專利名稱：使用n-羧酸酐(unca)的肽合成方法
使用N-羧酸酐(UNCA)的肽合成方法 本發(fā)明涉及一種用于合成肽或肽衍生物的方法。 合成的肽有大規(guī)模的應(yīng)用，尤其在藥用產(chǎn)品中是作為一種活性成分。肽的合成總體上要求使用在它們的使用之前被保護(hù)并且被活化的氨基酸。這種策 略既不是最簡單的，也不是最經(jīng)濟(jì)的?？扇芜x被保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐(以下稱為NCA或Leuchs酸酐)是對于常規(guī)的 肽偶聯(lián)形成劑的一種有利的替代物。NCA，總體上通過氨基酸的光氣化作用獲得，是非常具 有反應(yīng)性的化合物，它們(特別是通過重排)不形成次級產(chǎn)物，并且它們僅有的反應(yīng)副產(chǎn)物 是二氧化碳。被氨基甲酸酯基團(tuán)取代的氨基酸N-羧酸酐(UNCA)已在文獻(xiàn)中有描述，并且 特別是在肽合成領(lǐng)域。迄今為止已描述了一百余種UNCA衍生物(參見，例如William D. Fuller et al.， J. Am. Chem. Soc.，1990，112，7414-7416 以及William D. Fuller et al·，氨基甲酸酯保護(hù)的 α -氨基酸N-羧酸酐以及肽合成，生物高分子，1996，40，183-205)。應(yīng)注意，只有含伯胺官 能團(tuán)的氨基酸才能被轉(zhuǎn)化為它們相應(yīng)的UNCA衍生物。William D. Fuller et al.綜述了(在氨基甲酸酯保護(hù)的α-氨基酸N-羧酸酐以 及肽合成，高分子，1996，40，183-205中)UNCA在肽合成中的不同應(yīng)用，在固相以及在液相 中，并評論了與它們的用途相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。作者Zhu和Fuller描述了一種從具有酯保護(hù)的或酰胺保護(hù)的羧基官能團(tuán)的二肽 片段到三肽的快速合成(四面體快報(bào)，Vol. 36，No. 6，807-810，1995)。本發(fā)明目的特別在于，特別是提供一種有效、快速并且經(jīng)濟(jì)的合成高純度、尤其是 高光學(xué)純度的肽或肽衍生物的方法，并且該方法能夠容易地用于工業(yè)中。具體地說，根據(jù)本 發(fā)明的方法使之有可能進(jìn)行短鏈肽(如二肽，三肽或四肽)的大規(guī)模的合成。本申請人已發(fā)現(xiàn)，使用游離氨基酸或游離肽代替之前所使用的、在它們的羧基官 能團(tuán)上被保護(hù)的氨基酸或肽，根據(jù)本發(fā)明的方法出人意料地使之有可能以高的產(chǎn)率獲得光 學(xué)上純的肽。此外，借助該方法獲得的肽或肽衍生物總體上不要求純化，或者至少可以容易 地進(jìn)行純化。因此本發(fā)明涉及一種用于制備肽或肽衍生物的方法，該方法包括至少一個步驟， 在該步驟中使一種游離氨基酸或一種游離肽與一種氨基甲酸酯保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐 (UNCA)溶液進(jìn)行反應(yīng)。為了本發(fā)明的目的，表述“氨基酸”應(yīng)理解為是指包含至少一個NR1R2基團(tuán)(它優(yōu) 選是NH2胺基團(tuán))以及至少一個羧基基團(tuán)的任何化合物。本發(fā)明的氨基酸可以是天然或合 成來源的。除甘氨酸外，天然氨基酸都含有手性碳原子。本發(fā)明所使用的氨基酸優(yōu)選是對 映體純的氨基酸。表述“對映體純的氨基酸”應(yīng)理解為是指主要由一種對映異構(gòu)體構(gòu)成的 一種手性氨基酸。對映體過量(ee)被定義為ee(% ) = 100 (X1-X2)/(Xl+X2)其中X1 > X2 ； X1和X2分別代表混合物中對映異構(gòu)體1或2的含量。使用天然或非天然的氨基酸都是有 可能的。氨基酸可以具有D或L構(gòu)型?？梢允褂玫陌被岬臍埢鶕?jù)以下3個字母的代碼 縮寫丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(He)、亮氨酸(Leu)、賴 氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、 酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)具有親核側(cè)鏈的氨基酸有利的是在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用 它們之前在側(cè)鏈上加以保護(hù)。表述“保護(hù)基”應(yīng)理解為是指任何類型的基團(tuán)，它阻止與其相連的原子或基團(tuán)(例 如氧原子或氮原子)在合成過程中參與所不希望的反應(yīng)。這些保護(hù)基包括側(cè)鏈保護(hù)基以及 保護(hù)C-或N-末端的基團(tuán)，統(tǒng)稱為胺保護(hù)基和酸保護(hù)基。作為胺保護(hù)基的非窮盡的例子，可以提及特別是苯甲?；?Bz)、乙?；?Ac)、三 氟乙?；?Tfa)、芐氧羰基(Z)、對氯芐氧羰基(2C1Z)、對溴芐氧羰基(2BrZ)、對硝基芐氧羰 基、二苯甲氧基芐氧羰基、二苯甲氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苯磺酰 基、對甲苯磺?；?-硝基苯磺?；?。 作為酸保護(hù)基的非窮盡的例子，可以提及烷基、芳基、芳烷基、甲硅烷基類型，如甲 氧基甲基、甲基硫代甲基、2，2，2-三氯乙基、2-鹵代乙基、2-(三甲基硅烷基)-乙基、叔丁 基、芳基、烷基、芳烷基、烯丙基、苯基、三苯甲基(trityl)、二苯甲基、對硝基芐基、對甲氧 芐基以及三烷基甲硅烷基的基團(tuán)，如三甲基硅醚類、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷 基、或異丙基二甲基甲硅烷基。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“肽”指一種聚合物，在該聚合物中的單體是通過酰胺類 型的共價(jià)鍵連接在一起的氨基酸。肽衍生物表示其中一個或多個原子被取代或加入的、與原始的肽相類似的化合 物。肽衍生物的典型的例子可以選自其側(cè)基團(tuán)被活化或保護(hù)的肽，其端基被活化或保護(hù)的 肽，肽的環(huán)狀形式或包含環(huán)狀氨基酸的肽。肽包含至少兩個氨基酸。優(yōu)選地，肽鏈中的氨基 酸的數(shù)目大于或等于3。肽鏈經(jīng)常包含最多100個氨基酸。優(yōu)選地，肽鏈中氨基酸的數(shù)目少 于或等于20。特別優(yōu)選地，肽鏈中氨基酸的數(shù)目少于或等于15。根據(jù)本發(fā)明的方法特別適 用于二肽、三肽和四肽的合成，尤其是大規(guī)模合成。還有利的是用于生產(chǎn)(例如)五肽、六 肽或七肽。此外，所有肽序列都是由從左到右排列的化學(xué)式表示的，其取向是在常規(guī)的方向 中，即從胺末端部分到羧基末端部分排列。已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法特別適用于呈現(xiàn)高程度的非對映異構(gòu)體純度的肽和肽 衍生物的合成。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的肽和肽衍生物總體上呈現(xiàn)的非對映異構(gòu)體的純度(定 義為所要求的非對映異構(gòu)體的重量含量)是大于或等于98%。經(jīng)常地，該非對映異構(gòu)體純 度是大于或等于99%。優(yōu)選地，該非對映異構(gòu)體純度是大于或等于99.5%。特別優(yōu)選地， 該非對映異構(gòu)體純度是大于或等于99. 9%。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法使一個處于UNCA形式的氨基酸能夠與另一個游離氨基 酸或游離肽偶聯(lián)。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“偶聯(lián)”特別是指一個氨基酸或一個肽的C末端部分的羧 基基團(tuán)與另一個氨基酸或一個第二肽的N末端的氨基基團(tuán)之間的反應(yīng)。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“C-末端”表示以一個羧基(-C00H)基團(tuán)為末端一個肽 的氨基酸鏈的末端部分或端基。此外，術(shù)語“N-末端”是指以一個氨基(-NH2)基團(tuán)為末端的一個肽的氨基酸鏈的末端部分或端基。為了本發(fā)明的目的，游離氨基酸或游離肽表示具 有至少一個羧基基團(tuán)(適當(dāng)時(shí)為C-末端基團(tuán)，其形式為COOH)的氨基酸或肽。更特別地， 在游離氨基酸或游離肽中，適當(dāng)時(shí)，氨基或N-末端處于-NH2的形式。更特別地，“游離氨基 酸”或“游離肽”表示一種未保護(hù)的氨基酸或一種未保護(hù)的肽。應(yīng)理解的是，游離的氨基酸 或肽的內(nèi)鹽適當(dāng)時(shí)也被包括在此定義內(nèi)。在本發(fā)明的背景下，縮寫“NCA”表示一種氨基酸N-羧酸酐，并且“UNCA”表示一種 氨基甲酸酯保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐。根據(jù)本發(fā)明的方法，與游離氨基酸或游離肽反應(yīng)的氨基甲酸酯保護(hù)的氨基酸 N-羧酸酐(UNCA)溶液總體上是通過將UNCA溶解于一種合適的溶劑中而獲得的。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的UNCA是包含Boc、Fmoc或Z基團(tuán)的UNC A。 最特別優(yōu)選地，該UNCA包含Boc基團(tuán)。當(dāng)使用被保護(hù)的UNCA時(shí)所獲得的受保護(hù)的肽可以被脫保護(hù)，并且如果希望的話， 可以用作隨后的肽合成步驟的一種起始產(chǎn)物，該步驟特別是根據(jù)本發(fā)明的方法來進(jìn)行。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，有利的是使一種游離氨基酸或一種游離肽與一種UNCA 溶液在一種溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，在該溶劑中該游離氨基酸或該游離肽至少部分地可溶。因此， 可以使處于固體形式的游離氨基酸或處于固體形式的游離肽與該UNCA溶液進(jìn)行接觸。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，將該溶劑選擇為使該游離氨基酸或該游離肽在該溶 劑中具有足夠的溶解度來引發(fā)反應(yīng)。優(yōu)選的是溶劑使之有可能在小于或等于24小時(shí)的反 應(yīng)時(shí)間內(nèi)達(dá)到在溶液中存在的至少50%的UNCA到偶聯(lián)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。更特別地，該溶劑使之 有可能在小于或等于12小時(shí)、或甚至6小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)達(dá)到這種轉(zhuǎn)化。更優(yōu)選地，該溶劑是一種極性非質(zhì)子溶劑，尤其是選自二甲基亞砜(DMSO)、N， N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N, N- 二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)、甲酰胺和 環(huán)丁砜、四氫呋喃(THF)和乙腈。用二甲基亞砜獲得了優(yōu)異的結(jié)果。作為溶劑，還有可能使用離子液體，例如烷基化咪唑的液體鹽。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，該反應(yīng)總體上是在一種液體介質(zhì)中進(jìn)行。這種介質(zhì)可以 是均質(zhì)的。經(jīng)常地，該反應(yīng)介質(zhì)(尤其是最初時(shí))是不均勻的，例如它可能是一種游離氨基 酸或一種游離肽在UNCA溶液中的懸浮液。該反應(yīng)介質(zhì)還可以由浸在UNCA溶液中的游離氨 基酸或游離肽構(gòu)成的一種固體物質(zhì)而構(gòu)成。優(yōu)選的是該液體介質(zhì)是基本無水的?？偟貋碚f，液體介質(zhì)中的水含量是保持為最 多IOOOmg水/kg液體介質(zhì)。經(jīng)常地，這一含量最多為500mg水/kg液體介質(zhì)。優(yōu)選地，這 一含量最多為250mg水/kg液體介質(zhì)。經(jīng)常地，該液體介質(zhì)中的水含量是大于或等于IOmg 水/kg液體介質(zhì)，或甚至50mg水/kg液體介質(zhì)。當(dāng)該方法使一種游離氨基酸與該UNCA溶液反應(yīng)時(shí)，經(jīng)常使用對映體純的游離氨 基酸，即一種手性氨基酸，它主要由對映異構(gòu)體過量為大于或等于99%的一種對映異構(gòu)體 構(gòu)成。優(yōu)選的是具有大于或等于99. 5%的對映異構(gòu)體過量的一種對映體純的氨基酸。特別 優(yōu)選地，使用具有大于或等于99. 9%的對映異構(gòu)體過量的一種對映體純的氨基酸。當(dāng)該方法使一種游離肽與該UNCA溶液反應(yīng)時(shí)，總體上使用非對映異構(gòu)體純的游 離肽，其特征是非對映異構(gòu)體純度大于或等于98 %。經(jīng)常地，該非對映異構(gòu)體純度是大于或 等于99%。優(yōu)選地，該非對映異構(gòu)體純度大于或等于99.5%。特別優(yōu)選地，該非對映異構(gòu)體純度大于或等于99.9%。 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，該游離氨基酸或游離肽有利的是以如下比例與UNCA溶 液反應(yīng)，這些比例使得該游離氨基酸或游離肽相對于UNCA而言稍微化學(xué)計(jì)量過量?？傮w而 言，使用從1到1. 5當(dāng)量的游離氨基酸或游離肽。優(yōu)選地，游離氨基酸或游離肽的量是大于 或等于約1. 1當(dāng)量。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，該游離氨基酸或游離肽有利的是在15°C到90°C的溫度 下與UNCA溶液反應(yīng)。通常，該反應(yīng)高于或等于20°C的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，該溫度高于或 等于30°C。經(jīng)常地，該反應(yīng)在低于或等于80°C的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，該溫度是低于或等 于 60°C。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的肽和肽衍生物總體上呈現(xiàn)的非對映異構(gòu)體純度(定義 為所要求的非對映異構(gòu)體的重量含量)是大于或等于98%。經(jīng)常地，該非對映異構(gòu)體純度 是大于或等于99%。優(yōu)選地，該非對映異構(gòu)體純度是大于或等于99.5%。特別優(yōu)選地，該 非對映異構(gòu)體純度是大于或等于99. 9%?？傮w上將壓力選擇為使得將反應(yīng)介質(zhì)(特別是UNCA溶液)保持為液體狀態(tài)。根據(jù)一個實(shí)施方案，大氣壓(約101. 3kPa)和超大氣壓是特別合適的。根據(jù)另一個實(shí)施方案，使用了低于大氣壓的壓力。經(jīng)常地，在此實(shí)施方案中，壓力 是等于或高于400mbar (40kPa)。經(jīng)常地，該壓力是等于或低于500mbar (50kPa)。大氣壓(約101. 3kPa)并且尤其是低于大氣壓的壓力特別適合去除反應(yīng)形成的二 氧化碳。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，該游離氨基酸或游離肽有利的是與該UNCA溶液經(jīng)一定 的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)，該反應(yīng)時(shí)間的范圍是從0. 5到10小時(shí)?？傮w而言，該時(shí)間為從1到 3小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，未反應(yīng)的游離氨基酸或未反應(yīng)的游離肽總體上可以通過固/液分 離操作進(jìn)行回收，例如，離心或(優(yōu)選地)過濾。若有必要的話，在此實(shí)施方案中，可能有利 的是用一種第二有機(jī)溶劑將該反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行稀釋，該第二有機(jī)溶劑比在該反應(yīng)介質(zhì)中存在 的溶劑或多種溶劑的混合物的極性更小。合適的第二溶劑作為舉例可以提及烷基酯，例如 乙酸乙酯或(優(yōu)選地)乙酸異丙酯。若有必要的話，在回收該游離氨基酸或游離肽之后，總體上是將該反應(yīng)介質(zhì)用水 進(jìn)行處理，并且所獲得的肽或肽衍生物可以通過萃取而回收。生成的肽可以例如通過在一種合適的沉淀溶劑中沉淀而分離，該沉淀溶劑典型的 是一種烷，特別是選自環(huán)己烷、石油醚和正庚烷。還有可能通過形成一種銨鹽來分離所生成 的肽，例如DCHA(二環(huán)己胺)或CHA(環(huán)己胺)的鹽。根據(jù)本發(fā)明的方法使之有可能以典型地高于80 %的產(chǎn)率獲得肽和肽衍生物。以下實(shí)例旨在說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。實(shí)例1 :Boc-IIe-Leu-OH 的合成將45ml DMSO和6. 30g (1. 2當(dāng)量)H-Leu-OH引入一個250ml圓底燒瓶中，以獲得 一個懸浮液。在向其中加入10. 29g(1.0當(dāng)量)Boc-IIeUNCA之前使該反應(yīng)介質(zhì)達(dá)到60°C。 反應(yīng)2小時(shí)后，通過HPLC對來自該反應(yīng)介質(zhì)的一個樣品進(jìn)行分析。在用360ml乙酸異丙酯 稀釋之前將該反應(yīng)介質(zhì)冷卻至環(huán)境溫度。
加入0. 1當(dāng)量的二甲氨基丙胺(DMAPA)，并且將該反應(yīng)介質(zhì)在環(huán)境溫度下攪拌約 10分鐘。然后將該有機(jī)相順序地用以下各項(xiàng)洗滌-300ml 含有 1. 0 當(dāng)量 KHS04(5. 45g)的 5%的 NaCl 水溶液；-300ml的5 %的NaCl水溶液；以及-300ml的脫礦質(zhì)水。 通過蒸發(fā)將有機(jī)相進(jìn)行濃縮并且用乙酸異丙酯(共300ml)進(jìn)行共沸干燥操作。 在冷卻過程中，二肽開始結(jié)晶。將其用150ml環(huán)己烷稀釋并且繼續(xù)蒸發(fā)。將懸浮液冷卻至 0士5°C。過濾后，將所獲得的固體用70ml環(huán)己烷洗滌并且干燥，獲得了 12. 8g所希望的肽。產(chǎn)率(基于^R) = 93 %。實(shí)例2-6根據(jù)類似于實(shí)例1的方法合成了一系列化合物。下表概述了對Boc-IleUNCA進(jìn)行 的一系列測試的結(jié)果。Boc-Ile UNCA.系列
權(quán)利要求
用于制備肽或肽衍生物的方法，該方法包括至少一個步驟，在該步驟中使游離氨基酸或游離肽與氨基甲酸酯保護(hù)的氨基酸N 羧酸酐(UNCA)溶液進(jìn)行反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使該游離氨基酸或該游離肽與該UNCA溶液在溶劑 中進(jìn)行反應(yīng)，在該溶劑中該游離氨基酸或該游離肽至少部分可溶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該溶劑是以下的溶劑，其中該游離氨基酸或該游 離肽在該溶劑中具有的溶解度使之有可能在小于或等于24小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)達(dá)到在溶液 中存在的至少50%的UNCA向偶聯(lián)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中該溶劑是極性非質(zhì)子溶劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中該極性非質(zhì)子溶劑選自二甲基亞砜(DMSO)，N， N- 二甲基甲酰胺(DMF)，N, N- 二甲基乙酰胺(DMA)，N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，甲酰胺和 環(huán)丁砜，四氫呋喃(THF)和乙腈。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中該溶劑是DMS0。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中使該游離氨基酸或該游離肽與該 UNCA溶液在15°C到90°C的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該UNCA包含Boc、Fmoc或Z基團(tuán)。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所形成的二氧化碳被排出。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該游離氨基酸或該游離肽是以固體 形式使用。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中該反應(yīng)介質(zhì)為游離氨基酸或游離 肽在該UNCA溶液中的懸浮液。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中在反應(yīng)結(jié)束時(shí)通過固/液分離操 作來回收未反應(yīng)的游離氨基酸或游離肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，在該固/液分離之前，將該反應(yīng)介質(zhì)用第二有 機(jī)溶劑進(jìn)行稀釋，該第二有機(jī)溶劑比在該反應(yīng)介質(zhì)中存在的該溶劑或多種溶劑的混合物的 極性更小。
全文摘要
用于制備肽或肽衍生物的方法，該方法包括至少一個步驟，在該步驟中使游離氨基酸或游離肽與氨基甲酸酯保護(hù)的氨基酸N-羧酸酐(UNCA)溶液進(jìn)行反應(yīng)。
文檔編號C07K1/02GK101970453SQ200980108399
公開日2011年2月9日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月10日
發(fā)明者洛朗·讓尼, 羅蘭·卡倫斯 申請人:索爾維公司