專利名稱：檉柳鐵蛋白基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鐵蛋白基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列。
背景技術(shù)：
鐵是植物生長發(fā)育的必需元素。雖然土壤中含有豐富的鐵，但在干旱或半干旱的土壤中，通常以穩(wěn)定的氧化物形態(tài)存在，其平衡濃度只有10 17pmol/L，遠遠不能滿足植物生長的需要。缺鐵會影響植物氧化還原酶活性及電子在光合和呼吸傳遞鏈的正常轉(zhuǎn)移，還可導(dǎo)致葉綠素合成受阻，影響植物的正常生長發(fā)育和產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決在干旱或半干旱的土壤中鐵離子濃度低而不能滿足植物生長需要的問題，而提供檉柳鐵蛋白基因的cDNA序列及氨基酸序列。
本發(fā)明檉柳鐵蛋白cDNA基因全長為1179bp，基因序列如SEQ ID No.l所示。
本發(fā)明檉柳鐵蛋白基因的cDNA序列編碼的氨基酸序列包括265個氨基酸，檉柳鐵蛋白基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
本發(fā)明檉柳鐵蛋白cDNA基因是從木本植物檉柳的基因中提取篩選的鐵蛋白基因，通過實時定量PCR技術(shù)驗證其鐵離子的應(yīng)答情況，證實本發(fā)明的檉柳鐵蛋白基因在檉柳中具有對鐵離子的應(yīng)答功能，將本發(fā)明的檉柳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入到模式植物中，提高了植物新品種對鐵離子的利用效率，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的吸收和貯存鐵離子的能力，滿足了植物生長的需要。將本發(fā)明的檉柳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入到模式植物煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草的含鐵量比未轉(zhuǎn)基因的煙草的含鐵量提高20%以上，株高和鮮重也提高了 10% 20%，鐵還原酶活性提高了30%~50%。
檉柳鐵蛋白是一種由24個亞基組成的高分子貯藏蛋白質(zhì)，可以儲存多達4500個鐵離子，對動植物及微生物鐵離子的新陳代謝起著非常重要的作用。
具體實施方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式檉柳鐵蛋白cDNA基因全長為1179bp，基因序列為
CTGGTGAAAAAA AAAAAAAAAAAAA 。
本實施方式的鐵蛋白基因的序列是按照以下方法得到的 一、利用CTAB法提取檉柳的總RNA，用Promega公司的mRNA分離試劑盒分離的mRNA，再用Copy試劑盒(Invitrogeb, Groningen, New Zealand)合成雙鏈cDNA，然后用cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(ZAP-cDNA Synthesis Kit禾卩ZAP-cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit)構(gòu)建檉柳cDNA文庫，經(jīng)過3'端測序獲得鐵蛋白基因片段
未知區(qū)域的克隆根據(jù)已知3'端的序列設(shè)計引物Rl :'
CAACGTAAGCCAAAAGCCTGTATCACAAC 和 引 物 R2 :GATCCCAACTGAAGCCTCAAGCAGCAG,結(jié)合RACE技術(shù)(Roche MolecularBiochemicals Mannheim, Germany),對5，端未知區(qū)域進行了擴增，并將該片段克隆到了 PCRTOPO載體(TOPO AT Cloning Kit, Groningen, TheNethdand)進行測序，得到了全長鐵蛋白基因cDNA序列；三、將步驟一和步驟二所得的cDNA片段進行比對拼接；即得到完整的鐵蛋白基因。
將本實施方式中所得鐵蛋白基因cDNA構(gòu)建到植物表達載體pBI121植物表達載體中，用一對引物(R3: 5'-GGTCAATAACACTATGCTTCTC-3，和R4:5，-GCCTCAAGCAGCAGCTCCATCAGC-3，)進行RT-PCR擴增，克隆檉柳鐵蛋白cDNA的編碼序列，在cDNA的5，和3'端分別加入了 Xbal和Sacl酶切位點，使cDNA能夠在RT-PCR擴增中定向克隆到植物表達載體pBI121的啟動子下游，取代GUS基因(轉(zhuǎn)P-葡糖醛酸酶基因)，這個組成型表達系統(tǒng)應(yīng)用的是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子和胭脂堿合成酶(nos)終止子系統(tǒng)以及
卡那抗性基因(NPTii;新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶n)。將重組的質(zhì)粒用電穿孔法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(EHA105菌株)中，通過葉盤轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因煙草，在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基因上篩選Tl代轉(zhuǎn)基因煙草，用PCR-Southern和Northern
雜交方法檢測葉片中外源鐵蛋白基因的表達情況，初步選出的轉(zhuǎn)化子進行自花授粉，得到T2代植株，以下所有的試驗都是用T2代植株進行的將10個轉(zhuǎn)基因株系和IO個非轉(zhuǎn)基因株在含MS培養(yǎng)基(Fe"濃度為100pmol/mL)的培養(yǎng)瓶中生長l個月，分別測量轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的苗高及鮮重，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草株系的苗高比非轉(zhuǎn)基因株系平均高出15%，轉(zhuǎn)基因煙草株系的鮮重比非轉(zhuǎn)基因株系平均高出20%;通過測定紫色的Fe(II)-ferrozine復(fù)合物的分光光度值定量分析不同煙草株系的根部三價鐵還原酶的活性，轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系進行比較可以發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系的鐵還原酶活性比非轉(zhuǎn)基因株系均高出1.3 1.5倍；通過測定不同株系葉片在510nm下Fe-O-鄰二氮雜菲的吸收值計算鐵離子含量，葉片含鐵量比非轉(zhuǎn)基因株系均高出1.3~1.5倍。這些堯.果表明，在轉(zhuǎn)鐵蛋白基因煙草增加了鐵離子還原能力，提高了內(nèi)源鐵蛋白基因的表達水平和鐵離子吸收儲存能力。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點為檉柳鐵蛋白基因cDNA序列中包含5，端非翻譯區(qū)lbp-70bp、蛋白質(zhì)編碼區(qū)71bp-868bp和3'端非翻譯區(qū)869bp-1179bp。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式的檉柳鐵蛋白基因的cDNA序列編碼的威基酸序列包括265個氨基酸，檉柳鐵蛋白基因編碼的氨基酸序列為
IXHGDAVADGAAA。
將具體實施方式
一的所得鐵蛋白基因cDNA構(gòu)建到植物表達載體pBI121植物表達載體中，用一對引物(R3: 5，-GGTCAATAACACTATGCTTCTC-3，和R4: 5'-GCCTCAAGCAGCAGCTCCATCAGC-3，)進行RT-PCR擴增， 一克隆檉柳鐵蛋白cDNA的編碼序列，在cDNA的5，和3，端分別加入了 Xbal和Sacl
7酶切位點，使cDNA能夠在RT-PCR擴增中定向克隆到植物表達載體pBI121的啟動子下游，取代GUS基因(轉(zhuǎn)P-葡糖醛酸酶基因)，這個組成型表達系統(tǒng)應(yīng)用的是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子和胭脂堿合成酶(nos)終止子系統(tǒng)
以及卡那抗性基因(NPTii;新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶n)。將重組的質(zhì)粒用電穿孔法
導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(EHA105菌株)中，通過葉盤轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因煙草，在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基因上篩選Tl代轉(zhuǎn)基因煙草，用PCR-Southem和Northern雜交方法檢測葉片中外源鐵蛋白基因的表達情況，初步選出的轉(zhuǎn)化子進行自花授粉，得到T2代植株，隨機取30株T2代植株的葉片，采用Western雜交對
轉(zhuǎn)基因煙草葉片中所含蛋白質(zhì)進行檢測，結(jié)果表明所有葉片均能檢測出含有與
本實施方式氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)，說明外源檉柳鐵蛋白基因在轉(zhuǎn)基因煙草中得到了正確、穩(wěn)定表達。序列表
<110>東北林業(yè)大學(xué)
<120>檉柳鐵蛋白基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列
<160>7
<210> 1
<211>1179
<212>DNA
<213>檉柳屬(Tamarix L.)
<220><221> CDS<222> (71)…(865)
<400> 1
acttatctat caatttcaaa ccgtcgaact cctgaattta ccccgttgtg agagaaaggt 60caataacact atg ctt etc aag ggc get gcc get get tct act ttt tea 109Met Leu Leu Lys Gly Ala Ala Ala Ala Ser Thr Phe Ser
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Lys Leu 160 Lys Gly 175
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Arg lie 240 His Gly 255
<210> 3
<211>450
<212>DNA
〈213〉檉柳屬(T謹rixL.)
<220>
<223>檉柳鐵蛋白基因序列3'端部分cDNA片段 <400> 3 '
gagtgagcag gtggatgcta tca卿aaat atccgaatat gttgctcagc tc卿卿at 60
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caaggtggtt tacccgcctc atgtgattgc aUtttgttt tgcattatca acctgagatt 420 gttctctggt gaaa肪a幼a 3aa3助幼幼450<210>4 <211>29 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)已知3'端的序列設(shè)計的引物R1 <400> 4
caacgtaagc caaaagcctg tatcacaac 29
<210>5 <211>27 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)已知3'端的序列設(shè)計的引物R2 <400> 5
gatcccaact gaagcctcaa gcagcag 27
<210> 6 <211>22 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>用于反轉(zhuǎn)錄擴增目的片段設(shè)計的引物R3 <400> 6
ggtcaataac actatgcttc tc 22
<210>7 <211>24 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>用于反轉(zhuǎn)錄擴增目的片段設(shè)計的引物R4 <400> 7
gcctcaagca gcagctccat cage 2權(quán)利要求
1、檉柳鐵蛋白基因cDNA序列，其特征在于檉柳鐵蛋白cDNA基因全長為1179bp，檉柳鐵蛋白cDNA基因序列為ACTTATCTATCAATTTCAAACCGTCGAACTCCTGAATTTACCCCGTTGTGAGAGAAAGGTCAATAACACTATGCTTCTCAAGGGCGCTGCCGCTGCTTCTACTTTTTCATACTTCGCCGCTACCAGTGCTGAAAATCAGGTTACCTGTGCACAATCGTTGAGCGGTTCAGTCAGGTTTTCATCGCCGAGTAATGGAAGAAGATTGGTGGTTTCTGCATCTGCTCCGGAGGCGAATAATAGGCCTCTGACCGGTGTTGTTTTTAAGCCGTTTGAAGAGGTTAAGAAAGAGCTTCAAATGGTTCCAACTCTACCGCAGGTTTCACTTGCTCGTCAGAAGTTTGTTGATGAGTGTGAAGCTGCCATTAATGAGCAGATTAACGTGGAGTATAATGTATCATATGTTTATCACGCCATGTATGCTTACTTTGATCGGGATAATGTCGCACTGAAGGGGCTCGCTAAGTTTTTCAAGGAATCAAGTTTGGAGGAAAGGGAGCACGCTGAAAAGCTTATGGAATATCAGAACAAGCGTGGTGGTAGAGTGAAGTTGCAGTCCATTGTGATGCCTCTGTCTGAGTTCGATCATATGGAGAAAGGAGATGCTCTATACGCTATGGAGCTTGCTTTGTCCTTGGAGAAGCTTACTAATGAGAAATTATTGAACCTTCACCATGTTGCGGAGGAAAACCATGATGTTCAGTTGCAAGAATTTATTGAAGGCGAATATTTGAGTGAGCAGGTGGATGCTATCAAGAAAATATCCGAATATGTTGCTCAGCTCAGAAGAATTGGCAAAGGACACGGGGTGTGGCATTTCGATCAAATGCTTCTTCACGGGGATGCTGTTGCTGATGGAGCTGCTGCTTGAGGCTTCAGTTGGGATCTGTATCAATATTTTGGGGAATGGTCATTAGTTACTTTGTTGTGATACAGGCTTTTGGCTTACGTTGTGTTTGAATTTAATTGACACGGGATGGTAGATAAAAAATTGCTTCAAAAACAATTTTCTTTCTATTTTTCCTGGGTTTGGTTAGCATACCTTGTCATGTATGACCCATATGTTGTTAGACCGATTTTCCTGATGCAGTTCAAGGTGGTTTACCCGCCTCATGTGATTGCATTTTTGTTTTGCATTATCAACCTGAGATTGTTCTCTGGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檉柳鐵蛋白基因cDNA，其特征在于檉柳鐵蛋 白基因cDNA序列中包含5，端非翻譯區(qū)lbp-70bp、蛋白質(zhì)編碼區(qū)71bp-868bp和3，端非翻譯區(qū)869bp-1179bp。
3、檉柳鐵蛋白基因的cDNA序列編碼的氨基酸序列，其特征在于檉柳鐵 蛋白基因的cDNA序列編碼的氨基酸序列包括265個氨基酸，檉柳鐵蛋白基因 編碼的氨基酸序列為-LLHGDAVADGAAA 。
全文摘要
檉柳鐵蛋白基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列，本發(fā)明涉及了鐵蛋白基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列。本發(fā)明解決了在干旱或半干旱的土壤中鐵離子濃度低而不能滿足植物生長需要的問題。本發(fā)明檉柳鐵蛋白基因全長為1179bp，基因序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明鐵蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明所得的鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入到煙草中，可使轉(zhuǎn)基因煙草的鐵離子含量提高20％以上，該基因可以提高轉(zhuǎn)基因植物對鐵離子的利用效率，滿足了植物生長的需要。
文檔編號C07K14/415GK101550417SQ200910072120
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日
發(fā)明者丁寶建, 周博如, 姜廷波, 曲躍軍, 雷 王, 王玉成 申請人:東北林業(yè)大學(xué)