專利名稱：對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的裝置及方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種對(duì)流體進(jìn)行生物修飾裝置和方法，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種可補(bǔ)充、增加或替代器官功能的一種人工裝置。在特定情況下，該人工裝置含有肝微器官培養(yǎng)體。在更特定的情況下，該人工裝置含有一種可存活的腎微器官組件。在更特定的情況下，該人工裝置含有常用于血液透析的一種透析部件。腎微器官培養(yǎng)體與透析部件一同可作為腎臟代用品來(lái)發(fā)揮生理學(xué)作用。
此外，本發(fā)明還涉及一種裝置和方法，通過(guò)使用同時(shí)含有肝微器官培養(yǎng)體和腎微器官培養(yǎng)體的單個(gè)人工裝置來(lái)補(bǔ)充、增加或替代肝與腎的功能。
此外，本發(fā)明還涉及一種裝置和方法，通過(guò)使用含有比率約為6∶1地肝微器官培養(yǎng)體及腎微器官培養(yǎng)體的單個(gè)人工裝置來(lái)補(bǔ)充、增加或替代肝與腎的功能。
此外，本發(fā)明還涉及一種含有肝與腎的組合微器官培養(yǎng)體以及一種透析部件的人工裝置。
此外，本發(fā)明還涉及一種制備可存活組織的方法，該組織無(wú)需進(jìn)行前期培養(yǎng)即可保存在人工裝置中，用于補(bǔ)充、增加或替代器官的功能，也可在此后移植到宿主內(nèi)。
有多種體內(nèi)器官，如肝臟和腎臟，可對(duì)血液等體液進(jìn)行修飾。腎臟是一種多功能器官，它能夠以尿素形式排泄含氮廢物、排泄過(guò)量的無(wú)機(jī)鹽，并能夠主動(dòng)分泌促紅細(xì)胞生成素和其它物質(zhì)，例如，但不局限于，凝乳酶和組織纖維蛋白溶酶原激活質(zhì)。肝臟能夠從血液中去除毒性物質(zhì)，并能夠行使多種生化功能，例如，但不局限于，將氨解毒成尿素、膽紅素代謝、糖原儲(chǔ)存、脂類合成、藥物代謝、白蛋白分泌和凝血因子分泌。肝臟與腎臟的功能密切相關(guān)，有多種代謝副產(chǎn)物和毒素由肝臟經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)流至腎臟，繼而被分泌到尿中。因此，肝臟和腎臟都是不可缺少的器官，這兩種器官的協(xié)同作用至關(guān)重要。肝衰竭或腎衰竭病人若未能立即治療，其死亡的可能性非常大。
有多種因素可導(dǎo)致肝衰竭，其中包括，例如，暴露于毒性物質(zhì)、肝炎和遺傳缺陷(Kasai，et al.，Artif.Organs，18348-54，1994)。如今在急性肝衰竭患者中有70％因未能得到治療而死亡(Kasai，etal.，Artif.Organs，18348-54，1994)。此外，有10-30％的患者因等待供體肝器官而死亡(LePage，et al.，Am.J.Crit.Care，3224-7，1994；Sussman，et al.Artif.Organs，18390-6，1994；and Uchino& Matsushita，Asaio J.，4074-7，1994)。
能夠在肝衰竭期間暫時(shí)行使肝臟功能的床邊生命維持裝置稱為體外肝臟裝置——ELD。有多種原因說(shuō)明該裝置的開(kāi)發(fā)和商品化會(huì)帶來(lái)明顯的巨大利益(Fox et al，Am.J.Gastroenterol.，881876-81，1993)。在美國(guó)，ELD每年使大約2000名爆發(fā)性肝功能衰竭(FH)患者受益(Hoofnagle，et al.，Hepatology，21240-52，1995)。該裝置還可作為等待供體器官的患者在肝移植前的過(guò)渡裝置使用。
此外，可考慮使用能維持?jǐn)?shù)周功能的ELD來(lái)恢復(fù)患者自身肝臟的正常功能。由于受損的肝臟中不可能所有肝細(xì)胞都被破壞，因而為肝臟提供2-3周的充分支持會(huì)使受損肝臟中幸存的肝細(xì)胞重新恢復(fù)。在患有致死性肝疾病的動(dòng)物模型中，肝臟的重新恢復(fù)只需不到12個(gè)肝細(xì)胞(Sandgren et al.，Cell，66245-56，1991)。90-95％肝臟壞死的患者只需幾天的支持即可重新獲得足以獨(dú)立生存的功能(Sussman et al.Artif.Organs，19390-6，1994)。
為了提供這種ELD，已努力開(kāi)發(fā)出幾種純機(jī)械的非生物性血液處理裝置。從最基本的形式來(lái)看，這些裝置的目的是利用孔徑較小的膜來(lái)選擇性去除毒素，同時(shí)添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。HemocleanseTM開(kāi)發(fā)出的非生物性裝置是其中最先進(jìn)的裝置之一，最近已得到FDA的認(rèn)證。在利用該HemocleanseTM裝置進(jìn)行的隨機(jī)受控臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，代謝物的去除很有限，同時(shí)對(duì)血液的氨含量沒(méi)有明顯影響(Hughes et al.，Int.J.Artif.Org.，17657-662，1994)。很明顯，肝臟的功能異常復(fù)雜，目前還不可能只用機(jī)械的或化學(xué)的裝置來(lái)替代。
目前可使用的其它ELDs以生物材料為出發(fā)點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，有一種經(jīng)過(guò)大多數(shù)臨床試驗(yàn)的裝置稱為ELAD(體外肝臟輔助裝置)，該裝置用轉(zhuǎn)化的無(wú)限增殖人細(xì)胞系作為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的來(lái)源(Sussman et al.Artif.Organs，19390-6，1994)。該裝置的初次試驗(yàn)符合“未批準(zhǔn)醫(yī)療裝置的急救備用”或“研究裝置免責(zé)條例”的情況。其效率未經(jīng)測(cè)定，但除了可通過(guò)藥物治療來(lái)加以控制的凝血現(xiàn)象之外，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的不良副作用。無(wú)限增殖人細(xì)胞系可作為細(xì)胞的消耗來(lái)源，所以其應(yīng)用非常方便，但它并不是最理想的，其原因主要有兩個(gè)。第一，在臨床實(shí)踐中使用無(wú)限增殖細(xì)胞系會(huì)帶來(lái)明顯的安全及控制問(wèn)題。第二，并不認(rèn)為無(wú)限增殖細(xì)胞具有最初肝細(xì)胞的所有正常生理特性，尤其是在大規(guī)模的擴(kuò)增之后(Sussman et a1.Artif.Organs，1990-6，1994)。
獲得用于ELD的肝細(xì)胞源的另一種常規(guī)方法是由完整的肝臟分離出肝細(xì)胞或肝組織。此前常利用酶，如膠原酶，來(lái)分離肝臟細(xì)胞，但這些酶會(huì)破壞肝臟的正常顯微結(jié)構(gòu)。也有嘗試使用肝臟碎片的方法，但未將碎片的形狀設(shè)計(jì)成最適于維護(hù)組織的適當(dāng)表面積/體積比(Lie etal.，Res Exp Med(Berl)185483-94，1985)。
目前，培養(yǎng)哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞的方法在提供條件使細(xì)胞聚集成與完整機(jī)體中真實(shí)組織的三維空間形式類似的組織能力方面仍受到限制。由于類似的原因，傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法會(huì)限制培養(yǎng)組織對(duì)高度功能特異性狀態(tài)或?qū)Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞分化以及具有研究及藥學(xué)意義的特定生物活性分子的分泌至關(guān)重要的不同狀態(tài)的表現(xiàn)能力。與微生物不同的是，高等生物，如哺乳動(dòng)物，的細(xì)胞可自身形成高度有序的多細(xì)胞組織。盡管這種自組裝的確切機(jī)制仍不清楚，但從目前的情況來(lái)看，細(xì)胞發(fā)展成組織依賴于細(xì)胞相互間或相對(duì)于另一錨定基的取向和(或)諸如激素等特定物質(zhì)的存在與否?？偟膩?lái)說(shuō)，目前用于器官輔助裝置的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法都無(wú)法既使細(xì)胞在體外發(fā)揮正常功能，同時(shí)又可維持關(guān)鍵性的細(xì)胞/細(xì)胞/基質(zhì)相互作用和適當(dāng)微環(huán)境以極好地模擬體內(nèi)器官的組織結(jié)構(gòu)與功能。本發(fā)明則提供一種方法，用于在ELD內(nèi)使用器官組織，其中包括肝組織，這對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)而言是一個(gè)重大的進(jìn)步。
這種使用器官組織，其中包括但不局限于肝組織，的方法依賴于在微器官培養(yǎng)之前或之后的冷凍保存技術(shù)。適當(dāng)冷凍保存液的成分可包括，但不局限于，美國(guó)專利5,879,875所授的蜜三糖或海藻糖，該專利在此全面引用作為參考。
在肝臟中，不同的細(xì)胞群體和基質(zhì)成分呈獨(dú)特的并置排列，與血管結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)一致，構(gòu)成一種精密的生物生態(tài)系統(tǒng)。因此不同于普通的肝細(xì)胞培養(yǎng)物，后者甚至連最低限度的肝臟功能都不可能實(shí)現(xiàn)。如前所述，高等生物，如哺乳動(dòng)物，的細(xì)胞可自身形成高度有序的多細(xì)胞組織。細(xì)胞與非細(xì)胞基底(基質(zhì))間存在物理性接觸，例如表皮細(xì)胞與其基底層之間的物理接觸。細(xì)胞相互間還存在功能性接觸，包括細(xì)胞間的電通訊或化學(xué)通訊。舉例來(lái)說(shuō)，心肌細(xì)胞可通過(guò)電脈沖與其它心肌細(xì)胞聯(lián)絡(luò)。此外，許多細(xì)胞可通過(guò)化學(xué)信息，如激素，與其它細(xì)胞聯(lián)絡(luò)，這些信息可局部擴(kuò)散(旁分泌信號(hào)發(fā)放和自分泌信號(hào)發(fā)放)，或可通過(guò)血管系統(tǒng)被運(yùn)送到更遠(yuǎn)的部位(內(nèi)分泌信號(hào)發(fā)放)。細(xì)胞間旁分泌信號(hào)發(fā)放的實(shí)例有不同消化道細(xì)胞(稱為腸內(nèi)分泌細(xì)胞)產(chǎn)生的信息，如幽門(mén)D細(xì)胞可分泌生長(zhǎng)抑素，該激素可轉(zhuǎn)而抑制附近的幽門(mén)促胃液素(D)細(xì)胞釋放促胃液素。這種顯微結(jié)構(gòu)對(duì)在基本培養(yǎng)基，如不含外源血清或生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基，中維持器官的組織外植塊極為重要，因?yàn)樵谶@種基本培養(yǎng)基中可通過(guò)微器官內(nèi)部特定細(xì)胞相互作用產(chǎn)生的旁分泌及自分泌因子來(lái)維持肝組織。
這種微器官培養(yǎng)體的制備方法在美國(guó)專利5,888,720和美國(guó)專利申請(qǐng)08/482,364中均有所描述，在此引入作為參考。在微器官培養(yǎng)體的制備方法中，構(gòu)成外植塊的細(xì)胞群體分離自肝臟，其分離方式可保持細(xì)胞間的天然親和性，例如，可按器官本身的情況維持不同的細(xì)胞層。舉例來(lái)說(shuō)，在皮膚微器官培養(yǎng)體中，表皮的角化細(xì)胞仍與基質(zhì)相聯(lián)系，同時(shí)保留正常的組織結(jié)構(gòu)，包括毛囊和腺體。這種基本結(jié)構(gòu)是所有器官所共有的，例如含有上皮部分和基質(zhì)部分的器官。此外，這種聯(lián)系能夠促進(jìn)細(xì)胞間通訊。這對(duì)分化細(xì)胞來(lái)說(shuō)尤其重要，此時(shí)“誘導(dǎo)”的定義是，一種(誘發(fā))組織或細(xì)胞與另一種(應(yīng)答)組織或細(xì)胞間的相互作用，其結(jié)果是應(yīng)答細(xì)胞的分化方向發(fā)生改變。此外，在胚細(xì)胞和成體細(xì)胞間可產(chǎn)生相互的誘導(dǎo)作用，這種作用除能夠誘導(dǎo)分化外，還可建立并維持形態(tài)發(fā)生的模式(Gurdon，Cell，68185-199，1992)。
此外，按美國(guó)專利申請(qǐng)08/482,364制備的微器官培養(yǎng)體可保持正常的肝組織結(jié)構(gòu)，甚至在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)后也是如此。這些培養(yǎng)體可在統(tǒng)一的受控條件下加以維持，并且與體內(nèi)組織非常相似，因此可作為體外功能性肝細(xì)胞的唯一持續(xù)來(lái)源。
現(xiàn)有技術(shù)中的器官輔助裝置或相關(guān)裝置都不使用微器官培養(yǎng)體或冷凍微器官培養(yǎng)體來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾。
美國(guó)約有200,000人患有急性腎衰竭(ARF)。該群體的死亡率約為50％。其治療僅限于支持性醫(yī)護(hù)、透析和移植。甚至對(duì)這些人經(jīng)常進(jìn)行連續(xù)透析也不能滿足要求。據(jù)National Kidney Foundation估計(jì)，約有53,000個(gè)美國(guó)人在等待移植器官來(lái)救命；每天有10人在等待中死亡。
保健行業(yè)的另一個(gè)重要需求是補(bǔ)充或替代腎透析。遺憾的是，目前透析方法作為腎衰竭的解決方法，不但臨床應(yīng)用困難，而且價(jià)格昂貴。因而嘗試用一種較為簡(jiǎn)單的過(guò)濾系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行透析，以代替異常復(fù)雜并且使用受到限制的機(jī)械器官。
美國(guó)約有250,000人接受透析治療，其費(fèi)用達(dá)數(shù)十億美元。ESRD人數(shù)每年增加7％-9％；到2010年，此類患者將超過(guò)350,000人。為每個(gè)接受透析的患者提供護(hù)理的平均費(fèi)用為45,000美元/年。
盡管接受移植器官的患者可具有更靈活的生活方式，并且可保持更佳的狀態(tài)，但如上文所述，等待腎移植器官的患者約有50,000人。去年，這些等待的人中只有約1/5接受了器官移植。
用血液透析作為處理方法有幾個(gè)固有的缺點(diǎn)。第一，它需要使用昂貴的儀器和熟練的醫(yī)療輔助人員來(lái)操作該儀器。第二，由于門(mén)診病人一般要每周進(jìn)行幾次處理，因而其費(fèi)用昂貴，且患者不能遠(yuǎn)離治療設(shè)施。此外，被治療的患者必須在此期間保持嚴(yán)格的飲食，這樣就通常會(huì)由于不能遵守而導(dǎo)致醫(yī)療危險(xiǎn)。每次處理要持續(xù)數(shù)小時(shí)，而且要通過(guò)靜脈穿刺來(lái)與血液透析機(jī)相聯(lián)接。所以一些長(zhǎng)期血液透析患者會(huì)在臂部最容易穿刺的靜脈出現(xiàn)靜脈萎陷。
對(duì)腎功能缺乏患者而言，盡管腎移植本身具有一些固有的缺點(diǎn)，但仍被認(rèn)為是優(yōu)選的治療方法。許多醫(yī)療中心都將其作為常規(guī)方法使用，但該方法仍會(huì)帶來(lái)與腹內(nèi)手術(shù)相關(guān)的所有風(fēng)險(xiǎn)。此外，為了防止器官排異，往往要利用免疫抑制性藥物對(duì)接受移植的患者進(jìn)行長(zhǎng)期處理，這種做法會(huì)使他們受感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。最大的問(wèn)題在于，可用來(lái)移植的腎臟長(zhǎng)期短缺，而供體器官與適當(dāng)受者相匹配的難度很大。甚至在移植成功的情況下，受者也只有一個(gè)腎臟。用諸如本發(fā)明的裝置來(lái)補(bǔ)充移植腎臟的功能的方法可減輕移植腎臟的負(fù)荷，從而延長(zhǎng)其移植后的存活時(shí)間。
為了解決供體腎長(zhǎng)期短缺的問(wèn)題，人們?cè)陂_(kāi)發(fā)人性化基因工程豬以充當(dāng)器官供體方面付出了相當(dāng)大的努力。遺憾的是，盡管它在技術(shù)上可行，但最近發(fā)現(xiàn)的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(pervs)使人們對(duì)異種移植方法的合理性產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)膽岩?。使用按本發(fā)明所述經(jīng)物理方法分離自患者的微器官培養(yǎng)體的技術(shù)是可行的，它有助于在人體內(nèi)安全使用這些改造的豬器官。
因而人們普遍認(rèn)為，需要一種不存在上述限制的裝置和方法來(lái)補(bǔ)充、增加或替代肝臟的功能、腎臟的功能，或二者兼顧，這將會(huì)帶來(lái)極大的利益。這種裝置和方法能夠使患者在等待移植的同時(shí)享受更高的生活質(zhì)量，還能使患者在接受新器官后的平均壽命延長(zhǎng)，在某些情況下還會(huì)使患者自身的器官在該裝置支持下得以恢復(fù)。
美國(guó)專利5,888,720講述了一種用來(lái)繁殖非胚胎性動(dòng)物細(xì)胞群體的體外微器官培養(yǎng)系統(tǒng)及其制備方法，該系統(tǒng)將上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞一同置于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這些細(xì)胞可存活24小時(shí)以上。更優(yōu)選地，此專利涉及一種體外微器官培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將包括一種上皮組織和一種基質(zhì)組織在內(nèi)的群體共同培養(yǎng)，并且經(jīng)組織學(xué)方法測(cè)定仍可保持基質(zhì)組織與上皮組織的形式，同時(shí)經(jīng)DNA合成方法測(cè)定在無(wú)血清的情況下至少可存活48小時(shí)。最優(yōu)選地，此專利涉及一種體外微器官培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，這些細(xì)胞經(jīng)組織學(xué)方法測(cè)定仍可保持基質(zhì)組織與上皮組織的形式，同時(shí)經(jīng)DNA合成方法測(cè)定在無(wú)血清的情況下至少可存活7天。據(jù)美國(guó)專利5,888,720所述，這些微器官培養(yǎng)體無(wú)需在內(nèi)部使用合成的支持結(jié)構(gòu)，并且不使用層狀支持結(jié)構(gòu)。
美國(guó)專利5,888,720還指出，微器官培養(yǎng)體的第一條邊不大于第二條邊，而且小于第三條邊，其中第一條邊的測(cè)量方向基本與獲得微器官培養(yǎng)體的原器官的外表面平行。該專利還指出，置于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的非胚胎性動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自一種具有活體組織結(jié)構(gòu)的器官，該器官含有上皮組織和毗連的基質(zhì)組織，其中上皮組織的第一表面相當(dāng)于器官的外表面，第二表面則與基質(zhì)相接觸。這種微器官培養(yǎng)體可來(lái)源于，例如但不局限于，肺、十二指腸、食管、腸、結(jié)腸、肝和胰等器官。
根據(jù)美國(guó)專利5,888,720，微器官培養(yǎng)體的表面積/體積指數(shù)被定義為“Aleph”，其中Aleph＝1/x+1/a＞1.5mm-1，x為組織厚度，a為組織寬度，單位均為毫米。該專利指出，微器官培養(yǎng)體的第一條邊不大于第二條邊，而且小于第三條邊，其中第一條邊不大于0.45mm。在確定表面積/體積指數(shù)時(shí)不考慮第三條邊，這是因?yàn)榈谌龡l邊的變化會(huì)使體積和表面積按比例改變。因此，在確定Aleph時(shí)，a和x應(yīng)該是組織片最短的兩條邊。
該表面積/體積指數(shù)構(gòu)成本發(fā)明獨(dú)特的一方面，因?yàn)樗軌蚴範(fàn)I養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)擴(kuò)散均衡地到達(dá)組織中的所有細(xì)胞。使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散到三維微器官培養(yǎng)體的每個(gè)細(xì)胞的要求是Aleph至少約為1.5mm-1。
此外，據(jù)美國(guó)專利5,888,720所述，細(xì)胞群體的聚集方式要能夠維持一個(gè)細(xì)胞與另一個(gè)細(xì)胞的天然親和力，從而保持上皮組織和基質(zhì)組織的活體結(jié)構(gòu)。舉例來(lái)說(shuō)，在皮膚微器官培養(yǎng)體中，表皮的角化細(xì)胞仍與基質(zhì)相聯(lián)系，同時(shí)保留正常的組織結(jié)構(gòu)，其中包括毛囊。這種聯(lián)系能夠促進(jìn)細(xì)胞間通訊。在動(dòng)物細(xì)胞間存在多種類型的通訊方式。這對(duì)分化細(xì)胞來(lái)說(shuō)尤其重要，此時(shí)“誘導(dǎo)”的定義是，一種(誘發(fā))組織或細(xì)胞與另一種(應(yīng)答)組織或細(xì)胞間的相互作用，其結(jié)果是應(yīng)答細(xì)胞的分化方向發(fā)生改變。此外，在胚胎細(xì)胞和成體細(xì)胞間可相互產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，這種作用除能夠誘導(dǎo)分化外，還可建立并維持形態(tài)發(fā)生的模式(Gurdon，(1992)Cell 68185-199)。
根據(jù)美國(guó)專利5,888,720，按本發(fā)明實(shí)施例1所述制備的微器官培養(yǎng)體含有以某種方式聚集的細(xì)胞群體，該細(xì)胞群體含有基質(zhì)層和上皮層，從而可保持天然的組織結(jié)構(gòu)。此專利講述了由動(dòng)物制備微器官培養(yǎng)體的方法，該方法包括分離成人的皮膚、小鼠、豚鼠和大鼠的皮膚，并在培養(yǎng)基上培育長(zhǎng)達(dá)21天。但將培養(yǎng)體維持21天以上以及由其它動(dòng)物獲得這些培養(yǎng)體的情況亦處在該專利所述發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外還講述了來(lái)源于皮膚和其它器官，如哺乳動(dòng)物的胰、肝、腎、十二指腸及食管，的微器官培養(yǎng)體。類似地，利用美國(guó)專利5,888,720所述的方法可制備出來(lái)源于諸如腸和結(jié)腸等食管的上皮微器官培養(yǎng)體，還可制備出來(lái)源于哺乳動(dòng)物角膜、腎、乳房組織以及多種腸衍生組織的上皮微器官培養(yǎng)體。
美國(guó)專利5,888,720還指出，這些微器官培養(yǎng)體可維持在不含血清的Dulbecco’s Minimal Essential等簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中，同時(shí)經(jīng)組織學(xué)方法測(cè)定仍保持基質(zhì)和上皮組織的形式，并且經(jīng)DNA合成方法測(cè)定仍保持細(xì)胞存活能力。培養(yǎng)基和培養(yǎng)體可裝在氧壓基本不超過(guò)大氣中氧分壓的一種培養(yǎng)小室中。此外，培養(yǎng)體可在不含血清和任何其它生物流體的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且可長(zhǎng)時(shí)間保持，如48小時(shí)-21天。
據(jù)美國(guó)專利5,888,720所述，微器官培養(yǎng)體可保持在任何適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)小室中，如24孔或96孔微量滴定板，并且可保持在37℃和5％CO2的條件下?？蓪⑴囵B(yǎng)物進(jìn)行振蕩以促進(jìn)通氣，振蕩速度為，例如，12rpm。
此外，美國(guó)專利5,888,720還講述了具有上述特性的微器官培養(yǎng)體的制備方法。發(fā)明概述
本發(fā)明提供一種對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的裝置，該裝置包括(a)帶有一個(gè)流體入口和一個(gè)流體出口的一種小室；以及(b)至少一種器官的微器官培養(yǎng)體的集合，用來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾，該集合的每種微器官培養(yǎng)體均含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過(guò)約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中可保持器官單位(如肝腺泡)的活體器官構(gòu)造(器官結(jié)構(gòu))，微器官培養(yǎng)體的集合位于所述小室內(nèi)，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)有，生物流體的人口和出口采用管道形式，并且該裝置安裝在患者體外。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，生物流體的人口和出口采用半透膜形式，并且該裝置以可體內(nèi)移植裝置的形式安裝在患者體內(nèi)。
優(yōu)選的可選器官包括肝臟和(或)腎臟。同樣優(yōu)選地，微器官培養(yǎng)體的集合可含有至少來(lái)自一種器官的細(xì)胞，從而可維持細(xì)胞間的相互接觸。最優(yōu)選地，各微器官培養(yǎng)體集合的Aleph均至少約為2.6mm- 1。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，微器官培養(yǎng)體基本上都被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片基本都處在所述小室內(nèi)。優(yōu)選地，該薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。同樣優(yōu)選地，可將方向基本平行的多層薄片裝在小室中，從而使流體能夠在薄片間自由流動(dòng)。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案提供一種對(duì)受試者的流體進(jìn)行生物修飾的裝置，該裝置包括(a)帶有一個(gè)流體入口和一個(gè)流體出口的一種小室；(b)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的每種微器官培養(yǎng)體均含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過(guò)約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中可保持器官單位的活體器官構(gòu)造，微器官培養(yǎng)體的集合位于所述小室內(nèi)，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸；(c)具有第一和第二末端的第一管道，第一末端用來(lái)聯(lián)接受試者以接收流體，第二末端用來(lái)聯(lián)接入口；以及(d)具有第一和第二末端的第二管道，第一末端用來(lái)聯(lián)接出口，第二末端用來(lái)聯(lián)接受試者以使生物修飾后的流體返回受試者。
本發(fā)明的其它一些實(shí)施方案提供一種對(duì)來(lái)自受試者的流體進(jìn)行生物修飾的方法，該方法包括，用來(lái)自受試者的流體對(duì)含有微器官培養(yǎng)體集合的一種小室進(jìn)行灌注，以使微器官培養(yǎng)體的集合能夠?qū)υ摿黧w進(jìn)行生物修飾，其中，集合的各微器官培養(yǎng)體均含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過(guò)約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中保持器官單位的活體器官構(gòu)造。
本發(fā)明的其它一些實(shí)施方案提供一種制備連續(xù)平面器官的方法。該方法包括(a)獲得一種器官的單個(gè)微器官培養(yǎng)體的集合，使該集合的每種微器官培養(yǎng)體均含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過(guò)約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體可保持器官單位的活體器官構(gòu)造；以及(b)將來(lái)源于該器官的一種細(xì)胞懸浮液添加(如平鋪)在微器官培養(yǎng)體上，并將細(xì)胞懸浮液與微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由衍生于微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與懸浮細(xì)胞的混合物形成連續(xù)平面器官。
根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案，可在連續(xù)肝平面器官內(nèi)提供肝微器官培養(yǎng)體的集合，該平面器官的制備方法是將肝細(xì)胞和(或)內(nèi)皮細(xì)胞或其它類型的細(xì)胞與肝微器官培養(yǎng)體的集合共培養(yǎng)，從而由微器官培養(yǎng)體細(xì)胞與所選細(xì)胞的混合物形成連續(xù)肝平面器官。
本發(fā)明的其它一些實(shí)施方案提供一種制備連續(xù)肝平面器官的方法。該方法包括(a)獲得單個(gè)肝微器官培養(yǎng)體的集合，使該集合的每種微器官培養(yǎng)體均含有肝細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過(guò)約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中保持腺泡體的活體肝臟結(jié)構(gòu)；以及(b)將肝細(xì)胞和(或)內(nèi)皮細(xì)胞或其它類型的細(xì)胞的懸浮液添加(如平鋪)在微器官培養(yǎng)體上，并將細(xì)胞懸浮液與肝微器官培養(yǎng)體的集合共培養(yǎng)，從而由衍生于微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與所選細(xì)胞的混合物形成連續(xù)肝平面器官。
一方面，本發(fā)明提供一種裝置，用于在器官功能受損的情況下為受試者提供一種或多種器官功能，該裝置包括一種小室，其中含有多個(gè)微器官培養(yǎng)體，從而使微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時(shí)至少與其中的一部分相接觸，其中，多個(gè)微器官培養(yǎng)體的每個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100或150微米，但又不超過(guò)約225微米，從而能夠在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)能夠使各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死。
另一方面，本發(fā)明提供一種方法，用于在器官功能受損的情況下為受試者提供一種或多種器官功能，該方法包括(a)提供一種含有多個(gè)微器官培養(yǎng)體的小室，其中單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過(guò)約225微米，從而能夠在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)能夠使各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及(b)在小室與受試者的循環(huán)系統(tǒng)之間形成流體交通，使血液能夠由受試者流經(jīng)小室并由小室流回受試者，從而使微器官培養(yǎng)體在所述受試者的血液流經(jīng)所述小室時(shí)至少能夠與其中的一部分相接觸。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)有，本發(fā)明的小室可安裝在體外。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，本發(fā)明的小室采用可體內(nèi)移植的形式。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，本發(fā)明還包括那些用來(lái)補(bǔ)充、增加或替代器官功能的系統(tǒng)，作為代用品時(shí)，這些系統(tǒng)依賴于微器官培養(yǎng)體，并且是其功能的組成部分。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，本發(fā)明還包括那些以微器官培養(yǎng)體作為其功能的組成部分的用來(lái)補(bǔ)充、增加或替代器官功能的方法。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)還有，被補(bǔ)充、增加或替代的器官功能為肝器官的功能。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)還有，被補(bǔ)充、增加或替代的器官功能為腎器官的功能。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)還有，被補(bǔ)充、增加或替代的器官功能為腎臟與肝臟的器官功能。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)還有，被補(bǔ)充、增加或替代的器官功能包括將小分子排泄至體外的透析功能。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)還有，血液可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)與小室和受試者的循環(huán)系統(tǒng)相連的管道進(jìn)出該小室。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)還有，血液可通過(guò)由能夠促進(jìn)新血管形成的生物相容性膜構(gòu)成的小室外壁進(jìn)出該小室。在新血管形成前，血液通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)出該小室。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，內(nèi)部的生物相容性半透膜中另含有MCs，因而小室中來(lái)自血液的血漿可擴(kuò)散到膜內(nèi)并與MCs相接觸，同時(shí)MCs的分泌物可擴(kuò)散到小室內(nèi)的血液中，繼而返回受試者的循環(huán)系統(tǒng)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，所述生物相容性膜為聚碳酸酯。
本發(fā)明的下述優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，將來(lái)自細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞與多種微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)以形成連續(xù)平面器官。
本發(fā)明的下述優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，來(lái)自細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞為肝臟衍生細(xì)胞。
本發(fā)明的下述優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，來(lái)自細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞為腎臟衍生細(xì)胞。
本發(fā)明的下述優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入小室前融解。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，利用冷凍保存的器官的一部分來(lái)制備微器官培養(yǎng)體。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，利用冷凍保存的肝臟的一部分來(lái)制備肝微器官培養(yǎng)體。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，利用冷凍保存的腎臟的一部分來(lái)制備腎微器官培養(yǎng)體。
本發(fā)明的其它一些實(shí)施方案提供一種制備冷凍微器官培養(yǎng)體的方法，該方法包括(a)至少將器官的一部分冷凍保存；(b)將冷凍保存的器官切成片，同時(shí)保持所得切片的冷凍保存狀態(tài)；(c)在使用前將冷凍保存器官的冷凍保存切片融解；以及(d)用融解的切片作為微器官。這種冷凍微器官可在融解后加到裝置中，或可在融解后進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后再加到裝置中。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)有，將器官冷凍保存在一種溶液中，該溶液至少有一種組分選自DMEM、DMSO、甘油、海藻糖、蜜三糖、一種抗生素、一種抗霉菌素和葡萄糖。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，將器官冷凍保存的溫度以及將器官切片的溫度為-180-0℃。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，來(lái)自器官的一部分的切片厚度約為200-400微米。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，在融解并用作微器官前，冷凍切片可再保存一段時(shí)間，也可立即融解并使用。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它特點(diǎn)還有，用融解的切片作為微器官的實(shí)施方法是(i)提供一種小室；(ii)將多個(gè)融解的切片置于該小室內(nèi)；(iii)至少將受試者的部分血液引入該小室，以使多個(gè)融解的切片至少與受試者的部分血液相接觸，其中多個(gè)融解切片的單個(gè)融解切片內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)融解切片的最近端表面至少約100或150微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各融解切片中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使多個(gè)融解切片的各融解切片內(nèi)位置最深的細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及(iv)至少將一部分與融解切片接觸過(guò)的受試者血液重新引入受試者。
本發(fā)明提供一種裝置和方法，用于在肝臟功能受損、腎臟功能受損或兩種功能均受損的情況下來(lái)補(bǔ)充、增加或替代這些功能，從而成功解決了目前已知裝置的缺點(diǎn)。此外，本發(fā)明有助于解決供體移植器官長(zhǎng)期短缺的問(wèn)題，并可能減少組織排異以及移植器官傳遞疾病的問(wèn)題。此外，本發(fā)明提供的方法可維持組織的結(jié)構(gòu)，并且無(wú)需在使用前用人工培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，因而可提高器官輔助裝置中的細(xì)胞集結(jié)效率，尤其會(huì)減少細(xì)胞在制備過(guò)程中承受的壓力。附圖簡(jiǎn)述
本發(fā)明將利用附圖來(lái)加以說(shuō)明，這些附圖只作為實(shí)例。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，在細(xì)節(jié)上參考特定附圖時(shí)，提供的細(xì)節(jié)只作為例子來(lái)對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明性論述。提供這些細(xì)節(jié)的原因是，相信它們能夠?qū)Ρ景l(fā)明的原理和概念性問(wèn)題進(jìn)行最有效和最易于理解地描述。因此，除了為基本了解本發(fā)明而必需的一些描述之外，未對(duì)本發(fā)明的構(gòu)造細(xì)節(jié)做更詳細(xì)地描述，附圖的描述會(huì)使該領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚地了解本發(fā)明在實(shí)踐中會(huì)有幾種具體的表現(xiàn)形式。
附圖中


圖1A-1D為用來(lái)容納代謝活性微器官培養(yǎng)體的典型生物反應(yīng)器的示意圖2A和2B為微器官培養(yǎng)體的免疫隔離室示意圖3A-3C為本發(fā)明的另一種生物反應(yīng)器的示意圖4為使用圖1或圖3所示生物反應(yīng)器的裝置的示范性操作電路示意圖5顯示幾種微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞增殖測(cè)定結(jié)果；
圖6顯示小鼠肝細(xì)胞在微器官培養(yǎng)體中產(chǎn)生白蛋白的測(cè)定結(jié)果；
圖7顯示小鼠肝微器官培養(yǎng)體中氨向尿素的轉(zhuǎn)化；
圖8顯示人類肝微器官培養(yǎng)體可長(zhǎng)期地將大量氨轉(zhuǎn)化成尿素；
圖9顯示人類肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性；
圖10顯示冷凍保存的肝微器官培養(yǎng)體培育在37℃時(shí)仍具有功能；
圖11顯示冷凍保存的人類肝微器官培養(yǎng)體培育在37℃時(shí)重新恢復(fù)了功能；
圖12顯示封裝在藻酸鹽片中的小鼠肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性；
圖13顯示培育在100％胎牛血清中的小鼠肝微器官培養(yǎng)體仍具有功能；
圖14A和14B顯示封裝在藻酸鹽片中冷凍后再融解的大鼠肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性；
圖15顯示可安全地將本發(fā)明的一例裝置與正常大鼠相連接；以及
圖16顯示小鼠肝微器官培養(yǎng)體的最佳厚度為450微米。
圖17顯示可為患者提供器官功能、同時(shí)進(jìn)行血液透析的另一種附加系統(tǒng)的橫斷面圖。
圖18為腎MCs的氨產(chǎn)量隨時(shí)間的作圖，圖中對(duì)包含及不含谷氨酰胺/Hepes的培養(yǎng)基進(jìn)行了比較。
圖19的曲線圖顯示本發(fā)明的腎MCs在低pCO2及高pCO2條件下的尿素產(chǎn)量和氨產(chǎn)量。氨產(chǎn)量不受CO2濃度的影響，而尿素產(chǎn)量取決于CO2濃度。T4時(shí)間為4小時(shí)。
圖20A顯示在含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長(zhǎng)的腎MCs培養(yǎng)體的HCO3-濃度隨時(shí)間的作圖。對(duì)照為含有培養(yǎng)基或正常血但不含MCs的基本裝置。
圖20B顯示在含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長(zhǎng)的腎MCs培養(yǎng)體的pH隨時(shí)間的作圖。對(duì)照為含有培養(yǎng)基或正常血但不含MCs的基本裝置。
圖20C顯示在含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長(zhǎng)的腎MCs培養(yǎng)體的氧分壓隨時(shí)間的作圖。對(duì)照為含有培養(yǎng)基或正常血但不含MCs的基本裝置。
圖20D顯示在含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長(zhǎng)的腎MCs培養(yǎng)體的二氧化碳分壓隨時(shí)間的作圖。對(duì)照為含有培養(yǎng)基或正常血但不含MCs的基本裝置。
圖20E顯示在含有正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長(zhǎng)的腎MCs培養(yǎng)體的pH隨時(shí)間的作圖。
圖21A顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的葡糖濃度隨時(shí)間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖21B顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的HCO3-濃度隨時(shí)間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖21C顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的pH隨時(shí)間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖21D顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的氧分壓隨時(shí)間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖21E顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的二氧化碳分壓隨時(shí)間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖22顯示經(jīng)MCs處理的肝切除動(dòng)物與利用不含MCs的相同裝置處理的類似動(dòng)物相比的存活百分率隨時(shí)間的作圖。處理使平均存活時(shí)間增加了10小時(shí)。
圖23顯示灌注到本發(fā)明所述裝置之前和之后的肝微器官的RT-PCR結(jié)果。選擇用于白蛋白及凝血因子IX和X的mRNA的特異性引物對(duì)來(lái)證明這些肝標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄。第1-4泳道顯示由白蛋白mRNA的特異性引物產(chǎn)生的718bp條帶。第6-9泳道顯示由凝血因子IX mRNA的特異性引物產(chǎn)生的821bp條帶。第11-14泳道顯示由凝血因子X(jué) mRNA的特異性引物產(chǎn)生的1158bp條帶。第5和第10泳道為分子量標(biāo)記。第1、6和11泳道的樣品來(lái)自灌注前的第175號(hào)動(dòng)物，第2、7和12泳道的樣品來(lái)自灌注后4小時(shí)的同一動(dòng)物。第3、8和13泳道的樣品來(lái)自灌注前的第176B號(hào)動(dòng)物，第4、9和14泳道的樣品來(lái)自灌注后4小時(shí)的同一動(dòng)物。
圖24顯示在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的肝MCs介質(zhì)的利多卡因濃度隨時(shí)間的作圖。濃度的下降表明該藥物隨時(shí)間的代謝。
圖25A顯示大鼠肝MCs與豬肝MCs的氧分壓隨時(shí)間的變化。所用MCs是用指定培養(yǎng)基或血清進(jìn)行灌注。用于處理無(wú)肝大鼠時(shí)，豬肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
圖25B顯示大鼠肝MCs與豬肝MCs的二氧化碳分壓隨時(shí)間的變化。所用MCs是用指定培養(yǎng)基或血清進(jìn)行灌注。用于處理無(wú)肝大鼠時(shí)，豬肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
圖25C顯示大鼠肝MCs與豬肝MCs的碳酸氫根離子濃度隨時(shí)間的變化。所用MCs是用指定培養(yǎng)基或血清進(jìn)行灌注。用于處理無(wú)肝大鼠時(shí)，豬肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
圖25D顯示大鼠肝MCs與豬肝MCs的葡糖濃度隨時(shí)間的變化。所用MCs是用指定培養(yǎng)基或血清進(jìn)行灌注。用于處理無(wú)肝大鼠時(shí)，豬肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
圖26A顯示由測(cè)量活性線粒體脫氫酶的MTT(3-[4，5-二甲噻唑-2-基]2，5-二苯四唑溴化物；噻唑蘭)比色反應(yīng)測(cè)定一組冷凍保存液(S1-S6)在第0及第120分鐘時(shí)的活細(xì)胞百分率。S1-S6溶液的成分詳列于下文表4。
圖26B顯示由吖啶橙染色法測(cè)定一組冷凍保存液(S1-S6)在第0及第120分鐘時(shí)的活細(xì)胞百分率。S1-S6溶液的成分詳列于下文表4。
圖27A為二氧化碳產(chǎn)量隨時(shí)間的變化，圖中對(duì)新鮮肝MCs和在S4(S4溶液的成分見(jiàn)表4)中液氮保存72小時(shí)的MCs進(jìn)行了比較。冷凍和融解沒(méi)有對(duì)肝MCs產(chǎn)生不良影響。
圖27B為耗氧量隨時(shí)間的變化，圖中對(duì)新鮮肝MCs和在S4(S4溶液的成分見(jiàn)表4)中液氮保存72小時(shí)的MCs進(jìn)行了比較。冷凍和融解沒(méi)有對(duì)肝MCs產(chǎn)生不良影響。
圖27C為pH隨時(shí)間的變化，圖中對(duì)新鮮肝MCs和在S4(S4溶液的成分見(jiàn)表4)中液氮保存72小時(shí)的MCs進(jìn)行了比較。冷凍和融解沒(méi)有對(duì)肝MCs產(chǎn)生不良影響。
圖27D為葡糖濃度隨時(shí)間的變化，圖中對(duì)新鮮肝MCs和在S4(S4溶液的成分見(jiàn)表4)中液氮保存72小時(shí)的MCs進(jìn)行了比較。冷凍和融解沒(méi)有對(duì)肝MCs產(chǎn)生不良影響。
圖28顯示由先在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)再與肝MC共培養(yǎng)的肝內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行肝MC建群的顯微圖。培養(yǎng)的肝細(xì)胞可表達(dá)一種轉(zhuǎn)基因的β-半乳糖苷酶。顯象方法采用Lac Z染色，以使來(lái)源于細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞呈藍(lán)色。
圖29顯示腎MCs的體內(nèi)功能性。將腎MCs移植到正常大鼠的腹膜腔內(nèi)，并在48小時(shí)后用RT-PCR方法分析凝乳酶、促紅細(xì)胞生成素(Epo)及T-PA的mRNAs表達(dá)情況。由圖可見(jiàn)，48小時(shí)后的凝乳酶水平提高，而促紅細(xì)胞生成素和T-PA的水平下降。M＝100bp梯形DNA分子量標(biāo)記(Promega)。優(yōu)選實(shí)施方案詳述
本發(fā)明涉及對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的裝置，特別用于協(xié)助或替代在正常情況下行使這種修飾作用的器官來(lái)發(fā)揮功能。本說(shuō)明書(shū)和附屬權(quán)利要求中使用的短語(yǔ)“對(duì)流體進(jìn)行生物修飾”是指改變?cè)摿黧w的生物成分，在正常情況下，流體中這些生物成分的引入、去除或變化是通過(guò)一般在體內(nèi)對(duì)血液進(jìn)行修飾的器官的分泌、攝取或其催化活性來(lái)完成。優(yōu)選的是將本發(fā)明的裝置直接與受試者或患者相連或植入其體內(nèi)，以對(duì)該受試者的流體進(jìn)行修飾。文中使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”可彼此互換，二者都是指與本發(fā)明所述裝置聯(lián)接的、或被植入本發(fā)明所述裝置的、或被實(shí)施本發(fā)明所述方法的人或較低等動(dòng)物。
利用附圖和附述可更好地理解本發(fā)明所述裝置對(duì)生物流體進(jìn)行修飾的原理及操作。
在對(duì)本發(fā)明的至少一項(xiàng)實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明之前，應(yīng)該了解本發(fā)明在應(yīng)用時(shí)并不局限于以下敘述或附圖所指明的結(jié)構(gòu)及配置細(xì)節(jié)。本發(fā)明可以有其它不同的實(shí)施方案或?qū)嵺`或執(zhí)行方式。此外還應(yīng)了解，文中使用的措詞和術(shù)語(yǔ)只是用于說(shuō)明，而不作為限制。
對(duì)該說(shuō)明書(shū)和附屬權(quán)利要求而言，術(shù)語(yǔ)“微器官”、“MC”和“MCs”是指仍保持原組織的細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-間質(zhì)基本結(jié)構(gòu)的至少一種組織，優(yōu)選的為多種組織，的外植塊。這些術(shù)語(yǔ)包括培養(yǎng)的外植塊、培養(yǎng)后灌注到本發(fā)明所述裝置中的外植塊以及不預(yù)先培養(yǎng)而直接灌注到本發(fā)明所述裝置中的外植塊。此外，這些術(shù)語(yǔ)還包括與來(lái)自一種懸浮液的細(xì)胞共培養(yǎng)的外植塊，以及由外植塊和多種特定細(xì)胞的共培養(yǎng)物形成的平面器官。
由于外植塊的尺寸對(duì)其細(xì)胞的存活力十分重要，所以若希望長(zhǎng)時(shí)間維持微器官培養(yǎng)體，如1-21天或更長(zhǎng)，就需要對(duì)組織外植塊的尺寸進(jìn)行選擇，以使養(yǎng)分和氣體，如氧氣，能夠充分?jǐn)U散到三維微器官的每個(gè)細(xì)胞，同時(shí)使細(xì)胞廢物能夠擴(kuò)散出外植塊，以盡量減少?gòu)U物在微器官內(nèi)停留而導(dǎo)致的細(xì)胞毒性及伴隨的死亡。因此，外植塊大小的確定要能夠滿足在不具備專門(mén)的遞送結(jié)構(gòu)或合成基質(zhì)的情況下對(duì)每個(gè)細(xì)胞最低限度的可達(dá)性的要求。據(jù)美國(guó)專利申請(qǐng)08/482,364所述，只要使表面積/體積指數(shù)處在特定范圍內(nèi)，就能夠維持這種可達(dá)性。
處在該選定范圍內(nèi)的表面積/體積指數(shù)能夠使細(xì)胞足以通過(guò)擴(kuò)散來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)和排除廢物，其依據(jù)是生物存在擴(kuò)散極限，由發(fā)育的哺乳動(dòng)物胚胎在血液循環(huán)開(kāi)始前可達(dá)到的最大體積/表面積比以及細(xì)胞可通過(guò)擴(kuò)散存活的最大體積/表面積比即可意識(shí)到這一點(diǎn)。而在含有上皮的哺乳動(dòng)物組織中，細(xì)胞與毛細(xì)血管的距離幾乎無(wú)一例外地都不超過(guò)約400微米，由此也可對(duì)生物的擴(kuò)散極限有所認(rèn)識(shí)。
若文中定義為“Aleph”或“Aleph指數(shù)”的表面積/體積指數(shù)至少約為2.6mm-1，則能夠獲得并維持該可達(dá)性水平。由于第三條邊的變化，所以在確定表面積/體積指數(shù)時(shí)將其忽略。
而在確定Aleph時(shí)，a和x應(yīng)被定義為組織片最短的兩條邊。
對(duì)該說(shuō)明書(shū)和附屬權(quán)利要求而言，“Aleph”是指由公式1/x+1/a確定的表面積/體積指數(shù)，其中x＝組織厚度，a＝組織寬度，單位均為毫米。在優(yōu)選實(shí)施方案中，外植塊的Aleph應(yīng)約為2.7-25mm-1，更優(yōu)選的約為2.7-15mm-1，再優(yōu)選的則約為2.7mm-1至約10mm-1。表1給出Aleph的實(shí)例，其中，例如，厚度0.1mm、寬度1mm的組織，其Aleph指數(shù)為11mm-1。
因此，舉例來(lái)說(shuō)，單個(gè)微器官培養(yǎng)體或外植塊中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約150微米，但又不超過(guò)約225微米，這樣可使活體結(jié)構(gòu)得以保留，同時(shí)確保所有細(xì)胞與氣源和營(yíng)養(yǎng)源的距離都不超過(guò)約225微米。
表1表面積/體積指數(shù)“Aleph”隨a(寬度)和x(厚度)變化的不同mm-1
值
人們將直徑約700微米、長(zhǎng)約2mm的多角形肝小葉作為肝臟的基本結(jié)構(gòu)與功能單位達(dá)一個(gè)世紀(jì)之久。直到50年代才認(rèn)識(shí)到肝臟的基本結(jié)構(gòu)與功能單位是更小的腺泡。一個(gè)腺泡大致上是圍繞一根終動(dòng)脈、一根微靜脈和一根門(mén)管區(qū)側(cè)支膽管排列的一個(gè)卵形的實(shí)質(zhì)細(xì)胞團(tuán)。腺泡兩端各有一根導(dǎo)管，稱為終末肝微靜脈(該導(dǎo)管在以前用于小葉的術(shù)語(yǔ)中被稱為中央靜脈)。腺泡作為一種小單位，其較短的邊約為300-450微米，它包括傳統(tǒng)意義上的兩個(gè)相鄰的小葉部分。應(yīng)該指出的是，自從腺泡被發(fā)現(xiàn)以來(lái)就被認(rèn)為是肝臟最小的結(jié)構(gòu)與功能單位，同時(shí)它確定了所有肝細(xì)胞與氣源和營(yíng)養(yǎng)源之間的最大距離。因此，以腺泡為代表的肝臟微觀結(jié)構(gòu)確定了肝臟內(nèi)所有細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)源的距離都不超過(guò)約150-225微米。事實(shí)上，其它所有身體器官都是如此，因?yàn)闅怏w和營(yíng)養(yǎng)的有效擴(kuò)散上限被明顯確定在大約150-225微米。有關(guān)腺泡結(jié)構(gòu)與功能的其它說(shuō)明材料可在任一本組織學(xué)教科書(shū)中找到。例如“組織學(xué)教材”，Bloom and Fawcett Eds.12th Edition.Chatman and Hall.N.Y.-London.1994的第652-656頁(yè)。
在不受任何特定理論限制的前提下，該三維培養(yǎng)系統(tǒng)的許多因素都有助于其獲得成功。首先是通過(guò)使用，例如，上述的Aleph計(jì)算方法來(lái)合理地選擇外植塊的尺寸，這樣就可獲得適當(dāng)?shù)谋砻娣e/體積比，使?fàn)I養(yǎng)物能夠充分?jǐn)U散到外植塊的所有細(xì)胞，并且使細(xì)胞廢物能夠由外植塊的所有細(xì)胞充分?jǐn)U散出去。
其次，由于外植塊為立體結(jié)構(gòu)，所以各種細(xì)胞仍能活躍生長(zhǎng)，最重要的是仍可完全分化并發(fā)揮功能，相比之下，單層培養(yǎng)的細(xì)胞只能生長(zhǎng)到鋪滿狀態(tài)，然后表現(xiàn)出接觸抑制并停止生長(zhǎng)和分裂，從而使其功能受到限制。通過(guò)外植塊細(xì)胞的復(fù)制而產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子和調(diào)節(jié)因子可承擔(dān)起刺激增殖和調(diào)節(jié)分化、繼而調(diào)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞功能的部分責(zé)任，甚至對(duì)，例如，總體積不變的微器官培養(yǎng)體也是如此。
第三，外植塊的三維基質(zhì)可保持一種與相應(yīng)活體器官極為相似的細(xì)胞因子空間分布狀態(tài)。第四，細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-基質(zhì)相互作用可建立起能夠?qū)е录?xì)胞成熟的局部微環(huán)境。人們已認(rèn)識(shí)到，維持分化細(xì)胞的表型不但需要生長(zhǎng)/分化因子，而且需要適當(dāng)?shù)募?xì)胞相互作用。本發(fā)明可有效地模仿組織的微環(huán)境。微器官培養(yǎng)體的生物活性
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中包含的肝微器官培養(yǎng)體被認(rèn)為可行使所有種類的肝特異性生物學(xué)功能。這些功能的實(shí)例包括，例如，氨和尿素的代謝以及產(chǎn)生白蛋白。這些肝特異性生物學(xué)功能對(duì)于要在肝臟輔助裝置(LAD)中使用的細(xì)胞而言特別重要。在用較短期形式的LADS對(duì)諸如患有爆發(fā)性肝衰竭(FHF)、等待肝移植或具有無(wú)功能肝移植物的受試者進(jìn)行支持時(shí)，上述肝特異性生物學(xué)功能更顯得至關(guān)重要。但除上文所述之外，還有其它同樣重要或更重要的功能。其它功能性缺陷可利用其它方法來(lái)支持(如提供葡糖或監(jiān)測(cè)葡糖水平)，或是無(wú)需給予嚴(yán)重關(guān)注(如膽汁酸的結(jié)合，或膽色素的產(chǎn)生，或藥物的代謝活性)?？蔀楦嗡ソ呋蚋喂δ懿蝗颊咛峁俺浞种С帧钡母闻K特異性生物活性水平是指，該水生物活性平能夠使血清蛋白、氨向尿素的轉(zhuǎn)化率、凝血因子、氨基酸以及由肝臟產(chǎn)生或代謝的其它代謝物保持在或接近正常水平。
這些改進(jìn)可通過(guò)生化方法或受試者臨床狀況的改善來(lái)加以衡量。這些不同的分子、代謝參數(shù)與臨床參數(shù)、產(chǎn)物及其濃度或含量的生理學(xué)與病理學(xué)范圍已為該領(lǐng)域所熟知，或在，例如，Zakim & Boyer，肝臟病學(xué)；肝臟疾病教材，W.B.Saunders Company；Harcourt，Brace，Jovanovich，Inc.，Philadelphia，London，Toronto，Montreal，Sydney，Tokyo，(1990)中有所描述，在此引入作為參考。
本發(fā)明所述裝置的一些實(shí)施方案中包含的腎微器官培養(yǎng)體被認(rèn)為可行使所有種類的腎特異性生物學(xué)功能。這些功能包括，例如，尿素代謝，分泌促紅細(xì)胞生成素、凝乳酶以及維生素D調(diào)節(jié)。當(dāng)受試者排出尿素的功能不是由腎微器官培養(yǎng)體本身來(lái)完成時(shí)，也可用本發(fā)明所述裝置的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案的血液透析部件來(lái)完成。該血液透析部件的功能將在下文敘述，其應(yīng)用實(shí)例則在實(shí)施例部分的實(shí)施例18和19進(jìn)行詳述。微器官培養(yǎng)體的保存
作為本發(fā)明的一部分使用的微器官培養(yǎng)體的優(yōu)選制備及冷凍保存方法是，在存在，例如，10％DMSO(二甲亞砜)和20％血清的條件下于-160℃將其逐漸冷凍和保存，直至使用。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，肝微培養(yǎng)體可被封裝在藻酸鹽等半透性基質(zhì)片中，如圖2B所示，然后將其逐漸冷凍在，例如，含有10％DMSO和20％血清的諸如Ham’s F12等標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中。再把冷凍的薄片保存于-160℃。舉例來(lái)說(shuō)，可將含有微器官培養(yǎng)體的平面薄片插入到四周密封且大小與薄片十分接近的無(wú)菌合成塑料袋中。袋子的一端應(yīng)帶有一個(gè)塑料管入口，反端則帶有一個(gè)塑料管出口。然后在裝入含有微器官培養(yǎng)體的平面薄片的塑料袋中灌注含有10％DMSO和20％血清的諸如Ham’s F12等標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，并于一160℃逐漸冷凍和保存。
需要使用時(shí)，可將冷凍的薄片或冷凍的微器官培養(yǎng)體融解并裝到本發(fā)明的裝置中，優(yōu)選的是同時(shí)進(jìn)行，然后與系統(tǒng)聯(lián)接。
本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案是先培養(yǎng)微器官，然后將其冷凍，下文將對(duì)此做更詳細(xì)的描述。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及冷凍的微器官。該方面的根據(jù)是發(fā)現(xiàn)將器官或器官的一部分冷凍保存的多次嘗試都不很成功，其原因與難以培育完整器官或部分器官的原因相同。即所述物體的表面積/體積比太小。在降低溫度前通過(guò)器官內(nèi)的天然循環(huán)網(wǎng)絡(luò)用適當(dāng)?shù)睦鋬霰４嬉簩?duì)細(xì)胞進(jìn)行灌注并使其到達(dá)器官內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞，這樣就可在一定程度上克服這種限制。一旦器官被冷凍，就無(wú)法經(jīng)循環(huán)網(wǎng)絡(luò)到達(dá)所有細(xì)胞，原因是這些通道此時(shí)為凍結(jié)狀態(tài)。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)發(fā)現(xiàn)，若仍在冷凍條件下將冷凍保存的器官或其部分適當(dāng)?shù)厍懈睿蛊湓谌诮鈺r(shí)具有較大的表面積/體積比，就可確保所有細(xì)胞，包括微器官內(nèi)位置最深的細(xì)胞，能夠迅速而充分地接觸流體并達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟葪l件。其實(shí)現(xiàn)方法是，例如，制備的冷凍微器官需保留原器官的上皮/間質(zhì)基本相互作用，并且所有細(xì)胞與表面的距離都不超過(guò)約500微米，優(yōu)選的是300微米，最優(yōu)選的則是150微米。將冷凍器官或其冷凍部分切割成微器官時(shí)可采用任何適當(dāng)?shù)那懈钛b置，例如，但不局限于，冷凍切片機(jī)或帶有手動(dòng)或機(jī)械傳動(dòng)刀片并且處在預(yù)冷至適當(dāng)溫度的小室內(nèi)的裝置。
作為不限制本發(fā)明范圍的實(shí)例，冷凍微器官的制備方法可以是，利用該領(lǐng)域熟知的灌注方法用適當(dāng)?shù)睦鋬霰４嬉簩?duì)器官進(jìn)行灌注。然后以，例如，約每分鐘1度的速度逐漸降低溫度。當(dāng)組織的溫度達(dá)到，例如，-10℃--30℃時(shí)把器官切割成微器官。用于保存的微器官可在，例如，-70℃下進(jìn)一步冷卻，優(yōu)選的是-100℃，更優(yōu)選的則是在-196℃的液氮中。當(dāng)需要使用微器官時(shí)，可將其快速融解，方法是，例如，將其快速浸泡在預(yù)熱至37℃的適當(dāng)溶液中。由于微器官具有很大的表面積/體積比，因而可快速融解，從而減少融解過(guò)程中可能出現(xiàn)的細(xì)胞損傷。用微器官培養(yǎng)體形成連續(xù)的人造平面器官
本發(fā)明的事實(shí)依據(jù)是，如果能保持器官的顯微結(jié)構(gòu)(micro-architecture)，并選擇適當(dāng)條件(如尺寸)來(lái)確保所有細(xì)胞與氣源和營(yíng)養(yǎng)源的距離處在合理范圍內(nèi)，就能夠使來(lái)自體內(nèi)的細(xì)胞發(fā)揮與體內(nèi)細(xì)胞類似的功能。
下文實(shí)施例部分的實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)實(shí)施例13)可說(shuō)明肝MC培養(yǎng)體的狀態(tài)作為厚度的函數(shù)變化。它是在來(lái)自體內(nèi)的條件下，根據(jù)肝MC培養(yǎng)體對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源基因的表達(dá)能力而建立的。具有最佳結(jié)果的顯然是厚度為450微米的MCs。對(duì)培養(yǎng)物的組織學(xué)檢驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果。
因此，可把本發(fā)明的MCs片看作平面器官，每片都基本相當(dāng)于一個(gè)去卷曲的器官。正常的成熟器官被移出身體時(shí)會(huì)缺乏系統(tǒng)支持和為器官內(nèi)每個(gè)細(xì)胞提供充足營(yíng)養(yǎng)及氣體交換所必需的血液循環(huán)。另一方面，文中描述的來(lái)自體內(nèi)平面器官可確保(i)能夠維持器官的結(jié)構(gòu)，盡管其外形為平面，同時(shí)(ii)器官內(nèi)所有細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)源的距離都不超過(guò)約150-225微米。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是制備出連續(xù)平面器官并用來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法和裝置。
連續(xù)平面器官的制備方法如下。用如上所述制備的單個(gè)微器官的集合作為滋養(yǎng)層或基底層來(lái)支撐或維持來(lái)源于相同組織但被制成懸浮液的細(xì)胞。因此，滋養(yǎng)層可提供一個(gè)表面，使懸浮液中的細(xì)胞粘附于該表面并增殖和(或)分化并且(或)發(fā)揮其生物學(xué)功能。最后，由粘附細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞能夠與單個(gè)MCs的集合形成一種相互粘著的連續(xù)平面器官片。舉例來(lái)說(shuō)，連續(xù)肝平面器官的制備方法是將單個(gè)肝微器官培養(yǎng)體的集合與肝上皮細(xì)胞共培養(yǎng)。
因此，連續(xù)平面器官是一種重新設(shè)計(jì)的組合器官，它可保持基本的器官顯微結(jié)構(gòu)或構(gòu)造。本發(fā)明的連續(xù)平面器官可借助其平面尺寸來(lái)確保所有細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)源的距離都不超過(guò)約150-225微米，因而可避免對(duì)血液循環(huán)的依賴。
應(yīng)該了解的是，用單細(xì)胞層作為滋養(yǎng)層或基底層來(lái)培育其它類型細(xì)胞的想法并不是新近出現(xiàn)的，它曾被廣泛而又成功地使用過(guò)。
但用微器官的集合作為滋養(yǎng)層或基底層，更準(zhǔn)確地說(shuō)是作為“滋養(yǎng)器官”，的想法是嶄新的，它具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，主要是滋養(yǎng)器官上生長(zhǎng)的細(xì)胞有非常復(fù)雜的基底來(lái)支持，這種基底更類似于體內(nèi)增殖細(xì)胞的基底。
根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)替代優(yōu)選實(shí)施方案，可利用腎微器官培養(yǎng)體來(lái)制備平面器官。
根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)替代優(yōu)選實(shí)施方案，可同時(shí)使用腎微器官培養(yǎng)體和肝微器官培養(yǎng)體來(lái)制備一種既有腎臟功能又有肝臟功能的平面器官。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的其它一些特點(diǎn)，可在本發(fā)明所述裝置中加入一種血液透析部件。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的另一些特點(diǎn)，可將平面器官或含有微器官培養(yǎng)體的其它人造器官植入患者體內(nèi)，而不是安裝在體外。
對(duì)該說(shuō)明書(shū)和附屬權(quán)利要求而言，術(shù)語(yǔ)“基本培養(yǎng)基”是指化學(xué)成分確定的一種培養(yǎng)基，它只含有細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活和增殖所必需的營(yíng)養(yǎng)成分?；九囵B(yǎng)基一般不含生物提取物，如生長(zhǎng)因子、血清、垂體提取物或細(xì)胞群體在培養(yǎng)基中存活和增殖的其它非必需物質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，基本培養(yǎng)基通常含有至少一種氨基酸、至少一種維生素、至少一種鹽、至少一種抗生素、至少一種用來(lái)測(cè)定氫離子濃度的指示劑，如酚紅，葡糖、至少一種抗生素，以及細(xì)胞存活和增殖所必需的其它各種成分?；九囵B(yǎng)基不含血清。從Gibco BRL，Gaithersburg，MD可購(gòu)買到多種商品形式的基本培養(yǎng)基。
參考下文的實(shí)施例、注解和附圖可更好地理解本發(fā)明的裝置和方法。先看附圖，圖1A-1C顯示一種適于本發(fā)明所述裝置使用的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器2是一種帶有灌注入口6和灌注出口24的小室4，其間有特定的流體流動(dòng)通道。流體可如箭頭8所示由入口6進(jìn)入，并如箭頭10所示由出口24流出。優(yōu)選的是將至少一個(gè)，更優(yōu)選的是多個(gè)，灌注室18置于小室4的流動(dòng)通道上。每個(gè)灌注室18的范圍至少由一層，優(yōu)選的是多層，多孔膜19來(lái)確定。每個(gè)灌注室18含有至少一個(gè)，優(yōu)選的是多個(gè)，微器官培養(yǎng)體20，如肝微器官培養(yǎng)體。有一個(gè)或多個(gè)托架16與固定夾14或其它固定工具相連接，從而將灌注室18固定在小室4的流體通道上。優(yōu)選地，小室4內(nèi)有導(dǎo)流板22來(lái)指導(dǎo)流體的流動(dòng)。流體在小室4內(nèi)流動(dòng)的方向如箭頭所示。同樣優(yōu)選的是加入折返器21，使微器官培養(yǎng)體20集合的至少一種產(chǎn)物能夠返回受試者(未顯示)。
在圖1A-1C顯示的實(shí)施方案中，每個(gè)灌注室18的流動(dòng)通道和壓力都基本相同。
因此，經(jīng)多孔膜19向灌注室18的擴(kuò)散受簡(jiǎn)單界面擴(kuò)散原理的約束，如濃度梯度、布朗運(yùn)動(dòng)等。在這種擴(kuò)散不能滿足要求的情況下，可通過(guò)，例如，跨灌注室18的壓力差來(lái)提高流體向小室4中滲透的速率。舉例來(lái)說(shuō)，圖1D顯示圖1A的生物反應(yīng)器2經(jīng)改裝后在小室4內(nèi)具有兩種不同的流動(dòng)通道，一個(gè)“流體”室4A和一個(gè)“濾液”室4B，流體交換只能通過(guò)灌注室18來(lái)進(jìn)行，也就是只能通過(guò)微器官培養(yǎng)體20的集合來(lái)進(jìn)行。在所示生物反應(yīng)器2中可通過(guò)，例如，用閥門(mén)來(lái)限制流體出口24A下游流速的方法來(lái)建立跨灌注室18的壓力差。正壓力差(P流體-P濾液)會(huì)使流體從流體室4A向?yàn)V液室4B流動(dòng)，從而使流經(jīng)小室4的流體能夠與微器官培養(yǎng)體20的集合相接觸，繼而被生物修飾。一般而言，優(yōu)選的是將濾液室4B的出口24B與流體室4A的出口24A重新合并后再返回受試者。
用于形成微器官灌注室的適當(dāng)基質(zhì)材料包括聚酰胺，其中包括尼龍，如聚已內(nèi)酰胺和聚己二酸己二酯，聚酰胺-酰亞胺、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯，如聚甲基丙烯酸甲酯和聚甲基丙烯酸乙酯，和聚苯乙烯。對(duì)某些應(yīng)用而言，適當(dāng)?shù)幕|(zhì)材料還包括不同類型的角蛋白(絲綢、羊毛、毛發(fā))、膠原蛋白、聚烯烴，如聚乙烯、聚丙烯和聚丁烯，聚酯，如聚對(duì)苯二酸乙二酯和聚己二酸乙二酯，聚氨酯，如聚酯型聚氨酯和聚醚型聚氨酯，玻璃，如玻璃纖維，不銹鋼、硅酮、有機(jī)聚硅氧烷和石墨，以及上文所述的組合。角蛋白基質(zhì)可以是角蛋白、含角蛋白材料或角蛋白樣材料。其它材料已為該領(lǐng)域所熟知。例如，可參考美國(guó)專利5,344,454；美國(guó)專利4,883,666；美國(guó)專利4,892,538和5,106,627；美國(guó)專利4,391,909；以及美國(guó)專利4,353,888。
優(yōu)選的是將微器官培養(yǎng)體20的集合封裝在一種半透性基質(zhì)中以形成一個(gè)隔離室，例如可使用該領(lǐng)域已知的多種半透性材料。微器官培養(yǎng)體和被處理流體之間的半透膜等材料允許養(yǎng)分和活體小分子通過(guò)，其中包括氧氣、葡糖和激素，但不允許免疫系統(tǒng)因子通過(guò)，如白細(xì)胞，如果需要，則還可包括抗體。文中使用的術(shù)語(yǔ)“顆?！卑ǚ肿印⒓?xì)胞和蛋白。
更詳細(xì)地說(shuō)，當(dāng)微器官培養(yǎng)體來(lái)自另一種動(dòng)物時(shí)(即相對(duì)于被處理的受試者而言為異種的)，孔徑的大小必須足以避免炎癥細(xì)胞和分子免疫原性因子通過(guò)而由宿主進(jìn)入植入組織小室。該說(shuō)明書(shū)中使用的“分子免疫原性因子”是指諸如抗體和補(bǔ)體等分子。足以阻斷人類炎癥細(xì)胞和分子免疫原性因子通過(guò)的孔徑大小約為0.015微米。當(dāng)微器官培養(yǎng)體來(lái)自同種動(dòng)物但其遺傳組成不同時(shí)(即同種異體)，孔徑的大小通常只需足以避免炎癥細(xì)胞通過(guò)而由宿主進(jìn)入植入細(xì)胞小室。足以阻斷人類炎癥細(xì)胞通過(guò)的孔徑大小約為0.8微米。在大多數(shù)實(shí)施方案中，最好是將微器官培養(yǎng)體放置在一種免疫隔離室內(nèi)，例如，可選擇孔徑大小和膜的厚度，以使截留的分子量(MW)約為10,000Da-250,000Da，這樣就只能使分子量小于約10,000Da-250,000Da的分子通過(guò)。
圖2A為該免疫隔離室的一種說(shuō)明性實(shí)施方案，該圖顯示在由兩片相對(duì)的半透膜30形成的免疫隔離室28中至少放置一個(gè)，優(yōu)選的為其集合，微器官培養(yǎng)體26?？蓪⑽⑵鞴倥囵B(yǎng)體26的集合放在兩片半透膜30之間，也可如下圖(圖2B)所示封裝在一張半透膜中。通過(guò)使用，例如，一個(gè)或多個(gè)螺釘34將相對(duì)的夾具32固定在一起，這樣就能夠由每個(gè)夾具32的凸面脊36在微器官培養(yǎng)體26周圍形成基本防水的密封空間。作為選擇，同樣優(yōu)選的是用膠水、熱封、超聲焊接或該領(lǐng)域其它適當(dāng)?shù)姆饨蛹夹g(shù)來(lái)代替夾具32將半透膜片30的邊緣密封。更優(yōu)選的是將微器官培養(yǎng)體26的集合直接封裝在一張?zhí)囟ù笮〉钠矫嬖逅猁}片中。其外形顯示于圖2B，圖中顯示出多個(gè)平面藻酸鹽片38。舉例來(lái)說(shuō)，可制備第一條邊約為40cm、第二條邊約為60cm、第三條邊約為350微米的平面藻酸鹽片。這種藻酸鹽片每張可容納大約1-2×1010個(gè)細(xì)胞。因此，為了獲得與人類肝臟的細(xì)胞數(shù)量大致相同的細(xì)胞，需要使用，例如，約4-10張?jiān)逅猁}片。
應(yīng)該了解的是，其它結(jié)構(gòu)的受試者生物反應(yīng)器流體/濾液型實(shí)施方案也可形成多灌注室系統(tǒng)。這些結(jié)構(gòu)也可采用上述的一種薄片結(jié)構(gòu)。
舉例來(lái)說(shuō)，圖3A-3C顯示一種基本的盒式裝置40，它能夠與其它盒式裝置40串聯(lián)，以形成一種帶有多個(gè)灌注腔的生物反應(yīng)器(未顯示)。該說(shuō)明性實(shí)施方案是將微器官培養(yǎng)體20的集合放在灌注室18中。兩個(gè)端板(end plate)42和44與灌注室18之間至少插有一塊隔板46，從而可在灌注室18的兩側(cè)形成流體室48和濾液室50。在運(yùn)行時(shí)，由至少一個(gè)，優(yōu)選的為多個(gè)，流體入口52進(jìn)入的流體可穿過(guò)流體室48，然后沿灌注室18的滲透性表面流動(dòng)，再通過(guò)至少一個(gè)，優(yōu)選的為多個(gè)，橫向貫穿灌注室18的孔道，即流體管54，而離開(kāi)流體室48。此后，由流體管54提供的流體可通過(guò)至少一個(gè)，優(yōu)選的為多個(gè)，流體出口56而離開(kāi)盒式裝置40，從而不與濾液室50內(nèi)的任何流體相接觸。與此方式類似，由至少一個(gè)，優(yōu)選的為多個(gè)，濾液入口58進(jìn)入的濾液可被直接輸送到至少一個(gè)，優(yōu)選的為多個(gè)，濾液管60，從而不與流體室48內(nèi)的任何其它流體相接觸。
但濾液管60可將濾液排到濾液室50中，使其與灌注室18的另一個(gè)(滲透性)表面直接接觸。滲析液則通過(guò)至少一個(gè)，優(yōu)選的為多個(gè)，濾液出口62而離開(kāi)濾液室50。由此可見(jiàn)，來(lái)自流體室48的流體顯然還會(huì)滲透過(guò)灌注室18，被微器官培養(yǎng)體20的集合作用后，以代謝衍生物的形式返回濾液室50。
實(shí)際上，將盒式裝置40串聯(lián)排列時(shí)可把兩個(gè)相鄰盒式裝置中的第二個(gè)翻轉(zhuǎn)180°，以使第二個(gè)盒式裝置40的流體入口52和濾液入口58分別對(duì)準(zhǔn)第一個(gè)盒式裝置40的流體出口56和濾液出口62。重復(fù)這種組裝方式即可將大量盒式裝置40順序連接，并有效地形成一種其間配有多個(gè)微器官培養(yǎng)體的流體室和濾液室。若將其中的第一個(gè)盒式裝置40的濾液入口加蓋或以其它方式封閉，則濾液室中流動(dòng)的流體都是經(jīng)處理后離開(kāi)灌注腔的流體。
圖4進(jìn)一步說(shuō)明了圖1-3的上述生物反應(yīng)器2在本發(fā)明所述裝置中的應(yīng)用。為了便于理解，優(yōu)選實(shí)施方案是根據(jù)采用肝微器官培養(yǎng)體的肝臟輔助裝置來(lái)加以描述。但是，如上文所述，也可利用本發(fā)明的裝置實(shí)現(xiàn)其它的器官?gòu)?qiáng)化作用。
圖4顯示本發(fā)明所述裝置的另一種實(shí)施方案，該方案優(yōu)選地含有圖1D、2B或3A-3C的生物反應(yīng)器2。該實(shí)施方案只作為一個(gè)例子，并不限制本發(fā)明的范圍。另外還給出了該實(shí)施方案的使用方法。
通過(guò)圖中顯示的動(dòng)脈管道64可將血液從受試者的雙腔靜脈導(dǎo)管(等等)引出。進(jìn)入系統(tǒng)的血流可優(yōu)選地用，例如，一種蠕動(dòng)泵66來(lái)控制。優(yōu)選地，可利用注射器68將諸如肝素等抗凝劑輸送到動(dòng)脈管道64內(nèi)。也可將尿素、凝血因子、來(lái)源于肝細(xì)胞的其它蛋白或轉(zhuǎn)化產(chǎn)物等添加到血液中。此后，血液進(jìn)入動(dòng)脈滴注室70，并在此監(jiān)測(cè)柱前壓(PI)。血液離開(kāi)滴注室70后即進(jìn)入生物反應(yīng)器2，因而使生物反應(yīng)器2(含有微器官培養(yǎng)體集合的小室)充滿受試者的血液。如果需要，還可將過(guò)濾器等(如商品形式的1mm篩網(wǎng)過(guò)濾器)裝在滴注室70與生物反應(yīng)器2之間以避免裝置堵塞。生物反應(yīng)器2有一組入口管道72，可接納來(lái)自動(dòng)脈管道64的含有或不含抗凝劑的血液。生物反應(yīng)器2，特別是其中包含的微器官培養(yǎng)體的集合，可對(duì)血液進(jìn)行處理。
在流經(jīng)生物反應(yīng)器2的過(guò)程中，分子，優(yōu)選的是分子量約為10,000Da-250,000Da的分子，最優(yōu)選的則是分子量約為60,000Da-80,000Da的分子，可通過(guò)擴(kuò)散穿過(guò)免疫隔離膜而暴露于微器官培養(yǎng)體。血液中的細(xì)胞物質(zhì)則不能與微器官培養(yǎng)體直接接觸。低于截留分子量的小分子和蛋白可被送回血液。
生物反應(yīng)器2可將處理后的(如修飾的或解毒的)血液輸送到靜脈滴注室74和靜脈管道76，靜脈滴注室還可作為監(jiān)測(cè)血液中空氣的裝置的一部分。此外，該系統(tǒng)還可監(jiān)測(cè)滴注室74內(nèi)的壓力，即靜脈壓(Pv)。由此可計(jì)算出柱壓(PI-Pv)。
血漿穿過(guò)微器官培養(yǎng)體時(shí)可被超濾，優(yōu)選的是在血流通過(guò)生物反應(yīng)器2的同時(shí)進(jìn)行。泵78的吸力可使血漿穿過(guò)微器官培養(yǎng)體室而進(jìn)入濾液室，并在聚集后進(jìn)入濾液滴注室80，然后流經(jīng)細(xì)胞過(guò)濾器82，如0.45μm濾膜，這樣可確保細(xì)胞或大分子不會(huì)進(jìn)入受試者。測(cè)量濾液滴注室80的壓力(P2)，由此可計(jì)算出膜壓(PI-P2)。過(guò)濾器82可檢測(cè)并容納由微器官培養(yǎng)體滲漏出的所有細(xì)胞。然后將濾液與來(lái)自生物反應(yīng)器2的血流重新混合。優(yōu)選的是將過(guò)濾器82的出口與一個(gè)三通(如Y形或T形)管的接頭相聯(lián)接，該三通管有一個(gè)接頭與氧合器管線聯(lián)接，管線另一端為氧合器，這樣就可以對(duì)流體充氧。
因此，圖4所示的濾液循環(huán)可產(chǎn)生一種跨微器官培養(yǎng)體室的壓力差，從而促進(jìn)血清流過(guò)微器官培養(yǎng)體。優(yōu)選地，還可在動(dòng)脈管道64與注射器68之間的管線上裝一個(gè)壓力傳感器84。壓力傳感器84可監(jiān)測(cè)從受試者到生物反應(yīng)器2的動(dòng)脈血的壓力。此外，優(yōu)選的是在與生物反應(yīng)器2聯(lián)接的入口管處用一個(gè)壓力傳感器來(lái)監(jiān)測(cè)將肝素等抗凝劑泵入動(dòng)脈管線后的壓力。優(yōu)選地，還可將其它壓力傳感器裝在出口靜脈管線上來(lái)監(jiān)測(cè)返回受試者的流體，或裝在回流管的不同位置來(lái)提高安全性。這樣就可利用壓力傳感器來(lái)監(jiān)控受試者的接入壓和回流壓以及跨裝置的壓力，從而探測(cè)裝置的堵塞或破裂問(wèn)題。此外，在過(guò)濾器82兩邊使用壓力傳感器可監(jiān)控由裝置釋放的任何細(xì)胞顆?；虼箢w粒。
完整的管道組86包括上述實(shí)施方案中使用的所有管道。優(yōu)選地，管道組86是由聚氯乙烯(PVC)擠壓管等制成，其級(jí)別一般應(yīng)能夠用于在血液透析、治療性血漿置換和心臟直視手術(shù)中使用的系統(tǒng)。優(yōu)選的是將管道的泵送段設(shè)計(jì)成能在約100-500ml/分鐘，優(yōu)選的是250ml/分鐘，的血液流速下工作約120小時(shí)而不會(huì)逐漸破裂并導(dǎo)致受試者血液損失。管道組86中的模壓制件可含有硬PVC、Lexan HP樹(shù)脂等材料，并且可設(shè)計(jì)成能夠在符合上述應(yīng)用的環(huán)境中與PVC管長(zhǎng)期高強(qiáng)度結(jié)合。管道組86的消毒方法包括，用環(huán)氧乙烷對(duì)管道組86進(jìn)行消毒。
此外，如圖4所示，可利用控制系統(tǒng)88來(lái)對(duì)整個(gè)系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)行控制?？刂葡到y(tǒng)88可以是包含多個(gè)模塊的單整合系統(tǒng)，也可以是分離的模塊。其中有一個(gè)模塊用于控制雙泵系統(tǒng)的運(yùn)行。這種控制模塊可以在市場(chǎng)上買到(例如從CGH，Inc.of Lakew，Colo購(gòu)買BSM-22DualPump Blood Safety Module)。
控制系統(tǒng)88的另一模塊為輔助監(jiān)控裝置(AMU)，可用來(lái)監(jiān)測(cè)壓力、通過(guò)輔助鍵盤(pán)等接收操作者的報(bào)警設(shè)定，以及在達(dá)到某些報(bào)警極限時(shí)通知操作者。控制系統(tǒng)88的第三個(gè)模塊是一種靜脈壓監(jiān)測(cè)器(VPM)，可在治療期間監(jiān)測(cè)體外回路中返回受試者的靜脈壓。VPM也可以從CGH公司購(gòu)買，它可包含有兩種報(bào)警器。第一種報(bào)警器有一個(gè)上下限幅器，可在壓力值比選定值低40mmHg或以上、或比選定值高70mmHg或以上時(shí)觸發(fā)警報(bào)。第二種報(bào)警器即所謂的“溢出”報(bào)警器，可在壓力值高于+450mmHg或低于+10mmHg時(shí)觸發(fā)警報(bào)。當(dāng)報(bào)警器被觸發(fā)時(shí)，血液泵將停止。VPM包括壓力傳感元件及電源。
優(yōu)選地，該說(shuō)明性裝置的管道及其結(jié)合處可承受3個(gè)大氣壓(2,300mmHg)的正壓(由內(nèi)向外)和0.75個(gè)大氣壓的負(fù)壓而不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p壞或在管道組內(nèi)部與外部之間逐漸泄漏的情況。這種設(shè)計(jì)的起因是考慮到，一般用于體外處理的泵和管道可在大約0.7個(gè)大氣壓的負(fù)壓和1.5個(gè)大氣壓的正壓時(shí)達(dá)到其傳輸極限。上文確定的壓力范圍包含這些極限值，因而是一種合理的安全范圍。
優(yōu)選地，血液流速的可調(diào)范圍是0-500mls/分鐘。其原因有幾個(gè)方面。已經(jīng)明確的是，連續(xù)血液透析可在150mls/分鐘的血流速率下有效進(jìn)行。與此相比，安靜狀態(tài)下正常腎臟中的流速約為1,000mls/分鐘。而肝臟的儲(chǔ)備能力要低于腎臟，因而最大流速在約為1,500ml/分鐘的安靜狀態(tài)下正常肝臟的血液流速中占有較大的比例。另外還知道，這種體外流速可利用常規(guī)的血液接入裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)，如單腔或雙腔鎖骨下導(dǎo)管。更高的血液流速會(huì)提高治療的效果。
再循環(huán)管道組的再循環(huán)流速，如排出流速，可約為5-120ml/分鐘，優(yōu)選的則約為20-80ml/分鐘。也可根據(jù)占血液流速的比例來(lái)定義該流速。例如，排出流速約占血液流速的5％-30％，優(yōu)選的則占血液流速的10％-20％。優(yōu)選的是為操作者提供一份相對(duì)于血液流速的再循環(huán)流速表，作為選擇，也可優(yōu)選地將這些數(shù)據(jù)保存在控制系統(tǒng)88的存儲(chǔ)器中。
此外，或作為選擇，如果血液已經(jīng)是被生物修飾的流體，可優(yōu)選地在濾液回路上用一種血紅蛋白監(jiān)測(cè)器來(lái)顯示一個(gè)或多個(gè)微器官培養(yǎng)體小室的所有泄漏情況。還可以用血紅蛋白監(jiān)測(cè)器來(lái)檢測(cè)毛細(xì)血管外空間的任何細(xì)胞損失或顆粒損失，因?yàn)檫@些細(xì)胞能夠使光散射，并相應(yīng)地降低監(jiān)測(cè)器的輸出值。此外，還可將血紅蛋白監(jiān)測(cè)器與多種報(bào)警電路相聯(lián)接，用來(lái)指明需要操作者注意的地方。可以把壓力傳感器接到類似的報(bào)警系統(tǒng)中，或是壓力傳感器本身就具有一種報(bào)警系統(tǒng)。血紅蛋白監(jiān)測(cè)器和壓力傳感器可以與一個(gè)控制器相聯(lián)接，并用來(lái)關(guān)停閉合循環(huán)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)泵。優(yōu)選的是利用可檢測(cè)60份血漿中的1份積壓紅細(xì)胞的血紅蛋白光學(xué)監(jiān)測(cè)器來(lái)檢測(cè)再循環(huán)線路的血液損失。優(yōu)選地，該檢測(cè)方法應(yīng)即能檢測(cè)完整的紅細(xì)胞，又能檢測(cè)特定量的完全溶血的細(xì)胞。
此外還可以在系統(tǒng)配置中添加一種動(dòng)靜脈瘺，這樣就無(wú)需使用與動(dòng)脈管道64連接的泵。另外還可將結(jié)構(gòu)修改成適于用單個(gè)針頭進(jìn)行接入，方法是在生物反應(yīng)器2的任一端添加一個(gè)貯器，同時(shí)在回流線路上加一個(gè)血液泵。在確定本發(fā)明所述裝置的操縱方法時(shí)，采用的是常規(guī)的醫(yī)療操作，普通技術(shù)人員即能夠很好地掌握設(shè)備的裝配方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，負(fù)責(zé)設(shè)備裝配的操作者需要將管道組86接在控制部件88上，并將泵頭正確地?cái)Q入泵66和78(如果存在)，將壓力監(jiān)控管與壓力監(jiān)測(cè)器74(如果存在)相聯(lián)接，設(shè)置適合于起動(dòng)模式的報(bào)警設(shè)定值，在抗凝劑(如肝素)注射器68中裝滿規(guī)定劑量的肝素，并將肝素注射器68與管道72相聯(lián)接，再用控制部件88控制肝素注射器68，并將起動(dòng)液加入動(dòng)脈管64。起動(dòng)液可以是一般的生理鹽水。
對(duì)血液接入而言，負(fù)責(zé)該操作的醫(yī)生需要確定適當(dāng)?shù)某绦颍?shí)施血液接入的操作。該操作必須要以上文所述的流速來(lái)輸送血液，這是實(shí)現(xiàn)對(duì)受試者的預(yù)定治療效果所必需的。接入的血液需要如上所述用肝素等進(jìn)行適當(dāng)?shù)目鼓幚怼１景l(fā)明所述裝置的工作原理要求某些血載物質(zhì)能夠不受阻礙地進(jìn)入裝有微器官培養(yǎng)體的灌注室，并可同樣由微器官培養(yǎng)體進(jìn)入血液。應(yīng)該避免由抗凝作用不足而導(dǎo)致這種運(yùn)載能力受損的情況出現(xiàn)。在循環(huán)開(kāi)始時(shí)，應(yīng)特別注意準(zhǔn)備過(guò)程中出現(xiàn)接入口內(nèi)郁積而導(dǎo)致凝集的問(wèn)題。
首先應(yīng)連接受試者接入線路，如動(dòng)脈管64。將起動(dòng)液引入動(dòng)脈管64，其速率需足以確?；亓鞴?6和回流線路聯(lián)接中沒(méi)有殘存空氣。聯(lián)接完畢后中斷起動(dòng)液的流動(dòng)，使醫(yī)生能夠監(jiān)控管道，以確保聯(lián)接處不存在非容許數(shù)量的空氣。然后聯(lián)接動(dòng)脈管64。
開(kāi)始操作時(shí)，將泵66起動(dòng)。松開(kāi)靜脈管76上的夾子，并注入肝素。檢查壓力監(jiān)控室的讀數(shù)，并在必要時(shí)進(jìn)行調(diào)整。繼續(xù)操作時(shí)，操作者和助理人員應(yīng)定期檢查裝置的滲漏情況、旁路管道組的血細(xì)胞聚集情況以及監(jiān)測(cè)室的讀數(shù)是否正常。監(jiān)測(cè)室的讀數(shù)若與額定值的差異大于0.5cm，就需要重新調(diào)整，其中額定值為滴注室的50％或更高。經(jīng)常調(diào)整監(jiān)測(cè)室的給定值會(huì)促使操作者去充分檢查管道的細(xì)微滲漏情況。另外還應(yīng)監(jiān)測(cè)注射器68的抗凝劑剩余量，并在適當(dāng)情況下進(jìn)行更換。
當(dāng)需要結(jié)束操作并拆卸裝置時(shí)，可依次終止泵66和肝素注射，然后夾緊動(dòng)脈管64。利用流體或空氣置換方法使系統(tǒng)中剩余的血液返回受試者，然后夾緊靜脈管76。此時(shí)可以將控制部件88與聯(lián)接的管道組86以及治療裝置從重癥監(jiān)護(hù)室或使用區(qū)移走。
上文的敘述以本發(fā)明的裝置和方法為重點(diǎn)。以下則是成功制備可用于本發(fā)明所述裝置和方法的微器官培養(yǎng)體的實(shí)例，以及在體內(nèi)使用本發(fā)明所述裝置的實(shí)例。這些實(shí)例只是用于說(shuō)明，而不作為限制。
如下文說(shuō)明性實(shí)施例所述，分離自肝臟的微器官培養(yǎng)體已在培養(yǎng)基中培育長(zhǎng)達(dá)48天。但將培養(yǎng)體維持多于48天的情況亦處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
構(gòu)成本發(fā)明所述實(shí)施方案的裝置和方法不但可采用上文所述以及圖1、2、3、4和17所示的配置方式，也可均采用能夠移植于體內(nèi)的配置方式。在那些可移植于體內(nèi)的配置方式中，血液必須流經(jīng)的小室4的主壁是由生物相容性半透膜構(gòu)成。這種膜有利于血液成分?jǐn)U散到小室中，也有利于器官分泌物擴(kuò)散到小室外，并且在植入受試者后可通過(guò)血管重新生成作用而被血管化。這些新血管可以為小室中的MCs提供血液，也可以使分泌物或代謝物返回受試者。
如果將微器官培養(yǎng)體與來(lái)自一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞共培養(yǎng)以形成一種連續(xù)平面器官，即可提高構(gòu)成本發(fā)明所述實(shí)施方案的裝置和方法的效率。來(lái)自細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞與MCs之間的相互作用會(huì)使來(lái)自細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞發(fā)生一定程度的組織化。
作為不限制本發(fā)明范圍的實(shí)例，細(xì)胞懸浮液可來(lái)源于一種干細(xì)胞群體。這些干細(xì)胞可以是，例如，全能性胚胎干細(xì)胞，它們對(duì)微器官的微環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答的可能性很高，因而可摻入平面器官而成為其組成部分，并且可發(fā)生分化。這些干細(xì)胞可以是，例如，骨髓干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或其它任何有多種分化方向的干細(xì)胞，這些干細(xì)胞的分化方向取決于其微環(huán)境中的信號(hào)。這些部分組織化的細(xì)胞可補(bǔ)充MC的功能，并且可提高裝置的整體活性。
由于器官衰竭的緊迫性和醫(yī)療突發(fā)事件的不可預(yù)測(cè)性，有利的做法是提前制備MCs并大量?jī)?chǔ)備，以供后期使用。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，可將微器官培養(yǎng)體冷凍保存，并在使用前融解。在下文的實(shí)施例中將提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
在MC的制備、操作和保存過(guò)程中，器官片承受的壓力會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)受損，這會(huì)限制MC的功能，因此本發(fā)明提供將器官和器官片不經(jīng)培養(yǎng)而直接冷凍保存的特定實(shí)施方案。根據(jù)這些實(shí)施方案，可將完整器官或器官的一部分冷凍保存，然后冷凍切片至厚度約為200-400或450微米，用于形成微器官。冷凍的MCs可繼續(xù)保存，直至使用，也可立即融解并使用。
該方法可確保組織和細(xì)胞在切片過(guò)程中承受的壓力最小，并允許將組織精確切至所需的厚度。
利用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的多種方法均可將器官或器官的一部分冷凍保存。有一種制備冷凍保存器官的方法，作為非限制性實(shí)例，其步驟包括(a)用一種冷凍保存液對(duì)器官進(jìn)行體內(nèi)灌注，使器官內(nèi)的血液被置換成該冷凍保存液；(b)將器官由動(dòng)物轉(zhuǎn)移到一種含有冷凍保存液的小室中；(c)將器官的一部分冷凍；并且(d)在冷凍后將冷凍部分切割成適當(dāng)大小的切片。
該領(lǐng)域普遍了解的任何常規(guī)冷凍保存技術(shù)均可用來(lái)進(jìn)行冷凍。作為不限制本發(fā)明范圍的實(shí)例，冷凍保存液可以是含有約5-30％DMSO(二甲亞砜)的諸如DMEM等適當(dāng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還可添加海藻糖、葡糖以及該領(lǐng)域已知的其它添加劑。器官或器官的一部分可逐漸冷卻或快速冷卻，直至組織達(dá)到0℃以下的冷凍溫度，更優(yōu)選的是達(dá)到-70--100℃，最優(yōu)選的則是達(dá)到約-160℃。逐漸冷凍至-160℃的最簡(jiǎn)單方法是將器官或其部分或器官切片以受控方式逐漸浸沒(méi)在液氨中。
為了由器官的冷凍部分制備出微器官，可利用適當(dāng)方法將冷凍后的完整器官修整成適當(dāng)大小的片段。作為選擇，也可以將冷凍前的器官修整成適當(dāng)大小的片段，方法是直接由供體獲得器官片段，或是由供體取出器官后再將器官切成片段。
片段的大小可根據(jù)器官來(lái)源、預(yù)定用途以及隨后將其制備成MCs的方法而有所不同。作為不限制本發(fā)明范圍的實(shí)例，可將來(lái)源于完整器官的肝臟或腎臟片段切成長(zhǎng)度和厚度均約為1/2至數(shù)厘米的矩形方塊。保持這些片段的冷凍狀態(tài)，并將其轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)睦鋬銮衅b置中，利用該裝置將片段制成厚度約200-400或450微米的切片，同時(shí)保持組織的冷凍保存狀態(tài)。適當(dāng)?shù)睦鋬銮衅b置可包括，但不必局限于，諸如低溫切片機(jī)或冷凍切片機(jī)等該領(lǐng)域已知的裝置。傳統(tǒng)的低溫切片機(jī)需進(jìn)行改造，使其具有適當(dāng)?shù)膴A具來(lái)固定器官/器官片段，從而使裝置能夠切出厚度約為200-400或450微米的切片。由于低溫切片機(jī)一般是用來(lái)制備組織學(xué)檢查使用的更薄的切片，因而進(jìn)行這種改造十分必要。
利用上述方法由器官或器官片段獲得的外植塊的長(zhǎng)度約為1/2至數(shù)厘米，厚度約為1/2至數(shù)厘米，寬度約為200-400或450微米，這種外植塊可作為單個(gè)微器官。由于微器官在制備過(guò)程中始終保持冷凍狀態(tài)，因而可將其貯存或立即使用。貯存時(shí)可使用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的一種適當(dāng)裝置，如液氮瓶或Revco超低溫冰箱。
上文主要以肝臟為例，但本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案還包括腎MC裝置和方法，以及肝與腎MCs均使用的裝置和方法。其它器官也可以使用。
由于腎臟的一個(gè)重要功能是將尿素等小分子排泄出體外，因此本發(fā)明還提供一種利用裝置中添加的透析部件來(lái)實(shí)現(xiàn)這種功能的實(shí)施方案。
參考圖17，該實(shí)施方案顯示一種裝置112，該裝置在充滿血漿116的半透膜110中含有微器官102。在裝置的外壁112內(nèi)有一種貯器，可貯存流經(jīng)該裝置的受試者血液。在該裝置的如圖所示的體外實(shí)施方案中，血液可由裝置112的一端管道104進(jìn)入，由另一端管道106離開(kāi)。結(jié)構(gòu)的完整性由硅墊片116和聚碳酸酯板119來(lái)維持。用彈力夾(未畫(huà)出)將整個(gè)裝置合成一體。透析作用是由含透析溶液124的透析室122來(lái)完成，由于透析室122緊靠半透膜110，所以可吸收由微器官102分泌到血漿116中并向外擴(kuò)散過(guò)半透膜110的小分子。利用能夠與透析室122傳遞流體的管道126和128可不間斷地或定期地更換透析溶液124。
通過(guò)下文的非限制性實(shí)施例，該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將了解本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢(shì)和新特點(diǎn)。此外，上文所述的以及下文權(quán)利要求部分申請(qǐng)專利保護(hù)的本發(fā)明的每個(gè)不同的實(shí)施方案和方面都可在下文實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持。
實(shí)施例
以下實(shí)施例可供參考，這些實(shí)施例將與上文的敘述一同來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
一般而言，文中使用的術(shù)語(yǔ)和下文有關(guān)重組DNA技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法均是該領(lǐng)域所熟知并經(jīng)常使用的。克隆、DNA與RNA的分離、擴(kuò)增和純化均采用常規(guī)技術(shù)。涉及諸如DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶反應(yīng)一般是根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。這些技術(shù)以及其它不同的技術(shù)一般都按照Sambrook et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)來(lái)實(shí)施。以下將該手冊(cè)稱為“Sambrook”。書(shū)中提供了其它的一般參考文獻(xiàn)。其中的方法被認(rèn)為是該領(lǐng)域眾所周知的，并且以方便讀者的形式提供。其中包含的所有信息均在此引入作為參考。
以下是在下文實(shí)施例所述實(shí)驗(yàn)中使用的材料與方法，僅供參考。
材料與方法用于微器官培養(yǎng)體的外植體
可分離出能夠在本發(fā)明所述裝置中使用的肝微器官培養(yǎng)體或腎微器官培養(yǎng)體的動(dòng)物包括，例如，人和其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬，例如完全或部分近親繁殖的豬(如微型豬和轉(zhuǎn)基因豬)，以及嚙齒動(dòng)物等。肝組織可來(lái)源于同種異體的肝臟組織，如不適于移植但仍含有存活肝細(xì)胞的人類肝臟的小葉。
也可使用異種異體的器官，其中包括，但不局限于，牛和山羊的器官，優(yōu)選的則是豬的器官。盡管長(zhǎng)期暴露于異種抗原會(huì)引起免疫反應(yīng)，但從短期來(lái)看，由于可避免受試者的血液細(xì)胞與肝微器官培養(yǎng)體相接觸，因而免疫應(yīng)答在最初的臨床體驗(yàn)中并不是一個(gè)問(wèn)題。培養(yǎng)基
有多種組織培養(yǎng)基可用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。其中有復(fù)合型的，也有簡(jiǎn)單的。器官的微器官培養(yǎng)體可在復(fù)合培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，也可在諸如Dulbecco’s基本培養(yǎng)基等簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中維持。此外，盡管培養(yǎng)體可在含有血清或其它生物提取物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但血清或任何其它生物提取物都不是必需的(例如，參考美國(guó)專利申請(qǐng)08/482,364)。而且器官培養(yǎng)體可在不含血清的條件下維持很長(zhǎng)一段時(shí)間。因此，在體外維持培養(yǎng)體的過(guò)程中，培養(yǎng)基內(nèi)不必含有生長(zhǎng)因子。
但也可通過(guò)添加這些因子或?qū)⑵渌囟?xì)胞接種到培養(yǎng)體內(nèi)來(lái)促進(jìn)、改變或調(diào)節(jié)培養(yǎng)體細(xì)胞的增殖和成熟。這些因子包括，但不必局限于，胰島素、生長(zhǎng)激素、促生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、表皮生長(zhǎng)因子、肝紅細(xì)胞生成因子(肝促紅素)，以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、前列腺素、白介素和天然的生長(zhǎng)抑制因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族的成員、肝細(xì)胞以及腎細(xì)胞。培養(yǎng)小室
微器官培養(yǎng)體可維持在任何適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)小室中，并且可維持在37℃和5％CO2的條件下?？蓪⑴囵B(yǎng)物進(jìn)行振蕩以促進(jìn)通氣。培養(yǎng)小室通常可以是任何材料和(或)形狀。有多種不同的材料可用來(lái)制成小室，其中包括，但不局限于尼龍(聚酰胺)、滌綸(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸脂、聚乙烯化合物(如聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE、特氟隆)、thermanox(TPX)、硝酸纖維素、棉花、聚乙醇酸(PGA)、腸線縫線、纖維素、明膠、葡聚糖等。這些材料中的任何一種都可編制成網(wǎng)。
若要長(zhǎng)時(shí)間維持培養(yǎng)體或是將其冷凍保存，優(yōu)選的是使用諸如尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯酸脂、乙烯類聚合物、特氟隆、棉花等非降解性材料?？砂幢景l(fā)明使用的一種適當(dāng)?shù)哪猃埦W(wǎng)為Nitex，它是一種平均孔徑210微米、尼龍纖維平均直徑90微米的尼龍濾網(wǎng)(#3-210/36，Tetko，Inc.，N.Y.)。微器官的制備
腎臟或肝臟基本可取自適當(dāng)?shù)恼９w動(dòng)物(在下文實(shí)施例中為大鼠或小鼠)。對(duì)小型嚙齒動(dòng)物而言，可將腎臟沿中線切成大致相等的兩半。對(duì)大型動(dòng)物和人類而言，可沿中線切成厚度各約1-5cm的適當(dāng)大小的數(shù)塊。然后用傳統(tǒng)的組織刀沿中線或橫向切成厚度約300微米的外植塊。然后按以下各實(shí)施例所述對(duì)所得MCs進(jìn)行體外培養(yǎng)、來(lái)自體內(nèi)灌注和體內(nèi)灌注?；緦?shí)施方案
本發(fā)明的基本實(shí)施方案，以下稱為基本裝置，須滿足兩條很特定的標(biāo)準(zhǔn)(i)MCs與待修飾流體之間的接觸面積最大；以及(ii)流體量最小。該基本裝置的制備方法如下將微器官彼此相鄰地鋪在5×25cm的聚碳酸酯片上，使MCs將125cm2的整個(gè)區(qū)域覆蓋。這需要約3.5克肝臟(約相當(dāng)于300-350g大鼠的肝臟總質(zhì)量的30-40％)。該基本實(shí)施方案如圖1B所示，其描述見(jiàn)上文。用另一張相同尺寸的聚碳酸酯片覆蓋MCs(組合件A)。將整個(gè)組合件A裝到5.5×25.5cm的扁平尼龍袋中則構(gòu)成小室4。兩端分別插上P90聚丙烯管6和24，再用熱封機(jī)將兩端密封。下文實(shí)施例15、16和17的實(shí)驗(yàn)均使用本發(fā)明的該基本裝置。免疫隔離實(shí)施方案
本發(fā)明的免疫隔離實(shí)施方案，以下稱為免疫隔離裝置(見(jiàn)圖2A)，是基本裝置的改進(jìn)形式，該裝置將其中包含的MCs密封在半透膜30中，使血漿能夠穿膜與MCs接觸，同時(shí)防止血細(xì)胞發(fā)生這種接觸。該裝置基本上可利用血液將相同濃度的氧氣輸送到每個(gè)MC的所有表面細(xì)胞，無(wú)論是在裝置的入口處還是出口處。只有在氧氣穿過(guò)300微米厚的MCs時(shí)才會(huì)形成濃度梯度。由于紅細(xì)胞與MCs之間只隔有一層膜，所以該免疫隔離裝置還可進(jìn)行實(shí)時(shí)血漿過(guò)濾，以促使紅細(xì)胞緊鄰MCs，并在數(shù)微米，而不是數(shù)毫米，的短距離條件下發(fā)生血漿分離。因此，MCs并不直接與血液接觸，而是只與血漿接觸。在此將對(duì)該實(shí)施方案做詳細(xì)描述。為了將該裝置與動(dòng)物或患者聯(lián)接，可利用蠕動(dòng)泵從髂動(dòng)脈吸出血液。在生物反應(yīng)器內(nèi)，血漿可濾過(guò)半透膜30而被微器官中的細(xì)胞處理。處理過(guò)的血漿不斷擴(kuò)散出去，并再次進(jìn)入半透膜30周圍的血液，但仍處在該裝置的小室4中。用另一個(gè)蠕動(dòng)泵從該裝置的小室中吸出血液，并使其返回被治療受試者的頸靜脈。下文實(shí)施例20的實(shí)驗(yàn)采用本發(fā)明的該實(shí)施方案。
免疫隔離裝置須滿足幾個(gè)很特定的標(biāo)準(zhǔn)(i)MCs與待修飾流體之間的接觸面積最大；(ii)流體量最小；(iii)MCs的兩個(gè)大表面均與流體接觸；(iv)由血液實(shí)時(shí)分離血漿，以確保運(yùn)輸氧氣的是緊鄰MCs的血液中的最有效載體，即血紅蛋白。透析免疫隔離實(shí)施方案
圖17顯示的透析免疫隔離實(shí)施方案，以下稱為透析免疫隔離裝置，是免疫隔離裝置的改進(jìn)形式。它具有免疫隔離裝置的所有特征，此外還在含血液室108內(nèi)插有一種常用于血液透析的透析部件122，因而可對(duì)含血漿室110中的血漿進(jìn)行透析。在附加實(shí)施方案中，如圖所示，透析部件122的放置方法使其能夠?qū)ρ?08和血漿116都進(jìn)行透析。透析部件122充滿了常用于血液透析的透析溶液124。通過(guò)將附加管道126和128與分離的蠕動(dòng)泵(未畫(huà)出)相連可不斷地更換透析溶液。作為選擇，也可通過(guò)定期沖洗所述附加管道來(lái)更換透析溶液。這種配置可將相同濃度的氧氣輸送到每個(gè)MC的所有表面細(xì)胞，無(wú)論是在裝置的入口處還是出口處。只有在氧氣穿過(guò)300微米厚的MCs時(shí)才會(huì)形成濃度梯度。該裝置還可進(jìn)行實(shí)時(shí)血漿過(guò)濾，因此MCs102并不直接與血液108接觸，而是只與血漿116接觸。該裝置通過(guò)管道104和106與動(dòng)物聯(lián)接。由兩個(gè)蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)的附加回路可促使透析液進(jìn)入該裝置的透析部件122。透析液在進(jìn)入該裝置前可流經(jīng)一種能夠調(diào)節(jié)氣體、葡糖和小分子的小小室。該透析免疫隔離裝置須滿足幾個(gè)很特定的標(biāo)準(zhǔn)(i)MCs與待修飾流體之間的接觸面積最大；(ii)流體量最小；(iii)MCs的兩個(gè)大表面均與流體接觸；(iv)由血液實(shí)時(shí)分離血漿，以確保運(yùn)輸氧氣的是緊鄰MCs的血液中的最有效載體，即血紅蛋白；以及(v)添加透析部件后，有可能利用擴(kuò)散過(guò)小孔透析膜的方法來(lái)調(diào)節(jié)氣體和小分子的濃度。下文實(shí)施例18和19的實(shí)驗(yàn)采用本發(fā)明的該實(shí)施方案。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
下文實(shí)施例1-13和21-26涉及對(duì)只含肝組織的MCs的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1-12、22、23和26敘述對(duì)只含肝組織的MCs的體外實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例13、21、24和25涉及活體血液對(duì)肝MCs的體外灌注。實(shí)施例14-20涉及與腎MCs有關(guān)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例17演示了腎MCs與肝MCs在同一裝置中的應(yīng)用。實(shí)施例20涉及來(lái)自某一物種但與另一物種或受試者聯(lián)接的MCs的應(yīng)用。實(shí)施例14-17敘述的是體外實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例18-20敘述活體血液對(duì)MCs的灌注。實(shí)施例27-30則對(duì)本發(fā)明及其優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用做進(jìn)一步的詳述。
實(shí)施例1
肝微器官培養(yǎng)體的制備
小鼠肝微器官培養(yǎng)體的制備方法如下。取出器官并用解剖刀切成寬2mm、長(zhǎng)3mm的適當(dāng)片段，再用組織刀或其它適當(dāng)?shù)那懈罘椒ㄇ谐珊?00微米的切片。將這些微器官放在24孔微量滴定板中，然后置于5％CO2及37℃條件下的不含胎牛血清(FCS)的400ml Dullbeco’s基本培養(yǎng)基(DMEM)中，并以12rpm的速度持續(xù)振蕩1-8天。每孔培育20個(gè)微型外植塊。
實(shí)施例2
肝微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞增殖測(cè)定
將幾個(gè)小鼠器官切成微器官培養(yǎng)體，并利用實(shí)施例1的微器官細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在37℃增濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)。細(xì)胞分裂的評(píng)定是利用標(biāo)準(zhǔn)方案(Kobayashi，et al.(1994)，J Biomater Sci Polym Ed6(4)325-42)對(duì)摻入的氚標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷進(jìn)行測(cè)量。其結(jié)果說(shuō)明在培養(yǎng)期間可進(jìn)行DNA合成(圖5)。另外還按實(shí)施例1所述將小鼠肝微器官培養(yǎng)體培育14天，并用溴脫氧尿苷脈沖標(biāo)記4小時(shí)，然后固定，并用抗溴脫氧尿苷的熒光抗體進(jìn)行染色，以標(biāo)記有絲分裂的細(xì)胞核(Sigma Chemical)。在這些培養(yǎng)體中觀測(cè)到DNA合成十分活躍的細(xì)胞核(數(shù)據(jù)未顯示)。該結(jié)果說(shuō)明MCs可在體外長(zhǎng)期存活，并能夠來(lái)自體內(nèi)增殖。
實(shí)施例3
微器官培養(yǎng)體中的小鼠肝細(xì)胞可產(chǎn)生白蛋白
白蛋白分泌及尿素產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)圖6)顯示，在實(shí)施例1的微器官培養(yǎng)體中生長(zhǎng)的小鼠原始肝細(xì)胞至少可將功能維持4周。ELISA和比色法的測(cè)試結(jié)果都說(shuō)明微器官培養(yǎng)體中的小鼠肝細(xì)胞可產(chǎn)生較大量的白蛋白(試劑盒No631，Sigma Chem.Co.St.Louis MO)。下文的直方圖顯示每106個(gè)細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生的白蛋白量。應(yīng)該指出的是，甚至在培養(yǎng)一個(gè)月后，白蛋白的產(chǎn)率仍然很高，與另兩種傳統(tǒng)培養(yǎng)條件相比則尤其明顯。A是取自Nyberg et al.(Cell Transplant，2441-52)的數(shù)據(jù)，B是取自Shatford et al.(J.Surg.Res.，53549-57，1992)的數(shù)據(jù)。此結(jié)果說(shuō)明肝MCs可長(zhǎng)時(shí)間維持重要的生理功能。
實(shí)施例4
小鼠肝微器官培養(yǎng)體中氨向尿素的轉(zhuǎn)化
分離小鼠肝臟，并利用實(shí)施例1的微器官細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行無(wú)血清或無(wú)外源生長(zhǎng)因子的體外培養(yǎng)。利用Urea-Nkit No 640-A(Sigma Chem.Co.St.Louis MO)以標(biāo)準(zhǔn)比色法測(cè)量上清液中的尿素和氨含量。圖7所示數(shù)據(jù)說(shuō)明，微器官培養(yǎng)體中的小鼠肝細(xì)胞甚至在培養(yǎng)48天后仍可產(chǎn)生大量尿素。相比之下，Dixit et al.(Transplantation，55616-22)報(bào)道的微囊密封的體外大鼠肝細(xì)胞在培養(yǎng)1天后的尿素合成值為14.6mg/小時(shí)/百萬(wàn)細(xì)胞，培養(yǎng)10天后的值則為11.7mg/小時(shí)/百萬(wàn)細(xì)胞。該結(jié)果說(shuō)明肝MCs可長(zhǎng)時(shí)間維持重要的生理功能。
實(shí)施例5
人類肝微器官培養(yǎng)體可長(zhǎng)期地將大量氨轉(zhuǎn)化成尿素
人類肝微器官培養(yǎng)體的制備方法如下。將楔形的人類活體肝臟制成塊。再將肝臟塊切成寬2mm、長(zhǎng)3mm的適當(dāng)大小，然后用組織刀切成厚300微米的切片。將這些切片放在24孔微量滴定板中，其中加有0.4ml含或不含胎牛血清(FCS)的DMEM，然后在5％CO2及37℃條件下以12rpm的速度持續(xù)振蕩。每孔培育20個(gè)微型外植塊。每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基，并取樣進(jìn)行尿素和氨含量測(cè)定。圖8顯示分泌到培養(yǎng)基中的任意單位的尿素量，其數(shù)值相當(dāng)于10-25微克尿素/小時(shí)/百萬(wàn)細(xì)胞。
人每天可產(chǎn)生11.2克尿素，而人類肝臟中至少有1011個(gè)肝細(xì)胞。因此，人類肝細(xì)胞的體內(nèi)尿素產(chǎn)量約為5mg/小時(shí)/百萬(wàn)細(xì)胞。可以看出，人類肝微器官培養(yǎng)體可在體外將氨轉(zhuǎn)化成尿素，其速率即使不高于正常的體內(nèi)肝細(xì)胞，也是大致相等。
實(shí)施例6
人類肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性
按實(shí)施例5所述制備人類肝微器官培養(yǎng)體。培養(yǎng)的肝MCs能夠?qū)鞭D(zhuǎn)化成尿素。結(jié)果顯示于圖9。該結(jié)果說(shuō)明在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下至少可將人類器官的重要生理功能維持6天。
實(shí)施例7
冷凍保存的肝微器官培養(yǎng)體培育在37℃時(shí)仍具有功能
按實(shí)施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)體，并在10％DMSO中逐漸冷凍至-80℃，然后轉(zhuǎn)移至液氮。幾天后，將微器官培養(yǎng)體快速融解，清洗，并在10％FCS中培養(yǎng)幾天。然后進(jìn)行氨向尿素轉(zhuǎn)化的能力測(cè)定，其結(jié)果說(shuō)明微器官培養(yǎng)體中的肝細(xì)胞仍可存活，并能夠發(fā)揮功能，甚至在培養(yǎng)數(shù)天后也是如此。測(cè)定結(jié)果顯示于圖10，這些結(jié)果與培養(yǎng)在類似條件下的新鮮微器官培養(yǎng)體的測(cè)定結(jié)果有可比性。這說(shuō)明提前制備和保存鼠MCs以供后期使用的方法是可行的。
實(shí)施例8
冷凍保存的人類肝微器官培養(yǎng)體培育在37℃時(shí)仍具有功能
按實(shí)施例5所述制備人類肝微器官培養(yǎng)體，并在10％DMSO中逐漸冷凍至-80℃，然后轉(zhuǎn)移至液氮。幾天后，將微器官培養(yǎng)體快速融解，清洗，并在10％FCS中培養(yǎng)幾天。然后進(jìn)行氨向尿素轉(zhuǎn)化的能力測(cè)定，圖11顯示的測(cè)量結(jié)果說(shuō)明微器官培養(yǎng)體中的肝細(xì)胞仍可存活，并能夠發(fā)揮功能，甚至在培養(yǎng)數(shù)天后也是如此。這些結(jié)果與培養(yǎng)在類似條件下的新鮮微器官培養(yǎng)體的測(cè)定結(jié)果有可比性。這說(shuō)明提前制備和保存人以供后期使用的方法是可行的。
實(shí)施例9
封裝在藻酸鹽片中的肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性
按實(shí)施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)體。將其中的一半封裝在藻酸鹽薄片(厚度約400微米)中。在含有10％FCS的DMEM中將藻酸鹽片封裝的微器官培養(yǎng)體來(lái)自體內(nèi)培養(yǎng)12天。每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基，并取樣進(jìn)行尿素和氨含量測(cè)定。圖12顯示分泌到培養(yǎng)基中的任意單位的尿素量，其數(shù)值相當(dāng)于10-15微克尿素/小時(shí)/百萬(wàn)細(xì)胞。左邊為單獨(dú)的微器官培養(yǎng)體，右邊為藻酸鹽片中的微器官培養(yǎng)體。該結(jié)果說(shuō)明封裝的方法是可行的，當(dāng)需要在醫(yī)療應(yīng)用過(guò)程中將MCs取出人類患者時(shí)，此方法可作為潛在的重要考慮因素。
實(shí)施例10
培育在100％胎牛血清中的小鼠肝微器官培養(yǎng)體仍具有功能
按實(shí)施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)體。其中的一半在DMEM和10％FCS中培育5天(左)，另一半在100％FCS中培育5天(右)。每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基，并取樣進(jìn)行氨和尿素含量測(cè)定。結(jié)果顯示于圖13，這些結(jié)果可證明，肝微器官培養(yǎng)體不但能在體外條件下良好地發(fā)揮功能，而且在更接近全血但經(jīng)常對(duì)體外細(xì)胞產(chǎn)生毒性的100％血清中也是如此，所以這些結(jié)果具有特別的重要性。
實(shí)施例11
封裝在平面藻酸鹽片中冷凍并保存于-80℃然后再于37℃培育的
大鼠肝微器官培養(yǎng)體仍具有代謝活性
按實(shí)施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)體。將其中的一半封裝在藻酸鹽薄片(厚度約400微米)中。在10％DMSO中將微器官培養(yǎng)體和封裝在藻酸鹽片中的微器官培養(yǎng)體逐漸冷凍至-80℃，然后轉(zhuǎn)移至液氮。幾天后，將微器官培養(yǎng)體快速融解，清洗，并在10％FCS中培養(yǎng)幾天。每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基，并取樣進(jìn)行尿素和氨含量測(cè)定。圖14顯示分泌到培養(yǎng)基中的任意單位的尿素量(a)和白蛋白量(b)。該結(jié)果說(shuō)明，先封裝、再冷凍保存、然后融解并培養(yǎng)的MCs不會(huì)喪失生理功能。
實(shí)施例12
確定肝微器官培養(yǎng)體的最佳厚度
小鼠肝微器官培養(yǎng)體的制備方法如下。用剪刀取出器官，并剪成寬2mm、長(zhǎng)3mm的適當(dāng)大小，然后用組織刀或其它適當(dāng)?shù)那懈罘椒ㄇ谐珊?50-700微米不等的切片。將這些切片放在35mm培養(yǎng)皿中，其中加有2ml含10％胎牛血清(FCS)的F12培養(yǎng)基，然后在5％CO2及37℃條件下以12rpm的速度持續(xù)振蕩3周。每個(gè)培養(yǎng)皿含有指定厚度的微器官培養(yǎng)體。每?jī)商烊∫淮螛硬⑦M(jìn)行常規(guī)組織學(xué)處理和尿素產(chǎn)量測(cè)定。此外還在培養(yǎng)6天后以1千萬(wàn)CFUs/ml的濃度用能夠使lac-Z基因轉(zhuǎn)錄的腺衍生病毒構(gòu)建體對(duì)微器官培養(yǎng)體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)(參考J.Clin.Invest.902598-2607，1992)。轉(zhuǎn)導(dǎo)兩周后取樣，固定，并測(cè)定由重組β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的β-gal含量。圖16顯示β-gal產(chǎn)量隨厚度的變化。獲得最大產(chǎn)量的450微米厚的微培養(yǎng)體器官。與此類似，在培養(yǎng)3周后進(jìn)行的組織學(xué)及尿素產(chǎn)量測(cè)定的結(jié)果均說(shuō)明，與150、300和700微米厚的微培養(yǎng)體器官相比，最理想的是450微米厚的微培養(yǎng)體器官。
實(shí)施例13含有封裝在藻酸鹽片中的肝微器官培養(yǎng)體的生物反應(yīng)器可安全地與正
?；铙w大鼠相連接
通過(guò)右頸動(dòng)脈和左頸靜脈將大鼠與上述樣機(jī)相聯(lián)接。進(jìn)行數(shù)小時(shí)的血液灌注。同時(shí)監(jiān)測(cè)幾種生化參數(shù)，其中當(dāng)然包括整個(gè)動(dòng)物的健康狀況。利用蠕動(dòng)泵將流經(jīng)微器官培養(yǎng)體的血液重新引入頸靜脈(見(jiàn)圖15，為清晰起見(jiàn)，照片中的大鼠用輪廓表示)。在持續(xù)約8小時(shí)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，該動(dòng)物始終存活著。這說(shuō)明用MCs來(lái)補(bǔ)充活體動(dòng)物的肝臟功能的方法是可行的。
實(shí)施例14腎MCs可長(zhǎng)期體外培養(yǎng)并能夠在開(kāi)始培養(yǎng)4天后被干擾的情況下對(duì)pH
進(jìn)行調(diào)節(jié)
如上所述制備腎MCs，并將其培育在含有2mM谷氨酰胺的F-12中。培養(yǎng)4天后，用含有4mM谷氨酰胺和10mM HEPES的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)體的F-12培養(yǎng)基。培養(yǎng)體的氨產(chǎn)量增加，甚至在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始8天后仍是如此(圖20)。這說(shuō)明微器官可長(zhǎng)時(shí)間保持活力，并且還能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，即調(diào)節(jié)pH水平。
實(shí)施例15
腎MCs可在血液中良好地發(fā)揮功能
如上所述制備腎MCs，并在一種基本裝置中(見(jiàn)上文“材料與方法”)無(wú)灌注培養(yǎng)4小時(shí)。與類似條件下的肝MCs相比，腎MCs中的尿素濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，氨濃度則增加(圖19)。由于肝MCs和腎MCs均顯示出該活性，所以此結(jié)果說(shuō)明肝MCs中尿素濃度增加的觀測(cè)結(jié)果是肝MC生理功能的表現(xiàn)，而不是培養(yǎng)系統(tǒng)的假象。
實(shí)施例16腎MCs適用于含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除動(dòng)物血的來(lái)自
體內(nèi)基本裝置
如上所述制備腎MCs，并在正常動(dòng)物血(+MC N)、肝切除動(dòng)物血(+MCHEP)和含有2mM谷氨酰胺的F-12培養(yǎng)基(+MC MED)中培養(yǎng)5小時(shí)。作為基準(zhǔn)，對(duì)含有相同培養(yǎng)基(-MC MED)或正常血(-MCN)但不含MCs的相同的基本裝置(見(jiàn)上文的“材料與方法”)進(jìn)行培養(yǎng)(圖20A-E)。監(jiān)測(cè)pH、碳酸鹽離子濃度、O2飽和度和CO2飽和度隨時(shí)間的變化值。腎MCs在培養(yǎng)基和正常動(dòng)物血或肝切除動(dòng)物血中能夠同樣良好地發(fā)揮功能。該結(jié)果進(jìn)一步證明，腎MCs適用于補(bǔ)充活體動(dòng)物的腎臟功能。
實(shí)施例17
在基本裝置中組合培養(yǎng)的肝與腎MCs可協(xié)同發(fā)揮功能
如上所述制備腎MCs。按前文所述制備肝MCs。方法基本上是，將正常成體大鼠的肝臟切成表面積為8mm×8mm的肝臟塊。再用組織刀將組織塊切成厚300微米的外植塊。這樣即獲得8mm×8mm×0.3mm的肝MCs。在一種基本裝置(見(jiàn)上文的“材料與方法”)中將腎MCs和肝MCs培養(yǎng)5小時(shí)，其比例與正常動(dòng)物中的比例大致相等(即每1份腎用6份肝)。對(duì)含有正常動(dòng)物血和肝切除動(dòng)物血的該基本裝置進(jìn)行來(lái)自體內(nèi)操作。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，pO2明顯降低，而pCO2明顯增加。盡管如此，在腎MCs的調(diào)節(jié)作用下，HCO3的濃度仍十分穩(wěn)定(圖21A-E)。這些結(jié)果說(shuō)明混合使用MCs的裝置是可行的。
實(shí)施例18腎MCs能夠在與部分腎切除大鼠聯(lián)接的一種透析免疫隔離裝置中良好
地發(fā)揮功能
將一只大鼠的右腎完全切除，左腎70％切除。3小時(shí)后將其與包含透析室和小室的一種透析免疫隔離裝置(見(jiàn)上文的“材料與方法”)相聯(lián)接，所述小室中含有相當(dāng)于該動(dòng)物腎臟質(zhì)量的30％的腎微器官。腎MCs的制備方法如上文所述。透析液為不含酚紅但含有5％葡糖、30mg％/HCO3和1％葡聚糖的F12培養(yǎng)基。用16％O2、5％CO2與空氣的混合物對(duì)透析液進(jìn)行連續(xù)充氣。如下表2所示，腎微器官在4個(gè)小時(shí)的總連接時(shí)間內(nèi)始終具有生物活性。將處理后進(jìn)入0期昏迷的大鼠移走。完成連接后，從生物反應(yīng)器中取出MCs，提取RNA，并通過(guò)RT-PCR測(cè)定MCs的促紅細(xì)胞生成素基因轉(zhuǎn)錄情況。在0時(shí)間與腎切除動(dòng)物聯(lián)接后，MCs能夠以大致相同的水平連續(xù)轉(zhuǎn)錄促紅細(xì)胞生成素。該結(jié)果進(jìn)一步證明，腎MCs適用于補(bǔ)充活體動(dòng)物的腎臟功能。
表2時(shí)間(小時(shí))動(dòng)脈pO2 透析液pO2 生物反應(yīng)器pO2
0 113.273.9
1 103.4 159.3 100.8
2 102.6 151.2 110
4 112.6 147.1 114.3時(shí)間動(dòng)脈pCO2 透析液pCO2 生物反應(yīng)器pCO2 0 35.5 37 1 39.9 18.037.4 2 39.2 19.637.0 4 39.1 21.838.7時(shí)間動(dòng)脈葡糖透析液葡糖生物反應(yīng)器葡糖 0 96 - 97 2 114 106 74 4 103 112 87
實(shí)施例19裝在透析免疫隔離裝置中的腎MCs在與部分腎切除大鼠第二次聯(lián)接后
仍可保持全部活性
24小時(shí)后，將實(shí)施例18的動(dòng)物再次與實(shí)施例18的含有腎MCs的透析免疫隔離裝置相聯(lián)接。除使用2％葡聚糖溶液外，其余條件與上一實(shí)施例相同。動(dòng)物進(jìn)入0期昏迷即被釋放，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的生理參數(shù)均正常。這說(shuō)明制備24小時(shí)后的腎MCs是可以使用的。該結(jié)果進(jìn)一步證明腎MCs適用于補(bǔ)充活體動(dòng)物的腎臟功能。該結(jié)果說(shuō)明，即使只定期地與動(dòng)物相聯(lián)接，腎MCs也同樣適用于補(bǔ)充活體動(dòng)物的腎臟功能。
實(shí)施例20裝到一種免疫隔離裝置中的豬肝MCs在與異種大鼠聯(lián)接時(shí)可良好地發(fā)
揮功能
完全按照實(shí)施例17所述的相同條件制備豬肝MCs，只是組織的來(lái)源為豬的肝臟。將含有豬肝MCs的免疫隔離裝置(見(jiàn)上文的“材料與方法”)與正常大鼠相聯(lián)接。在該條件下處理的大鼠未顯示出不良的副作用。此外，根據(jù)耗氧量和葡糖產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果判斷，來(lái)源于豬肝的MCs比大鼠MCs更有活性。另外還發(fā)現(xiàn)，用豬MCs來(lái)處理大鼠也未對(duì)豬MCs產(chǎn)生不良影響。在零時(shí)間、在與正常大鼠聯(lián)接的裝置中使用4小時(shí)后，以及在F-12培養(yǎng)基中再體外培養(yǎng)18小時(shí)后對(duì)MCs進(jìn)行MTT測(cè)定。這三種條件下測(cè)量的MTT活性水平都非常高，并且彼此之間難以區(qū)分。此外，在UV顯微鏡下檢驗(yàn)吖啶橙摻入的結(jié)果顯示，這三種情況下的細(xì)胞存活率都＞90％。
圖25A-D顯示，豬MCs至少在調(diào)節(jié)氧/二氧化碳?jí)毫ζ胶?、碳酸鹽離子濃度和葡糖濃度方面與大鼠MCs同樣有效。在培養(yǎng)基和大鼠血清中都是如此。
這些結(jié)果表明，用豬肝臟對(duì)豬以外的其它哺乳動(dòng)物進(jìn)行處理是可行的。
實(shí)施例21
肝MC裝置可明顯延長(zhǎng)92％肝切除的大鼠的壽命
在受控體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用含有肝MC的本發(fā)明所述裝置對(duì)12只肝切除大鼠進(jìn)行處理(圖22；已處理)。用不含MCs的裝置在相同條件下對(duì)另外10只肝切除大鼠進(jìn)行處理(圖22；對(duì)照)。處理時(shí)間為4小時(shí)。處理完后將動(dòng)物釋放，并繼續(xù)觀察直至死亡。圖22顯示，利用含有MC的裝置可將存活時(shí)間平均延長(zhǎng)10個(gè)小時(shí)。該結(jié)果經(jīng)t分布檢驗(yàn)為有效結(jié)果(P＜0.05)。
實(shí)施例22
肝MCs在經(jīng)連接至92％無(wú)肝大鼠的裝置進(jìn)行灌注期間和之后
能夠以體內(nèi)正常水平轉(zhuǎn)錄白蛋白和凝血因子IX及X的信使RNAs
肝MCs在對(duì)本發(fā)明的裝置進(jìn)行灌注后仍具有功能，并能夠轉(zhuǎn)錄白蛋白和凝血因子IX與X的mRNA，其使用的RT-PCR方法如下。
逆轉(zhuǎn)錄的實(shí)現(xiàn)方法是，將1μg RNA(約10μl)、0.5μg Oligo-dT(1μl，Promega)和無(wú)RNase的H2O(總體積15μl)70℃保溫5分鐘。將混合物放在冰上冷卻，然后添加以下成分5μl RT緩沖液(Promega)、5μl dNTPs混合物(10mM，Promega)、20單位的RNAsin(Promega)和100單位的MLV-逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)。添加無(wú)RNase的H2O至終體積50μl。將反應(yīng)體系置于42℃保溫60分鐘。
PCR擴(kuò)增的方法是，制備含有2.5μl 10×反應(yīng)緩沖液、0.2mMdNTPs、1.5mM MgCl2、2μl由RT反應(yīng)獲得的單鏈DNA、0.6mM(1μl)各種引物(上游引物和下游引物)、2.5單位(0.5μl)Taq DNA聚合酶(Promega)的混合物，并加H2O至終體積25μl。循環(huán)條件為第1個(gè)循——94℃60秒，TM℃60秒和74℃5分鐘；第2-34個(gè)循環(huán)——94℃45秒，TM℃60秒和74℃2分鐘；最后一個(gè)循環(huán)——94℃60秒，TM℃60秒和74℃5分鐘，其中TM為下文進(jìn)一步詳述的每對(duì)擴(kuò)增引物的特征性解鏈溫度。
反應(yīng)采用以下擴(kuò)增引物對(duì)。擴(kuò)增白蛋白cDNA的678bp產(chǎn)物時(shí)使用TM為45℃的Alb15’-TGAACTGGCTGACTGCTGTG-3’(序列號(hào)1)和Alb25’-CATCCTTGGCCTCAGCATAG-3’(序列號(hào)2)。擴(kuò)增凝血因子IX cDNA的821bp產(chǎn)物時(shí)使用TM為42℃的IX15’-TCTGT TGCCTACAATTCT-3’(序列號(hào)3)和IX25’-TAGTATATATTCCATATT-3’(序列號(hào)4)。擴(kuò)增凝血因子X(jué) cDNA的1158bp產(chǎn)物時(shí)使用TM為46℃的X15’-ATAAAGAAAGGAAAT CTG-3’(序列號(hào)5)和X25’-TCACAAAGTAGGTGTCTT-3’(序列號(hào)6)。
在室溫和100V條件下將所有PCR產(chǎn)物在0.5×TBE中進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠(BRL)電泳。結(jié)果顯示于圖23。
在圖23中，第1-4泳道顯示由白蛋白mRNA的特異性引物產(chǎn)生的718bp條帶。第6-9泳道顯示由凝血因子IX mRNA的特異性引物產(chǎn)生的821bp條帶。第11-14泳道顯示由凝血因子X(jué) mRNA的特異性引物產(chǎn)生的1158bp條帶。第5和第10泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
第1、6和11泳道的樣品來(lái)自灌注前的第175號(hào)動(dòng)物，第2、7和12泳道的樣品來(lái)自灌注后4小時(shí)的同一動(dòng)物。第3、8和13泳道的樣品來(lái)自灌注前的第176B號(hào)動(dòng)物，第4、9和14泳道的樣品來(lái)自灌注后4小時(shí)的同一動(dòng)物。這兩只動(dòng)物在灌注后均可轉(zhuǎn)錄所有3種肝臟基因，說(shuō)明肝MCs可在灌注過(guò)程中維持其復(fù)雜的生理功能。
實(shí)施例23
對(duì)利多卡因消耗量的測(cè)定結(jié)果說(shuō)明
來(lái)自體內(nèi)培養(yǎng)在受控條件下的MCs可顯示出P450功能
對(duì)來(lái)自體內(nèi)培養(yǎng)的MCs進(jìn)行利多卡因代謝測(cè)定，作為其肝臟功能的另一種指標(biāo)(圖24)。培養(yǎng)基中的利多卡因濃度持續(xù)下降了30個(gè)小時(shí)，說(shuō)明微器官培養(yǎng)體的肝細(xì)胞具有攝取利多卡因的P450功能。
實(shí)驗(yàn)采用以下材料。DMEM培養(yǎng)基；HEPES；青霉素-鏈霉素溶液(10,000單位，10mg/ml)購(gòu)買于Biological Industries Ltd.，Israel。甘氨酸；葡糖；谷氨酰胺；胰島素；皮質(zhì)醇購(gòu)買于Sigma Israel。利多卡因(Esracain2％鹽酸利多卡因，200mg/ml)購(gòu)買于MedicalLaboratories Ltd.，Israel。
在補(bǔ)加有2mM谷氨酰胺、10mM HEPES、1/500(體積比)的抗生素溶液；3mM甘氨酸；2克/升(重量體積比)的葡糖；1mg/％(重量體積比)胰島素；7.5μg/ml皮質(zhì)醇的每毫升DMEM培養(yǎng)基(無(wú)酚紅)中放4個(gè)Lewis大鼠肝MCs，開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)將80μg/ml(重量體積比)的利多卡因添加到培養(yǎng)基中，然后在37℃和5％CO2/95％空氣的增濕培養(yǎng)箱(FormaScientific)中培養(yǎng)48小時(shí)。在下文所述的時(shí)間點(diǎn)取100μl培養(yǎng)基樣品至微量離心管中，2,000rpm離心，然后保存于-20℃，直至利用熒光偏振免疫測(cè)定法進(jìn)行TDx/TDxFLx利多卡因測(cè)定，測(cè)定采用商品化試劑和Pape B.E.et al；Clinical Chemistry24(11)2020-2922，1978的方法。結(jié)果總結(jié)于下表3。
表3
時(shí)間(小時(shí))鹽酸利多卡因μg/ml
T0-10.50 AM 0 62.2
T1-18hr PM 7.1 33.9
T2-11hr AM 24.123.7
T3-17hr PM 30.120.9
實(shí)施例24
含有MC的裝置可避免與其連接的無(wú)肝大鼠惡化達(dá)13小時(shí)
當(dāng)無(wú)肝大鼠與含有肝MCs的本發(fā)明所述裝置連接時(shí)，可以從II期昏迷恢復(fù)到I期昏迷，甚至可恢復(fù)到0期。這些大鼠在長(zhǎng)達(dá)13個(gè)小時(shí)的整個(gè)灌注期內(nèi)始終保持在該昏迷期。這些結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明在肝衰竭病例中具有潛在的臨床實(shí)用性。
實(shí)施例25
冷凍保存后的肝MCs仍可恢復(fù)功能
配制并測(cè)試一系列不同的冷凍保存液(表4)。用MTT和吖啶橙染色法評(píng)定冷凍保存72小時(shí)并融解后的細(xì)胞活力(圖26A和B)。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷，最有效的是含有20％DMSO和100mM海藻糖的溶液(S4)，因而將其應(yīng)用于其它研究。由二氧化碳產(chǎn)量、耗氧量、pH調(diào)節(jié)和葡糖產(chǎn)量的來(lái)自體內(nèi)測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷凍保存的MCs表現(xiàn)出與新制備的MCs類似的性能(圖27A-D)。
表4MC的冷凍保存條件的優(yōu)化**在液氮中將S1-S6各溶液中的肝MCs冷凍72小時(shí)。
這些冷凍保存方法具有重要意義，原因有三點(diǎn)。第一，這些方法允許用中央設(shè)施來(lái)制備MCs?？梢灾苽涑龃笈鶰Cs并將其冷凍保存。在銷售和使用前可由每批抽樣融解并測(cè)試性能。
第二，可在1個(gè)小時(shí)之內(nèi)將保存在液氮中的MCs安裝到功能性生物裝置中。這一點(diǎn)對(duì)處理急性器官衰竭患者而言至關(guān)重要。
第三，利用這種方式可將用于移植但仍未移植的供體人類器官無(wú)限期保存，以供后期使用。將這種方法與上文所述的免疫隔離裝置協(xié)同使用可幫助消除器官排斥的問(wèn)題，并且可提高供體器官的實(shí)際使用百分率。
實(shí)施例26
肝平面器官的制備
由轉(zhuǎn)基因Rosa26小鼠(參考Kennedy et al.(1997)Blood，1，90(3)986-93)獲得可通過(guò)組成型啟動(dòng)子表達(dá)β-半乳糖苷酶的原始肝臟間充質(zhì)細(xì)胞。將表達(dá)轉(zhuǎn)基因β-半乳糖苷酶的細(xì)胞植入MCs，然后可利用簡(jiǎn)單的比色反應(yīng)來(lái)鑒別這些細(xì)胞。
將轉(zhuǎn)基因間充質(zhì)細(xì)胞植入原生肝MCs中，并進(jìn)一步保溫在適當(dāng)條件下。如圖28所示，MCs中摻入了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(藍(lán)色)。該結(jié)果論證了將多個(gè)摻有間充質(zhì)細(xì)胞的MCs結(jié)合成平面器官的可能性。
實(shí)施例27
冷凍微器官表現(xiàn)出能與新鮮微器官一樣良好地發(fā)揮功能
通過(guò)4項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)定冷凍微器官相對(duì)于新鮮微器官的功能性。按本發(fā)明所述制備冷凍微器官。用改進(jìn)的Krebs溶液和MEM-α溶液對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行灌注。分離出肝小葉并切成0.8cm的小塊。將肝臟塊在冰上放30分鐘，然后轉(zhuǎn)移至-15℃。用Leitz低溫切片機(jī)在-15℃的溫度下將冷凍塊切成300微米的切片。然后將切片轉(zhuǎn)到冰上，放置30分鐘，再用液氮以緩慢冷凍的方法(-1℃/分鐘)進(jìn)行冷凍。然后迅速浸沒(méi)在含有10％胎牛血清的37℃DMEM中(每ml放4個(gè)MCs)使切片融解，然后培養(yǎng)在37℃。同時(shí)并行制備和培養(yǎng)新鮮微器官以作為對(duì)照。所有在培養(yǎng)皿中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)都是每4片MCs使用1ml FCS。
第一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)(表5)是在培養(yǎng)皿中培育由冷凍保存組織獲得的冷凍保存的MCs。第二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)(表6)是在圖17所述的裝置中培育由冷凍保存組織獲得的冷凍保存的MCs。第三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)(圖7)是在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿中培育由新鮮組織獲得的冷凍保存的MCs。第四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)(表8)則是在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿中培育由新鮮組織獲得的新鮮的MCs。在這四種實(shí)驗(yàn)設(shè)置條件下分別對(duì)下文表5-8所示的幾種象征肝臟功能的因素進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在這四種不同的實(shí)驗(yàn)條件下，MC的功能未表現(xiàn)出明顯的整體變化。
表5
表6
表7
表8
實(shí)施例28移植到大鼠體內(nèi)48小時(shí)后的腎MCs可表達(dá)凝乳酶、Epo及T-PA的mRNA
按上文所述制備腎MCs，并移植到大鼠的腹膜腔內(nèi)。48小時(shí)后取出腎MCs，利用RT-PCR分析凝乳酶、Epo和T-PA mRNAs的表達(dá)情況，并與時(shí)間計(jì)算起點(diǎn)時(shí)腎MCs中這些mRNAs的表達(dá)情況進(jìn)行比較。
逆轉(zhuǎn)錄的實(shí)現(xiàn)方法是，將1μg RNA(約10μl)、0.5μg Oligo-dT(1μl，Promega)和無(wú)RNase的H2O(總體積15μl)70℃保溫5分鐘。將混合物放在冰上冷卻，然后添加以下成分5μl RT緩沖液(Promega)、5μl dNTPs混合物(10mM，Promega)、20單位的RNAsin(Promega)和100單位的MLV-逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)。添加無(wú)RNase的H2O至終體積50μl。將反應(yīng)體系置于42℃保溫60分鐘。
PCR擴(kuò)增的方法是，制備含有2.5μl 10×反應(yīng)緩沖液、0.2mMdNTPs、1.5mM MgCl2、2μl由RT反應(yīng)獲得的單鏈DNA、0.6mM(1μl)各種引物(上游引物和下游引物)、2.5單位(0.5μl)Taq DNA聚合酶(Promega)的混合物，并加H2O至終體積25μl。循環(huán)條件為94℃45秒，54℃ 60秒和74℃2分鐘。
反應(yīng)采用以下擴(kuò)增引物對(duì)。擴(kuò)增凝乳酶cDNA的657bp產(chǎn)物時(shí)使用Rennin15’-GCTTTG GACGAATCTTGC-3’(序列號(hào)7)和Rennin25’-AATGTTGAGGGTCACTGC-3’(序列號(hào)8)。擴(kuò)增Epo cDNA的325bp產(chǎn)物時(shí)使用Epo15’-ACCACTCCCAACCCTCATCAA-3’(序列號(hào)9)和Epo25’-CGTCCAGCACCCCGTAAATAG-3’(序列號(hào)10)。擴(kuò)增T-PA cDNA的493bp產(chǎn)物時(shí)使用T-PA15’-GCAGAAAATGGGGCTGAA-3’(序列號(hào)11)和T-PA25’-GTTTGTATTGCCTCAGGC-3’(序列號(hào)12)。
在室溫和100V條件下將所有PCR產(chǎn)物在0.5×TBE中進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠(BRL)電泳。結(jié)果顯示于圖29。由圖可見(jiàn)，48小時(shí)后的凝乳酶含量增加，而促紅細(xì)胞生成素和T-PA的含量降低。
實(shí)施例30
與肝-腎裝置相聯(lián)接的無(wú)肝動(dòng)物可表現(xiàn)出幾乎正常的性能
通過(guò)Lewis大鼠(體重241克)的髂靜脈和頸動(dòng)脈將其與一種同時(shí)含有腎MCs和肝MCs的本發(fā)明所述體外裝置相聯(lián)接。利用已預(yù)先經(jīng)過(guò)70％乙醇、生理鹽水和含有200單位肝素的生理鹽水清洗的Harvard泵使大鼠的血液以0.5ml/分鐘的速度流經(jīng)該裝置。該裝置包含一種夾層狀的0.2μm聚碳酸酯膜，其間共含有9.7克肝MCs、0.5克腎MCs和13ml含有供體大鼠血液的培養(yǎng)基。用含有5％CO2的空氣對(duì)含有95ml血溶膠、5ml 5.88％HCO3、280mg％葡糖、和4％葡聚糖的培養(yǎng)基進(jìn)行飽和充氣，并在培養(yǎng)基中添加抗生素和Hepes緩沖液。3天后將大鼠的肝臟切除(取出3.05克肝臟)。與裝置相聯(lián)接的大鼠在肝切除35小時(shí)后進(jìn)入I期昏迷。不進(jìn)行通氣。死后檢驗(yàn)的結(jié)果顯示未出現(xiàn)腹部大量出血。脾臟、腎臟和胰臟看上去很正常。大鼠呈黃色，其尿液亦呈黃色。按下文表9所述在肝切除后的前5小時(shí)內(nèi)取樣并進(jìn)行分析。肝切除2小時(shí)后將8μl維生素K和0.4ml 25％甘露醇注入大鼠。
因此，每小時(shí)取4份樣品，并對(duì)每份樣品的血細(xì)胞比容(Htc)、pH、pCO2、pO2、碳酸氫鹽(HCO3 mM)以及葡糖進(jìn)行測(cè)定。樣品則來(lái)源于進(jìn)入裝置的動(dòng)脈血(Art)、離開(kāi)裝置的血液(Bio)、進(jìn)入裝置的透析培養(yǎng)基(Min)和離開(kāi)裝置的透析培養(yǎng)基(mout)。血液氣體的測(cè)定采用一種氣體分析儀(ABL-330 Radiometer Copenhagen)。血糖的測(cè)定采用常規(guī)的便攜式葡萄糖計(jì)(Elite)。此外還在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每小時(shí)記錄一次昏迷期(C.S.)、呼吸率(Resp rate)和體溫(B.T.)。
表9
盡管已對(duì)本發(fā)明連同其特定實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但對(duì)該領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，明顯還存在其它的選擇、改進(jìn)和變化。因而希望將所有處在附加權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的這些選擇、改進(jìn)和變化都包括在內(nèi)。
序列表
序列表<110>Mitrani，Eduardo<120>對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的裝置及方法<130>01/23134<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>1tgaactggct gactgctgtg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>2catccttggc ctcagcatag 20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>3tctgttgcct acaattct 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>4tagtatatat tccatatt 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>5ataaagaaag gaaatctg 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>6tcacaaagta ggtgtctt 18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>7gctttggacg aatcttgc 18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>8aatgttgagg gtcactgc 18<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>9accactccca accctcatca a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>10cgtccagcac cccgtaaata g21<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>11gcagaaaatg gggctgaa18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>12gtttgtattg cctcaggc18
權(quán)利要求
1.一種用來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的裝置，該裝置包括
(a)帶有一個(gè)流體入口和一個(gè)流體出口的一種小室；以及
(b)用來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的肝微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的各肝微器官培養(yǎng)體都含有肝細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個(gè)肝培養(yǎng)體中位置最深的肝細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體肝臟的基本顯微結(jié)構(gòu)，該肝微器官培養(yǎng)體集合位于所述小室內(nèi)，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)肝平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將來(lái)源于肝臟的細(xì)胞與所述肝微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來(lái)源于所述微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與所述來(lái)源于肝臟的細(xì)胞的混合物形成所述連續(xù)肝平面器官。
4.權(quán)利要求1的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內(nèi)。
5.權(quán)利要求4的裝置，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
6.權(quán)利要求4的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
7.權(quán)利要求1的裝置，該裝置還包括一種基本位于所述小室內(nèi)的多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述肝微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
8.權(quán)利要求7的裝置，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過(guò)。
9.權(quán)利要求7的裝置，其中的多孔膜可限制白細(xì)胞和紅細(xì)胞通過(guò)。
10.權(quán)利要求1的裝置，該裝置還包括多個(gè)管道，用來(lái)與含有待生物修飾流體的受試者相聯(lián)接，所述管道中至少有一個(gè)與所述入口相聯(lián)接，并且至少有另一個(gè)與所述出口相聯(lián)接。
11.權(quán)利要求1的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
12.權(quán)利要求4的裝置，其中的薄片的特征是被裝在所述小室內(nèi)。
13.一種用來(lái)對(duì)受試者的流體進(jìn)行生物修飾的裝置，該裝置包括
(a)帶有一個(gè)流體入口和一個(gè)流體出口的一種小室；
(b)用來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的肝微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的每個(gè)肝微器官培養(yǎng)體都含有肝細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個(gè)肝培養(yǎng)體中位置最深的肝細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體肝臟的基本顯微結(jié)構(gòu)，該肝微器官培養(yǎng)體集合位于所述小室內(nèi)，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸；
(c)具有第一和第二末端的第一管道，所述第一末端用來(lái)聯(lián)接受試者以接收受試者的流體，所述第二末端用來(lái)聯(lián)接所述入口；以及
(d)具有第一和第二末端的第二管道，所述第一末端用來(lái)聯(lián)接所述出口，所述第二末端用來(lái)聯(lián)接受試者以使生物修飾后的流體返回受試者。
14.權(quán)利要求13的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
15.權(quán)利要求13的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)肝平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將來(lái)源于肝臟的細(xì)胞與所述肝微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來(lái)源于所述微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與所述來(lái)源于肝臟的細(xì)胞的混合物形成所述連續(xù)肝平面器官。
16.權(quán)利要求13的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
17.權(quán)利要求16的裝置，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
18.權(quán)利要求16的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
19.權(quán)利要求13的裝置，該裝置還包括一種基本位于所述小室內(nèi)的多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述肝微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
20.權(quán)利要求19的裝置，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過(guò)。
21.權(quán)利要求19的裝置，其中的多孔膜可限制白細(xì)胞和紅細(xì)胞通過(guò)。
22.權(quán)利要求19的裝置，其中的薄片的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
23.一種對(duì)受試者的流體進(jìn)行生物修飾的方法，該方法包括，用受試者的流體對(duì)含有肝微器官培養(yǎng)體集合的一種小室進(jìn)行灌注，以使所述肝微器官培養(yǎng)體集合能夠?qū)α黧w進(jìn)行生物修飾，其中所述集合的各肝微器官培養(yǎng)體都含有肝細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個(gè)肝培養(yǎng)體中位置最深的肝細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體肝臟的基本顯微結(jié)構(gòu)。
24.權(quán)利要求23的方法，該方法的步驟還包括，在制備用于安裝在所述灌注室內(nèi)的所述微器官培養(yǎng)體之前，至少將肝臟的一部分冷凍保存。
25.權(quán)利要求23的方法，其中的流體為血液。
26.權(quán)利要求23的方法，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)肝平面器官中提供，該肝平面器官的制備方法是將來(lái)源于肝臟的細(xì)胞與所述肝微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由所述微器官培養(yǎng)體與來(lái)源于肝臟的細(xì)胞混合物形成所述連續(xù)肝平面器官。
27.權(quán)利要求23的方法，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內(nèi)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
29.權(quán)利要求27的方法，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
30.權(quán)利要求23的方法，其中的小室內(nèi)包含一種多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述肝微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
31.權(quán)利要求30的方法，其中的多孔膜允許分子量約為10,000Da-250,000Da的顆粒通過(guò)。
32.權(quán)利要求30的方法，其中的多孔膜可限制白細(xì)胞和紅細(xì)胞通過(guò)。
33.權(quán)利要求30的方法，其中的薄片的特征是在基本裝入所述小室之前被冷凍保存。
34.權(quán)利要求23的方法，該方法的步驟還包括，使流體返回受試者。
35.權(quán)利要求34的方法，該方法的步驟還包括，至少使所述肝微器官培養(yǎng)體集合分泌的一種產(chǎn)物返回受試者。
36.一種制備連續(xù)平面器官的方法，該方法包括
(a)獲得一種器官的單個(gè)微器官培養(yǎng)體的集合，使所述集合的各微器官培養(yǎng)體均含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使該單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體結(jié)構(gòu)；以及
(b)將一種細(xì)胞懸浮液添加在所述微器官培養(yǎng)體上，并將該細(xì)胞懸浮液與所述微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來(lái)源于所述微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與所述懸浮液中的細(xì)胞的混合物形成連續(xù)平面器官。
37.權(quán)利要求36的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述微器官培養(yǎng)體集合之前，至少將器官的一部分冷凍保存。
38.一種制備連續(xù)肝平面器官的方法，該方法包括
(a)獲得單個(gè)肝微器官培養(yǎng)體的集合，使該集合的各微器官培養(yǎng)體均含有肝細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使該單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體肝臟的基本結(jié)構(gòu)；以及
(b)將來(lái)源于肝臟的細(xì)胞的懸浮液添加在所述肝微器官培養(yǎng)體上，并將所述細(xì)胞懸浮液與所述肝微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來(lái)源于所述微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與所述來(lái)源于肝臟的細(xì)胞的混合物形成連續(xù)肝平面器官。
39.權(quán)利要求38的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述肝微器官培養(yǎng)體集合之前，至少將肝臟的一部分冷凍保存。
40.一種用來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的裝置，該裝置包括
(a)帶有一個(gè)流體入口和一個(gè)流體出口的一種小室；以及
(b)用來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的各微器官培養(yǎng)體都含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持器官單位的活體器官結(jié)構(gòu)，該微器官培養(yǎng)體集合位于所述小室內(nèi)，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸。
41.權(quán)利要求40的裝置，其中，所述器官的所述微器官培養(yǎng)體集合由該器官的冷凍保存部分制成。
42.權(quán)利要求40的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將懸浮細(xì)胞與所述微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來(lái)源于所述微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與所述懸浮細(xì)胞的混合物形成所述連續(xù)平面器官。
43.權(quán)利要求40的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內(nèi)。
44.權(quán)利要求43的裝置，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
45.權(quán)利要求43的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
46.權(quán)利要求40的裝置，該裝置還包括一種基本位于所述小室內(nèi)的多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
47.權(quán)利要求46的裝置，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過(guò)。
48.權(quán)利要求46的裝置，其中的多孔膜可限制白細(xì)胞和紅細(xì)胞通過(guò)。
49.權(quán)利要求40的裝置，該裝置還包括多個(gè)管道，用來(lái)與含有待生物修飾流體的受試者相聯(lián)接，所述管道中至少有一個(gè)與所述入口相聯(lián)接，并且至少有另一個(gè)與所述出口相聯(lián)接。
50.權(quán)利要求40的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
51.權(quán)利要求42的裝置，其中的薄片的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
52.一種用來(lái)對(duì)受試者的流體進(jìn)行生物修飾的裝置，該裝置包括
(a)帶有一個(gè)流體入口和一個(gè)流體出口的一種小室；
(b)用來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的各微器官培養(yǎng)體都含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持器官單位的活體器官結(jié)構(gòu)，該微器官培養(yǎng)體集合位于所述小室內(nèi)，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸；
(c)具有第一和第二末端的第一管道，所述第一末端用來(lái)聯(lián)接受試者以接收受試者的流體，所述第二末端用來(lái)聯(lián)接所述入口；以及
(d)具有第一和第二末端的第二管道，所述第一末端用來(lái)聯(lián)接所述出口，所述第二末端用來(lái)聯(lián)接受試者以使生物修飾后的流體返回受試者。
53.權(quán)利要求52的裝置，其中，所述器官的所述微器官培養(yǎng)體集合由該器官的冷凍保存部分制成。
54.權(quán)利要求52的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將懸浮細(xì)胞與所述微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來(lái)源于所述微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與所述懸浮細(xì)胞的混合物形成所述連續(xù)平面器官。
55.權(quán)利要求52的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內(nèi)。
56.權(quán)利要求55的裝置，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
57.權(quán)利要求55的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
58.權(quán)利要求52的裝置，該裝置還包括一種基本位于所述小室內(nèi)的多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
59.權(quán)利要求58的裝置，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過(guò)。
60.權(quán)利要求58的裝置，其中的多孔膜可限制白細(xì)胞和紅細(xì)胞通過(guò)。
61.權(quán)利要求58的裝置，其中的薄片的特征是在基本裝入所述小室之前被冷凍保存。
62.一種對(duì)受試者的流體進(jìn)行生物修飾的方法，該方法包括，用受試者的流體對(duì)含有微器官培養(yǎng)體集合的一種小室進(jìn)行灌注，以使所述微器官培養(yǎng)體集合能夠?qū)α黧w進(jìn)行生物修飾，其中，所述集合的各微器官培養(yǎng)體都含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個(gè)培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持器官單位的活體器官結(jié)構(gòu)。
63.權(quán)利要求62的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述微器官培養(yǎng)體集合之前，至少將器官的一部分冷凍保存。
64.權(quán)利要求62的方法，其中的流體為血液。
65.權(quán)利要求62的方法，其中的微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將衍生的懸浮細(xì)胞與所述微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來(lái)源于所述微器官培養(yǎng)體的細(xì)胞與所述懸浮細(xì)胞的混合物形成所述連續(xù)平面器官。
66.權(quán)利要求62的方法，其中的微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內(nèi)。
67.權(quán)利要求66的方法，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
68.權(quán)利要求66的方法，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
69.權(quán)利要求62的方法，其中的述小室內(nèi)包含一種多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
70.權(quán)利要求69的方法，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過(guò)。
71.權(quán)利要求69的方法，其中的多孔膜可限制白細(xì)胞和紅細(xì)胞 通過(guò)。
72.權(quán)利要求69的方法，其中的薄片的特征是在基本裝入所述小室之前被冷凍保存。
73.權(quán)利要求69的方法，該方法的步驟還包括，使流體返回受試者。
74.權(quán)利要求73的方法，該方法的步驟還包括，至少使所述微器官培養(yǎng)體集合分泌的一種產(chǎn)物返回受試者。
75.一種體外裝置，用于為受試者提供一種或多種肝臟功能，該裝置包括
(a)一種位于受試者體外的小室，該小室配有能夠與受試者的循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行流體交通的第一管道和第二管道，從而使血液能夠通過(guò)第一管道由受試者流入小室，并通過(guò)第二管道由小室流至受試者；以及
(b)裝在所述小室中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時(shí)至少與其中的一部分相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死。
76.權(quán)利要求75的裝置，其中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
77.權(quán)利要求75的裝置，該裝置還包括
(c)處在所述小室內(nèi)并裝有所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體的生物相容性薄膜，該薄膜可以使血液成分和肝臟分泌物透過(guò)。
78.權(quán)利要求77的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
79.權(quán)利要求75的裝置，該裝置還包括
(d)來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞，這些細(xì)胞與所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
80.權(quán)利要求79的裝置，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞為來(lái)源于肝臟的細(xì)胞。
81.權(quán)利要求75的裝置，其中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
82.一種體內(nèi)裝置，用于為受試者提供一種或多種肝臟功能，該裝置包括
(a)一種可移植于體內(nèi)的小室，該小室由一個(gè)或多個(gè)所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構(gòu)成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；以及
(b)裝在所述小室中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時(shí)至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死。
83.權(quán)利要求82的裝置，其中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
84.權(quán)利要求82的裝置，其中的薄膜可以使血液成分和肝臟分泌物透過(guò)。
85.權(quán)利要求84的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
86.權(quán)利要求82的裝置，該裝置還包括
(d)來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞，這些細(xì)胞與所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
87.權(quán)利要求86的裝置，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞為來(lái)源于肝臟的細(xì)胞。
88.權(quán)利要求84的裝置，其中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
89.權(quán)利要求84的裝置，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過(guò)。
90.權(quán)利要求82的裝置，其中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
91.一種方法，用于為受試者提供一種或多種肝臟功能，該方法包括
(a)提供一種配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使該小室內(nèi)裝有多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)當(dāng)位于患者體外時(shí)，在所述小室與受試者的循環(huán)系統(tǒng)之間形成一種流體交通，從而使血液能夠通過(guò)第一管道由受試者流入小室，并通過(guò)第二管道由小室流至受試者，從而使所述肝微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時(shí)至少與其中的一部分相接觸。
92.權(quán)利要求91的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將肝臟的一部分冷凍保存。
93.權(quán)利要求91的方法，其中，處在所述小室內(nèi)的生物相容性薄膜裝有所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體，該薄膜可以使血液成分和肝臟分泌物透過(guò)。
94.權(quán)利要求93的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
95.權(quán)利要求91的方法，該方法的步驟還包括，將來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞與所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
96.權(quán)利要求95的方法，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞為來(lái)源于肝臟的細(xì)胞。
97.權(quán)利要求91的方法，其中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
98.一種方法，用于為受試者提供一種或多種肝臟功能，該方法包括
(a)提供一種可移植于體內(nèi)的小室，該小室由一個(gè)或多個(gè)所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構(gòu)成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；和
(b)使該小室內(nèi)裝有多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時(shí)至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)將該小室植入受試者。
99.權(quán)利要求98的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將肝臟的一部分冷凍保存。
100.權(quán)利要求98的方法，其中的薄膜可以使血液成分和肝臟分泌物透過(guò)。
101.權(quán)利要求100的方法，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
102.權(quán)利要求98的方法，該方法的步驟還包括，將來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞與所述多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
103.權(quán)利要求102的方法，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞為來(lái)源于肝臟的細(xì)胞。
104.權(quán)利要求100的方法，其中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
105.權(quán)利要求100的方法，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過(guò)。
106.權(quán)利要求98的方法，其中的多個(gè)肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
107.一種體外裝置，用于為受試者提供一種或多種腎臟功能，該裝置包括
(a)一種位于受試者體外的小室，該小室配有能夠與受試者的循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行流體交通的第一管道和第二管道，從而使血液能夠通過(guò)第一管道由受試者流入小室，并通過(guò)第二管道由小室流至受試者；以及
(b)裝在所述小室中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體，從而使所述的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時(shí)至少與其中的一部分相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死。
108.權(quán)利要求107的裝置，其中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的腎臟的至少一部分制成。
109.權(quán)利要求107的裝置，該裝置還包括
(c)處在所述小室內(nèi)并裝有所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體的生物相容性薄膜，該薄膜可以使血液成分和腎臟分泌物透過(guò)。
110.權(quán)利要求109的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
111.權(quán)利要求107的裝置，該裝置還包括
(d)來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞，這些細(xì)胞與所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
112.權(quán)利要求111的裝置，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞為來(lái)源于腎臟的細(xì)胞。
113.權(quán)利要求107的裝置，該裝置還包括一種能夠與所述小室進(jìn)行流體交通的血液透析部件，用于對(duì)所述受試者的血液進(jìn)行透析。
114.權(quán)利要求107的裝置，其中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
115.一種體內(nèi)裝置，用于為受試者提供一種或多種腎臟功能，該裝置包括
(a)一種可移植于體內(nèi)的小室，該小室由一個(gè)或多個(gè)所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構(gòu)成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；以及
(b)裝在所述小室中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時(shí)至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死。
116.權(quán)利要求115的裝置，其中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的腎臟的至少一部分制成。
117.權(quán)利要求115的裝置，其中的薄膜可以使血液成分和腎臟分泌物透過(guò)。
118.權(quán)利要求117的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
119.權(quán)利要求115的裝置，該裝置還包括
(d)來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞，這些細(xì)胞與所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
120.權(quán)利要求119的裝置，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞為來(lái)源于腎臟的細(xì)胞。
121.權(quán)利要求117的裝置，其中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
122.權(quán)利要求117的裝置，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過(guò)。
123.權(quán)利要求115的裝置，其中的小室包含一種裝有可更換的透析緩沖液的透析袋，該透析袋有一個(gè)流體交通管道，該管道的遠(yuǎn)端裝有一個(gè)閥門(mén)，選擇的該管道的長(zhǎng)度足以使所述閥門(mén)位于受試者的體外，從而可用來(lái)更換所述透析緩沖液。
124.權(quán)利要求115的裝置，其中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
125.一種方法，用于為受試者提供一種或多種腎臟功能，該方法包括
(a)提供一種配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使該小室內(nèi)裝有多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)當(dāng)位于患者體外時(shí)，在所述小室與受試者的循環(huán)系統(tǒng)之間形成一種流體交通，從而使血液能夠通過(guò)第一管道由受試者流入小室，并通過(guò)第二管道由小室流至受試者，從而使所述腎微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時(shí)至少與其中的一部分相接觸。
126.權(quán)利要求125的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分冷凍保存。
127.權(quán)利要求125的方法，其中，處在所述小室內(nèi)的生物相容性薄膜裝有所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體，該薄膜可以使血液成分和腎臟分泌物透過(guò)。
128.權(quán)利要求127的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
129.權(quán)利要求125的方法，該方法的步驟還包括，將來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞與所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
130.權(quán)利要求129的方法，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞為來(lái)源于腎臟的細(xì)胞。
131.權(quán)利要求125的方法，該方法的步驟還包括，提供一種能夠與所述小室進(jìn)行流體交通的血液透析部件，用于對(duì)所述受試者的血液進(jìn)行透析。
132.權(quán)利要求125的方法，其中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
133.一種方法，用于為受試者提供一種或多種腎臟功能，該方法包括
(a)提供一種可移植于體內(nèi)的小室，該小室由一個(gè)或多個(gè)所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構(gòu)成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；和
(b)使該小室內(nèi)裝有多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時(shí)至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)將該小室植入受試者。
134.權(quán)利要求133的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分冷凍保存。
135.權(quán)利要求133的方法，其中的薄膜可以使血液成分和腎臟分泌物透過(guò)。
136.權(quán)利要求135的方法，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
137.權(quán)利要求133的方法，該方法的步驟還包括，將來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞與所述多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
138.權(quán)利要求137的方法，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞為來(lái)源于腎臟的細(xì)胞。
139.權(quán)利要求135的方法，其中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
140.權(quán)利要求135的方法，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過(guò)。
141.權(quán)利要求133的方法，該方法的步驟還包括，使所述小室內(nèi)裝有一種包含可更換的透析緩沖液的透析袋，該透析袋有一個(gè)流體交通管道，該管道的遠(yuǎn)端裝有一個(gè)閥門(mén)，選擇的該管道的長(zhǎng)度足以使所述閥門(mén)位于受試者的體外，從而可用來(lái)更換所述透析緩沖液。
142.權(quán)利要求133的方法，其中的多個(gè)腎微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
143.一種體外裝置，用于為受試者提供一種或多種腎臟和肝臟功能，該裝置包括
(a)一種位于受試者體外的小室，該小室配有能夠與受試者的循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行流體交通的第一管道和第二管道，從而使血液能夠通過(guò)第一管道由受試者流入小室，并通過(guò)第二管道由小室流至受試者；以及
(b)包含在所述小室中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時(shí)至少與其中的一部分相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死。
144.權(quán)利要求143的裝置，其中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的腎臟的至少一部分和已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
145.權(quán)利要求143的裝置，該裝置還包括
(c)處在所述小室內(nèi)并裝有所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體的生物相容性薄膜，該薄膜可以使血液成分以及腎臟和肝臟的分泌物透過(guò)。
146.權(quán)利要求145的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
147.權(quán)利要求143的裝置，該裝置還包括
(d)來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞，這些細(xì)胞與所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
148.權(quán)利要求147的裝置，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞選自來(lái)源于腎臟的細(xì)胞和來(lái)源于肝臟的細(xì)胞。
149.權(quán)利要求145的裝置，該裝置還包括一種能夠與所述小室進(jìn)行流體交通的血液透析部件，用于對(duì)所述受試者的血液進(jìn)行透析。
150.權(quán)利要求143的裝置，其中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
151.一種體內(nèi)裝置，用于為受試者提供一種或多種腎臟和肝臟功能，該裝置包括
(a)一種可移植于體內(nèi)的小室，該小室由一個(gè)或多個(gè)所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構(gòu)成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；以及
(b)包含在所述小室中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時(shí)至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死。
152.權(quán)利要求151的裝置，其中，在用于獲得所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分和肝臟的一部分冷凍保存。
153.權(quán)利要求151的裝置，其中的薄膜可以使血液成分以及腎臟和肝臟的分泌物透過(guò)。
154.權(quán)利要求153的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
155.權(quán)利要求151的裝置，該裝置還包括
(d)來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞，這些細(xì)胞與所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
156.權(quán)利要求155的裝置，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞選自來(lái)源于腎臟的細(xì)胞和來(lái)源于肝臟的細(xì)胞。
157.權(quán)利要求153的裝置，其中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
158.權(quán)利要求153的裝置，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過(guò)。
159.權(quán)利要求151的裝置，其中的小室內(nèi)裝有一種包含可更換的透析緩沖液的透析袋，該透析袋有一個(gè)流體交通管道，該管道的遠(yuǎn)端裝有一個(gè)閥門(mén)，選擇的該管道的長(zhǎng)度足以使所述閥門(mén)位于受試者的體外，從而可用來(lái)更換所述透析緩沖液。
160.權(quán)利要求151的裝置，其中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
161.一種方法，用于為受試者提供一種或多種腎臟和肝臟功能，該方法包括
(a)提供一種配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使該小室內(nèi)裝有多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)當(dāng)位于患者體外時(shí)，在所述小室與受試者的循環(huán)系統(tǒng)之間形成一種流體交通，從而使血液能夠通過(guò)第一管道由受試者流入小室，并通過(guò)第二管道由小室流至受試者，從而使所述腎-及肝微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時(shí)至少與其中的一部分相接觸。
162.權(quán)利要求161的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分和肝臟的一部分冷凍保存。
163.權(quán)利要求161的方法，其中，處在所述小室內(nèi)的生物相容性薄膜裝有所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體，該薄膜可以使血液成分以及腎臟和肝臟的分泌物透過(guò)。
164.權(quán)利要求163的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
165.權(quán)利要求161的方法，該方法的步驟還包括，將來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞與所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
166.權(quán)利要求165的方法，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞選自來(lái)源于腎臟的細(xì)胞和來(lái)源于肝臟的細(xì)胞。
167.權(quán)利要求161的方法，該方法的步驟還包括，提供一種能夠與所述小室進(jìn)行流體交通的血液透析部件，用于對(duì)所述受試者的血液進(jìn)行透析。
168.權(quán)利要求161的方法，其中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
169.一種方法，用于為受試者提供一種或多種腎臟和肝臟功能，該方法包括
(a)提供一種可移植于體內(nèi)的小室，該小室由一個(gè)或多個(gè)所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構(gòu)成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；和
(b)使該小室內(nèi)裝有多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時(shí)至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的單個(gè)微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)將該小室植入受試者。
170.權(quán)利要求169的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分和肝臟的一部分冷凍保存。
171.權(quán)利要求169的方法，其中的薄膜可以使血液成分以及腎臟和肝臟的分泌物透過(guò)。
172.權(quán)利要求171的方法，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
173.權(quán)利要求169的方法，該方法的步驟還包括，將來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞與所述多個(gè)腎一及肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
174.權(quán)利要求173的方法，其中來(lái)源于一種細(xì)胞懸浮液的所述細(xì)胞選自來(lái)源于腎臟的細(xì)胞和來(lái)源于肝臟的細(xì)胞。
175.權(quán)利要求171的方法，其中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
176.權(quán)利要求171的方法，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過(guò)。
177.權(quán)利要求169的方法，該方法的步驟還包括，使所述小室內(nèi)裝有一種包含可更換的透析緩沖液的透析袋，該透析袋有一個(gè)流體交通管道，該管道的遠(yuǎn)端裝有一個(gè)閥門(mén)，選擇的該管道的長(zhǎng)度足以使所述閥門(mén)位于受試者的體外，從而可用來(lái)更換所述透析緩沖液。
178.權(quán)利要求169的方法，其中的多個(gè)腎-及肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
179.一種制備和使用冷凍微器官的方法，該方法包括
(a)至少將器官的一部分冷凍保存，以獲得該器官的冷凍保存片段；
(b)在冷凍保存狀態(tài)下將該冷凍保存片段切成片；
(c)在使用前將該冷凍切片融解，以獲得融解的切片；以及
(d)用融解的切片作為微器官。
180.權(quán)利要求179的方法，其中，至少將所述器官的所述部分冷凍保存，以便在一種溶液中獲得所述器官的所述冷凍保存組織，該溶液至少有一種組分選自DMEM、DMSO、甘油、海藻糖、蜜三糖、一種抗生素、一種抗霉菌素和葡萄糖。
181.權(quán)利要求179的方法，其中，用于冷凍保存的溫度為-180℃-0℃。
182.權(quán)利要求179的方法，其中，所述切片的厚度約為200-400微米。
183.權(quán)利要求179的方法，該方法的步驟還包括
(e)在將所述切片融解前，在能夠維持其冷凍保存狀態(tài)的溫度下將該切片保存一段時(shí)間。
184.權(quán)利要求179的方法，其中，將所述融解切片作為微器官的方法是
(i)提供一種小室；
(ii)將多個(gè)所述切片置于該小室內(nèi)；
(iii)至少將受試者的部分血液引入該小室，以使所述多個(gè)融解切片與該受試者的血液相接觸，其中，在所述多個(gè)融解切片的單個(gè)融解切片內(nèi)位置最深的細(xì)胞離該單個(gè)融解切片的最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而可在各融解切片中保持活體組織的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使所述多個(gè)微器官培養(yǎng)體的各融解切片內(nèi)位置最深的這些細(xì)胞能夠得益于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(iv)至少將一部分已經(jīng)與融解切片接觸的受試者血液重新引入受試者。
全文摘要
一種對(duì)流體進(jìn)行生物修飾的裝置，該裝置包括(a)帶有一個(gè)流體入口和一個(gè)流體出口的一種小室；以及(b)至少一種器官的微器官培養(yǎng)體的集合，用來(lái)對(duì)流體進(jìn)行生物修飾，該集合的每個(gè)微器官培養(yǎng)體均含有細(xì)胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個(gè)微器官培養(yǎng)體中位置最深的細(xì)胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過(guò)約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中可保持器官單位(如肝腺泡)的活體器官構(gòu)造(器官結(jié)構(gòu))，微器官培養(yǎng)體的集合位于所述小室內(nèi)，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸。
文檔編號(hào)A61M1/16GK1407853SQ00813290
公開(kāi)日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2000年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月23日
發(fā)明者E·米特拉尼 申請(qǐng)人:耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)伊森姆研究發(fā)展公司