專利名稱：新的重組型抗體及其cdr氨基酸序列和編碼它們的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有抑制人TNFα活性的參與抗體的抗原結(jié)合的新的氨基酸序列和編碼該序列的基因，以及含有這些序列的基因重組型抗體，特別是人源化抗體，該抗體的生產(chǎn)方法以及含有該抗體的藥物組合物。
先有技術(shù)腫瘤壞死因子α(TNFα)是對(duì)細(xì)胞具有多方面生物活性的炎性細(xì)胞因子(Proc Natl Acad Sci USA 72，3666，1975)。TNFα由巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，通過與細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合發(fā)揮作用(Anu Rev Biochem 57，505，1988)。在TNFα的作用中，既有破壞腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的有益作用，也存在對(duì)生物體的明顯傷害作用。例如，已知TNFα是敗血性休克的主要起因物質(zhì)(Science234，470，1986)，另外，在慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病或多發(fā)性硬化癥、瘧疾等疾病中，人們認(rèn)為全身性的或局部的TNFα量過剩是這些病的病因(Proc NatlAcad Sci USA 89，9784，1992，J.Infect.Dis.161，1148，1990，J.Exp.Med.170，607，1989)。人們認(rèn)為對(duì)于這樣的疾病通過抑制TNFα過量生成，或通過抑制TNFα的生物活性來緩解病情是有效果的。
抗體與抗原的親和性一般都很強(qiáng)，而且特異性高，特別是抑制抗原生物活性的中和抗體人們期待它能用作藥物。以前，制備的抗體有來自兔抗血清的多克隆抗體和小鼠或大鼠的單克隆抗體，有各種用途。然而，這些不是來自人的抗體對(duì)于人有很高的免疫原性，這些抗體如果進(jìn)入人體，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生人抗這些非人抗體的抗體，這些抗體不僅妨礙所期望的效果，而且還存在著在患者中誘發(fā)源于免疫反應(yīng)的嚴(yán)重的副作用等問題。因此，這樣的抗體作為藥物用于患者受到很大的制約。
抗體分子是由兩種多肽鏈構(gòu)成，分子量大的多肽鏈稱之為H鏈，分子量小的稱之為L鏈。而各個(gè)多肽鏈由形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)和在每類抗體中大致都具有一定結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定區(qū)組成的?？勺儏^(qū)由與抗原結(jié)合部位的形成密切相關(guān)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和插在CDR區(qū)之間的稱之為框架組織的區(qū)構(gòu)成。CDR分別位于H和L鏈的3個(gè)部位(共6個(gè)部位)，從N末端起分別命名為CDR-1、CDR-2和CDR-3?？贵w對(duì)抗原的親和性和特異性主要由這些CDR的氨基酸序列決定的。
近年來，用抗體作為藥物的新的方法已報(bào)道過人鼠嵌合抗體或人源化抗體的制作方法(Nature 328，323，1988)。在人鼠嵌合抗體中，含有抗原結(jié)合部位的可變區(qū)來自小鼠的單克隆抗體，而穩(wěn)定區(qū)來自適當(dāng)?shù)娜丝贵w。由于嵌合抗體含有原來鼠抗體的完整的可變區(qū)，所以可以預(yù)料嵌合抗體與抗原結(jié)合的親和性和特異性與原來鼠抗體一樣。另外，由于嵌合抗體來自鼠的氨基酸序列只限于可變區(qū)，所以與原來鼠抗體相比，其免疫原性降低了。另外，人源化抗體是通過將鼠抗體的CDR移植到人抗體可變區(qū)制備的(Immunol.Today，14，243，1993，Int Rev Immunol10，241，1993)。人源化抗體中來自人以外的氨基酸序列只是CDR，所以移植了鼠CDR的人源化抗體比嵌合抗體對(duì)人的免疫原性進(jìn)一步降低。
對(duì)于TNFα的中和抗體到目前為止已有很多報(bào)道。例如，通過鼠慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病模型顯示出效果的TNFα抗體(Proc Natl Acad Sci USA89，9784，1992)、通過鼠敗血病模型顯示出緩解病情的TNFα抗體(Nature330，662，1987)、含有通過實(shí)際人慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病模型顯示出效果的TNFα抗體(Lancet 344，1105，1994)等。但是，這些抗體無論是來自鼠的單克隆抗體，還是人鼠嵌合抗體，他們的氨基酸序列和編碼這些序列的基因，特別是參與識(shí)別抗原TNFα的CDR的氨基酸序列和編碼這些序列的基因還不知道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供抗人TNFα人源化抗體及其生產(chǎn)方法，另外還提供由這些抗體和醫(yī)藥上容許的載體組成的藥物組合物。
本發(fā)明人開發(fā)了特異識(shí)別有活性的TNFα的鼠單克隆抗體MAB-3B10，并在特開昭63-253099號(hào)上公布了。本發(fā)明人進(jìn)一步深入研究，解析了MAB-3B10的H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列，根據(jù)解析的氨基酸序列提供抗TNFα重組型抗體及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明優(yōu)選的重組型抗體是人源化抗體。
圖2是抗人TNFα人鼠嵌合抗體的表達(dá)載體的模式圖。A表示抗人TNFα人鼠嵌合抗體的H鏈的表達(dá)載體，B表示抗人TNFα人鼠嵌合抗體的L鏈的表達(dá)載體。VH表示H鏈的可變區(qū)；SH表示H鏈的信號(hào)區(qū)；CH1、CH2、CH3分別表示H鏈的3個(gè)穩(wěn)定區(qū)；而VL表示L鏈的可變區(qū)；SL表示L鏈的信號(hào)區(qū)；CL表示L鏈的穩(wěn)定區(qū)。
圖3是人源化抗人TNFα抗體的構(gòu)建程序圖。用星號(hào)表示的部位表示在h3B10-1框架組織中變換成了鼠3B10的氨基酸殘基的部位。L1～L6代表制作h3B10-1的L鏈用的PCR引物，H1～H6代表制作h3B10-1的H鏈用的PCR引物。該方法按已經(jīng)公開的方法(Cancer Res 53，851，1993)。
圖4是表示人源化抗人TNFα抗體與人TNFα結(jié)合特性曲線圖。表示分別導(dǎo)入了編碼各種人源化抗人TNFα抗體的基因的COS-1細(xì)胞、以及導(dǎo)入基因48小時(shí)后的培養(yǎng)上清與人TNFα的結(jié)合特性。首先，利用FCA法對(duì)帶有人IgG Fc的IgG進(jìn)行定量，然后利用ELISA法研究于各種IgG濃度下各種人源化抗人TNFα抗體與人TNFα的結(jié)合特性，用450nm波長的吸光度表示他們的結(jié)合強(qiáng)度。
圖5是表示人源化抗人TNFα抗體與人TNFα結(jié)合特性的曲線圖。表示分別導(dǎo)入了編碼各個(gè)人源化抗人TNFα抗體基因的COS-1細(xì)胞、以及導(dǎo)入基因48小時(shí)后的培養(yǎng)上清與人TNFα的結(jié)合特性。首先，利用FCA法對(duì)帶有人IgG Fc的IgG進(jìn)行定量，然后利用ELISA法研究于各種IgG濃度(A)或1.0ng/ml(B)濃度下各種人源化抗人TNFα抗體與人TNFα的結(jié)合特性，用450nm波長的吸光度表示他們的結(jié)合強(qiáng)度。(B)濃度的測量的數(shù)據(jù)是用平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明的抗TNFα的重組型抗體至少含有由以下氨基酸序列構(gòu)成的H鏈可變區(qū)以及L鏈可變區(qū)的CDR-1、CDR-2和CDR-3中的一個(gè)，優(yōu)選的抗體應(yīng)都含有。
H鏈的CDR-H1Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-Asn(序列號(hào)1)H鏈的CDR-H2Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly(序列號(hào)2)H鏈的CDR-H3Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-Asp-Tyr(序列號(hào)3)L鏈的CDR-L1Thr-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Ser-Phe-Ser-Tyr-Leu-His(序列號(hào)4)L鏈的CDR-L2Tyr-Ser-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-Ser(序列號(hào)5)L鏈的CDR-L3His-Gln-Tyr-Leu-Arg-Ser-Pro-Tyr-Thr(序列號(hào)6)。
本發(fā)明的抗體的一種構(gòu)成方式是H鏈可變區(qū)含有

圖1(A)的3B10行氨基酸序列中的1～113位的氨基酸序列(序列7)或含有實(shí)質(zhì)上與該序列具有同樣功能的氨基酸序列，而L鏈可變區(qū)含有圖1(B)的3B10行氨基酸序列中的1～107位的氨基酸序列(序列8)或含有實(shí)質(zhì)上與該序列具有同樣功能的氨基酸序列，而且能識(shí)別人TNFα。(這些序列作為MAB-3B10的H鏈和L鏈的可變區(qū)的序列在本發(fā)明中已進(jìn)行了鑒定)在本發(fā)明說明書中，所謂「抗體」除了含有通常生物體內(nèi)存在的抗體形式以外，還包括至少含有一個(gè)由抗體的H鏈或L鏈可變區(qū)或通過它們的組合形成的抗原結(jié)合部位的分子。例如，由通常存在于生物體內(nèi)的抗體經(jīng)木瓜蛋白酶酶切得到的象Fab那樣的1組H鏈片段與L鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)，或者是由同樣通過木瓜蛋白酶酶切制備的象F(ab’)2那樣的兩組H鏈片段與L鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)，或者是由H鏈片段和L鏈直線排列在同一肽鏈上構(gòu)成的一條鏈抗體ScFv等也都包括在內(nèi)。這些存在于生物體內(nèi)的形式以外的「抗體」有時(shí)是通過用蛋白分解酶酶切生物體內(nèi)抗體得到的，有時(shí)是通過基因重組方法制作的。
在本發(fā)明中，作為上述本發(fā)明的抗體分子的片段也至少含有上述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3中的一個(gè)片段。例如，含有圖1(A)的3B10行氨基酸序列中的1～113位的氨基酸序列的H鏈可變區(qū)或含有實(shí)質(zhì)上與該序列具有同樣功能的氨基酸序列的肽也包括在內(nèi)，含有圖1(B)的3B10行氨基酸序列中的1～107位的氨基酸序列的L鏈可變區(qū)或含有實(shí)質(zhì)上與該序列具有同樣功能的氨基酸序列的肽也包括在內(nèi)。將這樣的抗體單獨(dú)或進(jìn)行各種組合有可能制造出模仿抗體的人工構(gòu)建抗體。
在本發(fā)明說明書中，所謂的「實(shí)質(zhì)上具有同樣功能」的意思是指抗體分子上的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列與抗原的親和性實(shí)質(zhì)上是相同的，以及隨場合變化親和性更大。即有時(shí)將可變區(qū)的框架組織或穩(wěn)定區(qū)的一個(gè)乃至數(shù)個(gè)氨基酸換成其他氨基酸時(shí)也可以制作實(shí)質(zhì)上具有同樣功能的抗體，或者制作的人源化抗體對(duì)抗原的親和性變得更大。因此，可以制作出CDR的氨基酸序列保持一定，而可變區(qū)框架組織或穩(wěn)定區(qū)的氨基酸中的幾個(gè)氨基酸換成別的氨基酸那樣的「實(shí)質(zhì)上具有同樣功能」的幾個(gè)抗體的「衍生物」。進(jìn)行這樣的氨基酸取代可以在性質(zhì)類似的氨基酸之間進(jìn)行，這是人們最熟悉的，例如在堿性氨基酸之間進(jìn)行取代、在酸性氨基酸之間進(jìn)行取代、或在芳香族氨基酸之間進(jìn)行取代。
可以預(yù)料在可變區(qū)的框架組織或穩(wěn)定區(qū)內(nèi)即使缺失或附加一個(gè)乃至數(shù)個(gè)氨基酸也能夠制作「實(shí)質(zhì)上具有同樣功能」的幾個(gè)抗體的「衍生物」，這些實(shí)質(zhì)上具有同樣功能的衍生物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的抗體或其片段可以通過基因重組手法制備。
本發(fā)明抗體的互補(bǔ)決定區(qū)以外的結(jié)構(gòu)可以選擇抗人TNFα單克隆抗體MAB-3B10以外的任一個(gè)抗體作為基本結(jié)構(gòu)。如果以人抗體作為基本結(jié)構(gòu)制造本發(fā)明抗體為例進(jìn)行說明的話，首先準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)娜藛慰寺】贵w，然后將該抗體的H鏈以及L鏈的可變區(qū)分別取代成上述的抗人TNFα單克隆抗體(MAB-3B10)的H鏈和L鏈的可變區(qū)，就可制造出嵌合抗體。使用的人單克隆抗體并沒有特別限制，例如可以使用稱之為HBS-1的人抗HBs抗體(Gastroenterol Jpn 19，344，1984；J Immunol Methods222，83，1999))。嵌合抗體的制造方法在Proc Natl Acad Sci USA81，6951，1984中已有詳細(xì)記載。
接下來，要將嵌合抗體改造成人源化抗體。即，嵌合抗體的H鏈和L鏈的可變區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)以外的框架組織部分變?yōu)槿丝贵w框架組織部分。為此，象實(shí)施例3記載的那樣利用Sato等人的方法(CancerRes，53，851，1993)，分別以編碼HBS-1的L鏈和H鏈可變區(qū)的DNA為模板，根據(jù)MAB-3B10的CDR-L1～CDR-L3和CDR-H1～CDR-H3的序列制作適當(dāng)?shù)囊?例如序列號(hào)9～14的引物L(fēng)1～引物L(fēng)6和序列號(hào)15～19的引物H1～引物H5)，使用該引物擴(kuò)增編碼框架組織部分已人源化的MAB-3B10的L鏈以及H鏈的各個(gè)可變區(qū)的DNA。利用擴(kuò)增獲得的分別編碼L鏈以及H鏈的各個(gè)可變區(qū)的DNA，再次使用嵌合抗體制造法取代分別編碼上述嵌合抗體的L鏈以及H鏈的DNA可變區(qū)。
將得到的分別編碼人源化抗體的L鏈以及H鏈的DNA導(dǎo)入表達(dá)載體，使兩者轉(zhuǎn)化同一宿主細(xì)胞或分別轉(zhuǎn)化不同的宿主細(xì)胞，通過使L鏈和H鏈分別表達(dá)或同時(shí)表達(dá)，分泌出人源化抗體是有可能的(Proc Natl AcadSci USA 84，241，1987；Cancer Res，47，999，1987)。
作為重組抗體的生產(chǎn)方法，例如可以通過將編碼重組抗體的基因?qū)隒OS-1細(xì)胞(來自非洲綠猴腎臟的細(xì)胞)或CHO細(xì)胞(來自日本倉鼠卵巢的細(xì)胞)進(jìn)行分泌表達(dá)。在導(dǎo)入基因時(shí)可以使用各種載體，例如可以利用對(duì)真核細(xì)胞用表達(dá)載體pdKCR-dhfr(Biochem Biophys Res Commun164，39，1989)進(jìn)行象實(shí)施例記載的那樣的改造過的載體。為了使載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼L鏈或H鏈的DNA，載體要含有啟動(dòng)子、終止子、以及其他要素。而為了使宿主分泌L鏈和/或H鏈，可以將編碼L鏈和/或H鏈的DNA安插在編碼與宿主細(xì)胞相適合的信號(hào)肽基因的下游。
例如，使用COS-1細(xì)胞，要使用象加有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM培養(yǎng)基)那樣的培養(yǎng)基，于5％ CO2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。至于向COS-1細(xì)胞導(dǎo)入基因的方法和導(dǎo)入基因后的細(xì)胞培養(yǎng)方法在Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等實(shí)驗(yàn)書中已有記載。
生產(chǎn)醫(yī)藥用的抗體時(shí)，為了避免混入來自血清的牛抗體，希望用無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。如果這樣操作的話，分泌到培養(yǎng)上清的抗TNFα抗體通過使用諸如可使蛋白A結(jié)合的樹脂等一般的抗體純化方法(Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988)很容易純化。工業(yè)生產(chǎn)用的宿主細(xì)胞可以使用CHO細(xì)胞或鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0等細(xì)胞。例如使用CHO細(xì)胞，通過MTX等藥物可選擇出生產(chǎn)效率高的菌落(Immunol Lett 64，139，1998)，如果能獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，那該菌株可用于重組型抗人TNFα抗體的工業(yè)化生產(chǎn)中。
本發(fā)明的抗體通過將可變區(qū)的框架組織部分中的一部分氨基酸取代為別的氨基酸，有時(shí)可提高對(duì)人TNFα的親和性。這樣的氨基酸取代就象實(shí)施例4所示的那樣，使用導(dǎo)入適當(dāng)突變的引物借助PCR是有可能實(shí)現(xiàn)的。
醫(yī)藥用的抗體形式可以直接利用生產(chǎn)出的抗體分子，也可以利用經(jīng)蛋白酶處理后獲得的含有抗原結(jié)合部位的片段。如上所述，抗體的形式除了通常存在于生物體的抗體形式以外只要是還至少含有一個(gè)由抗體的H鏈或L鏈可變區(qū)或通過它們的組合形成的抗原結(jié)合部位的片段就可以。這些抗體可以利用基因重組手法制作，也可以利用基因重組手法制作后再使用蛋白分解酶進(jìn)行有限地降解來制作，這些方法并沒有特別地限定。
另外，本發(fā)明提供由上述本發(fā)明的重組抗體和醫(yī)藥上容許的載體構(gòu)成的藥物組合物。
在本發(fā)明的藥物組合物中，為了使本發(fā)明的抗體在用于人體時(shí)使它保持活性也可以同時(shí)含有醫(yī)藥上容許的載體或穩(wěn)定劑等物質(zhì)，例如可以使用人血清白蛋白、明膠等。所謂醫(yī)藥上容許意思是指不能伴有惡心、目眩、嘔吐等不希望出現(xiàn)的副作用，以及多次服用時(shí)不引起對(duì)制劑的免疫應(yīng)答等。另外，使用醫(yī)藥上容許的適當(dāng)?shù)娜軇┗蛳♂寗?、隨穩(wěn)定劑一起溶解的液態(tài)的藥物組合物也可以。還有即使是含有在上述藥物組合物中以調(diào)節(jié)體內(nèi)濃度為目的的中心體、脂質(zhì)體等緩釋移植體的藥物用組合物也可以。
本發(fā)明的藥物組合物可以用于諸如敗血性休克癥狀、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、多發(fā)性硬化癥、瘧疾等患者，預(yù)防或治療與TNFα或TNFα生產(chǎn)過剩有關(guān)的疾病和癥狀。投藥方式根據(jù)需要進(jìn)行選擇，如果全身投藥，可以經(jīng)靜脈投藥、口服、腹腔內(nèi)投藥、皮下投藥、鼻內(nèi)投藥、經(jīng)皮投藥等方式，如果局部投藥，可以通過軟膏、洗劑等投藥方式。投藥量醫(yī)生可以根據(jù)癥狀、患者的年齡、以及其他因素確定。
實(shí)施例以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說明，是以具體的例子說明本發(fā)明，但對(duì)本發(fā)明并沒有限定。實(shí)施例1.抗人TNFα鼠中和抗體3B10的H鏈和L鏈可變區(qū)cDNA克隆使用RNAzol B試劑(BIOTEX Laboratories公司)分離分泌抗人TNFα鼠單克隆抗體的3B10細(xì)胞(J Immunol Methods 96，57，1987)的總RNA，用總RNA隨機(jī)雜化和使用逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperScript PreamplificationSystem、GIBCO BRL公司生產(chǎn))合成cDNA。由獲得的cDNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼H鏈以及L鏈可變區(qū)的cDNA。L鏈可變區(qū)的cDNA利用根據(jù)Huse等人的報(bào)道的序列(Science 246，1275，1989)合成擴(kuò)增用的的引物進(jìn)行擴(kuò)增，而H鏈可變區(qū)的cDNA利用根據(jù)Kabat等人的報(bào)道的H鏈氨基酸序列(US Dept.Health and Human Services，US GovernmentPrinting Offices，1991)設(shè)計(jì)5’端引物(5’-AGGTGAAGCTNGTGGAG/ATCTGG-3’)和Huse等人的3’端引物通過PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。在進(jìn)行PCR時(shí)使用了耐熱DNA聚合酶(AmpliTaq DNA polymerase、Perkin-Elmer公司生產(chǎn))和熱循環(huán)儀(TRIO-Thermo-block、Biometra公司生產(chǎn))。將得到的cDNA的堿基序列按照Sanger等人方法進(jìn)行解析(Proc Natl Acad Sci USA74，5463，1977)。圖1給出了獲得的3B10抗體的H鏈和L鏈可變區(qū)的堿基序列。按照Kabat等人的方法(US Dept.Health and Human Services，US Government Printing Offices，1991)或Chothia等人的方法(J MolBiol 196，901，1987)鑒定CDR區(qū)，在本發(fā)明中任一個(gè)CDR區(qū)所包含的氨基酸序列都視為「CDR區(qū)」。實(shí)施例2.抗抗人TNFα的人鼠嵌合抗體的表達(dá)載體的制作在真核細(xì)胞用表達(dá)載體pdKCR-dhfr(Biochem Biophys Res Commun164，39，1989)中導(dǎo)入多克隆位點(diǎn)(Eco RI，Mlu I，Spe I，Sal I)(以下稱之為pKDEMSS載體)。然后將pKDEMSS的二氫葉酸還原酶(DHFR)區(qū)取代為pMAMneoCAT(CLONTECH公司生產(chǎn))的抗新霉素(neor)區(qū)(以下稱之為pKNEMSS載體)。嵌合H鏈表達(dá)載體是通過從N末端依次將稱之為HBS-1的人抗HBs抗體(Gastroenterol Jpn 19，344，1984，J ImmunolMethods 222，83，1999)的γ1鏈的信號(hào)序列和實(shí)施例1得到的3B10的H鏈可變區(qū)以及HBS-1的γ1鏈的穩(wěn)定區(qū)插入到pKNEMSS載體制作的(以下稱之為pKNH-c3B10)，同樣，通過從N末端依次將HBS-1的κ鏈的信號(hào)序列和實(shí)施例1得到的3B10的L鏈可變區(qū)以及HBS-1的κ鏈的穩(wěn)定區(qū)插入到pKDEMSS載體制作嵌合L鏈表達(dá)載體(以下稱之為pKDL-c3B10)。圖2給出了pKNH-c3B10和pKDL-c3B10的構(gòu)建圖。實(shí)施例3.人源化抗人TNFα抗體的構(gòu)建按照Sato等人的方法(Cancer Res，53，851，1993)，構(gòu)建將鼠抗體3B10的6個(gè)CDR換成人IgG對(duì)應(yīng)的位置的抗體基因。就象圖3表示的那樣，首先以HBS-1抗體的L鏈的cDNA作為模板進(jìn)行5次PCR來制備L鏈可變區(qū)的cDNA片段。在第1次PCR中，是用引物L(fēng)1和L2進(jìn)行擴(kuò)增的。用擴(kuò)增的片段作為5’引物與L3引物一起進(jìn)行第2次PCR。依次類推，直至使用L6引物為止再進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，制作最終的L鏈可變區(qū)的cDNA片段。H鏈可變區(qū)的cDNA片段以HBS-1抗體的H鏈的cDNA作為模板也通過反復(fù)進(jìn)行PCR來制作。但是，第2次PCR用的3’引物是通過使用彼此重疊的兩種引物經(jīng)PCR制作的。通過將最終擴(kuò)增得到的這些L鏈和H鏈可變區(qū)cDNA片段換成抗抗人TNFα人鼠嵌合抗體的表達(dá)載體pKDL-c3B10和pKNH-c3B10的可變區(qū)來構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體。通過用各個(gè)載體同時(shí)轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，然后在表達(dá)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，可以分泌抗人TNFα人源化抗體(參照實(shí)施例4)。以上得到的人源化抗體命名為h3B10-1。
表1給出了本實(shí)施例使用的引物。而在這些引物中，L鏈的框架組織部分的第4位、36位、48位、71位的氨基酸以及H鏈的71位、93位的氨基酸分別換成了鼠3B10對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。
表1輕鏈L1 5’-AGG TGT GAC GTC CAG TTG ACC CAG TCT CCA (序列號(hào)9)L2 5’-CTG ATA CCA GTG TAA ATA ACT GAA GCT AAC GCT CGAACT CGC CGT ACA AGT GAT (序列號(hào)10)L3 5’-GAC CCC ACT TGC CAA ATT GGA TGT AGA ATA GAT CAG GAG CTT(序列號(hào)11)L4 5’-TGT GAG AGT GTA TTC TGT CCC AGA TCC ACT (序列號(hào)12)L5 5’-GCC GAA AGT GTA CGG GGA ACG AAG ATA CTG GTG ACA GTA(序列號(hào)13)L6 5’-CTC ATC AGA TGG CGG GAA GA(序列號(hào)14)重鏈H1 5’-CAG AAT TCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT (序列號(hào)15)H2 5’-GAC CCA GTT CAT ACC ATA GTT AGT GAA GGT GTA TCC AGA(序列號(hào)16)H3 5’-GAG TGG GTG GCA TGG ATA AAC ACT TAT ACA GGT GAG CCA ACC TAC GCA(序列號(hào)17)H4 5’-GTC TAA GGA AAT GGT GAA TCG GCC CTT GAA GTC GTC TGC GTA GGT TGG(序列號(hào)18)H5 5’-TCC CTG GCC CCA GTA GTC AAA TCC GTC ATA ATC ATA TCT TGC ACA GTA(序列號(hào)19)實(shí)施例4.抗人TNFα人源化抗體衍生物的構(gòu)建通過對(duì)h3B10-1進(jìn)一步實(shí)施突變制作了8種人源化3B10抗體，在H鏈和L鏈的框架組織部分導(dǎo)入了突變。即以h3B10-1為模板，通過利用導(dǎo)入突變的引物進(jìn)行PCR實(shí)施突變的。在進(jìn)行PCR時(shí)使用了耐熱DNA聚合酶(AmpliTaq DNA polymerase、Perkin-Elmer公司生產(chǎn))和熱循環(huán)儀(TRIO-Thermo-block、Biometra公司生產(chǎn))。表2中歸納了制作的8種人源化抗體(命名為h3B10-2～9)、h3B10-1H以及h3B10-1L中氨基酸序列的不同部分。將L鏈與h3B10-1相同，H鏈的框架組織區(qū)是HBS-1自身的抗體命名為h3B10-1H，將H鏈與h3B10-1相同，L鏈的框架組織區(qū)是HBS-1自身的抗體命名為h3B10-1L。
表2人源化抗人TNFα抗體框架區(qū)的構(gòu)建H鏈的氨基酸殘基 L鏈的氨基酸殘基抗體3 46 71 78 933 4 36 46 47 71m3B10 K K L A A E L Y L W Yc3B10 K K L A A E L Y L W YHBS-1 Q E R L I Q M F R L Fh3B10-1 Q E L L A Q L Y L L Yh3B10-1HQ E R L I Q L Y L L Yh3B10-1LQ E L L A Q M F R L Fh3B10-2 K E L L A Q L Y L L Yh3B10-3 Q K L L A Q L Y L L Yh3B10-4 Q E L A A Q L Y L L Yh3B10-5 K K L A A Q L Y L L Yh3B10-6 Q E L L A E L Y L L Yh3B10-7 Q E L L A Q L Y L W Yh3B10-8 Q E L L A E L Y L W Yh3B10-9 K K L A A Q L Y L W Y
表2中，氨基酸用單字母表示，按照Kabat等人的方法(US Dept.Healthand Human Services，US Government Printing Offices，1991)加以編號(hào)。而來自鼠的序列用下劃線標(biāo)出。
m3B10原來的鼠抗TNFα抗體；c3B10人鼠嵌合抗TNFα抗體；HBS-1人抗HBs抗體；h3B10-1HL鏈與h3B10-1相同，H鏈的框架組織區(qū)是HBS-1自身的抗體；h3B10-1LH鏈與h3B10-1相同，L鏈的框架組織區(qū)是HBS-1自身的抗體。實(shí)施例5.人源化抗人TNFα抗體及其衍生物的表達(dá)和解析將3.0×105個(gè)COS-1細(xì)胞(從ATCC獲得)接種于35mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行18小時(shí)前培養(yǎng)。使用10μl的脂(質(zhì))轉(zhuǎn)染胺試劑(GIBCO BRL公司生產(chǎn))同時(shí)將在實(shí)施例2～4中構(gòu)建的共計(jì)9種對(duì)應(yīng)于人源化抗人TNFα抗體和人鼠嵌合抗體的各個(gè)H鏈表達(dá)載體和L鏈表達(dá)載體成對(duì)(各2μg)導(dǎo)入COS-1細(xì)胞。在通過ELISA方法對(duì)從導(dǎo)入基因的細(xì)胞分泌出的各個(gè)重組型抗體對(duì)人TNFα的結(jié)合特性進(jìn)行檢測的同時(shí)，利用FCA(Fluorescence Concentration Analyzer)方法對(duì)培養(yǎng)上清中的人IgG的量進(jìn)行定量。ELISA按如下方法進(jìn)行。首先，向96孔板的中央?yún)^(qū)的60孔加滿10μg/ml的人TNFα，于室溫下溫育18小時(shí)，使其固化。用洗凈緩沖液(含有0.1％ Tween-20的磷酸緩沖鹽溶液(PBS))將孔洗3次后，用含有1％ BSA的PBS進(jìn)行2小時(shí)封閉。然后用PBS-T洗3次，與各個(gè)COS-1細(xì)胞的上清進(jìn)行2小時(shí)反應(yīng)。同樣洗過后，使結(jié)合TNF α的抗體與過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG Fc(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司生產(chǎn))或過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgGFc抗體(Caltag Laboratories公司生產(chǎn))反應(yīng)，利用文獻(xiàn)(J Immunol Methods 143，89，1991)記載的方法進(jìn)行檢測。另外，F(xiàn)CA法根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的方法(Biochem Biophys ResCommun 193，886，1993)使用包裹羊抗人IgG Fc抗體的FCA用顆粒和用FITC標(biāo)記的羊抗人IgG Fc抗體，以已知濃度的人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量。各個(gè)COS-1細(xì)胞表達(dá)的各人源化抗體與人TNFα的結(jié)合特性用對(duì)各種濃度的IgG的ELISA反應(yīng)量表示。
各種抗體對(duì)人TNFα的結(jié)合特性就象圖4和圖5表示的那樣，無論那一種人源化抗體都具有與TNFα的結(jié)合活性，而h3B10-9的結(jié)合活性最強(qiáng)，其結(jié)合強(qiáng)度與人鼠嵌合抗體相當(dāng)。而h3B10-1雖然也具有結(jié)合活性，但比人鼠嵌合抗體弱。而作為對(duì)照制作的h3B10-1H和h3B10-1L經(jīng)檢測確認(rèn)沒有結(jié)合人TNFα的特性。
發(fā)明效果本發(fā)明首次提供的6個(gè)氨基酸序列和編碼這些序列的基因通過將這些序列換成人IgG的對(duì)應(yīng)位置可獲得對(duì)人TNFα保持結(jié)合活性的人源化抗體。本發(fā)明得到的人源化抗TNFα抗體用作藥品時(shí)在人體內(nèi)的免疫原性比來自鼠等動(dòng)物的抗體帶來的免疫原性低得多，安全性進(jìn)一步提高。如果利用本發(fā)明，可以大量制備識(shí)別TNFα的人源化抗體，該抗體可以用于治療與TNFα有關(guān)的各種疾病。
序列表<110>Suntory Limited<120>新的重組抗體，它的CDR區(qū)的氨基酸序列和編碼CDR區(qū)的DNA。<130>YCT-588<160>19<210>SEQ ID NO1<211>10<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗體的CDR-H1<400>1Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn5 10<210>SEQ ID NO2<211>17<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗體的CDR-H2<400>2Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe5 10 15Lys Gly<210>SEQ ID NO3<211>8<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗體的CDR-H3<400>3Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr5<210>SEQ ID NO4<211>12<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗體的CDR-L1<400>4Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Ser Tyr Leu His5 10<210>SEQ ID NO5<211>8<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗體的CDR-L2<400>5Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser<210>SEQ ID NO6<211>9<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗體的CDR-L3<400>6His Gln Tyr Leu Arg Ser Pro Tyr Thr5<210>SEQ ID NO7<211>351<212>DNA<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗體的H-鏈CDR區(qū)<400>7cag gtg aag ctg ctc gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga tac acc ttt act aac tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30ggt atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ttg aag tgg gtg144Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val35 40 45gca tgg ata aac act tat aca ggt gag cca acc tac gca gac gac ttc192Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe50 55 60aag ggc cga ttc acc att tcc tta gac aat tcc aag aac aca gcg tat240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80ctg gaa gtg aag agc ctg caa act gag gac acg ggt gtc tat tac tgt288Leu Glu Val Lys Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys85 90 95gca aga tat gat tat gac gga ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg336Ala Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110gtc acc gtc tcc tca351Val Thr Val Ser Ser115<210>SEQ ID NO8<211>324<212>DNA<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗體的L-鏈CDR區(qū)<400>8gac gtc cag ttg acc cag tct cca tct gcc atg gct gca tct gta gga 48Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ala Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac aga gtc acc atc act tgt acg gcg agt tcg agc gtt agc ttc agt 96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Ser20 25 30tat tta cac tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gtc cct aag ctc tgg144Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Trp35 40 45atc tat tct aca tcc aat ttg gca agt ggg gtc cca tcg agg ttc agc192Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser50 55 60ggc agt gga tct ggg aca gaa tac act ctc aca atc agc agc ctg cag240Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln65 70 75 80cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt cac cag tat ctt cgt tcc ccg288Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Arg Ser Pro85 90 95tac act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa324Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>SEQ ID NO9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L1<400>9aggtgtgacg tccagttgac ccagtctcca 30<210>SEQ ID NO10<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L2<400>10ctgataccag tgtaaataac tgaagctaac gctcgaactc gccgtacaag tgat 54<210>SEQ ID NO11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L3<400>11gaccccactt gccaaattgg atgtagaata gatcaggagc tt 42<210>SEQ ID NO12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L4<400>12tgtgagagtg tattctgtcc cagatccact 30<210>SEQ ID NO13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L5<400>13gccgaaagtg tacggggaac gaagatactg gtgacagta 39<210>SEQ ID NO14<211><212>DNA<213>人工序列<220>20<223>Primer L6<400>14ctcatcagat ggcgggaaga 20<210>SEQ ID NO15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H1<400>15cagaattcac catggagttt gggctgagct 30<210>SEQ ID NO16<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H2<400>16gacccagttc ataccatagt tagtgaaggt gtatccaga 39<210>SEQ ID NO17<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H3<400>17gagtgggtgg catggataaa cacttataca ggtgagccaa cctacgca48<210>SEQ ID NO18<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H4<400>18gtctaaggaa atggtgaatc ggcccttgaa gtcgtctgcg taggttgg48<210>SEQ ID NO19<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H5<400>19tccctggccc cagtagtcaa atccgtcata atcatatctt gcacagta48
權(quán)利要求
1.抗人TNFα的重組型抗體的H鏈多肽或其片段，至少含有以下任一個(gè)氨基酸序列a)CDR-H1為作為CDR-H1記載于序列號(hào)1的氨基酸序列；b)CDR-H2為作為CDR-H2記載于序列號(hào)2的氨基酸序列；c)CDR-H3為作為CDR-H3記載于序列號(hào)3的氨基酸序列
2.抗人TNFα的重組型抗體的H鏈多肽或其片段，含有抗人TNFα的抗體的H鏈可變區(qū)，該H鏈可變區(qū)由序列號(hào)7記載的氨基酸序列構(gòu)成或由在該氨基酸序列中的序列號(hào)1至3記載的氨基酸序列以外的部分進(jìn)行1或數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、附加或取代的氨基酸序列構(gòu)成。
3.抗人TNFα的重組型抗體的L鏈多肽，至少含有以下任一個(gè)氨基酸序列d)CDR-L1為作為CDR-L1記載于序列號(hào)4的氨基酸序列；e)CDR-L2為作為CDR-L2記載于序列號(hào)5的氨基酸序列；f)CDR-L3為作為CDR-L3記載于序列號(hào)6的氨基酸序列
4.抗人TNFα的重組型抗體的L鏈多肽，含有抗人TNFα的抗體的L鏈可變區(qū)，該L鏈可變區(qū)由序列號(hào)8記載的氨基酸序列構(gòu)成或由在該氨基酸序列中的序列號(hào)4至6記載的氨基酸序列以外的部分進(jìn)行1或數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、附加或取代的氨基酸序列構(gòu)成。
5.編碼權(quán)利要求1或2記載的H鏈多肽或其片段的基因。
6.編碼權(quán)利要求3或4記載的L鏈多肽的基因。
7.插入了權(quán)利要求5和/或6記載的基因的表達(dá)載體。
8.抗人TNFα的重組型抗體的制造方法，用權(quán)利要求7記載的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，在表達(dá)抗人TNFα抗體的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，然后回收由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。
9.抗人TNFα的重組型抗體或其片段，是利用權(quán)利要求5和/或6記載的基因，或權(quán)利要求8記載的方法，通過基因重組手法獲得的。
10.藥物組合物，由權(quán)利要求9記載的抗體或其片段與醫(yī)藥上容許的載體構(gòu)成。
全文摘要
提供至少含有以下一個(gè)氨基酸序列的抗人TNFα重組型抗體的H鏈多肽或其片段:a)以CDR－H1記載的氨基酸序列:Gly－Tyr－Thr－Phe－Thr－Asn－Tyr－Gly－Met－Asn，b)以CDR－H2記載的氨基酸序列:Trp－Ile－Asn－Thr－Tyr－Thr－Gly－Glu－Pro－Thr－Tyr－Ala－Asp－Asp－Phe－Lys－Gly，c)以CDR－H3記載的氨基酸序列:Tyr－Asp－Tyr－Asp－Gly－Phe－Asp－Tyr提供至少含有以下一個(gè)氨基酸序列的抗人TNFα重組型抗體的L鏈多肽a’)以CDR－L1記載的氨基酸序列:Thr－Ala－Ser－Ser－Ser－Val－Ser－Phe－Ser－Tyr－Leu－His，b’)以CDR－L2記載的氨基酸序列:Tyr－Ser－Thr－Ser－Asn－Leu－Ala－Ser，c’)以CDR－L3記載的氨基酸序列:His－Gln－Tyr－Leu－Arg－Ser－Pro－Tyr－Thr提供由上述H鏈多肽或其片段和L鏈多肽構(gòu)成的抗人TNFα人源化抗體或其片段。同時(shí)還提供用含有編碼該抗體的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,然后進(jìn)行培養(yǎng),制造人源化抗TNFα抗體的方法。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1380884SQ01801502
公開日2002年11月20日 申請(qǐng)日期2001年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月19日
發(fā)明者福田好晃, 永平和廣, 中西俊博 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社