專利名稱：氨基酸用于制備治療胰島素抗性藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及氨基酸用于制備對胰島素外周靶組織具有胰島素模擬和/或胰島素敏化作用的藥物的用途，更具體地說是氨基酸用于制備治療和預防胰島素抗性藥物的用途。
在近幾年，對胰島素如何工作的分子機理方面的理解已有相當進展。

圖1顯示了表示胰島素信號轉導的主要途徑的圖解。胰島素受體是具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的轉膜受體(Combettes-Souverain M.和Issad T.，Diab.Metab.，24，477，1998)。胰島素與其受體結合造成受體在其酪氨酸殘基上自身磷酸化，其刺激了該受體對特定數(shù)目的細胞內(nèi)底物如胰島素受體底物1(IRS-1)、胰島素受體底物2(IRS-2)和Src同源膠原蛋白或Shc的酪氨酸激酶活性。這種酪氨酸激酶活性在傳遞胰島素信號方面起著決定性作用，在許多胰島素抗性的情況中這種活性都被改變了(Ricort J.M.等，Diabetologia，38，1148，1995)。胰島素抗性的全部細胞機理可以在激素與其受體的結合或與受體更遠端的結合后階段的結合中發(fā)現(xiàn)。正如圖1中的圖解所示，胰島素受體在IRS和Shc的酪氨酸上的磷酸化激活了細胞信號的兩種主要途徑，MAP激酶(MAPK)途徑和磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-K)途徑。磷酸酪氨酸的磷酸酶(PTP)在調(diào)節(jié)這些途徑方面起作用。
本發(fā)明人過去已報導過胰島素分泌者的作用，在胰細胞中由羥基化的葫蘆巴種子(Trigonella foenum graecum L.)的氨基酸提取物、尤其是由4-羥基異亮氨酸(4-OH-lle)和/或相應的內(nèi)酯發(fā)揮這種作用(專利FR 2 695 317和2 745 718和優(yōu)先權下的相應專利)。
而且，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)顯示這種化合物在胰島素靶細胞水平、即外周組織如肝和肌肉也能夠通過在胰島素受體水平上發(fā)揮活性和/或觸發(fā)該受體活化的信號級聯(lián)來起作用。在這些外周組織所觀察到的作用整體上相應于胰島素模擬作用或胰島素敏化作用。
正如實施例中所詳細描述的，所進行的研究實際上已經(jīng)表明了這些化合物在受體下啟動的磷酸化級聯(lián)水平上的作用，即在胰島素信號傳遞中所涉及的主要蛋白的磷酸化顯著增加。由磷酸化的IRS-1激活的并在葡萄糖運輸因子GLUT 4的易位中起主要作用的PI 3-激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)在這類化合物的作用下也在增加。在與使用這些化合物相同的條件下，與胰島素受體信號途徑有關的磷酸酶活性(PTP活性)下降，這與上述磷酸化的增加相一致。所以這類化合物不管是通過激酶的激活和/或磷酸酶的抑制都能夠作用于一般由胰島素觸發(fā)的信號途徑上。
本發(fā)明的主題將得益于所得到的這些結果，因此涉及這類氨基酸或其衍生物作為胰島素模擬劑或胰島素敏化劑的任何用途。特別是它涉及用這類化合物制備具有胰島素模擬作用和/或胰島素敏化作用的藥物的用途。這些作用在胰島素外周靶組織中可以觀察到。因為這些化合物對一般由胰島素觸發(fā)的信號途徑起作用，所以實際上它們能夠作為胰島素的底物、補體、增強劑(potentializers)和致敏劑使用。
因此本申請涉及任何氨基酸或氨基酸衍生物作為胰島素模擬劑或胰島素敏化劑的用途，它能夠實現(xiàn)磷酸酶PTP活性的降低和/或PI 3-激酶活性的增加，這種作用等同于或高于分別由胰島素所引起的降低或增加。任何能夠表明這種降低PTP活性或增加PI3-激酶活性作用的方法(means)都是合適的。下列實施例對此進行詳細說明。
這類化合物以顯著的方式相當于在其結合部位不識別胰島素受體但在實施例所提到的4-OH-lle條件下的受體后水平起作用的氨基酸，也相當于可保留，至少在實質上，其結合部位上的胰島素受體非識別特性以及所述衍生物的親本氨基酸呈現(xiàn)的受體后水平上的活性的這些氨基酸的衍生物。
有利地是，本發(fā)明用途的特征在于它涉及選自由單羥基化氨基酸、多羥基化氨基酸及這些單或羥基化氨基酸的內(nèi)酯形式組成的組的化合物。
特別是本發(fā)明涉及通式為 的4-羥基異亮氨酸和/或其內(nèi)酯形式的用途。
特別是，本發(fā)明涉及4-羥基異亮氨酸(簡稱為4-OH-lle)的2S，3R，4S異構體或相應的內(nèi)酯形式的用途。
考慮到所觀察到的這些作用，根據(jù)本發(fā)明所生產(chǎn)的藥物特別適合于治療胰島素抗性、抵抗或預防與胰島素抗性相關綜合征以及預防胰島素抗性。
而且，眾所周知在西方國家體重增長過多、缺少運動、飲食低劣和日益增加的老年人口是經(jīng)常面臨的社會-經(jīng)濟因素。這些因素都會促使胰島素抗性和常伴有肥胖的補償性血胰島素增多的發(fā)展，并且它們是潛在致糖尿病的。所以，游離脂肪酸是所提出的試圖用來解釋胰島素抗性、肥胖和血胰島素增高之間密切聯(lián)系的第一個候選者(MacGarry J.D.，J.Cell.Biochem.，555，29，1994)。
目前這種聯(lián)系已經(jīng)成為關系公眾健康的主要現(xiàn)象。聯(lián)系高胰島素血與未來心血管疾病危險、致動脈粥樣硬化或致糖尿病危險的大量臨床和流行病學證據(jù)已經(jīng)能夠繪制出一致的Reaven’s X綜合征表(高胰島素血、胰島素抗性、血清三甘油酯增加、動脈高血壓)和與其有關的致病危險(Reaven G.M.，糖尿病，37，1595，1988)。另外，按照最近的調(diào)查，促使某些上皮細胞(明顯地是結腸中的那些)增生的高胰島素血似乎與癌癥的危險有關(Hu F.B.等，J.Natl.CancerInst.，91，542，1999)。
本申請也涉及所述氨基酸和衍生物用于制備用來抵抗胰島素抗性和胰島素抗性綜合征特別是抗血胰島素增多、與老化有關的胰島素抗性以及與肥胖有關的疾病的藥物的任何用途。
本申請也涉及所述氨基酸和衍生物用于制備用來預防胰島素抗性藥物的任何用途，特別是制備用來降低對外源性胰島素需求的藥物的用途。由于這類藥物的胰島素模擬特性和胰島素敏化特性，對于內(nèi)源胰島素缺乏、甚至在1型糖尿病出現(xiàn)喪失胰島素的患者而言，它們實際上具有降低對外源胰島素需求的作用。患有1型糖尿病的患者實際上忍受著限制全部胰島素外源供應的胰島素分泌的總缺失(生產(chǎn)細胞的損壞)的痛苦。除了這種給藥原有的代價外，這種情況還經(jīng)常導致胰島素抗性的出現(xiàn)。為了預防和治療這些問題，為了治療內(nèi)源胰島素的缺乏，特別是缺少內(nèi)源胰島素如1型糖尿病以及為了制備用于這種治療的藥物，本發(fā)明建議使用至少一種所述氨基酸或衍生物。它們與胰島素的結合使用有利于降低患者對外源胰島素的需求(胰島素必需供應的減少)，并因此降低了治療費用同時預防了胰島素抗性及其副作用的出現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明所生產(chǎn)的藥物也有助于抑制與癌癥出現(xiàn)危險有關的某些細胞系的增生。
本發(fā)明也涉及所述衍生物特別是4-羥基異亮氨酸和/或其內(nèi)酯形式用于制備可通過降低與胰島素受體的信號途徑有關的磷酸酶活性和/或通過促進在IRS-1和/或IRS-2上的PI 3-激酶活性來起作用的藥物的用途。
本發(fā)明也涉及以組合方式含有胰島素和至少一種上述所定義的氨基酸化合物或衍生物的任意藥物組合物、任意藥用試劑盒和任意藥劑。這種組合可以是物理性的(胰島素和氨基酸或衍生物在相同組合物中)?；蛘咚梢韵鄳谖锢砩闲再|不同的組合物的形式提供，其中一個含有胰島素，另一個含有氨基酸或其衍生物，但它們是為了組合應用而組合出現(xiàn)的(分部分的試劑盒(kit-of-parts))。這種組合使用可以是在同一時間或在不同時間。
本發(fā)明藥物主要通過口腔途徑給藥，但也可以通過靜脈或肌肉內(nèi)途徑給藥，并含有按照選定的蓋倫劑型選用的賦型劑。
劑量將與所治病癥相適應。
在下列實施例中通過附圖2到11詳細說明本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(圖1和上文有關并顯示了胰島素信號轉導的主要途徑的圖解)，圖2到11分別表示-圖2，4-OH-lle對大鼠肝臟中胰島素受體及其底物磷酸化的作用，-圖3，4-OH-lle對肝臟PI 3-激酶活性的作用，-圖4，在肝LMH肝系中胰島素在其受體上的結合，-圖5到11，4-OH-lle對下列方面的作用·肌肉的PI 3-激酶活性(圖5)，·大鼠的基礎血胰島素和糖血(圖6)，·2型糖尿病大鼠肝臟的(圖7)和肌肉的(圖8)PI 3-激酶活性(圖7)·肥胖的Zucker大鼠(fa/fa)的PI 3-激酶活性(圖9)，·在正常大鼠的肝臟中與PDGF受體或與胰島素受體有關的PI 3-激酶活性(圖10)，以及·在正常大鼠的肝臟中與IRS-1有關的磷酸酶活性(圖11)。
PI 3-激酶活性的測定在用抗-IRS-1抗體進行的免疫沉淀物上測定PI 3-激酶活性。這樣能夠測定與胰島素作用有關的酶活性并將其與4-OH-lle所誘導的作用進行比較。試驗方法正常雄性Wistar大鼠(IFFA CREDO菌株，法國)經(jīng)腹膜內(nèi)注射接受普通胰島素(100U/kg)或者4-OH-lle(18mg/kg)，或者以相同劑量與4-OH-lle組合的胰島素。對照大鼠通過腹膜內(nèi)途徑接受9‰氯化鈉。注射后15分鐘，處死動物，馬上取下外周組織(肝臟，肌肉)并將其冷凍在液氮中。
為了測定PI 3-激酶的活性，將組織在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑以及增溶劑(Triton)的緩沖液中研磨，正如Taouis等在J.Biol.Chem.，269，14912，1994中所述。增溶后，用抗-IRS-1免疫沉淀上清液并在免疫沉淀物中測定PI 3-激酶的活性。實際上，該反應是通過加入酶的人工底物膦酯酰肌醇(PI)和(33P)gamma ATP啟動的。將反應產(chǎn)物進行薄層色譜(TLC平皿)，并通過STORM磷酸-顯影劑(Molecular Dynamics)測定PI的磷酸化水平。該活性是以儀器所給定的任意單位表示的(通過激光束進行放射活性向發(fā)光的轉化)。與胰島素信號途徑有關的磷酸酶活性的測定在用抗-IRS-1抗體和胰島素抗-受體進行的免疫沉淀物上進行磷酸酶活性的測定。
增溶方法與Taouis等所述的用于PI 3-激酶的方法相同(J.Biol.Chem.，269，14912，1994)。免疫沉淀后，按照Chen等所述的方法(J.Biol.Chem.，272，8026，1997)測定磷酸酶活性。實施例1胰島素和4-OH-lle對正常大鼠肝臟中胰島素受體和IRS-1的磷酸化作用的比較圖2中的結果清楚地顯示了通過單獨注射4-OH-lle(200μg/kgI.P.)的動物治療能夠在體內(nèi)誘導胰島素受體(IR)及其底物(IRS-1)的活化。4-OH-lle(4OH)的作用與胰島素(Ins)的作用是可比的。
這些結果顯示了在對于效應蛋白如PI3-激酶的激活來說是必需的胰島素受體磷酸化和IRS-1磷酸化活化方面4-OH-lle的胰島素模擬作用。實施例2胰島素和4-OH-lle對肝臟的PI 3-激酶活性的作用比較圖3中以直方圖給出了結果。在該圖中，可以看到胰島素但也包括單獨的4-OH-lle顯著激發(fā)(p＜0.05)肝的PI 3-激酶活性。當一起給予兩種物質時，顯示了更好的作用。
這些觀察證實了4-OH-lle在肝臟中具有胰島素模擬作用。另外，當兩種物質共同注射時，客觀化的更大的作用促進了協(xié)同活化機制。
胰島素和4-羥基異亮氨酸對肝細胞胰島素膜受體作用的對比研究證實了4-羥基異亮氨酸沒有與該受體結合。
在圖4中，給出了有關異亮氨酸和4-OH-lle結合的對比結果。在這些試驗中所用的LMH細胞來自于雞的肝癌(Kawaguchi T.等，癌癥研究，47，4460，1987)。實施例3胰島素和4-OH-lle對肌肉的PI 3-激酶活性作用的比較圖5中以直方圖顯示了結果。在該圖中，可以看到不僅胰島素清楚地激發(fā)了PI 3-激酶活性，而且4-OH-lle也具有可比的作用。這樣，在肌肉水平證實了在肝臟水平所觀察到的4-OH-lle的胰島模擬素作用。
所以，在實施例1和2結果的檢查中看到了在肝臟和肌肉水平，4-羥基異亮氨酸獨立于胰島素激發(fā)了IRS-1/PI 3-激酶途徑，這一途徑是控制胰島素代謝和致有絲分裂作用的主要途徑。另外，4-羥基異亮氨酸不識別胰島素受體，或者至少不參與胰島素結合受體的競爭。
圖6中顯示了所獲得的結果。
可觀察到每日給予4-羥基異亮氨酸具有顯著降低(p＞0.05)所治動物胰島素血的作用。
另外，停止治療后，可以看到血漿胰島素再次升高達到接近于治療前所觀察的數(shù)值。在這些條件下，在治療結束時觀察到糖血微微下降。
在用4-羥基異亮氨酸長期治療大鼠后所觀察到的胰島素血下降從體內(nèi)證實了體外試驗中所觀察到的胰島素模擬作用和/或胰島素敏化作用。實施例5胰島素和4-OH-lle對從患有2型糖尿病取出的肌肉和肝臟的PI 3-激酶活性作用的比較圖7和8以直方圖顯示了結果。從中可以看到如果胰島素激活肝臟的PI 3-激酶(圖7)和肌肉PI 3-激酶(圖8)，它是與4-OH-lle相同的。在病理狀態(tài)中的4-OH-lle誘導了與相同強度胰島素的相同作用。
此外，可以看到，4-OH-lle在肌肉(p＜0.01)比在肝臟(p＜0.05)更清楚地顯著刺激了IRS-1/PI 3-激酶途徑。
按照已經(jīng)描述過的方法比較在有或無4-OH-lle(18mg/kg，腹膜內(nèi)注射)存在下PDGF受體與胰島素受體的PI 3-激酶活性。
圖10以直方圖顯示了結果。它們清楚地顯示了4-OH-lle在大鼠肝臟水平作用途徑的特異性，也就是說，只有與胰島素受體有關的PI3-激酶活性增加了(p＜0.05)。實施例84-OH-lle對與胰島素受體信號途徑有關的磷酸酶活性的作用為了更好地給4-OH-lle的作用部位定位，研究了它對磷酸酶活性的影響。測定了與IRS-1有關的磷酸酶活性。
圖11顯示了4-OH-lle(200μmol/l)顯著抑制(p＜0.05)正常大鼠的肝臟中的這種活性。
權利要求
1.選自單羥基化氨基酸、多羥基化氨基酸及這些酸的內(nèi)酯形式的化合物用于制備具有胰島素模擬和/或胰島素敏化作用的藥物的用途。
2.權利要求1中所述的用途，其特征在于所述藥物是用來在胰島素的外周靶組織水平上發(fā)揮胰島素模擬和/或胰島素敏化作用的。
3.權利要求1或2中所述的用途，其特征在于所述化合物降低了與胰島素受體信號途徑有關的磷酸酶活性，和/或刺激在IRS-1和/或IRS-2上的PI 3-激酶活性。
4.前述權利要求中任一項所述的用途，其特征在于所述化合物是通式為 的4-羥基異亮氨酸和/或該氨基酸的內(nèi)酯形式。
5.權利要求4所述的用途，其特征在于4-羥基異亮氨酸是以其2S，3R，4S異構體或相應的內(nèi)酯形式存在的。
6.權利要求1-5任一項中所述的用于制備治療胰島素抗性的藥物的用途。
7.權利要求1-6任一項中所述的用于制備抵抗與胰島素抗性有關綜合征的藥物的用途。
8.權利要求1-7任一項中所述的用于制備抵抗血胰島素增多的藥物的用途。
9.權利要求1-7任一項中所述的用于制備抵抗與老化有關的胰島素抗性藥物的用途。
10.權利要求1-7任一項中所述的用于制備抵抗與肥胖有關疾病的藥物的用途。
11.權利要求1-7任一項中所述的用于制備用來抑制與癌癥發(fā)生危險有關的細胞系增殖的藥物的用途。
12.權利要求1-5任一項中所述的用于制備用來預防胰島素抗性的藥物的用途。
13.權利要求1-5和12任一項中所述的用于制備用來降低對外源胰島素需求的藥物的用途。
14.藥物組合物或試劑盒，其含有胰島素和選自單羥基化氨基酸、多羥基化氨基酸及這些酸的內(nèi)酯形式的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用單羥基或多羥基氨基酸及其內(nèi)酯形式制備對胰島素外周靶組織具有胰島素模擬和/或胰島素敏化作用的藥物的用途,更具體地說是它們制備用來治療和預防胰島素抗性藥物的用途。
文檔編號A61P3/04GK1376062SQ00813316
公開日2002年10月23日 申請日期2000年8月23日 優(yōu)先權日1999年8月27日
發(fā)明者G·里比斯, M·陶伊斯, P·R·派提特, C·布羅卡, Y·索瓦里, B·保 申請人:因諾迪亞公司