(fēng)險的婦女，包括那些高齡產(chǎn)婦 (those of advanced maternal age) (> 35歲)、那些母體血清篩查異常的婦女或那些以 前有過胎兒染色體異常的婦女。這些檢查的結(jié)果是使得年齡超過35歲的婦女生出染色體 異常(如唐氏綜合征)的嬰兒的百分比顯著降低。然而，缺乏用于大多數(shù)孕婦的適當(dāng)?shù)幕?相對安全的產(chǎn)前檢查或篩查的導(dǎo)致了大約80%生出唐氏綜合征嬰兒的婦女的年齡在35歲 以下。如此需要用于一般群體的孕婦的非-侵入性篩查試驗，特別是針對鑒定胎兒染色 體異常以及其它遺傳變異、病癥或疾病的檢查。這需要分離可以用于產(chǎn)前遺傳篩查的胎兒 核酸的非-侵入性技術(shù)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn)，即能夠在不溶解或去除樣品中細(xì)胞的情況下從生物樣 品分離無細(xì)胞核酸，例如，來自凋亡或壞死細(xì)胞的核酸或胎兒核酸。因此，本發(fā)明提供了分 離無細(xì)胞核酸(例如，凋亡的核酸或胎兒核酸)的方法，和鑒定胎兒的遺傳組成的方法。本 發(fā)明還提供包含抗-DNA抗體的磁性顆粒，和包含所述磁性顆粒的試劑盒。
在本發(fā)明的一個實施方式中提供一種分離胎兒核酸的方法。該方法包括從母體生 物樣品分離無細(xì)胞核酸，該母體生物樣品含有細(xì)胞成分和無細(xì)胞核酸，在分離之前不用處 理細(xì)胞成分。在本發(fā)明的另一實施方式中提供一種鑒定胎兒遺傳組成的方法。該方法包括根據(jù) 本發(fā)明的方法分離胎兒核酸，并基于分離的胎兒核酸來鑒定胎兒的遺傳組成。在本發(fā)明的另一實施方式中提供一種磁性顆粒。該磁性顆粒包含在其表面上的 抗-DNA抗體。本發(fā)明的又一個實施方式中提供一種包含本發(fā)明的磁性顆粒的試劑盒。附圖簡述

圖1顯示將抗-DNA抗體與鏈霉抗生物素蛋白涂覆的磁性顆粒附接的過程中的示 例性步驟。圖2顯示通過蛋白G將抗-DNA抗體與鏈霉抗生物素蛋白Dynabead M-280附接的 過程中的示例性步驟。圖3顯示將抗-DNA抗體與胺化Dynabead附接的過程中的示例性步驟。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn)，即在不溶解或去除樣品中細(xì)胞的情況下可以從生物樣 品分離無細(xì)胞核酸，例如凋亡的或胎兒的核酸。根據(jù)本發(fā)明的一方面，其提供一種分離凋亡 或胎兒核酸的方法。該方法包括從生物樣品，例如受試者或母體的生物樣品，分離無細(xì)胞核 酸。此處所用的術(shù)語“無細(xì)胞核酸”指的是循環(huán)的、或自由漂浮的(free floating)核酸， 并且可與循環(huán)的、或自由漂浮的核酸互換使用。在一個實施方式中，無細(xì)胞核酸包括存在于 任何完整或部分完整的細(xì)胞外的核酸。在另一實施方式中，無細(xì)胞核酸包括存在于任何完 整或部分完整的細(xì)胞外，但在細(xì)胞或細(xì)胞樣成分內(nèi)的核酸，例如在膜結(jié)構(gòu)、線粒體樣結(jié)構(gòu)、 脂質(zhì)膜囊泡內(nèi)等。一般而言，術(shù)語“母體(maternal host) ”指的是懷有(即孕有)胎兒的女性受試 者。任何合適的母體生物樣品，例如一種包含胎兒核酸的母體生物樣品，均可以用于本發(fā)明 的方法中。示例性的生物樣品包括，但不限于，全血、血漿、血清、尿、宮頸粘液、羊水或絨毛 膜絨毛樣品。在一個實施方式中，母體生物樣品是全血。在另一實施方式中，所述生物樣品 是儲存在水性介質(zhì)中的宮頸粘液樣品或尿樣。在又一個實施方式中，所述生物樣品是含有 從一種或多種宮頸粘液樣品或尿樣中浙濾的核酸的介質(zhì)(例如，水性介質(zhì))的樣品。水性 介質(zhì)可以是任何介質(zhì)，例如含水緩沖液，其適用于保存宮頸粘液樣品或尿品。一般而言，所述生物樣品(例如母體生物樣品)包含細(xì)胞成分以及無細(xì)胞核酸，并 且所述無細(xì)胞核酸的分離不用在分離前對所述細(xì)胞成分進(jìn)行處理。例如，所述細(xì)胞成分可 以包含細(xì)胞或(例如，如在血漿或血清的情況下)細(xì)胞的或基質(zhì)的成分或蛋白。此處所用的術(shù)語“分離”指的是分開、捕獲、隔離(sequester)等，并可與它們互換 使用?？梢酝ㄟ^目前已知或者以后發(fā)現(xiàn)的任何用于從生物樣品分離核酸的手段(means)來 分離所述無細(xì)胞核酸。在一個實施方式中，所述無細(xì)胞核酸是通過使生物樣品與包含核酸 的配體的固體表面接觸而分離的。所述配體可以直接或間接(例如通過接頭)涂覆或固定 在固體表面上。用于將配體附接到固體表面的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且可以使用 現(xiàn)在已知的或以后開發(fā)的任何方法。在一個實施方式中，所述固體表面為磁性顆粒，包含在柱(例如樹脂柱)中的顆粒，微通道、微孔、平板、濾器、膜或載玻片的表面。在另一實施方式中，可以將所述配體涂覆在裝置(例如，微流裝置)的表面。示例 性的微流裝置包括進(jìn)口裝置(inlet means)、出口裝置(outlet means)和在進(jìn)口和出口裝 置之間延伸的微通道配置。該微通道配置可以是任何能為生物樣品提供隨機化流動通路的 微通道。例如，所述微通道配置可以包括多個橫向分離柱(separator post)，其與微通道和 自微通道的突起相整合。這種柱通常以能夠提供隨機化流出通路的模式排列。微流裝置的 實例在美國申請?zhí)?1/458，668和11/331,988中描述，將這兩篇申請在此全部并入。微流 裝置的微通道配置的表面可以用配體部分或完全地涂覆。示例性的配體包括，但不限于4’，6’ - 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、吖 啶、偏端霉素、溴化乙錠、8-甲氧沙林(8-methoxypsoralen)、二氨基-二四氫呋喃 (diamino-bistetrahydrofuran)、反義寡核苷酸、2，-脫氧核糖-或核糖核苷酸、天然的或 修飾的寡核苷酸、PNA、LNA、2’ -甲氧基_、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或其組合。在一個實施 方式中，分離的核酸是DNA，并且所述配體是DNA-結(jié)合劑，包括，但不限于，抗-DNA抗體，例 如，多克隆抗-DNA抗體或單克隆抗-DNA抗體；DNA結(jié)合蛋白；DNA結(jié)合核酸和DNA-結(jié)合有 機分子?？梢詫⒑怂岬呐潴w或者直接地或者通過接頭附接到固體表面。任何合適的接頭， 例如，親水的或疏水的聚合物都可以使用。接頭的實例包括，但不限于，IgG、蛋白-G、蛋 白A、鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和NHS-R-馬來酰亞胺，其中R是(CH2CH20)n，n = 1-100 ；多核苷酸、多肽、聚苯乙烯、聚乙烯亞胺等。在一個實施例中，接頭包含約2至約50、 75、100、125、150、200或250個原子，例如，C、N、S、P和/或0原子。在另一實施方式中，接 頭包括不同長度的親水聚合物，例如，聚乙二醇、聚乙烯醇等。根據(jù)本發(fā)明的方法，無細(xì)胞核酸的分離不用在分離之前處理細(xì)胞成分。在一個實 施方式中，無細(xì)胞核酸的分離不用在分離之前溶解或使用手段來溶解細(xì)胞成分中的細(xì)胞。 這樣的手段包括已知用于對細(xì)胞進(jìn)行手動溶解或以其他方式殺死、破壞等從而將核酸從細(xì) 胞內(nèi)釋放到生物樣品中的任何手段。溶解手段的實例包括，但不限于，用溶解劑、洗滌劑或 表面活性劑處理生物樣品；加熱含細(xì)胞的生物樣品；改變含細(xì)胞的生物樣品的PH值，例如， 以使得PH在pH 4、5或6以下，或在pH 8、9或10以上。在另一實施方式中，無細(xì)胞核酸的分離不用在分離前去除(例如，通過過濾、離心 等)細(xì)胞成分(即細(xì)胞或細(xì)胞因子或蛋白)。通常本發(fā)明的方法可以用于分離無細(xì)胞核酸，其含有至少百分之 0. 00001 (lxl0-5% )的凋亡或胎兒核酸。在另一實施方式中，無細(xì)胞核酸含有至少百分之 0. 0005(5xl0-s% )的凋亡或胎兒核酸。在又一實施方式中，無細(xì)胞核酸含有至少百分之 0. 0001(lxl0-4% )的凋亡或胎兒核酸。在又一實施方式中，無細(xì)胞核酸含有大約0.01%、 0. 1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%的凋亡或胎兒核酸。本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括從分離的無細(xì)胞核酸分離用長度小于約250、300、 350、400、450、500、550或600個核苷酸的核酸的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，其提供一種鑒定胎兒的遺傳組成的方法。所述方法包括 根據(jù)本發(fā)明的方法分離胎兒核酸，并基于所述分離的胎兒核酸鑒定胎兒的遺傳組成。胎兒的遺傳組成可以指示胎兒的性別，或胎兒中的狀況或病癥。在一個實施方式中，通過本發(fā)明的方法分離的無細(xì)胞核酸可以直接用于確定胎兒的性別。在另一實施方式 中，胎兒核酸是從無細(xì)胞核酸中分離的并且胎兒的遺傳組成是基于所述分離的胎兒核酸鑒 定的。胎兒核酸可以通過任何已知的手段從無細(xì)胞核酸分離。在一個示例性的實施方式中，胎兒核酸是通過按大小分級從無細(xì)胞核酸分離的。 從無細(xì)胞核酸分離長度小于例如大約600、550、500、450、400、350、300或250個核苷酸的核 酸。用于大小分級的任何已知手段，例如，凝膠電泳(例如，PAGE)、HPLC、TLC或基于柱的大 小分級可以用于分離胎兒核酸。在一個實施方式中，胎兒的遺傳組成是基于分離的胎兒核酸鑒定的。所述遺傳組 成可以指示胎兒中的狀況或疾病。狀況或疾病的實例包括，但不限于，囊性纖維化、鐮狀 細(xì)胞貧血、0地中海貧血、軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia)、先兆子癇(Preeclampsia)、 苯丙酮酸尿(Phenylketonuria)、泰-薩病(Tay-Scahs Disease)、腎上腺增生(Adrenal Hyperplasia)、范禾斗尼貧血(Fanconi Anemia)、脊髓性肌萎縮(Spinal Muscularatrophy)、 迪謝納肌營養(yǎng)不良(Duchenne’ s Muscular Dystrophy)、亨廷頓病、0地中海貧血、強直性 肌營養(yǎng)不良(Myotonic Dystrophy)、脆性X染色體綜合征、唐氏綜合征、愛德華茲綜合征、 帕陶綜合征、克萊恩費爾特綜合征、三體X綜合征、XYY綜合征、8三體性、16三體性、特納綜 合征、羅伯遜易位、安格爾曼綜合征、迪喬治綜合征、沃-希綜合征、RhD綜合征、結(jié)節(jié)狀硬化 (Tuberous Sclerosis)、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(Ataxia Telangieltasia)和普-威綜 合征。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，其提供檢測贅生性(neoplastic)細(xì)胞、贅生性核酸或贅 生性細(xì)胞的遺傳標(biāo)記(例如受試者中的腫瘤細(xì)胞)的方法。該方法包括根據(jù)本發(fā)明的方法 分離無細(xì)胞核酸，和基于所述分離的無細(xì)胞核酸檢測贅生性核酸(例如贅生性細(xì)胞如腫瘤 細(xì)胞的遺傳標(biāo)記)的存在與否。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，其提供了一種磁性顆粒。該磁性顆粒包含在其表面上的 抗-DNA抗體。該抗-DNA抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。在一個實施方式中，所述 磁性顆粒包含順磁性核。在另一實施方式中，所述磁性顆粒包含由材料圍繞的核(例如， 順磁性核)，該材料包括，但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、二氧化硅(silica)、尼龍、聚丙 烯酸酯、聚丙烯酰胺、瓊脂糖(agarose)、陶瓷交聯(lián)葡聚糖(ceramic sephadex)和瓊脂糖 (s印harose)。所述抗_DNA抗體可以直接或間接(即，通過接頭)與磁性顆粒附接。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，其提供一種包含本發(fā)明的磁性顆粒的試劑盒。
實施例以下實施例意欲說明，而不是以任何方式、形態(tài)或形式，或者明示或者暗示地限制 本發(fā)明。盡管它們代表了可能采用的那些，但是作為選擇可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 其它步驟、方法學(xué)或技術(shù)。實施例1 :DNA結(jié)合珠的制備圖1、2和3分別概述了制備通過IgG、蛋白-G和NHS-PEG-馬來酰亞胺結(jié)合 抗-DNA-抗體的磁珠中涉及的步驟。實施例2 從母體血液分離胎兒DNA的步驟用抗DNA抗體涂覆的珠6 (圖1)、12 (圖2)、或18 (圖3)處理2ml母體血液。使用攜帶至少100 y g抗DNA抗體的足夠的珠。在室溫下輕輕旋轉(zhuǎn)樣品15分鐘以確保珠與血液 充分混合。然后將樣品置于磁選器中1-2分鐘，然后移出上清。然后將珠用2M NaClUOmM Tris. HClUmM EDTA(pH 7.0)洗滌 3 遍。然后用蛋白酶 K 在包含 lOOmM NaClUOmM Tris. HCl、25mMEDTA、l% SDS的200 yl緩沖液(pH 8. 0)中在55°C下將珠消化1小時。在95°C 下將蛋白酶K滅活10分鐘后，通過加入2體積的無水乙醇并在-80°C下冷卻樣品20分鐘來 乙醇沉淀上清。用90%乙醇沖洗DNA團(tuán)塊一次。實施例3 件別的確定在PCR中使用引物和探針將來自實施例2的DNA用作模板來確定胎兒性別。在用 90%乙醇沖洗后，干燥所述DNA團(tuán)塊，溶解入80iU水中并通過PCR分析胎兒性別。使用用 于Y染色體序列標(biāo)記的一種或多種TaqMan探針，雙重標(biāo)記的探針，在5’端具有報告熒光團(tuán) 且在3’端具有猝滅熒光團(tuán)的18-22堿基寡核苷酸探針，和一種或多種引物來檢測Y染色體 序列。使用SRY (性別決定區(qū)Y)引物靶向存在于人和其他靈長類動物的Y染色體上的性 別決定基因。所述SRY基因編碼睪丸決定因子，其也稱作SRY蛋白。使用FCY引物靶向Y 染色體中另一常用標(biāo)記。血紅蛋白基因，一種存在于總DNA中的管家基因，在每個PCR 反應(yīng)中用于內(nèi)部控制。如下所示，所有5個測試的樣品已經(jīng)通過一致的數(shù)據(jù)得到確認(rèn)。將以下對照用于所述PCR反應(yīng)女性DNA (陰性對照)5 Pi中200ng對照男性基因組DNA (陽性對照)5 ii 1 中 Opg 對照 DNA ；5 ill 中 7pg 對照 DNA ；5 ii 1 中 40pg 對照 DNA ；u 1 中 100pg u 1 中 200pg。使用用于1-11樣品的96孔板設(shè)計用于PCR反應(yīng)。所有對照(作為陽性對照的男 性DNA，作為陰性對照的女性DNA，和珠蛋白)和樣品的反應(yīng)對于每個標(biāo)記均以一式兩 份進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種分離胎兒核酸的方法，該方法包括從母體生物樣品分離無細(xì)胞核酸，其中所述生物樣品包含細(xì)胞成分和無細(xì)胞核酸，并且其中進(jìn)行無細(xì)胞核酸的分離不用 在分離之前處理該細(xì)胞成分。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物樣品為全血。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物樣品為儲存在水性介質(zhì)中的宮頸粘液樣品。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物樣品為儲存在水性介質(zhì)中的尿樣。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中無細(xì)胞核酸是通過使所述生物樣品與包含DNA-結(jié)合劑 的固體表面接觸而分離的。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述固體表面為磁性顆粒、微通道、微孔、平板、濾器、 膜或載玻片的表面。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述DNA-結(jié)合劑為抗-DNA抗體、DNA-結(jié)合蛋白、核酸 或DNA-結(jié)合有機分子。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述DNA-結(jié)合劑為選自下組的DNA結(jié)合有機分子吖 啶、溴化乙錠和DAPI。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述DNA-結(jié)合劑通過接頭附接到所述固體表面。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述接頭選自下組1gG、蛋白-G、蛋白A、鏈霉抗生物 素蛋白、抗生物素蛋白、聚乙二醇、聚乙烯醇和NHS-R-馬來酰亞胺。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述接頭為親水或疏水聚合物。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中R為(CH2CH2O)n,η = 1-100;多核苷酸；多肽；聚苯 乙烯；或聚乙烯亞胺。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行無細(xì)胞核酸的分離不用在分離前使用溶解細(xì)胞 成分中的細(xì)胞的手段。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行無細(xì)胞核酸的分離不用在分離前除去細(xì)胞成分。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離的無細(xì)胞核酸至少包含百分之0.0001的胎 兒核酸。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括從分離的無細(xì)胞核酸分離長度少于500個核 苷酸的核酸的步驟。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括從分離的無細(xì)胞核酸分離長度少于300個核 苷酸的核酸的步驟。
18.—種鑒定胎兒遺傳組成的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求1的方法分離胎兒核酸，和基于所述分離的胎兒核酸鑒定胎兒的遺傳組成。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述遺傳組成指示胎兒的性別。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分離胎兒核酸的步驟進(jìn)一步包括從分離的無細(xì) 胞核酸分離長度少于500個核苷酸的核酸。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述遺傳組成指示胎兒的狀況或病癥。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述遺傳組成指示選自下組的疾病或病癥囊性纖 維化、鐮狀細(xì)胞貧血、苯丙酮酸尿、泰-薩病、腎上腺增生、范科尼貧血、脊髓性肌萎縮、迪謝納肌營養(yǎng)不良、亨廷頓病、強直性肌營養(yǎng)不良、β地中海貧血、脆性X染色體綜合征、唐氏綜 合征、克萊恩費爾特綜合征、愛德華茲綜合征、帕陶綜合征、三體X綜合征、XYY綜合征、8三 體性、16三體性、特納綜合征、羅伯遜易位、安格爾曼綜合征、迪喬治綜合征、沃-希綜合征、 RhD綜合征、結(jié)節(jié)狀硬化、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥和普_威綜合征。
23.一種磁性顆粒，包含在其表面上的抗-DNA抗體。
24.權(quán)利要求23所述的磁性顆粒，其中所述抗-DNA抗體為單克隆抗體。
25.—種試劑盒，包含權(quán)利要求23所述的磁性顆粒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分離無細(xì)胞核酸(例如凋亡或胎兒核酸)的方法，以及檢測贅生性細(xì)胞或鑒定胎兒的遺傳組成的方法。本發(fā)明也提供包含抗DNA抗體的磁性顆粒和包含該磁性顆粒的試劑盒。
文檔編號C07H21/00GK101999003SQ200980112841
公開日2011年3月30日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月12日
發(fā)明者拉姆·巴特, 范文華 申請人:諾瓦蒂斯公司